Антиотцовские антилейкоцитарные антитела что за анализ

При иммунной причине невынашивания шанс доносить беременность составляет 30% после 3 выкидышей (БЕЗ ВРАЧЕБНЫХ ВМЕШАТЕЛЬСТВ), 25% после 4 выкидышей, 5% после 5 выкидышей. При адекватной терапии шанс благополучного исхода беременности составляет 70-85%.

Под адекватной терапией понимается ЛИТ и капельницы ИГ.

ЗНАЧЕНИЕ ПРИСУТСТВИЯ БЛОКИРУЮЩИХ АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКЕ :

Блокирующие антитела были впервые обнаружены в in vitro системе по инкубации лимфоцитов с опухолевыми клетками. Опухолевые клетки прекращали разрушаться в присутствии сыворотки, полученной от животных с раковой опухолью; в этой же сыворотке была обнаружена новая фракция IgG (59, 60). Блокирующие антитела к клеткам плода были найдены у беременных животных (61). Недавно блокирующие антитела были обнаружены у женщин с физиологически протекающей беременностью, и зафиксировано отсутствие этих антител у нерожавших и у женщин с выкидышами в анамнезе (40-50). Это привело к формулировке гипотезы блокирующих антител, заключающейся в том, что блокирующие антитела необходимы для благополучного протекания беременности (40, 41). Эта гипотеза была подтверждена многими клиническими исследованиями, как описано выше (48-53).В случае недостатка блокирующих антител трофобласт не способен расти и выживатьИммунотерапия лимфоцитами мужа может оказаться эффективной в лечении привычного невынашивания неясного генеза при сниженной продукции блокирующих антител в течение беременности и при отсутвствии аутоиммунных механизмов невынашивания. Эффективность объясняется сенситизацией продукции блокирующих антител дополнительными антигенами главного комплекса гистосовместимости отцовских лимфоцитов.

К сожалению, первая DQ 4, 4 – беременность активирует киллерные клетки материнского организма и снижает уровень блокирующих антител. В результате вынашивание второй и последующих беременностей становится невозможным без применения лимфоцитоиммунотерапии для повышения уровня защитных антител и внутивенного введения гамма-глобулина для снижения уровня киллерных клеток.

ВОТ ПОЧЕМУ У НЕКОТОРЫХ ЖЕНЩИН ПЕРВАЯ Б ПРОТЕКАЕТ НА УРА, А С ПОСЛЕДУЮЩИМИ МОГУТ ВОЗНИКНУТЬ ПРОБЛЕМЫ.

При совпадении показателей DQ во время беременности назначают гепарин в качестве превентивной меры, даже если тест на антифосфолипидные антитела был отрицательным до беременности. Было показано, что при совпадении генов DQ у родителей, во время беременности может возникнуть резкий всплеск уровня антифосфолипидных антител. Если после 10 недель беременности уровень антител так и остается низким, гепаринотерапию отменяют.

Определение лейкоцитарных антител:

С помощью этого анализа изучают выраженность иммунологической цепной реакции, вызванной совпадением DQ-антигенов. Низкие результаты этого анализа говорят доктору о необходимости назначить иммуноцитотерапию лимфоцитами мужа. Некоторые доктора назначают внутривенное введение гамма-глобулина. Другие предлагают просто подсаживать большее число эмбрионов, чтобы снизить вероятность сохранения именно того эмбриона, у которого произойдет полное совпадение DQ-антигенов. Обычно используют лимфоциты мужа. Однако если антигены DQ альфа у супругов очень близки, то используют лимфоциты донора. Эта терапия дает положительный результат, если уровень антител у женщины к Т– и В– лимфоцитам ее мужа превышает 30%, и положителен тест микроцитотоксичности.

Репродуктивный иммунофенотип (иммунограмма):

Этот анализ проводят для определения уровня есественных киллеров. В большинстве случаев наличие естественных киллерных клеток – хороший признак, поскольку они защищают организм от раковых опухолей. Однако бывают ситуации, когда их количество резко возрастает и убивает эмбрион или нарушает работу эндокринной системы, делая невозможным вынашивание беременности. При высоких уровнях естественных киллеров назначается внутривенное введение иммуноглобулина. Наоборот, при низких уровнях естественных киллеров доктора назначают стероидные гормоны, в частности, преднизолон.

АНТИТЕЛА К ОТЦОВСКИМ ЛЕЙКОЦИТАМ:

При обследовании супружеских пар с привычным невынашиванием изучают степень их совместимости по HLA – чаще всего по локусам В, DR и DQ. Недостаточные различия по этой системе нарушают продукцию аллоантител. У многорожавших женщин обнаруживают циркуляцию APLA и вне беременности, в то время как у женщин с привычным невынашиванием уровень антител низкий или вовсе не определяется Лечение заключается в иммунизации матери концентрированной культурой лимфоцитов мужа, таким образом, что антигенная нагрузка увеличивается в 10000 раз по сравнению с нормой в ранние сроки беременности. Иммунизация лимфоцитами мужа происходит обычно в течение 4 недель. Через 4 недели после второй процедуры измеряют уровень APLA. Если он значительно повышается перед зачатием, успешное вынашивание достигает 80%

Заключение: данные настоящего исследования позволяют предположить, что иммунизация отцовскими лимфоцитами влияет на показатели иммунитета женщин с привычным невынашиванием неясного генеза, изменяя соотношение Т1 к Т2-хелперному типу реактивности в сторону преобладания Т2-типа.

источник

Способ выявления антиотцовских антител после иммунизации женщин с идиопатическим привычным выкидышем лимфоцитами полового партнера

Владельцы патента RU 2614729:

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для выявления антиотцовских антител после иммунизации женщин с идиопатическим привычным выкидышем лимфоцитами полового партнера. Женщинам двукратно с интервалом в один месяц на 5-9 день менструального цикла внутрикожно вводят партнерские лимфоциты в однократной дозе 50 млн клеток в 10-12 точек ладонной части предплечья. Затем через две недели получают сыворотку крови, в которую добавляют в соотношении 1:1 выделенные из цельной периферической венозной крови лимфоциты (CD3 + ) партнера, полученные в градиенте плотности фиколл-верографин 1,077 г/см 3 в течение 10 минут при 1600 g в соотношении 500 мкл фиколла к 1000 мкл крови, разведенной в 2 раза фосфатно-солевым раствором. Далее инактивированную женскую сыворотку с полученными лимфоцитами партнера инкубируют в течение 30 минут при температуре 37°С, после чего добавляют антитела к Fc-фрагменту иммуноглобулина G в разведении 1:4 с фосфатно-солевым раствором в объеме 1:1 суспензии лимфоцитов и инкубируют в течение 30 минут при температуре 4°С. Методом проточной цитометрии определяют процент партнерских лимфоцитов (CD3 + ), покрытых антителами к Fc-фрагменту иммуноглобулина G партнера, которые соответствуют уровню антиотцовских антител в сыворотке женщин. Изобретение позволяет отразить динамику появления антиотцовских антилейкоцитарных антител после иммунизации указанных женщин. 3 ил., 1 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области клинико-лабораторной диагностики патологии беременности и касается оценки состояния иммунной системы во время предгестационной подготовки женщин с идиопатическим привычным выкидышем.

В качестве одной из причин, приводящих к развитию патологии раннего гестационного периода, заключающейся в нарушении процессов имплантации и плацентации, рассматривается слабая аллогенная стимуляция иммунной системы матери антигенами плода отцовского происхождения. В частности, наличие у супругов совпадающих аллелей генов системы гистосовместимости человека HLA, уменьшающее взаимную аллогенную стимуляцию, обсуждалось в качестве аллоиммунного фактора, приводящего к нарушению нормального протекания беременности /1, 2/. В настоящее время развитие иммунного ответа на отцовские аллоантигены признается необходимым условием нормальных взаимоотношений матери и развивающегося плода /3/.

Для усиления специфического ответа лимфоцитов женщины на аллоантигены партнера в период предгестационной подготовки в супружеских парах с привычным выкидышем используется иммуноцитотерапия (ИЦТ) — иммунизация женщин лимфоцитами полового партнера /4, 5/. Эта процедура проводится в парах с привычным выкидышем неясного генеза, то есть с идиопатическим привычным выкидышем. Данный диагноз ставится при исключении генетических, анатомических, эндокринных, инфекционных и аутоиммунных причин выкидыша. При наличии аллоиммунных факторов нарушения гестационного процесса, таких как совместимость супругов по HLA-антигенам или высокий уровень натуральных киллерных клеток с фенотипом CD56 + у женщины, ставят диагноз идиопатического привычного выкидыша аллоиммунного генеза.

Один из показателей формирования ответа иммунной системы женщины на введение аллогенных клеток — появление в сыворотке крови антител к HLA-антигенам лейкоцитов партнера, или антиотцовских антител (АОАТ). Однако мнения о возможности использования АОАТ в качестве маркера эффективности иммунизации привычного невынашивания беременности противоречивы /1, 6/. Во-первых, потому, что для регистрации АОАТ используются разные методы /7/. Во-вторых, потому, что отсутствие АОАТ у первобеременных с физиологическим течением беременности в первом триместре гестации /8/ можно считать признаком необязательности их наличия для нормального развития беременности и, соответственно, их обнаружение может не быть признаком нормальной иммунной реакции матери на аллоантигены плода на ранних сроках. В-третьих, в иммунизации привычного выкидыша используются лимфоциты и полового партнера, и доноров в разных дозах (от 50 до 400 млн клеток в процедуре), при разных способах иммунизации (подкожной, внутрикожной, внутривенной, внутримышечной) с разным количеством иммунизации (от одной до девяти) с помощью контроля разных иммунологических показателей (блокирующие антитела, цитотоксические антитела, определение доли натуральных киллерных клеток) /9/. Известно, что продукция антител при последовательных иммунизациях — это динамичный процесс, развивающийся в течение нескольких месяцев, и выбор оптимального срока тестирования также становится ключевым фактором в оценке последствий иммунизации с помощью выявления уровня АОАТ.

Выявление аллогенных антител в сыворотке реципиента, способных связываться с поверхностными антигенами лимфоцитов донора, с помощью проточной цитофлуорометрии (ПЦМ) широко используется в трансплантологии для выявления предсуществующих антител, являющихся фактором риска при пересадке органов /10/. В отличие от трансплантологии появление определенного уровня антител к аллоантигенам плода в процессе иммунизации может быть признаком нормализации иммунного ответа матери, который после иммунизации будет способствовать пролонгированию беременности. С этой точки зрения отсутствие АОАТ у первобеременных не означает, что чувствительные к появлению отцовских антигенов системы материнского организма, ответственные за нормальное взаимодействие с развивающимся плодом, не стимулированы. Это означает, что АОАТ, регистрируемые таким способом, не отражают природы стимуляции материнской иммунной системы аллоантигенами плода в условиях нормально развивающейся беременности.

Метод определения АОАТ с помощью ПЦМ заключается в определении связывания флуоресцентно-меченых антител к иммуноглобулину G (IgG) женщины с антителами IgG-класса на поверхности лимфоцитов партнера. Развитие многоцветной флуорометрии привело к усовершенствованию метода и определило возможность выявления антител на определенных субпопуляциях иммунокомпетентных клеток /11/. Об использовании этих подходов для выявления АОАТ сообщалось лишь в единичных работах /12, 13/. Модификации метода ПЦМ заключаются в использовании разного времени и температуры инкубирования сыворотки реципиента с клетками донора, а также различных разведений тестируемых сывороток и различных концентраций клеток /14/.

Наиболее близок патентуемому метод /13/.

Задача настоящего изобретения — предложить метод определения антиотцовских антилейкоцитарных антител, отражающий динамику их появления после иммунизации женщин с идиопатическим привычным выкидышем лимфоцитами полового партнера.

Цель настоящего изобретения — создание способа оценки появления антиотцовских антител после иммунизации женщин с идиопатическим привычным выкидышем во время подготовки к беременности.

Поставленная цель достигается двукратным внутрикожным введением женщинам с идиопатическим привычным выкидышем лимфоцитов полового партнера с интервалом в один месяц;

инкубированием лимфоцитов полового партнера in vitro с сывороткой пациентки после предгестационной иммунизации;

использованием прямых меченных фикоэритрином (РЕ) антител к CD3 + -лимфоцитам;

использованием прямых меченных флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) антител к Fc-фрагменту иммуноглобулина G (IgG);

регистрацией СD3 + -лимфоцитов, несущих на своей поверхности антитела к HLA-антигенам с помощью проточной цитометрии. Уровень АОАТ в сыворотке женщины соответствует доле мужских лимфоцитов, покрытых антителами к Fc-фрагменту IgG.

Кровь у партнеров для анализа забирают натощак из локтевой вены.

У женщин кровь забирают на 18-22 день менструального цикла. Сыворотку крови женщин получают после образования в течение 30 минут при комнатной температуре кровяного сгустка, который осаждают центрифугированием при 900g в течение 10 минут. Перед проведением анализа сыворотку инактивируют нагреванием в течение 30 минут при 56°С.

Лимфоциты из цельной крови партнеров выделяют стандартным методом центрифугирования в градиенте плотности с использованием смеси фиколл-верографин плотностью 1,077 /15/.

Для определения АОАТ лимфоциты партнера инкубируют с сывороткой крови женщины. В качестве контроля неспецифического связывания используют инактивированную пулированную АВ-сыворотку (Sigma, США). Определяют долю CD3 + -лимфоцитов, покрытых антителами (Beckman Coulter, США). Анализ проводят на проточном цитофлуориметре FacsCalibur (Beckton Dickinson, США).

Определение АОAT проводили у пациентки X. 32 лет с идиопатическим привычным выкидышем. В анамнезе у пациентки было 4 беременности, две из которых закончились самопроизвольным выкидышем на малом сроке и две неразвивающиеся беременности на сроке 7-6 недель.

АОАТ определяли до иммунизации лимфоцитами партнера и через две недели после 2-й процедуры иммунизации (иммунизацию проводили двукратно в течение двух менструальных циклов подряд на 5-9 день цикла).

Кровь для анализа у пациентки X. и ее партнера брали натощак из локтевой вены, у женщины — в пробирку с факторами свертывания крови, у партнера — в пробирку с антикоагулянтом (гепарином).

Процедура определения АОАТ

1. Сыворотку крови женщины инактивировали нагреванием на водяной бане в течение 30 минут при 56°С.

2. Выделяли из периферической крови мужчины лимфоциты стандартным способом в градиенте плотности фиколл-верографин 1,077 г/см 3 в пробирках типа Эппендорф в течение 30 минут при 900 g (500 мкл фиколла + 500 мкл крови + 500 мкл фосфатносолевого раствора (ФСР)).

3. Отмывали клетки однократно раствором ФСР при 23°С с 1% фетальной бычьей сыворотки (ФБС) в течение 10 минут при 600 g.

4. Добавляли 500 мкл ФСР с 1% ФБС.

5. В камере Горяева подсчитали количество выделенных лимфоцитов партнера. Концентрация клеток для реакции должна быть 10 6 кл/мл.

6. Приготовили две конические центрифужные пробирки объемом 14 мл, в каждую добавили по 25 мкл лимфоцитов партнера из готовой клеточной суспензии.

7. Добавили в одну пробирку 25 мкл сыворотки крови женщины, в другую — 25 мкл пулированной АВ-сыворотки.

8. Инкубировали 30 минут при температуре 37°С на водяной бане.

9. Отмыли три раза по 4 мл ФСР с 1% ФБС при 23°С в течение 10 минут при 600 g. После последней отмывки объем клеточной суспензии должен быть не менее 25 мкл.

10. Добавили претитрованные антитела к Fc-фрагменту иммуноглобулина человека (анти-Human-IgG F9512 фирмы Sigma, США) в объеме 25 мкл на 25 мкл суспензии клеток (общее разведение F9512 — 1:4, т.е. 1,25 мкл исходных AT и 23,75 мкл ФСР 4°С).

11. Инкубировали 30 минут в защищенном от света месте при 4°С.

12. Отмыли однократно ФСР с 1% ФБС объемом 4 мл в течение 10 минут при 600 g при 4°С.

13. Добавили 100 мкл ФСР с 1% ФБС.

14. Перенесли содержимое в пробирки для накопления на проточном цитофлуориметре FacsCalibur (Beckton Dickinson, США). Пример цитограмм для анализа представлен на рис. 1.

Результаты определения АОAT у женщин с привычным выкидышем (ПВ) во время предгестационной подготовки после разного количества иммунизации представлены на рис. 2.

Всего обследовано 112 пациенток с ПВ.

Наглядно демонстрируется низкий уровень АОАТ у женщин с ПВ до назначения лечения. Проведение процедуры иммунизации приводит к постепенному значимому повышению уровня АОАТ по сравнению с исходным. Уровень АОАТ, достигнутый после второй процедуры ИЦТ, не изменяется после 2, 3 и 4 иммунизаций.

На рис. 3 представлена динамика АОАТ у пациенток с ПВ после двукратной иммунизации в предгестационной подготовке и в первом триместре наступившей беременности (n=53).

Как видно из рис. 3, до назначения иммунизации уровень АОАТ у женщин с привычным выкидышем был низким.

Не обнаружено различий в уровне АОАТ у женщин с привычным выкидышем до назначения лечения и в группе фертильных здоровых женщин, имеющих от одного до трех здоровых детей в анамнезе (16,6±3,5, n=53 и 24,2±6,7, n=20).

Во время предгестационной подготовки уровень АОАТ в сыворотке пациенток с ПВ постепенно повышался до максимального от процедуры к процедуре. Уровень АОАТ, достигнутый после второй процедуры ИЦТ, сохранялся стабильным у забеременевших в дальнейшем женщин на протяжении всего первого триместра. Отличий уровня АОАТ после последней иммунизации вне беременности от уровней АОАТ на разных сроках первого триместра не выявлено. Во время наступившей беременности уровень АОАТ сохраняется на максимуме (93,2±2,1%).

Также нами выявлено, что сходная динамика и неотличающиеся уровни АОАТ были как у женщин с состоявшимся самопроизвольным выкидышем, так и у женщин с пролонгированной беременностью (табл. 1), но различий в СИФ позитивных клетках в этих группах не обнаружено.

На основании изложенных результатов по анализу АОАТ после 2-кратной и 4-кратной аллоиммунизации женщин с ПВ в предгестационной подготовке можно сделать заключение о достаточности двух таких процедур для стимуляции иммунной системы женщины HLA-антигенами супруга, регистрируемой по уровню АОАТ.

1. Nielsen H.S., Witvliet M.D., Steffensen R. et al. //J.Reprod.Immunol. — 2010. — V. 87, №1. — 2. — P. 67-73.

2. Ober C., Hyslop T., Elias S. et al. //Hum. Reprod. — 1998. — V. 13, №1. — P. 33-8.

3. Druckmann R., Druckmann M.A. Progesterone and the immunology of pregnancy. J Steroid Biochem Mol Biol. 2005 Dec; 97(5):389-96.

4. Говалло В.И., Сидельникова В.М. «Иммунизация беременных женщин аллогенными лимфоцитами мужа как метод профилактики самопроизвольных выкидышей». Акушерство и гинекология, №12, с. 25-27, 1983 г.

5. Сидельникова В.М. Подготовка и ведение беременности у женщин с привычным невынашиванием: Метод. пособия и клин. рекомендации. — М: МЕДпресс-информ, 2011. — 224 с.

6. Bartel G., Walch K., Wahrmann М., Pils S., L., Polterauer S., Tempfer C., G.A. Prevalence and qualitative properties of circulating anti-human leukocyte antigen alloantibodies after pregnancy: no association with unexplained recurrent miscarriage. Hum Immunol. 2011 Feb; 72(2): 187-92.

7. Lashley E.E., Meuleman T., Claas F.H. Beneficial or Harmful Effect of Antipaternal Human Leukocyte Antibodies on Pregnancy Outcome? A Systematic Review and Meta-Analysis. Am J Reprod Immunol. 2013 Mar 18.

8. Кречетова Л.В., Хачатрян Н.А., Тетруашвили Н.К., Вторушина В.В., Степанова Е.О., Голубева Е.Л., Николаева М.А., Сухих Г.Т. Динамика выработки антилейкоцитарных антител к отцовским антигенам при иммунизации аллогенными клетками женщин с привычным выкидышем. Акушерство и гинекология 2015, №3, 16-20.

9. Early Pregnancy Edited by Roy G. Farquharson, Mary D. Stephenson Cambridge University Press, 2012/ Cambridge Books Online http://ebooks.cambridge.org/ Book DOI: http://dx.doi.org/10.1017/CBO9780511777851.

10. Garovoy M.R., Rheinschmidt M.A., Bigos M., Perkins H., Colombe В., Feduska N., Salvatierra O. (1983)//Transplant. Proc., v. 15, p. 1939.

11. Cook D.J., Terasaki P.I., Iwahi G.Y., Terashita G.Y., Lau M. The flow cytometry crossmatch in kidney transplantation (1987). Clin. Transplant, v. 1, p. 253.

12. Maruyama T., Makino Т., Sugi T. et al. Flow cytometric crossmatch and early pregnancy loss in women with a history of recurrent spontaneous abortions who underwent paternal leukocyte immunotherapy. //Am. J. Obstet. Gynecol. — 1993. — V. 168, №5. — P. 1528-36.

13. Ormerod M.G. Flow cytometry: a practical approach.-Oxford: University Press. — 3rd ed., 2000. — 276p.

14. L.V. Krechetova, M.A. Nikolaeva, L.V. Van’ko, M.M. Ziganshina, E.L. Golubeva, E.O. Stepanova, G.T. Sukhikh Optimal detection of serum antipaternal antileukocytic antibodies after injection of allogenic lymphocytes in woman with habitual abortions// Bulletin of Experimental Biology and Medicine. — 2012, — V. 153, №5. — P. 726-729.

15. Меньшиков B.B., Делекторская Л.Н., Золотницкая Р.П. и др. Лабораторные методы исследования в клинике. — М.: Медицина, 1987. — 368 с.

Рис. 1 — Пример цитограмм для анализа появления АОАТ

Рис. 2 — Влияние количества аллоиммунизаций на выявление АОАТ в женской сыворотке (n — количество обследованных женщин)

Рис. 3 — Доля позитивных мужских лимфоцитов с фенотипом CD3+, покрытых АОАТ, после их инкубации с сывороткой женщин с привычным выкидышем

Примечание: n — количество обследованных женщин.

Способ выявления антиотцовских антител после иммунизации женщин с идиопатическим привычным выкидышем лимфоцитами полового партнера, при котором женщинам двукратно с интервалом в один месяц на 5-9 день менструального цикла внутрикожно вводят партнерские лимфоциты в однократной дозе 50 млн клеток в 10-12 точек ладонной части предплечья, затем через две недели получают сыворотку крови, в которую добавляют в соотношении 1:1 выделенные из цельной периферической венозной крови лимфоциты (CD3 + ) партнера, полученные в градиенте плотности фиколл-верографин 1,077 г/см 3 в течение 10 минут при 1600 g в соотношении 500 мкл фиколла к 1000 мкл крови, разведенной в 2 раза фосфатно-солевым раствором; далее инактивированную женскую сыворотку с полученными лимфоцитами партнера инкубируют в течение 30 минут при температуре 37 С, после чего добавляют антитела к Fc-фрагменту иммуноглобулина G в разведении 1:4 с фосфатно-солевым раствором в объеме 1:1 суспензии лимфоцитов и инкубируют в течение 30 минут при температуре 4°С; затем методом проточной цитометрии определяют процент партнерских лимфоцитов (CD3 + ), покрытых антителами к Fc-фрагменту иммуноглобулина G партнера, которые соответствуют уровню антиотцовских антител в сыворотке женщин.

источник

Клетки крови и белки плазмы содержат системы антигенов, определяющих индивидуальность организма. Поддержание постоянства внутренней среды организма является общебиологической закономерностью и реализуется элиминацией чужеродных антигенов. Переливание крови как лечебный метод нашло широкое применение только после установления ее групповых различий. Внедренная в широкую клиническую практику система оценки биосовместимости гемокомпонентов донора и организма реципиента позволяет предупредить несовместимость по наиболее иммуногенным системам антигенов эритроцитов — АВО и резус. Оценка совместимости по антигенам лейкоцитов и тромбоцитов проводится методами скрининга лишь при угрозе риска или развитии гемотрансфузионных осложнений.

Известные на современном этапе методы иммунологического подбора совместимых пар «донор — реципиент» включает в себя исследования:

1. эритроцитарных антигенов и анти-эритроцитарных антител;
2. лейкоцитарных антигенов и антилейкоцитарных антител;
3. антигенов сывороточных белков и антител к ним;
4. выполнение комплекса серологических проб на совместимость между клетками и сывороткой крови исследуемой пары.

Одним из принципиальных подходов повышения иммунологической безопасности гемокомпонентной терапии является использование крови доноров, гистосоместимых с реципиентом. Определяющее значение для индивидуальности организма играет система лейкоцитарных антигенов человека (human leukocyte antigens, HLA-система), являющаяся главным комплексом гистосовместимости человека.

Ее основная функция — сохранение целостности организма путем обеспечения взаимодействия между иммунокомпетентными и всеми другими клетками организма. Антигены НLА — рецепторы клеточной мембраны, выполняющие распознавательную и регуляторную функции. Выделяют два класса антигенов гистосовместимости: антигены НLА I класса (локусы А, В и С) и II класса (локусы D, DR, DP и DQ). Молекулы НLА I класса экспрессированы на мембране каждой ядросодержащей клетки организма, распознаются Т-лимфоцитами-киллерами, играя основную роль в цитотоксическом эффекте. Молекулы НLА II класса экспрессированы на поверхности иммунокомпетентных клеток, распознаются Т-лимфоцитами-хелперами. Антигенная несовместимость тканей донора и реципиента по антигенам НLА приводит к развитию реакций по типу гиперчувствительности замедленного типа и сенсибилизации реципиента. Данные реакции являются причиной целого ряда осложнений и посттрансфузионных реакций негемолитического типа.

Одним из основных методов профилактики этих осложнений гемотрансфузионной терапии является использование компонентов крови от гистосовместимых доноров.

АНТИГЕНЫ ЛЕЙКОЦИТОВ, ТРОМБОЦИТОВ И БЕЛКОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ, НLА-АНТИГЕНЫ

Аллоантигены, в наибольшей степени ответственные за гистосовместимость и определяющие приживление тканевых трансплантатов, аллоантитела против которых с наибольшей частотой формируются при трансфузиях крови и беременности — это лейкоцитарные антигены системы HLA. HLA-система обладает рядом важнейших свойств: полиморфизмом, конкордантностью (соответствие каждого аллеля на хромосоме определенному антигену на клеточной мембране) и сцепленностью генов.

Антигены HLA — продукты HLA-генов, специализированные на процессинге и презентации эндогенных и экзогенных антигенов иммунокомпетентным клеткам. Комплекс HLA-генов расположен на коротком плече 6 хромосомы и занимает от 2000 до 4000 тыс. п.н. Выделяют четыре главные категории генов, вовлеченных в процесс презентации антигенов: гены I класса, II класса, гены протеосомы и транспортные гены. По другой классификации все гены, входящие в систему HLA, подразделяют на три группы: экспрессирующие гены, псевдогены и гены с неустановленной функцией. К экспрессирующим генам первого класса относят НLА-А, В, С, а также открытые в конце 1980-х годов гены НLА-Е, G, F, функция которых до настоящего времени не ясна, а аллельные варианты не найдены. Молекулы HLA первого класса состоят из специфической цепи гликопротеинов и неспецифического (β₂-микроглобулина. Гены HLA II класса МНС комплекса формируют три широких локуса: НLА-DR, DQ и DР. Молекулы HLA II класса состоят из альфа- и бета-цепей, кодируемых соответственно А и В генами.

HLA-антигены I класса экспрессированы на большинстве соматических клеток, причем уровень их экспрессии тканеспецифичен. Максимальная экспрессия выявлена на лимфоидной ткани.

Номенклатура HLA — антигенов

Современная номенклатура комплекса HLA базируется на номенклатуре генов, она регулярно пересматривается на Международных рабочих совещаниях по тканевому типированию, последнее из которых состоялось в июне 1996 г. в Париже. В соответствии с действующей номенклатурой выделяют:

• специфичности локуса А: 1, 2, 3, 9, 10, 11, 19, 23, 24, 25, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 36, 43, 66, 68, 69, 74;
• специфичности локуса В: 5, 7, 8, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 21, 22, 27, 35, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 49, 51, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52-59, 67, 70, 73;
• специфичности локуса С: от Сw1 до Сw8 распознаются серологически;
• локус DР: w1-w6
• локус DQ: w1-w3
• локус DR: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17,18.
• локус Dw: w1-w26

Серологическое определение HLA-антигенов

Анализ антигенного состава лимфоцитов осуществляется с помощью набора гистотипирующих сывороток. Набор сывороток, определяющих антигены А, В и С локусов системы HLA, должен выявлять не менее 30 наиболее часто встречающихся и редких антигенов системы HLA. Фенотипирование лимфоцитов проводят в микролимфоцитотоксическом тесте.

Dw детерминанты идентифицируют с помощью гомозиготных типирующих клеток в тесте смешанной культуры лимфоцитов (Mixed Lymphocyte Culture — MLC).

В настоящее время все более доступным становится метод генотипирования аллелей локуса НLА. Первым в клиническую практику был внедрен метод измерения длин рестрикционных фрагментов ДНК. Хромосомная ДНК фрагментируется рестрикционными ферментами, и полиморфизм длин фрагментов ДНК распознается после проведения электрофореза и сопоставления с ДНК специфичных проб. В настоящее время для идентификации аллелей HLA большую популярность получил метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), при которой происходит изолированное умножение гена или его фрагмента при помощи термостабильной ДНК-полимеразы, четырех типов дезоксинуклеотидтрифосфатов, являющихся структурной основой всякой ДНК, и коротких олигонуклеотидных затравок (праймеров). Детекцию амплифицированного специфического фрагмента ДНК (амплификона) можно получить:

1. при электрофоретическом разделении продуктов ПЦР на агарозном или акриламидном геле. Специфичность полосы амплифицированой ДНК подтверждается ее положением (размерами) по отношению к ДНК-стандарту;
2. при гибридизации амплификата с зондами, имеющими флюоресцентную, радиоактивную или ферментную метку, позволяющую визуализировать результат.

Анти-HLA-антитела наиболее частая причина негемолитических посттрансфузионных реакций и рефрактерности к аллогенным гемокомпонентам. Естественная анти-HLA-сенсибилизация развивается у женщин во время беременности к аллоантигенам плода. Частота аллосенсибилизации при беременности составляет от 5 до 25%. Специфичность формирующихся анти-HLA-антител обычно широкая, чаще анти-В, чем анти-А. У женщин, имевших четыре и более беременности, часто формируются антитела к одному или двум антигенам гаплотипа мужа.

С высокой частотой анти-HLA-антитела формируются во время гемотрансфузий от многих доноров, причем антитела эти широкой специфичности из-за широкого спектра антигенов, представленных на донорских клетках. Однако даже если больной получает несколько повторных трансфузий от одного донора, вероятность его сенсибилизации высока. У 85-90% реципиентов удается определить антилейкоцитарные антитела в лимфоцитотоксическом тесте и методом лейкоагглютинации после кардиохирургических операций, гемотрансфузий при язвенной болезни желудка, однако эта сенсибилизация транзиторна, и антитела не удается выявить у большинства больных через 10-12 недель после окончания трансфузий. Однако даже при таких кратковременных ответах в организме остаются иммунокомпетентные клетки памяти, обусловливающие наличие анамнестического ответа. При повторных курсах трансфузий сенсибилизация развивается быстрее (через 7-10 дней, а не 18-20 — как при первичной), а титры специфических антител бывают гораздо выше. Для больных, получающих повторные курсы трансфузий, вопросы профилактики посттрансфузионных реакций становятся чрезвычайно актуальными и могут быть решены только при индивидуальном подборе гистосовместимых доноров.

Развитие HLA-сенсибилизации при трансфузиях обусловлено примесью лимфоцитов, содержащихся в большинстве гемокомпонентов. Практически свободны от этой примеси только размороженные криоконсервированные эритроциты. Пороговой величиной, так называемой дозой иммуногенной нагрузки, является доза в 5 млн лимфоцитов.

На развитие аллосенсибилизации значительное влияние оказывает состояние иммунной системы реципиента. Так, у больных с выраженным иммунодефицитом при сепсисе, ожоговой болезни клинически значимая сенсибилизация развивается значительно реже, чем у лиц не имеющих угнетения иммунной системы (гипопластическая анемия, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки и др.). Имеются наблюдения, свидетельствующие, что у больных, получавших гемотрансфузий, чаще наблюдаются рецидивы колоректального рака и опухолей других локализаций.

Специфичные антигены гранулоцитов (нейтрофилов) NА1 (НNА-1а по новой международной номенклатуре) и NА2 (НNА-1b) являются продуктами аллелей NA-локуса (хромосома 1), который формирует биаллельную систему. В последнее время к этой группе относят антиген SН (НNА-1с) [Minchinton R., 1999]. Другая серия гранулоцитспецифичных антигенов — NB1; NC1; ND1; NЕ1 и НGА-3 а, b, с, d, е; а также менее успешно дифференцируемые антигены GА, GВ, GС и GR (табл. 18.18 [показать] ).

Гранулоцит-специфичные антитела могут отвечать за различные клинические синдромы, в частности аутоиммунную нейтропению новорожденных, фебрильные реакции при переливании крови, связанное с трансфузией поражение легких, аутоиммуную нейтропению.

МЕТОДЫ ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО ПОДБОРА СОВМЕСТИМОГО ДОНОРА В ТРАНСФУЗИОЛОГИИ

Важным этапом иммунологического подбора является выполнение комплекса серологических проб на индивидуальную совместимость по аллоантигенам лейкоцитов, тромбоцитов и иммуноглобулинов. При этом используются лимфоцитотоксическая реакция, реакции лейкоцитоагглютинации и тромбоцитоагглютинации. Эти реакции могут осуществляться в двух ариантах: исследование сыворотки реципиента с клетками крови донора и сыворотки донора с форменными элементами реципиента.

Для исследования антигенного состава с использованием микрометодов достаточно 4 х 10 3 лимфоцитов и 0,5 х 10 3 тромбоцитов в 1 мм 3 , что очень важно при обследовании пациентов с гипоплазией кроветворения.

Техническое оснащение микрометодов включает в себя: микрошприцы, которые должны дозировать объем от 1 до 5 мкл, микрокамеры типа Терасаки с 60 лунками в форме усеченного конуса емкостью 0,01 мл. Площадка лунки позволяет производить микроскопирование клеток непосредственно в камере. Для предотвращения высыхания столь малых объемов реагирующей смеси лунки камеры перед распределением всех реагентов заполняются вазелиновым маслом.

Все стандартные и исследуемые сыворотки должны сохраняться в замороженном виде при температуре не выше — 40°С. Замораживание сывороток вызывает образование криопреципитата, который перед исследованием должен быть удален центрифугированием. При многократных температурных перепадах в осадок уходят до 50% всех гамма-глобулинов, в связи с чем сыворотки значительно снижают активность. Поэтому для избежания повторных замораживаний и оттаиваний сыворотки необходимо распределять в полиэтиленовые пробирки в малых объемах (по 0,5-1,0 мл).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛЕЙКОЦИТАРНЫХ АНТИГЕНОВ

Производится при аллогенных трансплантациях костного мозга для оценки гистосовместимости донора и реципиента, а также при трансфузиях крови, эритроцитарной массы, лейкоцитоконцентрата, лейкотромбовзвеси для предупреждения посттрансфузионных осложнений.

Материалы. Для выполнения лимфоцитотоксического теста в микроварианте необходимы:

• стандартные сыворотки, имеющие специфическую направленность к различным лейкоцитарным антигенам;
• взвесь лимфоцитов периферической крови [показать]

Выделение лимфоцитов в градиенте плотности

Приготовление градиента плотности. Градиент плотности приготавливается путем смешивания 96 мл 9% раствора фиколла (приготовленного на дистиллированной воде) и 40 мл 34% раствора верографина. 34% раствор верографина готовится из 75% раствора верографина путем разведения дистиллированной водой. Плотность смеси должна быть в пределах 1,076-1,078. Раствор может быть автоклавирован и использован для выделения лимфоцитов в стерильных условиях.

Выделение клеток: кровь, полученную путем венепункции, дефибринируют, затем смешивают в равных количествах с 0,9% раствором хлорида натрия. В пробирку наливают 2,5 мл смеси фиколл-верографин, а затем осторожно наслаивают 8 мл разведенной крови. Пробирки центрифугируют 30 мин при 1450 об./мин при температуре +18°С. После центрифугирования из пробирок пипеткой собирают кольцо, образованное на границе двух жидкостей, в котором находятся лимфоциты. Полученную взвесь лимфоцитов дважды отмывают раствором Хенкса.

Приготовление красителя:

1. раствор трипанового синего — рабочее разведение трипанового синего (0,3%) готовят путем смешивания равных частей 0,6% водного раствора красителя и гипертонического раствора фосфатного буфера, рН 7,8. Гипертонический фосфатный буфер получают непосредственно перед использованием, смешивая равные части фосфатного буфера, рН 7,8 и 1,8% раствора МаС1;
2. раствор эозина — 5% раствор эозина в дистиллированной воде центрифугируют для удаления частиц краски; 1 мкл краски добавляют к взвеси клеток. Спустя 2-3 минуты добавляется 8 мкл 17% раствора формальдегида (перенасыщенный карбонатом кальция — СаСО₃ до рН 7,2; предварительно центрифугированный). При использовании эозина лунки покрываются покровным стеклом 50×76, результаты учитываются на инвертированном фазово-контрастном микроскопе.

Получение, обработка, стандартизация и хранение комплемента

Результат лимфоцитотоксической реакции при всех прочих равных условиях во многом зависит от качества используемого комплемента. Наиболее активной комплемент-содержащей средой является пул сывороток крови кролика. Для приготовления комплемента необходимо взять смесь сывороток крови 8-10 кроликов, не содержащих ксеноантител к лимфоцитам человека.

У кроликов кровь получают из сонной артерии. После образования сгустка сыворотку отделяют, полученные образцы центрифугируют при 6000 об./мин в течение 20 мин. Сыворотку смешивают и разливают по 0,4 мл в полиэтиленовые пробирки и хранят при температуре -196°С. Повторное замораживание сывороток, используемых в качестве комплемента, недопустимо.

Хранение комплемента при температуре -20°С ограничивает его использование одной неделей. Хранение при -196°С обеспечивает высокую комплементарную активность сывороток крови человека и животных в течение 10-12 месяцев. Поскольку определение активности и специфичности комплемента является довольно трудоемким процессом, целесообразно получить достаточно большой объем сывороток и произвести их стандартизацию путем подбора оптимального соотношения указанных ингредиентов при титровании в лимфоцитотоксическом тесте.

Техника постановки микролимфоцитотоксической реакции

В лунки камеры, где под слоем вазелинового масла находится по 1 мкл различных образцов стандартных анти-HLA сывороток, добавляют 1 мкл приготовленной взвеси исследуемых лимфоцитов. Смесь инкубируют при температуре 22°С в течение 30-60 мин, после чего вводят 4 мкл комплемента и продолжают инкубировать в течение 1 ч при той же температуре. По окончании инкубации добавляют 1 мкл свежеприготовленного 0,3% раствора трипанового синего и после трехминутной инкубации при комнатной температуре надосадочную жидкость удаляют путем стряхивания. Учет результатов реакции производят при микроскопировании лимфоцитов непосредственно в лунках камеры при увеличении 10×15. Результат реакции определяют по числу погибших прокрашенных лимфоцитов:

• О-10% (-) — отрицательная реакция;
• 15-20% (+) — реакция слабоположительная;
• 21-39% (++) — реакция положительная;
• 40-79% (+++) — реакция отчетливо положительная;
• 80-100% (++++) — реакция резко положительная.

Причины ложных результатов и их контроль. Бактериальное загрязнение сыворотки и других реактивов, используемых в реакции, может быть причиной ложноположительных результатов; недостаточно активные сыворотки, малая комплементарная активность сывороток, используемых в качестве комплемента, дают ложноотрицательные результаты.

Достоверность полученных данных подтверждается следующими контрольными исследованиями:

1. контроль активности комплемента: к 1 мкл стандартной, высокоактивной, полиспецифической изоиммунной антилейкоцитарной сыворотки добавляют 1 мкл взвеси лимфоцитов, 4 мкл комплемента, 1 мкл раствора трипанового синего — результат реакции должен быть резко положительным (90-100% прокрашенных клеток);
2. контроль специфичности комплемента: к 1 мкл взвеси лимфоцитов добавляют 4 мкл комплемента, используемого в реакции, 1 мкл трипанового синего — число прокрашенных клеток не должно превышать 5%.
3. контроль жизнеспособности лимфоцитов: к 1 мкл взвеси лимфоцитов добавляют 4 мкл раствора Хенкса, 1 мкл раствора трипанового синего — число прокрашенных клеток не должно превышать 5%.

Реакция смешанной культуры лимфоцитов (микровариант)

Необходимым этапом иммунологических исследований при подборе донора костного мозга или переливании гемотрансфузионных сред, содержащих значительное количество аллогенных лимфоцитов иммунокомпрометированным реципиентам является биологическая оценка совместимости донора и реципиента в реакции смешанной культуры лимфоцитов (МLC). С помощью этой реакции выявляются лимфоцитоопределяемые (LD) детерминанты HLA-D локуса. Ценность реакции заключается в том, что по результатам реакции МLС, благодаря имеющемуся тесному сцеплению антигенов локуса D с другими локусами системы HLA, возможно анализировать взаимоотношения всех систем гистосовместимости и судить о степени совместимости пары донор — реципиент, независимо от количества выявленных антигенов и их принадлежности к главному комплексу гистосовместимости.

Для выполнения реакции смешанной культуры лимфоцитов необходимы следующие реагенты: 74% верографин; фиколл (М.м. 400000); среда 199; митомицин С; гепарин.

Кровь берут из вены стерильно с последующим дефибринированием или в раствор гепарина (15 единиц гепарина на 1 мл крови) и смешивают с равным объемом среды 199. Для получения лимфоцитов используют смесь фиколл-верографин.

После двукратного отмывания клеток надосадочную жидкость удаляют, осадок ресуспендируют в среде 199 с добавлением 30% фетальной телячьей сыворотки и доводят до концентрации 1 · 10 6 в 1 мл (отвечающая популяция, ОП).

Лимфоциты стимулирующей популяции (СП) ресуспендируют в 10 мл среды и облучают на γ-облучателе «ИПК» ( 137 Сs) общей дозой 2500 рад (мощность дозы 500 рад/мин, время облучения 5 мин). В дальнейшем облученные взвеси рекомендуется держать на льду. При отсутствии облучателя взвеси следует обработать митомицином С из расчета 25 мкг на 1 мл и инкубировать 40 мин при +37°С. После инкубации клетки стимулирующей популяции отмывают в среде 199 три раза в течение 20 мин и осаждают при 1500 об./мин. Отмытые таким образом лимфоциты ресуспендируют в среде 199, содержащей 30% фетальной телячьей сыворотки, доводя концентрацию клеток до 1 · 10 7 в 1 мл. Клетки отвечающей (ОП) и стимулирующей популяции (СП) смешивают, добавляя к 0,8 мл ОП (1 · 10 6 лимфоцитов) 0,2 мл СП (2-10 6 лимфоцитов), инкубируют в течение 120 ч при 37°С в атмосфере 5% СО₂.

По истечении указанного срока максимально удаляют надосадочную жидкость, из осадка готовят мазки, фиксируют в метаноле 15 мин и красят по Романовскому азур-эозином. Подсчет клеток производят при увеличении 10×90, считают 500 клеток и определяют процент бластов, учитывая следующие клеточные формы: неизмененные лимфоциты, лимфоциты с признаками трансформации в бласты, макрофаги и собственно бласты. Отрицательным считают результат, когда в культуре содержится не более 15% лимфоцитов с признаками трансформации в бласты.

Более совершенным способом учета результатов является использование радиационной метки. Для этого после инкубации в культуру добавляют 1 мкл 3 Н-тимидина, с активностью 40 кБк, и помещают на 6 ч в СО₂-инкубатор. Затем приостанавливают включение тимидина, для чего смесь лимфоцитов охлаждают в холодильнике при +4°С или в ванночке со льдом. Сбор клеток на фильтры, отмывание клеток физиологическим раствором, трихлоруксусной кислотой (ТХУК) и 96% этанолом выполняется автоматически с помощью аппарата «клеточный харвестер». При этом на фильтры переносятся комплексы ДНК-ТХУК. Все миллипоровые фильтры с комплексами ДНК-ТХУК помещают во флакончики с 5 мл сцинтиляционной жидкости. Регистрация результатов радиоактивности проб осуществляется на β-счетчике в течение 1 мин. Полученные результаты позволяют высчитать индекс стимуляции (ИС), представляющий собой частное от деления величины синтеза ДНК лимфоцитами (имп./мин) при стимуляции их аллогенными лимфоцитами на величину синтеза ДНК этими же лимфоцитами при стимуляции их аутологичными лимфоцитами.

При постановке МLС выполняются следующие контрольные исследования:

• к отвечающей популяции лимфоцитов человека добавляют его же лимфоциты, обработанные митомицином С;
• в тесте МLС смешивают две популяции лимфоцитов, обработанные митомицином С. В обоих контролях стимуляции не должно быть.
• обязательно использование взвеси лимфоцитов от третьего (неродственного) партнера.

Полученные результаты позволяют сделать заключение о совместимости или несовместимости реципиента по HLA-D. При совместимости реципиента и донора по HLA-D индекс стимуляции лимфоцитов реципиента лимфоцитами донора и индекс стимуляции лимфоцитов донора лимфоцитами реципиента должны быть близки к единице. При этом индексы стимуляции лимфоцитов реципиента и донора лимфоцитами третьего партнера должны в несколько раз превышать единицу. При слабой реакции лимфоцитов реципиента на лимфоциты третьего партнера (например, вследствие иммунодепрессивного состояния) низкий пролиферативный ответ лимфоцитов реципиента на лимфоциты донора не может рассматриваться как результат идентичности антигенов HLA-D.

Определение антилейкоцитарных антител

Перекрестная проба в микролимфоцитотоксическом тесте [показать]

Ход определения: исследуемые сыворотки крови больных помещают в камеры Терасаки под слой вазелинового масла по 1 мкл, заполняя по 3 лунки каждым сывороточным образцом. Из крови доноров выделяют взвесь лимфоцитов на градиенте плотности фиколл-верографин (1,077 г/см 3 ) и после двухкратного отмывания доводят концентрацию лимфоцитов до 2 х 10 6 /мл. Полученную взвесь донорских лимфоцитов вносят под слой вазелинового масла по 1 мкл и смешивают с исследуемыми сыворотками. Смесь инкубируют при +20°С 60 минут, после чего вносят в лунки по 4 мкл кроличьего комплемента и продолжают инкубацию в течение 1 ч. По окончании инкубации добавляют 1 мкл 5% раствора эозина и через 5 мин останавливают реакцию добавлением 4 мкл 17% раствора формальдегида. Учет реакции проводят непосредственно в лунках камеры Терасаки при микроскопировании лимфоцитов (увеличение 10×7 или 10×15).

Примечание: в качестве отрицательного контроля используют сыворотку донора АВ (IV) группы, инактивированную прогреванием при +56°С. Положительным контролем может служить антилимфоцитарный глобулин.

Получение взвеси лимфоцитов: венозную кровь, стабилизированную цитратом натрия в соотношении 1:5, разливают в центрифужные пробирки, которые оставляют на 30 мин при +37°С в наклонном положении для оседания эритроцитов. Верхний слой плазмы, обогащенный тромбоцитами, удаляют. Нижний слой плазмы переносят в центрифужную пробирку и определяют количество лейкоцитов. Оптимальной концентрацией является 1-1,5×10 4 лейкоцитов в 1 мм 3 .

Сыворотку больного инактивируют при +56°С 30 мин. В микропробирку вносят (по 10 мкл сыворотки больного, цельной и разведенной 1:2 и по 10 мкл лейкоцитов донора. Инкубируют 1 ч при 37°С. По окончании инкубации добавляют 10 мкл 1% раствора уксусной кислоты и через несколько минут микроскопируют.

Интерпретация результатов. Результат реакции определяют по числу агглютинированных лейкоцитов. Отсутствие агглютинатов или их наличие, не превышающее 10-15% от общего числа лейкоцитов, оценивают как отсутствие антител. 16-30% — реакция слабо положительная, 31-50% — реакция положительная, более 50% — реакция резко положительная.

Примечание: в качестве контроля используется инактивированная сыворотка донора АВ(IV) группы.

Многие аллоантигены, ранее считавшиеся специфичными только для тромбоцитов, найдены на других клетках. Большинство из этих антигенов экспрессируется на суперсемействе молекул клеточной адгезии — интегринов, участвующих в межклеточных взаимодействиях или взаимодействии клеток с мембраной. Пять диаллельных антигенов НРА-1, -2, -3, -4 и -5 (табл. 18.19 [показать] ) и 11 редко встречающихся антигенов (НРА-6bW и т.д.) локализуются на пяти гликопротеинах мембраны тромбоцита: GРI_α, GРIb_α, GРIb_β, GPIIb и GPIII_а.

Все эти пять гликопротеинов кодируются различными генами. Аллель системы НPА с высокой частотой распространенности обозначается буквой а, с низкой — b. Предшествующие обозначения — антигены Р1А (Zw), Ко, Ваk, Yuk, Вr — всего более 20 антигенов отражают способность ряда сывороток вызывать агглютинацию некоторых образцов тромбоцитов [Кroll Н. еt аl., 1998]. Учитывая достижения молекулярной генетики, очевидно предстоят дальнейшие изменения номенклатуры антигенов тромбоцитов [Santoso S., Kiefel V., 1998]

При участии аллоантител к тромбоцитам развиваются тромбоцитопеническая пурпура новорожденных (анти-НРА-Iа — более 70%), посттрансфузионная пурпура (анти-НРА-Iа — более 80%) и рефрактерность к трансфузиям тромбоцитов (анти-НРА-1b — 55%, анти-НРА-5b — 30% и анти-HLA). Также существуют два редких синдрома аллоиммунной тромбоцитопении: пассивная аллоиммунная тромбоцитопения и тромбоцитопения, ассоциированная с трансплантацией — в качестве причин описаны только анти-НРА-1а и анти-НРА-5b.

ИСЛЕДОВАНИЕ АНТИГЕНОВ ТРОМБОЦИТОВ

Реакция связывания комплемента с тромбоцитами (микровариант)

Материалы:

• типирующие антитромбоцитарные сыворотки;
• взвесь исследуемых тромбоцитов [показать]

Получение взвеси тромбоцитов: тромбоциты выделяют из венозной крови, стабилизированной 5% раствором Na₂ ЭДТА в соотношении 9:1. Кровь, взятую в полиэтиленовую пробирку, центрифугируют при 1000 об./мин в течение 30 мин. Плазму со взвешенными в ней тромбоцитами отделяют и центрифугируют при 4000 об./мин в течение 30 мин. Осадок тромбоцитов трижды отмывaют физиологическим раствором при том же режиме центрифугировзния и готовят взвесь, содержащую 0,5 x 10 6 тромбоцитов в 1 мм 3 .

Тромбоциты, выдержанные при температуре 4-6°С в течение 24-48 ч, дают более отчетливые результаты по сравнению со свежевыделенными.

Приготовление взвеси эритроцитов барана

Дефибринированную кровь барана асептически консервируют раствором Олсвера в соотношении 1:1, разливают по 0,5 мл в пробирки и хранят при + 4°С в течение недели до использования. Кровь пригодна для постановки реакции в течение 4-6 недель, если при отмывании эритроцитов отсутствует гемолиз в надосадочной жидкости. Эритроциты перед использованием в реакции отмывают дважды физиологическим раствором и однокрaтно ВБР.

Приготовление гемолитической системы. Эритроциты бaрана после отмывания ресуспендируют в ВБР; для использования в реакции готовят 2% взвесь эритроцитов (4x 10 5 клеток в 1 мм 3 ).

Для приготовления индикаторной гемолитической системы сенсибилизируют 2% взвесь бараньих эритроцитов путем инкубации в течение 30 мин при температуре +37°С с соответствующим объемом гемолитической сыворотки, разведенной по титру забуференным физиологическим раствором. В реакции используется кроличья гемолитическая сыворотка. Сенсибилизированные бараньи эритроциты хранят при +4 С: их можно использовать в течение 24-48 ч.

Для постановки реакции необходимо определить титр комплемента и минимальную гемолитическую единицу гемолитической сыворотки. Это устанавливается предварительным титрованием. Можно одновременно производить титрование гемолитической сыворотки и комплемента в микрокамерах.

Способ приготовления ВБР: 85,0 г хлорида натрия, 3,75 г натрия 5,5-диэтилбарбитурата растворяют в 140 мл дистиллированной воды; 5,75 г 5,5% диэтилбарбитуровой кислоты растворяют в 500 мл горячей дистиллированной воды, после чего оба раствора смешивают, охлаждают, добавляют 5 мл 1 М раствора хлорида магния и 0,3 г хлорида кальция, доводят объем до 2000 мл дистиллированной водой. Сохраняют раствор при +4°С. Перед использованием этот раствор смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1:4.

Ход реакции связывания комплемента в микромодификации. Инактивированные путем прогревания при температуре +56°С в течение 30 мин сыворотки распределяют по лункам микрокамеры в объеме 2 мкл, к ним добавляют по 2 мкл взвеси тромбоцитов и по 2 мкл комплемента (2 минимальные гемолитические единицы по титру), смесь инкубируют при температуре +37°С в течение 1 ч, после чего добавляют по 2 мкл сенсибилизированных эритроцитов барана (гемолитическая система), инкубацию продолжают в течение 30 мин. На положительный результат реакции указывает полное отсутствие гемолиза (++++) или различные степени его задержки (+, ++, +++).

Полный гемолиз бараньих эритроцитов свидетельствует об отрицательном результате реакции. Для пояснения приводим схему постановки реакции (табл. 18.20 [показать] ).

Достоверность полученных результатов подтверждается постановкой соответствующих контрольных исследований. При правильной постановке реакции во всех контролях должен быть полный гемолиз.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИГЕНОВ БЕЛКОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ

Определение аллотипов иммунoглобулинов [показать]

Материалы

• антисыворотки анти-Gm и анти-Inv;
• исследуемые сыворотки (разведенные 0,9% раствором хлорида натрия в соотношении 1:4;
• эритроциты группы 0(1);
• анти-резусные сыворотки с известной Gm или Inv-антигенной принадлежностью.

Для выявления взаимодействия между антигенами Gm и Inv и антисыворотками, направленными к ним, применяется «индикаторная система», представляющая собой резусположительные эритроциты группы 0(1) с фиксированными на них анти-D иммуноглобулинами с определенным Gm- или Inv- антигенным составом.

Индикаторная система готовится следующим образом: к 0,6 мл 50% взвеси трижды отмытых эритроцитов добавляют 0,6 мл 0,9% раствора хлорида натрия и 0,6 мл сыворотки анти-D. Смесь инкубируют в термостате при температуре +37°С в течение 1,5 ч, после чего эритроциты отмывают от избытка анти-D сыворотки 0,9% раствором хлорида натрия и в этом же растворе готовят 2% взвесь сенсибилизированных эритроцитов. Приготовленная взвесь пригодна для работы в течение 48 ч.

Для исследования антигенов системы Gm и Inv используют микровариант реакции подавления гемагглютинации. В каждую лунку камеры Терасаки помещают 2 мкл стандартной сыворотки соответствующей анти-Огп или анти-Inv принадлежности и 2 мкл исследуемой сыворотки, разведенной 1:4 физиологическим раствором. Содержимое лунки перемешивают легким покачиванием. Камеру оставляют при комнатной температуре в течение 10-15 минут, а затем в каждую лунку добавляют по 4 мкл 2% взвеси сенсибилизированных эритроцитов, после чего камеру помещают в холодильник (4-5°С) в на 30-40 мин.

Результаты реакции оценивают макроскопически при положении камеры под углом 45°.

Если иммуноглобулины исследуемой сыворотки содержат антиген Gm или Inv, то они взаимодействуют со стандартной антисывороткой (анти-Gm или анти-Inv) и нейтрализуют ее, в результате чего сенсибилизированные эритроциты остаются неагглютинированными, и их осадок формирует на дне и стенках лунки камеры Терасаки полоску с ровными краями. В случае отсутствия в иммуноглобулинах исследуемой сыворотки указанных антигенов, стандартные сыворотки анти-Gm и анти-Inv сохраняют специфическую активность и реагируют с антигенами иммуноглобулинов, фиксированных на эритроцитах, вызывая агглютинацию последних. Агглютинированные эритроциты формируют плотный осадок с фестончатыми краями на дне лунки камеры.

Ложные результаты могут быть обусловлены бактериальным загрязнением исследуемой сыворотки, недостаточной активностью стандартных анти-Gm или анти-Inv сывороток.

Достоверность полученных результатов подтверждается следующими контрольными исследованиями:

• а) контроль на отсутствие собственной гемагглютинационной активности исследуемой сыворотки: к 3,0 мкл сенсибилизированных эритроцитов добавляют 3,0 мкл исследуемой сыворотки — агглютинация должна отсутствовать;
• б) контроль активности анти-Gm или анти-Inv сывороток: к 3,0 мкл сенсибилизированных эритроцитов добавляют 3,0 мкл анти-Gm или анти-Inv сыворотки. Отчетливая агглютинация эритроцитов подтверждает активность антисыворотки.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИТРОМБОЦИТАРНЫХ АНТИТЕЛ

Перекрестная проба в тесте тромбоцитоагглютинации

Реактивы и оборудование:

• 5% раствор ЭДТА (трилон Б),
• 0,9% раствор хлорида натрия с 5% содержанием ЭДТА,
• силиконированные или пластиковые пипетки,
• силиконированные пробирки,
• центрифуга лабораторная.

Ход определения. Получение взвеси тромбоцитов: венозную кровь, стабилизированную 5% раствором ЭДТА в соотношении 1:9, центрифугируют в силиконированной пробирке 5 мин при 2000 об./мин. Полученную таким образом обогащенную тромбоцитами плазму переносят в силиконированную пробирку и центрифугируют 2 мин при 3000-4000 об./мин. Осадок тромбоцитов ресуспендируют в физиологическом растворе с 5% ЭДТА. Оптимальная концентрация тромбоцитов составляет 3,0-5,0 · 1О 5 в 1 мм 3 . Сыворотку больного инактивируют прогреванием при +56°С в течение 30 мин. К 20 мкл сыворотки больного добавляют по 20 мкл взвеси тромбоцитов и инкубируют в течение 60 мин при 37°С. После инкубации пробирки осторожно встряхивают и каплю смеси переносят в камеру Горяева. Микроскопию производят при увеличении 10×10 и 20×15.

Трактовка результатов. Наличие средних и крупных (более 20 пластинок) агглютинатов свидетельствует о наличии тромбоагглютининов в исследуемой сыворотке.

Примечание. Отрицательным контролем служит донорская сыворотка АВ(IV) группы, инактивированная прогреванием, положительным — сыворотка больного, содержащая сильные тромбоагглютинины.

1. Иммунологический подбор донора и реципиента при переливаниях крови, ее компонентов и трансплантациях костного мозга / Сост. Ша-балин В. Н., Серова Л. Д., Бушмарина Т.Д. и др.- Ленинград, 1979.- 29 с.
2. Калеко С. П., Серебряная Н. Б., Игнатович Г. П. и др. Аллосенсибилизация при гемокомпонентной терапии и оптимизация подбора гистосовместимых пар «донор-реципиент» в военных лечебных учреждениях/ Методич. рекомендации.- С.-Петербург, 1994.- 16 с.
3. Практическая трансфузиология / Ред. Козинец Г. И., Бирюкова Л. С., Горбунова Н.А. и др.- Москва: Триада-Т, 1996.- 435 с.
4. Руководство по военной трансфузиоло-гии / Ред. Э. А. Нечаев. — Москва, 1991. — 280 с.
5. Руководство по трансфузионной медицине / Под ред. Е. П. Сведенцова. — Киров, 1999.- 716с.
6. Румянцев А. Г., Аграненко В. А. Клиническая трансфузиология.- М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1997.- 575 с.
7. Шевченко Ю.Л., Жибурт Е.Б., Безопасное переливание крови: Руководство для врачей.- СПб.: Питер, 2000.- 320 с.
8. Шевченко Ю.Л., Жибурт Е.Б., Серебряная Н.Б. Иммунологическая и инфекционная безопасность гемокомпонентной терапии.- СПб.: Наука, 1998.- 232 с.
9. Шиффман Ф.Дж. Патофизиология крови / Пер. с англ.- М.- СПб.: Издательство БИНОМ — Невский диалект, 2000.- 448 с.
10. Blood transfusion in Clinical Medicine / Ed. P.L.Mollison, C. P. Engelfriet, M. Contreras.- Oxford, 1988.- 1233 p.

Источник: Медицинская лабораторная диагностика, программы и алгоритмы. Под ред. проф. Карпищенко А.И., СПб, Интермедика, 2001

источник