Меню Рубрики

Ифа анализ и моноклональные антитела

Высокая специфичность антител в отношении антигена превращает их в мощный инструмент для идентификации различных веществ, будь то макромолекулы, клеточные фрагменты или целые клетки.

Начало широкому использованию антител в диагностических целях положил в 1955 году американский иммунолог А. Кунс. Он присоединил к антителам светящийся краситель. Флюоресцирующие антитела сделали видимыми места расположения интересующих его молекул в клетке. Этот метод получил название иммунофлюоресцентного. Чувствительность метода можно повысить несколькими путями.
В первом случае иммунный ответ усиливается за счет применения антител нескольких порядков:

Антиген иммобилизуется на подложке, к нему добавляются антитела 1-го порядка, связывающиеся непосредственно с антигеном. В исследуемый образец добавляются антитела 2-го порядка, связывающиеся с антигенными детерминантами антител 1-го порядка. Антитела 2-го порядка имеют флюоресцирующую (или другую) метку. Поскольку участков связывания может быть несколько, то реакция проявляется более отчетливо.
Другая система усиления сигнала основана на высоком сродстве биотина (низкомолекулярного растворимого витамина) к стрептавидину (бактериальному белку). Здесь возможны два варианта:
А. Если возможно ковалентно связать биотин непосредственно с антителами, то стрептавидин метят маркером и используют аналогично антителам второго порядка:

Б. Система “биотин-антитело + стрептавидин + меченый биотин”:

В этом случае образуется целая сеть из молекул стрептавидина, связанного с меченым биотином. Следовательно, происходит многократное усиление сигнала.
Применение антител второго и третьего порядков позволяет также упрощать процедуру определения микроорганизмов в мазке. При этом не обязательно иметь меченые антитела против всех бактерий. Достаточно иметь обычные антитела кролика или мыши против интересующего микроорганизма и меченые МКА против этих иммуноглобулинов. Если микроорганизм в мазке присутствует, то к нему “приклеятся” специфические антитела, а к ним уже — меченые. В результате мазок будет светится при люминесцентной микроскопии. Фотометрические или флуоресцентные методы могут быть использованы не во всех случаях, например, если измерение проводят очень мутной среде.
Кроме красителя в качестве метки можно использовать фермент (иммуноферментный анализ) или радиоактивный изотоп (иммунорадиологический). От чувствительности детекции маркера зависит чувствительность метода анализа.
Радиоактивные метки.
Выбор маркера и способа его «привязки» к антигену является одним из важных этапов в проведении анализа. Первоначально широко применялись радиоизотопные метки (радиоиммунный анализ — РИА), предложенные американскими исследователями (С. А. Берсон, Р. С. Ялоу, 1959). Однако в последние годы все более широкое использование в Качестве маркеров находят ферменты. Это обусловлено рядом принципиальных трудностей, связанных с применением изотопныx маркеров. Так, изотоп 125 I имеет время полураспада 60 суток, чем ограничивается срок его использования. Изотоп 3 Н имеет длительное время жизни (12.5 лет), однако под действием бэта-излучения происходит распад молекул антигена, в результате чего время жизни меченых 3 Н-соединений тоже ограничено. Кроме того, эффективность счета трития существенно ниже, чем 125 I. Ограничивающими факторами РИА являются сложность и высокая стоимость оборудования, необходимость централизованной системы распределения иммунохимических наборов, меченных радиоактивными изотопами, определенная опасность изотопов для окружающей среды. Учитывая трудности использования радиоизотопных меток, были предложены в качестве маркеров ферменты.
При иммуноферментном анализе антиген связывается с поверхностью лунки полистирольного планшета. В лунку добавляют антитела, несущие фермент в качестве метки, инкубируют и отмывают. Далее приливают субстрат, который меняет окраску при взаимодействии с этим ферментом. Изменение окраски можно измерить с помощью спектрофотометрии. Таким способом проводится индикация и количественная оценка биоорганических соединений с чувствительностью до 10 -12 г/литр.
В настоящее время известно более 2000 разных ферментов, однако только некоторые находят применение в иммуноферментном анализе. Это объясняется высокими требованиями, предъявляемыми к свойствам ферментов. Фермент должен быть высоко активен, а продукты его реакции детектироваться с высокой чувствительностью, он должен быть стабилен, так чтобы его активность сохранялась не менее одного года. Содержание фермента-маркера в определяемом образце должно быть минимальным. Именно из-за этого для разных объектов используют разные ферменты. Во многих случаях, когда необходим качественный результат, оценка иммунохимической реакции может быть проведена визуально.
Для введения ферментативной метки разработано много разных химических, биохимических и иммунологических способов.
Первым реагентом, использованным для синтеза иммуноферментных конъюгатов, был глутаровый альдегид, реагирующий с аминогруппами лизина белковых молекул. С помощью глутарового альдегида получены конъюгаты антител и антигенов с пероксидазой, щелочной фосфатазой, глюкоамилазой. В настоящее время широко используются иммунопероксидазные конъюгаты и конъюгаты с бэта-галактозидазой.
Ковалентные методы получения иммуноферментных конъюгатов нашли весьма широкое распространение, однако к некоторых случаях действие сшивающего реагента отрицательно сказывается на ферментативной и иммунологической активности компонентов гибридной макромолекулы. В связи с этим определенный интерес представляют иммунологические методы введения ферментной метки.
Один из подходов получил название метода «гибридных антител». Ферментативным гидролизом получают Fab-фрагменты молекул антител против определяемого антигена и используемого фермента. Затем смесь продуктов гидролиза подвергают восстановлению меркаптоэтанодом; при этом Fab-фрагменты обратимо диссоциируют на симметричные части. После удаления восстанавливающего агента молекулы снова ассоциируют, образуя гибридные молекулы антител, специфичные к определяемому антигену и ферменту. При добавлении фермента образуется комплекс антитело—фермент (рис. 19, а). Гибридомная технология открывает принципиально новый путь получения гибридных антител, который заключается в том, что сливаются моноклональные клетки, специфичные против данного антигена и фермента-маркера, в результате чего образуются гибридомы второго поколения, синтезирующие антитела, с двумя специфичностями.
Другой путь заключается в том, что получают антитела одного и того же вида животного (например, кролика) против определяемого антигена и фермента, которые соединяют между собой через антитела другого вида животных (антитела барана против кролика). Добавление фермента к такой тройной молекуле также приводит к образованию комплекса антитело—фермент. В настоящее время разрабатываются подходы получения гибридных антител методами клеточной и генной инженерии, что позволит существенно упростить способ их получения.
Стабильность иммуноферментных конъюгатов при хранении — важнейший параметр, обусловливающий возможность их практического использования. Методы направленной стабилизации конъюгатов пока еще не разработаны. Не существует также корреляции между стабильностью конъюгатов и методом их получения. Однако высокая стабильность гибридных молекул обеспечивает их применение на практике и значительно превосходит стабильность антител и антигенов, меченных радиоактивными изотопами. В лиофилизованном состоянии ферментные конъюгаты сохраняют свои свойства до двух лет.
Кроме ферментов в качестве маркеров могут быть использованы субстраты. В частности, в иммунокофакторном анализе применяются в качестве меток АТФ и НАД, которые могут быть «пришиты» к молекуле антигена через адениновый остаток таким образом, что сохраняется их способность взаимодействовать с ферментом. Аналогично были использованы субстраты пероксидазы (люминол, изолюминол), которые могут быть окислены пероксидом водорода в реакции хемилюминесценции, катализируемой пероксидазой.

источник

1.Моноклональные антитела в диагностике и лечении.

Использование антител в иммуноферментном анализе

Успехи в профилактике и лечении различных заболеваний человека, животных или растений в значительной степени зависит от своевременности и точности определения вызвавшего его патогенного микроорганизма. Классические методы микробиологического анализа, несмотря на свою высокую точность, являются весьма длительными, трудоемкими и дорогими. Кроме того, не всегда удается культивировать такие патогенные микроорганизмы как внутриклеточные паразиты или вирусы, а результаты часто бывают ошибочными.

В последнее время для устранения этих принципиальных ограничений были разработаны методы, в основе которых лежат важнейшие достижения биохимии, иммунологии и генной инженерии.

Любой метод выявления патогенных микро­организмов должен быть достаточно простым, быстрым и обладать высокой специфичностью и чувстви­тельностью. Диагностический тест должен давать положительный ответ только на микроорганизм- или молекулу-мишень, обнаруживать очень малые коли­чества такой мишени даже на фоне других мик­роорганизмов или молекул, загрязняющих образец. Простота метода подразумевает, что он является достаточно продуктивным, эффектив­ным и недорогим для рутинного применения.

Одним из наиболее широко применимым методом является иммуноферментный анализ (ИФА) и прежде всего его разновидность- ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA). Процедура его проведения включает следующие этапы (рис.1):

А. Фиксация (закрепление) компонентов анализируемого образца (сыворотка крови, образцы ткани, клетки микроорганизмов) на поверхности твердой подложки (лунки, планшетки).

Б. Добавление раствора антитела (первого антитела) специфичного к определенному, искомому антигену. Если он имеется в анализируемом образце, то произойдет его связывание с антителами. Далее лунку промывают с целью удаления несвязавшихся молекул первого антитела.

В. Добавление раствора другого антитела (второго антитела), способного специфически связываться с первым антителом. Лунку опять промывают для удаления несвязавшихся с первым антителом вторых антител. Второе антитело обычно представляет собой коньюгат (комплекс) с некоторыми ферментами, способными катализировать химические превращения определенных бесцветных веществ (субстратов), которые сопровождаются появлением цветной окраски или свечением (люминисценцией) при облучении УФ-лучами.

Г. Добавление раствора бесцветного субстрата. Если в лунке присутствует комплекс антиген-первое-второе антитела, то наблюдается окраска или свечение, по интенсивности которых судят о содержании искомого антигена и степени протекания болезни.

Рис. 1

Основной принцип ELISA — специфическое связывание первого антитела с определенной молекулой-мишенью. В качестве такой мишени обычно выступает какой либо имуногенный белок патогенного микроорганизма или специфические белки человека, например антитела, свидетельствующие о протекании определенного паталогического процесса в организме. Очищенный препарат таких белков-антигенов используют для получения специфических антител, при помощи которых затем и выявляют данную мишень. Однако антитела, которые образуются в сыворотке (антисыворот­ке) крови иммунизированного животного (обычно кролика или мыши), могут связываться с разными ан­тигенными детерминантами (участками, эпитопами) такой моле­кулы-мишени. Поэтому такую смесь антител называют поликлональным препаратом.

Использование поликлональных антител имеет два недостатка, существенных для методов имунодиагно­стики: 1) содержание отдельных антител в поликлональном препарате может варьировать от од­ной партии к другой, что не обеспечивает однозначности и воспроизводимости анализов; 2) поликлональные антитела нельзя применять, если необходимо различить две сходные мишени, т.е. когда имуногенный белок патогенной формы микроорганизма, например coli-бактерий, вызывающих кишечные инфекции, и непатогенных (E.coli) форм различаются единственной детерминантой. Однако эти проблемы вполне разрешимы, поскольку сейчас научились получать чистые препара­ты антител, выработанных к одной специфической антигенной детерминанте, т. е. препараты моноклональных антител. Применение моноклональных антител поз­воляет существенно повысить специфичность метода ELISA, поскольку они связываются с одним, строго определенным антигенным сайтом. К настоящему времени получен целый ряд моноклональных антител, на основе которых созданы диагностические системы, которые можно исполь­зовать для обнаружения различных соединений и патогенных микроорганизмов.

Моноклоналъные антитела

Поскольку использование сывороток крови животных для получения моноклональных антител невозможно, то для практического примене­ния антител в качестве диагностического инст­румента или компонентов терапевтических средств необходимо было найти или создать такую чистую линию клеток, которая длительно росла бы в культуре и продуци­ровала антитела одного типа, обладающие высо­ким сродством к специфическому антигену-ми­шени, — моноклональные антитела. Подобная клеточная линия могла бы стать неиссякающим источником идентичных молекул антител. К со­жалению, β-лимфоциты (β-клетки), синтезиру­ющие антитела, не могут воспроизводиться в культуре. Решение данной проблемы виделось в создании гибридной клетки. Получив генетиче­скую составляющую от β-клетки, она могла бы вырабатывать антитела, а приобретя способ­ность к делению от клетки совместимого типа — расти в культуре. Было известно, что β-лимфо­циты иногда перерождаются и становятся рако­выми (миеломными) клетками, приобретая способность к росту в культуре и сохраняя в то же время многие свойства β-клеток. Так клетки миеломы, в первую очередь те, которые не вы­рабатывают антител, стали кандидатами на слияние с антителопродуцирующими β-клетками. Технология слияния таких клеток была разработана в 1975 г. американскими учеными Г. Келером и С. Мильштейном.

источник

Оценка специфичности противотуберкулезных моноклональных антител в двусайтовом иммуноферментном анализе

Изучение возможности использования антимикобактериальных моноклональных антител для выявления нативных антигенов туберкулезных микобактерий. Анализ специфичности распознаваемых антимикобактериальными моноклональными антителами антигенов микобактерий.

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Оценка специфичности противотуберкулезных моноклональных антител в двусайтовом иммуноферментном анализе

Авдиенко В.Г. кандидат медицинских наук

Бабаян С.С. кандидат биологических наук

Козлова И.В. кандидат биологических наук

В двусайтовом иммуноферментном анализе с антимикобактериальными моноклональными антителами (МАТ) и кроличьей противотуберкулезной сывороткой (АС) проанализирована специфичность распознаваемых МАТ антигенов микобактерий. Исследованы 14 МАТ против различных антигенов M.tuberculosis и 12 нетуберкулезных микобактерий. Наибольший интерес вызвал антиген против которого были направлены МАТ 1B7 (конформационный эпитоп?). Авторы считают, что исследование микобактериальных антигенов в подобном «гетеросэндвиче» МАТ-АГ-АС позволяет быстро проверить специфичность как самих МАТ, так и нативных АГ цельных клеток микобактерий с которыми они реагируют.

Ключевые слова: антимикобактериальные моноклональные антитела, микобактериальные антигены.

The specifics of AHA recognized antigens of mycobacteria was analyzed in a sandwich immunoenzymometric analysis with antimycobacterial homogeneous antibodies (AHA) and rabbit antituberculosis serum (AS). 14 AHAs were tested on various antigens of M.tuberculosis and 12 nontuberculous mycobacteria. The antigen of AHA 1B7 (conformational epitope?) was of a particular interest. The authors believe that the study of mycobacterial antigens in such a “heterosandwich” AHA-AG-AS makes it possible to quickly test the specificity of both AHA themselves and the native AG of whole mycobacterial cells with which they react with.

Keywords: antimycobacterial monoclonal antibodies, mycobacterial antigens.

Моноклональные антитела давно и активно используются в диагностике туберкулеза. Например, для быстрой идентификации Mycobacterium tuberculosis complex применяются иммунохроматографические тесты для выявления антигена MPT64 в микробиологических посевах на селективных жидких средах Мидлбрюка, в BACTEC MGIT 960 [9, С. 902]. Определение липоарабиноманнана B (LAM B) в биологических жидкостях больных туберкулезом также основано на МАТ [10, С. 2280], и на их основе создан коммерческий тест. Однако, диагностическая чувствительность выявления LAM B в моче не высока и составляет по разным источникам от 25% до 95%, а специфичность до 97% [11, С. 150], [1, С. 735].

Учитывая, что микобактерии — это живой организм, следует помнить, что в большинстве случаев нативные микобактериальные белки входят в состав мультипротеиновых комплексов. Например, антиген 38кДа (Psts1) входит в суперсемейство АТФ-связывающих кассетных субстрат-связывающих транспортеров, куда входят 15 различных белков [7, С. 78]. Кроме того, в этот комплекс ABC-транспортера входят 38 белков, относящихся к мембрансвязанному домену и еще 45 к нуклеотидсвязывающему домену [3, С. 450].

Читайте также:  Сдали анализ на антитела к полиомиелиту

Имеются и другие не менее сложные комплексы. Так в клеточной стенке микобактерий существует 7 поровых систем для секреции белков как наружу, так и в состав внешнего слоя микобактериальной клеточной стенки, которая, как известно, представляет единый липидогликопептидогликановый комплекс [5, С. 3]. Наиболее показательны PE-PPE белки, осуществляющие как метаболические функции клеточной стенки, так и являющиеся фактором вирулентости патогенных микобактерий. Из 38 известных в этом семействе белков только 7 секретируются, остальные локализуются во внешних и внутренних слоях клеточной стенки [6, С. 905]. В связи с этим, выявление моноантигенов в таких сложных агрегированных комплексах как клеточная стенка микобактерий не всегда возможно, особенно в случае исследования образцов без предварительной пробоподготовки, содержащих нативный неразрушенный материал микобактерий.

Таким образом, целью этого исследования было изучить возможность использования антимикобактериальных МАТ для специфического выявления нативных антигенов туберкулезных микобактерий в двусайтовом иммуноферментном анализе.

В экспериментах применяли культуру M.tuberculosis H37Rv, а также нетуберкулезные микобактерии из коллекции ФГБНУ «ЦНИИ туберкулеза», Москва. Для получения бактерий культуру микобактерий выращивали в синтетической среде Сотона в течение 28 дней при 37 о С. 3-х кратно отмывали в PBS, ресуспендировали в небольшом объеме PBS и далее в суспензиях определяли концентрацию белка методом Брэдфорда [2, С. 250].

В исследовании были использованы антимикобактериальные моноклональные антитела, полученные прежде против цельных клеток M.tuberculosis H37Rv: 1D4 (IgG1, k), реагирующие с антигеном 7кДа; 2F9 (IgG2b, l), направленные против антигена 10кДа (CFP10); 2E11A3 (IgG2a, l), против 19кДа (Rv0009, PPIase A, rotamase A); 1C10G10 (IgG1, k), против 20-23кДа (MPT83); 1A5 (IgG2a, l) против 24кДа; 2C2G7C6 (IgG2b, l) против 23кДа; 1D2 (IgG2b, k) против 25кДа; 2E8C2 (IgG2a, k) против 25-26кДа; 1B7 (IgG1, k) против 25-26кДа; 1F2A7(IgG2a, l) против 38кДа (PstS-1); 1A6 (IgG2a, k) против 30кДа (ESAT6); 2F5 (IgG1, k) против полисахаридного антигена на белках с мол.массой более 30кДа; 1G4 (IgG2b, k) и 1C1 (IgG2b, k) против 38, 39, 40кДа; 1F1 (IgG2b, k) против 58, 100кДа. Кроме того, в исследовании были применены МАТ, полученные против иммуноглобулинов кролика 1C9E1 (IgG2a, k). Все МАТ созданы методом гибридомной технологии, и их специфичность в основном была в пределах M.tuberculosis complex.

Гибридомы, продуцирующие МАТ, выращивали in vitro в культуральной среде, содержащей аффинноочищенную на белкaх A и G фетальную сыворотку, не содержащую иммуноглобулинов крупного рогатого скота. Это позволяло очищать иммуноглобулины МАТ на этих же сорбентах с белками A и G. Для очистки фетальной сыворотки и МАТ из супернатантов культуральных жидкостей использовали иммуноаффинную хроматографию на колонках с сефарозой, ковалентносвязанной с белками A, G или L в FPLC (Pharmacia, Швеция). Эффлюаты МАТ диализовали против физраствора забуференного фосфатами (PBS), концентрировали ультрафильтрацией, после диализа добавляли 0,02% азид натрия в качестве консерванта. МАТ против иммуноглобулинов кролика 1C9E1 ковалентно конъюгировали с пероксидазой хрена методом Наканэ-Уилсона [13, С. 171].

Гипериммунную кроличью антисыворотку получали многократной иммунизацией животных цельными клетками M.tuberculosis H37Rv в неполном адъюванте Фрейнда. Очистку кроличьих иммуноглобулинов проводили на сорбенте Sepharose-CL6B с ковалентно связанными антигенами ультразвукового дезинтеграта M.tuberculosis H37Rv. Истощение полученных антимикобактериальных иммуноглобулинов от перекрёстных реакций производили на сорбенте Sepharose-CL6B с ковалентно связанными иммуноглобулинами мыши. Полученный препарат концентрировали иммунофильтрацией и добавляли 0,02% азид натрия.

Спектр и активность МАТ и антимикобактериальных иммуноглобулинов кролика (АС) проверяли в иммуноблоттинге на расфракционированном в редуцирующих условиях в диск-электрофорезе в 12,5% ПААГ цельноклеточном препарате M.tuberculosis H37Rv.

Специфичность МАТ и связывающихся с ними антигенов оценивали в двусайтовом иммуноферментном анализе.

Для этого иммуноглобулины антимикобактериальных МАТ наносили на поверхность планшетов для ИФА, инкубировали в течение ночи при 4 о С, отмывали PBS — 0,001% Tween 20 (PBST), далее титровали цельноклеточную суспензию M. tuberculosis H37Rv в качестве стандарта и добавляли цельные клетки других нетуберкулезных микобактерий.

После инкубации и тщательной отмывки PBS-T наносили антимикобактериальные иммуноглобулины кролика.

Детекцию связанных в тройной комплекс МАТ-АГ-АС иммуноглобулинов кролика проводили с помощью иммунопероксидазных конъюгатов МАТ 1C9E1 против IgG кролика. Реакцию проявляли с помощью ТМБ, спектрофотометрировали при 450нм и определяли концентрацию в исследуемых образцах по стандартам.

На Рисунке 1 представлен иммуноблоттинг со всеми исследуемыми МАТ и антимикобактериальными иммуноглобулинами кролика. Как видно из приведенного рисунка, не все МАТ реагировали с денатурированными антигенами цельных клеток.

В Таблице 1 приведены данные двусайтового иммуноферментного анализа МАТ и цельных клеток микобактерий (Таблица 1).

Рис. 1 — Иммуноблоттинг антимикобактериальных МАТ с антигенами

Справа приведены молекулярные массы белков маркеров и расфракционированные в редуцирующих условиях в 12,5% ПААГ цельные клетки M.tuberculosis H37Rv. МАТ: 1- 1D4, 2- 2F9, 3- 1C10G10, 4- 1A5, 5-2C2G7C6, 6-1D2, 7- 2E8C2, 8-1B7, 9- 1A6, 10- 1F2A7, 11- 1F1, 12- 1G4, — 1C1, 14- 2F5, 15- антимикобактериальные иммуноглобулины кролика

Таблица 1 — Концентрация исследуемых антигенов микобактерий (мкг/мл), реагирующих с МАТ в двусайтовом ИФА

Как видно из представленной таблицы, большинство МАТ не были специфичны только в отношении M.tuberculosis и реагировали с нетуберкулезными микобактериями.

моноклональный антитело туберкулезный микобактерия

Для исследования были взяты МАТ против различных по молекулярной массе, специфичности и свойствам антигенов микобактерий.

Так микобактериальные белки 6кДа (ESAT-6) и 10кДа (CFP10) секретируются в раннюю фазу роста вирулентных микобактерий. Кроме того, ESAT-6 в экзосомах (мембранных везикулах), активно вырабатываемых вирулентными микобактериями. Оба белка секретируются через микобактериальную систему секреции Type VII или ESX-5 (early secretory antigenic target 6 (ESAT-6) system) [5, P. 3].

Белок 19кДа (Rv009) — железо-регулируемая пептидил-пропил цис-транс изомераза A (ротомаза А), которая идентифицируется масс-спектрометрией в культуральных фильтратах, мембранной фракции и в цельноклеточных лизатах M. tuberculosis H37Rv — аналогичен белкам нетуберкулезных микобактерий. Белок необходим для in vitro роста на холестерине [12, P. 504]. Липогликопротеин MPT/MPB-83 присутствует в клеточной стенке и культуральных фильтратах M. tuberculosis и M. bovis и является агонистом TLR2, т.е. MPB83 можно рассматривать как фактор вирулентности микобактерий [4, P. 94]. Антиген 38кДа (PstS-1) — известный фосфатсвязывающий белок микобактерий, входящий в состав ABC-транспортера клеточной стенки микобактерий. Он вызывает сильный специфический антительный ответ на самых ранних этапах заболевания туберкулезом у человека. 38кДа входит в комплекс из PstA2, PstB2, PstC1 и PstS2, относящихся к фосфатным пермеазам и, по-видимому, распознается МАТ 1G4 и 1С1. Аналогичные белки имеются у всех микобактерий.

Из полученных данных видно, что МАТ распознают антигены, входящие в мультипротеиновые комплексы и мембранные комплексы, представленные не только в M. tuberculosis, но и в других нетуберкулезных микобактериях. Это прежде всего указывает на то, что антимикобактериальные иммуноглобулины кролика имеют перекрестные реакции с многими микобактериями, а также на то, что нативные антигены микобактерий входят в сложные биологические комплексы, выполняющие метаболические и катаболические функции, сходные у разных бактерий.

Интересен антиген, выявляемый МАТ 1B7, поскольку он определяется только на цельных клетках M. tuberculosis, но идентифицировать его в иммуноблоттинге невозможно, т.к. эпитоп, распознаваемый МАТ 1B7, конформационный.

Таким образом, исследование микобактериальных антигенов в «гетеросэндвиче» МАТ-АГ-АС позволяет быстро проверить специфичность как самих МАТ, так и нативных АГ цельных клеток микобактерий, с которыми они реагируют.

1. Balcha T.T. Detection of lipoarabinomannan in urine for identification of active tuberculosis among HIV-positive adults in Ethiopian health centres / T.T. Balcha, N. Winqvist, E. Sturegеrd, S. Skogmar and others // Trop Med Int Health. — 2014. — Vol. 19. — №6. — P. 734-742.

2. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M.M. Bradford // Anal Biochem. — 1976 — Vol.7. — №72. — P. 248-254.

3. Braibant M.M. The ATP binding cassette (ABC) transport systems of Mycobacterium tuberculosis / M.M. Braibant, J.P. Gilot // FEMS Microbiology Reviews. — 2000. — Vol. 24. — P. 449-467.

4. Chambers M.A. Antibody bound to the surface antigen MPB83 of Mycobacterium bovis enhances survival against high dose and low dose challenge / M.A. Chambers, D. Gavier-Widen, R.G. Hewinson // FEMS Immunol Med Microbiol. — 2004. -Vol. 41. — P. 93-100.

5. Chiaradia L. Dissecting the mycobacterial cell envelope and defining the composition of the native mycomembrane / L. Chiaradia, C. Lefebvre, J. Parra, J. Marcoux and others // Sci Rep. — 2017. — Vol.7. — №1. — P.1-12.

6. Fishbein S. Phylogeny to function: PE/PPE protein evolution and impact on Mycobacterium tuberculosis pathogenicity / S. Fishbein, N. van Wyk, R.M. Warren, S.L. Sampson // Mol Microbiol. — 2015. — Vol.96. — №5. — P.901-916.

7. Hwang W.H. Expression, purification and improved antigenicity of the Mycobacterium tuberculosis PstS1 antigen for serodiagnosis / W.H. Hwang, W.K. Lee, S.W. Ryoo, K.Y. Yoo and others // Protein Expr Purif. — 2014. — Vol.95. — P.77-83.

8. Ivanyi J. Significance of antigen and epitope specificity in tuberculosis / J. Ivanyi, T.H. Ottenhoff // Front Immunol. — 2014. — Vol. 23. — №5. — P.524.

9. Maurya A.K. Evaluation of an immunochromatographic test for discrimination between Mycobacterium tuberculosis complex & non tuberculous mycobacteria in clinical isolates from extra-pulmonary tuberculosis./ A.K. Maurya, V.L. Nag, S. Kant, R.A. Kushwaha and others // Indian J Med Res. — 2012. — Vol.135. — №6. — P.901-906.

10. Pereira Arias-Bouda L.M. Development of antigen detection assay for diagnosis of tuberculosis using sputum samples / L.M. Pereira Arias-Bouda, L.N. Nguyen, L.M. Ho, S. Kuijper and others // J Clin Microbiol. — 2000. — Vol.38. — №6. — P.2278-83.

11. Shah M. Diagnostic accuracy of a urine lipoarabinomannan test for tuberculosis in hospitalized patients in a High HIV prevalence setting / M. Shah, E. Variava, C.B. Holmes, A. Coppin and others // J Acquir Immune Defic Syndr. — 2009. — Vol.52. — №2. — P.145-151.

12. de Souza G.A. Bacterial proteins with cleaved or uncleaved signal peptides of the general secretory pathway / G.A. de Souza, N.A. Leversen, H. Mеlen, H.G. Wiker // J Proteomics. — 2011. — Vol.75. — №2. — P.502-510.

13. Wilson M.B. The covalent coupling of proteins to periodate-oxidized sephadex: a new approach to immunoadsorbent preparation / M.B. Wilson, P.K. Nakane // J Immunol Methods. — 1976. — Vol.12. — №1-2. — P.171-181.

Изучение метода получения моноклональных антител путем слияния клеток мышиной миеломы с В-лимфоцитами. Основные среды, употребляемые при получении гибридов. Приготовление отдельных компонентов сред для культивирования. Процесс клонирования гибридом.

контрольная работа [40,6 K], добавлен 22.01.2015

Исследование и характеристика особенностей синегнойной палочки (Pseudomonas aeruginosa) – условно-патогенного микроорганизма. Определение токсиннейтрализующей активности моноклональных антител. Рассмотрение и анализ пигментов пиоцианина и флюоресцеина.

дипломная работа [1,8 M], добавлен 01.02.2018

Молекула антитела с двумя идентичными антиген-связывающими участками. Функциональные свойства, строение антител и их многообразие. Проблема получения индивидуальных антител. Роль специфических последовательностей ДНК. Механизмы экспрессии генов антител.

курсовая работа [174,8 K], добавлен 25.05.2009

Практическое применение антител и о способы их получения. При введении в организм животных и человека чужеродных макромолекулярных веществ — белков или полисахаридов (антигенов) в крови появляются защитные белки — антитела.

реферат [10,6 K], добавлен 24.07.2005

Характеристика и формы антигенов, их специфические свойства. Антигенная активность и иммунологическая толерантность. Синтетические полипептиды как аналоги белковых антигенов. Оценка информационной «емкости» иммунной системы в филогенезе и онтогенезе.

реферат [3,8 M], добавлен 06.09.2009

Особенности использования антител иммунной системой для идентификации и нейтрализации чужеродных объектов. Анализ антигенсвязывающей и эффекторной функций антител. Обзор строения и структуры генов иммуноглобулинов. Процесс возникновения точечных мутаций.

реферат [829,2 K], добавлен 24.02.2013

Сущность понятий «антигенная детерминанта», «специфичность антигена». Типы антигенных детерминант белков. Структура и антигенная специфичность гаптенов. Общая структурная характеристика молекул иммуноглобулинов. Аминокислоты, входящие в состав белков.

контрольная работа [115,8 K], добавлен 19.09.2009

История изучения рода Mycobacterium, особенности морфологии и физиологии. Антигенная структура микобактерий. Классификация и таксономия, виды микобактерий и их дифференциация. Внутривидовая и межвидовая идентификация, ветеринарное и медицинское значение.

курсовая работа [478,0 K], добавлен 11.01.2011

Функции антигенов эритроцитов, их химическая природа и факторы, влияющие на динамику действия. Современная классификация и типы, биологическая природа и значение в организме. Система антигенов эритроцитов Резус. Описание других антигенных систем крови.

реферат [477,9 K], добавлен 18.02.2015

Специфические факторы противовирусного иммунитета и синтез антител к определенному антигену. Клетки памяти и выдача иммунного ответа в форме биосинтеза антител. Распространение инфекционного бронхита птиц и ящера. Культивирование вирусов в клетках.

контрольная работа [568,3 K], добавлен 17.11.2010

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.

источник

Моноклональные антитела, которые можно выработать против практически любого природного антигена, широко используются как в молекулярной биологии и биохимии, так и в медицине.

Эта статья посвящена замечательному достижению современной иммунологии — методу гибридóм. Соматический гибрид нормальной антителообразующей и опухолевой клеток (гибридóма) дает потомство, обладающее бессмертием опухолевой клетки и способностью к синтезу антител, унаследованному от клетки нормальной. Гибридомы продуцируют огромное количество моноклональных антител, обладающих уникальной специфичностью.

Целое поколение лекарств, направленных на терапию и лечение тяжелых заболеваний (таких как рак), основано на моноклональных антителах. Так человек пока неловко, но все более и более уверенно пытается использовать в свое благо замечательное изобретение природы — приобретенный иммунитет. «Биомолекула» публикует статью известного российского ученого Гарри Израилевича Абелева, посвященную истокам технологии моноклональных антител, — методу гибридóм (первый вариант этой статьи был опубликован в Соросовском образовательном журнале [1]). Статья дополнена выпускницей биофака МГУ Олиферовой Жанной, которая рассказывает о современных способах получения моноклональных антител, шагнувших дальше гибридомной методики. — Ред.

При введении в организм животных и человека чужеродных макромолекулярных веществ — белков или полисахаридов (антигенов) в крови появляются защитные белки — антитела, для которых характерна необыкновенная, уникальная специфичность. Каждое антитело узнает только свой антиген, точнее, одну его детерминантную группу. Детерминантная группа состоит из нескольких остатков аминокислот или сахаров (обычно из 6–8), образующих пространственную структуру, характерную для данного белка. В одном белке, состоящем из нескольких сот аминокислот, имеется несколько (5–15) разных детерминант, поэтому к одному белку образуется целое семейство различных по своей специфичности антител. Даже к одной детерминанте образуется целый спектр антител, отличающихся по структуре, степени специфичности и прочности связывания с ней. То же относится и к полисахаридным антигенам, детерминантные группы которых образуются 3–6 остатками моносахаридов.

Читайте также:  Сдать анализ антитела к helicobacter pylori

Таким образом, при введении антигена возникает большое семейство антител, направленных к разным его детерминантам и различающихся также внутри группы антител, направленных к одной и той же детерминанте. В крови иммунизированных животных появляется богатый и уникальный по составу спектр антител, который и обеспечивает их абсолютную специфичность в распознавании данного антигена.

Антитела давно и широко используются для нейтрализации бактериальных токсинов (дифтерийного, столбнячного), змеиных ядов (кобры, гадюки), вирусов, попавших в кровь (особенно эффективно для вируса кори), и для идентификации индивидуальных белков (и других антигенов), находящихся в клетке или сложнейших тканевых экстрактах. Однако иногда требуются не многокомпонентные смеси антител, возникающие в крови в ответ на введение антигена, а отдельные, элементарные составляющие этой смеси, направленные лишь к одной детерминанте антигена и имеющие одни и те же характеристики. Такие антитела бывают нужны как для изучения их собственной природы, так и для практического использования, например для доставки в опухоли токсических веществ.

Очевидно, что путем иммунизации, то есть введением животному индивидуального антигена или только одной его детерминантной группы, это сделать, как правило, невозможно. Почему? Дело в том, что в организме в процессе созревания антителообразующих клеток (АОК) образуется большое количество (миллионы) генетически однородных семейств клеток — клонов, каждый из которых специализируется на синтезе только одного варианта антител, и в этом причина большого разнообразия антител, индуцируемых даже одним антигеном. Таких клонов много больше, чем требуется антител для распознавания любого, случайно взятого антигена. Антиген, попадая в организм, стимулирует размножение тех клонов, которые продуцируют антитела к его детерминантам.

Казалось бы, выход прост: надо вырастить отдельные клоны антителообразующих клеток in vitro — в культуре тканей — и они будут продуцировать моноклональные антитела, то есть антитела одной строго определенной специфичности, продукт одного клона. Но и это оказалось невозможным: нормальные клетки смертны, вскоре после высаживания в культуру они погибают. Дело не доходит до образования клонов АОК. Добавление в культуру факторов роста несколько продлевает их жизнь, но тоже не решает проблемы.

Путь решения проблемы неожиданно указали злокачественные опухоли. Уже давно известны опухоли у человека — плазмоцитомы, вырабатывающие и секретирующие в кровь иммуноглобулины, по структуре своей неотличимые от антител. Причем каждое такое «антитело» слегка отличалось от другого, вырабатываемого другой плазмоцитомой. Образовывалась как бы коллекция случайных антител к неизвестным антигенам. Когда накопились сотни таких «антител», и они были испытаны с сотнями наугад взятых антигенов, оказалось, что в этой коллекции обнаружились специфически реагирующие пары «антиген—антитело».

Почему именно опухоли указали на возможность получения моноклональных антител? Есть несколько причин, и все они коренятся в самой природе опухолевой клетки. Она всегда (или почти всегда) сохраняет свойства и функции клетки, из которой произошла. Плазмоцитома происходит из «юных» плазматических клеток, то есть как раз из тех клеток, которые синтезируют антитела. Это свойство сохраняется в опухолях, возникших из соответствующих клеток. Очень важной особенностью опухолей является их возникновение из одной генетически измененной (мутантной) клетки. Поэтому опухоль возникает и развивается как клон, в нашем случае как клон иммуноглобулинобразующих клеток. Причем они образуют строго однородный по всем свойствам моноклональный иммуноглобулин.

Нормальные плазматические клетки (или их предшественники — лимфоциты) смертны, их срок жизни — несколько дней. Опухоль, и в этом ее принципиальное отличие от нормальных предшественников, бессмертна (См. также: «Бессмертные клетки Генриетты Лакс»). Ее можно культивировать в пробирке или пересаживать от одного животного другому неограниченное число раз и в течение неограниченного времени. В отличие от нормальной ткани опухоль автономна; организм «хозяина» неспособен (за очень редкими исключениями) остановить неограниченный рост злокачественного опухолевого клона. Плазмоцитомы возникают не только спонтанно, то есть непредсказуемо: их можно довольно легко индуцировать у мышей и крыс и получить бессмертный, неограниченно растущий, перевиваемый клон клеток, продуцирующих иммуноглобулины, иногда обладающие специфичностью антител, причем антител моноклональных. Вполне естественно было желание иммунологов научиться получать плазмоцитомы, продуцирующие антитела заданной специфичности. Для этого мышей вначале интенсивно иммунизировали, а затем индуцировали у них плазмоцитомы, чтобы получить опухоли и из тех клонов, которые производили антитела к антигенам, использованным для иммунизации, но это практически не удавалось.

Слишком редки были совпадения. Тогда попробовали индуцировать опухоли антителообразующих клеток опухолеродными вирусами. Результаты были лучше, однако создать простой и универсальный метод получения моноклональных антител на этом пути также не оказалось возможным.

Успех пришел, как всегда, неожиданно, как побочный продукт исследования, имевшего иные цели. В начале 70-х годов молодой немецкий иммунолог Жорж Кёлер, получивший стипендию для работы в знаменитом Базельском институте иммунологии, заинтересовался вопросом о генетической изменчивости антител. В то время можно было ожидать, что антитела мутируют (генетически изменяются) с бóльшей частотой, чем другие белки. Для исследования надо было изолировать клон АОК, продуцирующий антитела определенной специфичности, получить из него стабильную клеточную линию, поддерживаемую в пробирке (в культуре), и проследить, с какой частотой появятся там генетически измененные варианты. Для реализации проекта Кёлер поехал в Англию, в лабораторию Сезара Мильштейна, изучавшего клоны плазмоцитом, и они вместе разработали оригинальный подход к этой проблеме: решили получить гибрид нормальной АОК и опухолевой клетки. В случае успеха такой гибрид унаследовал бы от нормальной клетки способность к синтезу антител, а от опухолевой — бессмертие и способность к неограниченному и бесконтрольному росту. Это им удалось осуществить.

Методы гибридизации соматических (то есть не половых) клеток к тому времени были хорошо известны и широко применялись для разных целей. Для этого использовали вирус, способствующий слиянию клеток. Разнородные клетки, у которых слились оболочки, образовывали двуядерные гибриды, которые сохраняли способность к клеточным делениям. В процессе клеточного деления хромосомы обоих ядер перемешивались и образовывали общее ядро. Таким образом, возникал истинный гибрид, потомок двух соматических клеток, или гибридóма. Гибридому можно получить и между нормальной АОК и опухолевой, плазмоцитомной клеткой. Плазмоцитома была взята потому, что она больше всего соответствовала АОК по типу дифференцировки: весь ее синтетический аппарат был настроен на синтез иммуноглобулинов. Проблема заключалась в том, как отделить заданную гибридому от присутствующих в системе отдельных неслившихся клеток и от гибридов иного состава или иной специфичности, чем требуемые.

Для достижения этой цели авторы разработали специальную схему, использующую отбор клеток в селектирующей среде. Прежде всего был получен особый мутант мышиной плазмоцитомы, рост которого можно было контролировать составом питательной среды. Для получения мутанта использовали особенности синтеза нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), имеющихся во всех клетках и необходимых для их существования. Известно, что имеются два пути синтеза предшественников нуклеиновых кислот: основной и резервный. Основной — это путь новообразования нуклеотидов (звеньев, входящих в состав нуклеиновых кислот). Этот путь включает несколько этапов и блокируется противоопухолевым препаратом аминоптерином (А). Однако клетки не гибнут от этого препарата, поскольку обладают резервным путем — способностью синтезировать нуклеотиды и нуклеиновые кислоты, реутилизируя продукты распада ранее синтезированных нуклеиновых кислот: гипоксантина (Г) и тимидина (Т). Добавление Г и Т в питательную среду, содержащую А, снимает токсический эффект последнего.

Для селекции гибридом надо было получить мутант плазмоцитомы, не способный пользоваться резервным путем и, следовательно, погибающий в среде, содержащей Г, A и T (ГАТ-среда). Такой мутант получили путем добавления в среду токсических аналогов Г и Т. Все клетки, способные усваивать Г и Т, включали их токсичные аналоги и погибали. Выживали лишь те редкие мутанты, которые были неспособны усваивать Г и Т, то есть были лишены резервного пути. Из потомства этих клеток дополнительно отбирали еще и такие мутанты, которые утратили способность к синтезу собственных иммуноглобулинов. Теперь все было готово для получения гибридом, то есть гибридов нормальных АОК и плазмоцитомных клеток (рис. 1).

Рисунок 1. Схема получения гибридом. Условные обозначения: А, В, С — многокомпонентная смесь антигенов, использованная для иммунизации; АОК — антителообразующие клетки селезенки; Пл — клетки плазмоцитомы, не растущие в селективной ГАТ-среде; ПЭГ — полиэтиленгликоль; ГАТ — среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин, тимидин; анти-А, анти-В, анти-С — моноклональные антитела соответственно к А-, В-, С-антигенам.

Мышей интенсивно иммунизировали определенным материалом — белком, бактериальной клеткой или клеткой животного происхождения. Когда в их крови появлялись антитела, у них брали селезенку и лимфатические узлы (места скопления АОК), и из них готовили взвесь клеток. К ней добавляли в избытке клетки мутантной плазмоцитомы и полиэтиленгликоль (ПЭГ). После короткой инкубации, требующейся для слияния клеток, их отмывали от ПЭГа и помещали в среду, содержащую Г, Т и А (ГАТ-среда). Теперь в системе находились гибриды АОК и АОК, АОК и плазмоцитомы, а также оставшиеся свободными АОК и клетки плазмоцитомы. Из них нужно было отобрать только гибриды АОК и плазмоцитомы. После недолгого (несколько дней) культивирования одиночные АОК, а также гибриды АОК и АОК погибали, так как нормальные клетки смертны и быстро погибают в культуре.

Плазмоцитомные клетки и их гибриды также погибали, так как А блокировал основной путь синтеза предшественников нуклеиновых кислот, а Г и Т их не спасали. Выживали, следовательно, только гибриды АОК и плазматических клеток, так как бессмертие они унаследовали от плазмоцитомы, а резервный путь — от нормальной клетки. Такие гибриды — гибридомы — сохраняли способность синтезировать и секретировать антитела.

Рисунок 2. Иммунофлуоресцентное окрашивание клетки соединительной ткани (фибробласта) моноклональным антителом к тубулину — белку микротрубочек, образующих скелет клетки.

Следующий этап после получения гибридом — клонирование и отбор нужных клонов. Выжившие в ГАТ клетки рассевали в специальные пластиковые планшеты, содержащие обычно 96 лунок емкостью примерно по 0,2 см 3 . В каждую лунку помещали в среднем по 10 гибридомных клеток, которые культивировали в присутствии «кормящих» клеток, не имеющих отношения к гибридомам, но способствующих их росту. После нескольких дней культивирования содержимое каждой лунки проверяли на присутствие антител нужной специфичности. Для этого использовали микрометоды выявления антител к соответствующему антигену. Клетки из лунок, содержащих нужные антитела, клонировали (то есть повторно рассевали по таким же лункам, но из расчета 1 клетка на лунку), вновь культивировали и проверяли на присутствие нужных антител. Процедуру повторяли 1–2 раза. Таким образом, отбирали клоны, продуцирующие антитела только одной нужной специфичности, то есть моноклональные антитела [2]. Полученные клоны можно заморозить при −70 °С и хранить до того, пока они не потребуются. Их можно культивировать и накапливать антитела в культуральной среде, а можно привить мышам (так как гибридомы — это опухолевые клетки), где они будут расти и накапливать колоссальные количества моноклональных антител. От одной мышки можно получить антител не меньше, чем от кролика. Эти антитела не содержат посторонних антител и настолько однородны физико-химически, что могут рассматриваться как чистые химические реактивы.

Рисунок 3. Последовательные срезы через желудок (жел) и пищевод (пищ) мыши, окрашенные двумя моноклональными антителами: 1 — первое моноклональное антитело реагирует с эпителием пищевода и слабее с эпителием желудка; 2 — второе моноклональное антитело реагирует только с эпителием желудка.

Обычные поликлональные антитела давно и широко применяются для определения биологически активных веществ — белков крови и других биологических жидкостей, гормонов, ростовых факторов, клеточных рецепторов, медиаторов воспаления и иммунитета, бактериальных и вирусных антигенов, различных ядов и т.п. Моноклональные антитела из-за высочайшей специфичности, стандартности и технологичности получения успешно вытесняют и заменяют иммунные сыворотки.

Далее гибридомы создают уникальные возможности в аналитических целях: их можно применять как «иммунологический микроскоп» с чрезвычайно высоким разрешением. Так, например, если нужно сравнить две клеточные линии, отличающиеся одним или немногими антигенами, и надо выявить такие антигены, то метод гибридом предоставляет для этого исключительные возможности. Проиммунизировав мышей одной из линий и получив сотни гибридом, продуцирующих антитела к антигенам этой линии, можно найти одну или две с антителами только к данной линии. Размножив такую гибридому в пробирке или вырастив ее на мышах, можно получить огромное количество антител к уникальному антигену (или детерминантной группе), затерянному среди других компонентов клетки подобно иголке в стоге сена. Это будет продукт одного клона. В крови иммунизированного животного среди множества других антител он никак не проявится из-за чисто количественных отношений. Благодаря же гибридомам его можно не только обнаружить, но и вывести в линию и получить любое количество соответствующих антител. С помощью гибридом можно обнаружить антигены, характерные для опухолей определенных тканей, получить к ним антитела и использовать их для диагностики и типирования опухолей. Такие моноклональные антитела нашли широкое применение в онкологической клинике. Наконец, во всем мире ведутся активные исследования по использованию моноклональных антител в качестве специфических переносчиков токсических веществ в опухолевые клетки. Пока же с помощью моноклональных антител в опухоль и ее метастазы доставляются радиоактивные вещества, позволяющие обнаружить небольшие узелки опухоли по локализации в них радиоактивности.

Читайте также:  Сдать анализ антитела к рецепторам ттг

Гибридомы сыграли и продолжают играть огромную роль в фундаментальной и прикладной иммунологии. Они созданы на основе клонально-селекционной теории иммунитета [3] и явились самым ярким и окончательным доказательством этой теории. Гибридомы сделали реальностью предполагаемые клоны антителообразующих клеток и позволили даже обнаружить их существование в организме до введения соответствующего антигена. Гибридомы революционизировали иммунологическую промышленность и создали в ней совершенно новые области. Благодаря гибридомам возникли новые методы диагностики многих заболеваний и открылись новые пути для изучения злокачественных опухолей. И хотя гибридомы скорее относятся к гениальным изобретениям, а не к открытиям, они были отмечены в 1984 году Нобелевской премией «за открытие и разработку принципов выработки моноклональных антител с помощью гибридом». Если бы Кёлер и Мильштейн запатентовали свой метод, они вскоре бы стали миллиардерами, так как все, кто использовал бы гибридомы в коммерческих целях, должны были бы платить за право пользоваться патентом. Авторы гибридом, несомненно, понимали это, но в интересах развития науки не пошли на такой шаг. Метод гибридом беспрепятственно вошел во все сферы иммунологии, и сами авторы всемерно способствовали этому, предоставляя свою клеточную линию плазмоцитомы для исследований всем желающим. И первые гибридомы в нашей стране, полученные в 1979–1980 годах, были созданы на основе клеток, ведущих происхождение из лаборатории этих авторов и с их любезного разрешения.

Первоначально статья была опубликована в Соросовском образовательном журнале [1], позже — на сайте автора.

Автор дополнительной главы — Жанна Олиферова.

В 1975 году, когда Кёлер и Мильштейн опубликовали статью о методе получения гибридом [4] и предположили, что этот метод может быть использован в медицине и промышленности, мало кто верил в возможность практического применения моноклональных антител. Как ни курьёзно это сейчас звучит, в ответе, полученном Мильштейном из национальной корпорации по исследованиям и разработкам в 1976 году, была фраза: «Нам, несомненно, трудно сейчас определить непосредственные практические применения [метода гибридом], которые имели бы коммерческий потенциал. » [5]. В наши дни моноклональные антитела стали одним из необходимых реагентов в биологической лаборатории, а объёмы продаж лекарств, созданных на их основе, превышают миллиарды долларов [6]. Развитие каких технологий сделало возможным такое широкое их применение? Этот раздел статьи посвящен истории создания популярного современного метода получения моноклональных антител, который пришёл на смену технологии гибридом, и виртуозному применению синтетических моноклональных антител для решения научных проблем.

Описанный выше метод гибридом позволил получать неограниченное количество моноклональных антител, специфичных к одной детерминантной группе. Их широкое применение в медицине и иммунологии поставило новые задачи:

  1. Мышиные антитела плохо подходят для использования в клинической практике — они вызывают иммунный ответ в организме человека точно так же, как введённый антиген приводит к выработке антител у мышей, из-за чего они быстро удаляются из организма. Стремление создать полностью человеческие антитела для клинической практики стало стимулом для разработки новых технологий.
  2. Иммунизация — необходимое условие для получения гибридомы, но не все молекулы могут легко активировать АОК. Например, они могут быть слишком токсичны для введения мышам. Каждая гибридома производит антитело только к одной детерминанте, но не всегда можно выбрать антитела с необходимой специфичностью к нужному белку даже из большого количества гибридом. Например, у исследователя могут быть такие требования к антителам: специфически связываться только с одним из двух похожих белков или узнавать только одну конформацию белка. Получить такие антитела при помощи метода гибридом очень трудно, потому что при иммунизации антитела могут вырабатываться к антигенным детерминантам, которые одинаковы у двух белков, так как они расположены на поверхности и более доступны для связывания антител. Требовался новый метод, который бы позволил получать антитела нужной аффинности и специфичности, не прибегая к иммунизации мышей.

Появление такого метода стало возможном благодаря развитию нескольких научных направлений. Прежде всего этому способствовал прогресс в понимании структуры и функции антител. Какой механизм обусловливает высокую аффинность и специфичность антител, которые производит гибридома? Во время дифференцирования B-лимфоцитов (в процессе соматической генетической рекомбинации) нуклеотидная последовательность гена, кодирующего вариабельный домен B-клеточного рецептора, собирается из нескольких сегментов (рис. 4). Эта последовательность уникальна у каждой B-клетки, как и рецепторы на её поверхности. Когда B-клетка узнаёт свой антиген, она активируется и становится АОК, часть из которых сразу начинает производить антитела низкой аффинности. Рецепторы других АОК проходят процесс аффинного созревания, в результате которого аффинность и специфичность рецептора АОК, а, следовательно, и антител, повышается.

Рисунок 4. Строение антител. Каждое антитело состоит из двух тяжёлых (Heavy) и двух легких (Light) цепей. Тяжелые цепи образованы вариабельным доменом (Variable Heavy) и тремя константными доменами (Constant Heavy 1, CH2, CH3). Лёгкие цепи содержат один вариабельный (Variable Light) и один константный (Constant Light) домен. Один вариабельный и один константный домен, соединённые дисульфидной связью, составляют Fab-фрагмент.
Сайт связывания антигена образован вариабельными доменами одной тяжёлой и одной лёгкой цепи. Участок антигена, который распознается антителом, называется эпитопом. Взаимодействующий с ним фрагмент поверхности антитела называют паратопом. Справа на рисунке показан вид «сверху» на паратоп антитела, специфичного к трансмембранному белку вируса иммунодефицита человека. Паратоп образован участками, определяющими комплементарность (complementarity-determining regions, CDR) вариабельных доменов. Каждый вариабельный домен содержит три таких CDR-участка, относящихся к тяжелой цепи ( CDRH1 , CDRH2 , CDRH3 ), и три — к легкой ( CDRL1 , CDRL2 , CDRL3 ).

Аффинное созревание основано на соматической гипермутации, в процессе которой в последовательности вариабельных доменов рецепторов специальные белки вносят 1–5 мутаций на каждое деление клетки. Большинство мутаций приводит к тому, что B-клетка перестает узнавать антиген и погибает. Редкие мутации повышают аффинность рецептора к антигену (такие мутации накапливаются в CDR-участках), и B-клетки, несущие такие рецепторы, выживают, размножаются и производят антитела с высокой аффинностью и специфичностью [7], [8]. К сожалению, этот процесс ещё недостаточно хорошо изучен, чтобы его можно было контролировать в пробирке и таким образом получать антитела с нужной специфичностью.

Развитие методов генной инженерии привело к появлению новых возможностей: вариабельные и константные участки генов, кодирующих антитела, можно комбинировать в пробирке, вносить в них мутации, отбирать необходимые варианты и экспрессировать в бактериях. Так можно получать антитела с нужными свойствами, не иммунизируя мышей. Для того чтобы это стало реальностью, сначала надо было создать библиотеки вариабельных доменов антител. Начало этому было положено в 1989 году, когда соответствующие гены были выделены из пяти гибридом и из активированных клеток селезёнки иммунизированных мышей. Эти гены были клонированы, и были определены их нуклеотидные последовательности. В настоящее время для создания библиотек используют вариабельные домены наивных (неактивированных) лимфоцитов мышей или человека и даже комбинируют фрагменты природных вариабельных доменов с синтезированными человеком [9].

В 1988 году Fab-фрагмент антитела впервые был экспрессирован в бактерии. Чтобы создавать антитела без использования гибридом, оставалось решить последнюю задачу: физически связать между собой антитело и кодирующий его ген, тогда выбрав из библиотеки антитело, специфичное к данной молекуле, можно клонировать его ген для экспрессии в бактерии и получать нужное количество антител. В 1990 году Г. Винтер и соавторы встроили в геном бактериофага нуклеотидную последовательность Fab-фрагмента антитела, объединив его с частью гена поверхностного белка III этого фага [10]. Это позволило экспрессировать на поверхности каждой вирусной частицы несколько копий этого гибридного белка, сохраняющего специфичность к своему антигену, — а значит, можно было проводить селекцию нужного антитела из фаг-дисплейной библиотеки (рис. 5). Один раунд селекции может увеличить частоту фага, специфичного к данному антигену, в 1000 раз. За несколько раундов можно из большой популяции выделить редкие фаги, специфичные к данному антигену, извлечь из них ДНК, определить нуклеотидную последовательность и клонировать для получения антител в бактерии.

Рисунок 5. Фаг-дисплейные библиотеки. Бактериофаги, несущие миллионы различных фрагментов антител, наносят на колонку, содержащую нужный антиген (1). После отмывания ненужных фагов (2), те, которые связывают данный антиген (3), снимают с колонки и размножают в бактериях (4). Нуклеотидная последовательность отобранных фагов может быть модифицирована (5), после чего мутированные фаги размножают в бактериях (6) и повторяют процесс селекции (7).

Кристаллографические структуры комплексов антиген—антитело позволили понять принципы организации, стоящие за кажущимся бесконечным разнообразием природных антител [11], [12]. Например, за исключением CDR-участков, структура антител довольно консервативна: известно всего несколько десятков различных структур, некоторые из которых более стабильны и встречаются в природных антителах чаще. При создании современных фаг-дисплейных библиотек выбирается одна наиболее стабильная структура вариабельных доменов тяжёлой и легкой цепи, разнообразие аминокислотных остатков CDR-участков создаётся искусственно [12]. Анализ природных антиген-связывающих сайтов антител выявил, что наиболее часто непосредственно взаимодействуют с поверхностью антигена аминокислотные остатки тирозин (Tyr) и серин (Ser), поэтому первые библиотеки синтетических антител получали, варьируя именно эти остатки в ключевых позициях CDR. В последующих поколениях библиотек начали варьировать также остатки, которые не взаимодействуют с поверхностью антигена непосредственно, но влияют на конформацию CDR-участков. Современные библиотеки содержат более 10 миллиардов фрагментов антител с уникальной специфичностью [12].

Пример успешного применения фаг-дисплейных библиотек — создание моноклональных антител, специфичных к различным конформациям белка убиквитина [13], [14]. В клетке встречаются полимеры убиквитина, связанные через боковые цепи разных остатков лизина (Lys). Lys48-связанные полимеры «помечают» белки, предназначенные для деградации в протеасомах, а Lys63-связанные цепи играют важную роль во многих клеточных процессах, — например, способствуют образованию сигнальных платформ рецепторов, включая рецептор фактора некроза опухолей 1 и рецептор интерлейкина 1 (ИЛ-1) (рис. 6). Для исследования убиквитиновых модификаций применялись дорогостоящие и трудоёмкие методы (такие как масс-спектроскопия), которые не позволяли следить за их быстрыми изменениями. Моноклональные антитела, специфично узнающие разные конформации полимеров убиквитина, стали бы незаменимым реагентом для исследования многих клеточных процессов. Долгое время попытки получить такие антитела были безуспешны.

Рисунок 6. Роль К63- и К48-связанных полимеров убиквитина в передаче сигнала от рецептора фактора некроза опухолей. Слева: К48- (вверху) и К63-связанный убиквитин (внизу) и их условные обозначения. Справа: Адаптерный белок RIP1 связывается с активированным рецептором, модификация К63-убиквитином важна для образования сигнальной платформы (5 мин). Через 10 мин деубиквитиназа А20 заменяет К63-связанные полимеры убиквитина на К48-связанные полимеры, что приводит к деградации сигнального комплекса. Антитела, узнающие две конформации убиквитина, показаны разными цветами.

Вишва Диксит и соавторы использовали фаг-дисплейные библиотеки для получения специфичных антител к Lys48- и Lys63-связанным полимерам убиквитина [15]. После четырех раундов из библиотеки были отобраны фрагменты антител, которые не связывались с моноубиквитином и были специфичны исключительно к Lys63- или Lys48-связанным полимерам, причем с наномолярной аффинностью. Выбранные антитела экспрессировали в бактериях и определили их аминокислотные последовательности. У антител к Lys48-связанным полимерам убиквитина вариабельность аминокислотных остатков была сконцентрирована в CDRH3, поэтому для повышения их аффинности в этот же участок внесли дополнительные мутации. Полученные после повторного отбора антитела к Lys48-связанным полимерам обладали очень высокой аффинностью (1,2 нМ).

Оптимизация антител к Lys63-связанным цепям потребовала, напротив, значительных усилий. Сначала, перед повторным отбором, мутации были внесены в CDRH1 и CDRH2, но аффинность полученных антител была на порядок ниже, чем у антител к Lys48-связанным цепям убиквитина. Для дальнейшей оптимизации была получена пространственная структура К63-связанных димеров убиквитина в комплексе с антителами, которая показала, что значительная часть паратопа составлена аминокислотными остатками CDRH2 и CDRL2, в которые и были внесены дополнительные мутации. Отобранные антитела имели высокое сродство к Lys63-связанному полимеру (6–7 нМ) и не связывались с другими конформациями убиквитина. Кристаллическая структура нового комплекса показала, что мутированные аминокислотные остатки не контактируют с поверхностью убиквитина, а повышение специфичности объясняется улучшением электростатической совместимости между поверхностями антигена и антитела.

Полученные антитела могут быть использованы для иммунопреципитации белков, модифицированных различными полимерами убиквитина, из клеточных лизатов, или для иммуннофлуоресцентного окрашивания клеток, что позволяет получить информация о пространственной организации модифицированных белков. С их помощью исследователям удалось проследить за быстрыми изменениями модификаций адаптерных белков в сигнальном каскаде, инициированном рецептором фактора некроза опухолей (ФНО) на поверхности клетки. Через пять минут после связывания ФНО со своим рецептором, киназа RIP1, модифицировнная К63-связанными полимерами убиквитина, связывается с рецептором. К63-полимеры убиквитина необходимы для взаимодействия с другими белками и передачи сигнала. Уже через 10 минут деубиквитиназа А20 начинает заменять К63- на К48-полимеры убиквитина, что приводит к деградации сигнального комплекса и прекращению сигнала (рис. 6). Такая же замена Lys63- на Lys48-связанные полимеры убиквитина происходит и во время передачи сигнала от других рецепторов, таких как рецептор ИЛ-1 и некоторых Толл-рецепторов. Время передачи сигнала варьирует в зависимости от рецептора: в случае рецептора ИЛ-1 замена K63→K48 происходит только через 30–60 минут после связывания лиганда [15].

Приведённый пример показывает, что развитие современных методов производства моноклональных антител превратило их в чрезвычайно точный научный инструмент, с помощью которого будет сделано ещё немало интересных открытий.

источник