Меню Рубрики

Методы анализа основанные на моноклональных антителах

Моноклональные антитела, которые можно выработать против практически любого природного антигена, широко используются как в молекулярной биологии и биохимии, так и в медицине.

Эта статья посвящена замечательному достижению современной иммунологии — методу гибридóм. Соматический гибрид нормальной антителообразующей и опухолевой клеток (гибридóма) дает потомство, обладающее бессмертием опухолевой клетки и способностью к синтезу антител, унаследованному от клетки нормальной. Гибридомы продуцируют огромное количество моноклональных антител, обладающих уникальной специфичностью.

Целое поколение лекарств, направленных на терапию и лечение тяжелых заболеваний (таких как рак), основано на моноклональных антителах. Так человек пока неловко, но все более и более уверенно пытается использовать в свое благо замечательное изобретение природы — приобретенный иммунитет. «Биомолекула» публикует статью известного российского ученого Гарри Израилевича Абелева, посвященную истокам технологии моноклональных антител, — методу гибридóм (первый вариант этой статьи был опубликован в Соросовском образовательном журнале [1]). Статья дополнена выпускницей биофака МГУ Олиферовой Жанной, которая рассказывает о современных способах получения моноклональных антител, шагнувших дальше гибридомной методики. — Ред.

При введении в организм животных и человека чужеродных макромолекулярных веществ — белков или полисахаридов (антигенов) в крови появляются защитные белки — антитела, для которых характерна необыкновенная, уникальная специфичность. Каждое антитело узнает только свой антиген, точнее, одну его детерминантную группу. Детерминантная группа состоит из нескольких остатков аминокислот или сахаров (обычно из 6–8), образующих пространственную структуру, характерную для данного белка. В одном белке, состоящем из нескольких сот аминокислот, имеется несколько (5–15) разных детерминант, поэтому к одному белку образуется целое семейство различных по своей специфичности антител. Даже к одной детерминанте образуется целый спектр антител, отличающихся по структуре, степени специфичности и прочности связывания с ней. То же относится и к полисахаридным антигенам, детерминантные группы которых образуются 3–6 остатками моносахаридов.

Таким образом, при введении антигена возникает большое семейство антител, направленных к разным его детерминантам и различающихся также внутри группы антител, направленных к одной и той же детерминанте. В крови иммунизированных животных появляется богатый и уникальный по составу спектр антител, который и обеспечивает их абсолютную специфичность в распознавании данного антигена.

Антитела давно и широко используются для нейтрализации бактериальных токсинов (дифтерийного, столбнячного), змеиных ядов (кобры, гадюки), вирусов, попавших в кровь (особенно эффективно для вируса кори), и для идентификации индивидуальных белков (и других антигенов), находящихся в клетке или сложнейших тканевых экстрактах. Однако иногда требуются не многокомпонентные смеси антител, возникающие в крови в ответ на введение антигена, а отдельные, элементарные составляющие этой смеси, направленные лишь к одной детерминанте антигена и имеющие одни и те же характеристики. Такие антитела бывают нужны как для изучения их собственной природы, так и для практического использования, например для доставки в опухоли токсических веществ.

Очевидно, что путем иммунизации, то есть введением животному индивидуального антигена или только одной его детерминантной группы, это сделать, как правило, невозможно. Почему? Дело в том, что в организме в процессе созревания антителообразующих клеток (АОК) образуется большое количество (миллионы) генетически однородных семейств клеток — клонов, каждый из которых специализируется на синтезе только одного варианта антител, и в этом причина большого разнообразия антител, индуцируемых даже одним антигеном. Таких клонов много больше, чем требуется антител для распознавания любого, случайно взятого антигена. Антиген, попадая в организм, стимулирует размножение тех клонов, которые продуцируют антитела к его детерминантам.

Казалось бы, выход прост: надо вырастить отдельные клоны антителообразующих клеток in vitro — в культуре тканей — и они будут продуцировать моноклональные антитела, то есть антитела одной строго определенной специфичности, продукт одного клона. Но и это оказалось невозможным: нормальные клетки смертны, вскоре после высаживания в культуру они погибают. Дело не доходит до образования клонов АОК. Добавление в культуру факторов роста несколько продлевает их жизнь, но тоже не решает проблемы.

Путь решения проблемы неожиданно указали злокачественные опухоли. Уже давно известны опухоли у человека — плазмоцитомы, вырабатывающие и секретирующие в кровь иммуноглобулины, по структуре своей неотличимые от антител. Причем каждое такое «антитело» слегка отличалось от другого, вырабатываемого другой плазмоцитомой. Образовывалась как бы коллекция случайных антител к неизвестным антигенам. Когда накопились сотни таких «антител», и они были испытаны с сотнями наугад взятых антигенов, оказалось, что в этой коллекции обнаружились специфически реагирующие пары «антиген—антитело».

Почему именно опухоли указали на возможность получения моноклональных антител? Есть несколько причин, и все они коренятся в самой природе опухолевой клетки. Она всегда (или почти всегда) сохраняет свойства и функции клетки, из которой произошла. Плазмоцитома происходит из «юных» плазматических клеток, то есть как раз из тех клеток, которые синтезируют антитела. Это свойство сохраняется в опухолях, возникших из соответствующих клеток. Очень важной особенностью опухолей является их возникновение из одной генетически измененной (мутантной) клетки. Поэтому опухоль возникает и развивается как клон, в нашем случае как клон иммуноглобулинобразующих клеток. Причем они образуют строго однородный по всем свойствам моноклональный иммуноглобулин.

Нормальные плазматические клетки (или их предшественники — лимфоциты) смертны, их срок жизни — несколько дней. Опухоль, и в этом ее принципиальное отличие от нормальных предшественников, бессмертна (См. также: «Бессмертные клетки Генриетты Лакс»). Ее можно культивировать в пробирке или пересаживать от одного животного другому неограниченное число раз и в течение неограниченного времени. В отличие от нормальной ткани опухоль автономна; организм «хозяина» неспособен (за очень редкими исключениями) остановить неограниченный рост злокачественного опухолевого клона. Плазмоцитомы возникают не только спонтанно, то есть непредсказуемо: их можно довольно легко индуцировать у мышей и крыс и получить бессмертный, неограниченно растущий, перевиваемый клон клеток, продуцирующих иммуноглобулины, иногда обладающие специфичностью антител, причем антител моноклональных. Вполне естественно было желание иммунологов научиться получать плазмоцитомы, продуцирующие антитела заданной специфичности. Для этого мышей вначале интенсивно иммунизировали, а затем индуцировали у них плазмоцитомы, чтобы получить опухоли и из тех клонов, которые производили антитела к антигенам, использованным для иммунизации, но это практически не удавалось.

Слишком редки были совпадения. Тогда попробовали индуцировать опухоли антителообразующих клеток опухолеродными вирусами. Результаты были лучше, однако создать простой и универсальный метод получения моноклональных антител на этом пути также не оказалось возможным.

Успех пришел, как всегда, неожиданно, как побочный продукт исследования, имевшего иные цели. В начале 70-х годов молодой немецкий иммунолог Жорж Кёлер, получивший стипендию для работы в знаменитом Базельском институте иммунологии, заинтересовался вопросом о генетической изменчивости антител. В то время можно было ожидать, что антитела мутируют (генетически изменяются) с бóльшей частотой, чем другие белки. Для исследования надо было изолировать клон АОК, продуцирующий антитела определенной специфичности, получить из него стабильную клеточную линию, поддерживаемую в пробирке (в культуре), и проследить, с какой частотой появятся там генетически измененные варианты. Для реализации проекта Кёлер поехал в Англию, в лабораторию Сезара Мильштейна, изучавшего клоны плазмоцитом, и они вместе разработали оригинальный подход к этой проблеме: решили получить гибрид нормальной АОК и опухолевой клетки. В случае успеха такой гибрид унаследовал бы от нормальной клетки способность к синтезу антител, а от опухолевой — бессмертие и способность к неограниченному и бесконтрольному росту. Это им удалось осуществить.

Методы гибридизации соматических (то есть не половых) клеток к тому времени были хорошо известны и широко применялись для разных целей. Для этого использовали вирус, способствующий слиянию клеток. Разнородные клетки, у которых слились оболочки, образовывали двуядерные гибриды, которые сохраняли способность к клеточным делениям. В процессе клеточного деления хромосомы обоих ядер перемешивались и образовывали общее ядро. Таким образом, возникал истинный гибрид, потомок двух соматических клеток, или гибридóма. Гибридому можно получить и между нормальной АОК и опухолевой, плазмоцитомной клеткой. Плазмоцитома была взята потому, что она больше всего соответствовала АОК по типу дифференцировки: весь ее синтетический аппарат был настроен на синтез иммуноглобулинов. Проблема заключалась в том, как отделить заданную гибридому от присутствующих в системе отдельных неслившихся клеток и от гибридов иного состава или иной специфичности, чем требуемые.

Для достижения этой цели авторы разработали специальную схему, использующую отбор клеток в селектирующей среде. Прежде всего был получен особый мутант мышиной плазмоцитомы, рост которого можно было контролировать составом питательной среды. Для получения мутанта использовали особенности синтеза нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), имеющихся во всех клетках и необходимых для их существования. Известно, что имеются два пути синтеза предшественников нуклеиновых кислот: основной и резервный. Основной — это путь новообразования нуклеотидов (звеньев, входящих в состав нуклеиновых кислот). Этот путь включает несколько этапов и блокируется противоопухолевым препаратом аминоптерином (А). Однако клетки не гибнут от этого препарата, поскольку обладают резервным путем — способностью синтезировать нуклеотиды и нуклеиновые кислоты, реутилизируя продукты распада ранее синтезированных нуклеиновых кислот: гипоксантина (Г) и тимидина (Т). Добавление Г и Т в питательную среду, содержащую А, снимает токсический эффект последнего.

Для селекции гибридом надо было получить мутант плазмоцитомы, не способный пользоваться резервным путем и, следовательно, погибающий в среде, содержащей Г, A и T (ГАТ-среда). Такой мутант получили путем добавления в среду токсических аналогов Г и Т. Все клетки, способные усваивать Г и Т, включали их токсичные аналоги и погибали. Выживали лишь те редкие мутанты, которые были неспособны усваивать Г и Т, то есть были лишены резервного пути. Из потомства этих клеток дополнительно отбирали еще и такие мутанты, которые утратили способность к синтезу собственных иммуноглобулинов. Теперь все было готово для получения гибридом, то есть гибридов нормальных АОК и плазмоцитомных клеток (рис. 1).

Рисунок 1. Схема получения гибридом. Условные обозначения: А, В, С — многокомпонентная смесь антигенов, использованная для иммунизации; АОК — антителообразующие клетки селезенки; Пл — клетки плазмоцитомы, не растущие в селективной ГАТ-среде; ПЭГ — полиэтиленгликоль; ГАТ — среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин, тимидин; анти-А, анти-В, анти-С — моноклональные антитела соответственно к А-, В-, С-антигенам.

Мышей интенсивно иммунизировали определенным материалом — белком, бактериальной клеткой или клеткой животного происхождения. Когда в их крови появлялись антитела, у них брали селезенку и лимфатические узлы (места скопления АОК), и из них готовили взвесь клеток. К ней добавляли в избытке клетки мутантной плазмоцитомы и полиэтиленгликоль (ПЭГ). После короткой инкубации, требующейся для слияния клеток, их отмывали от ПЭГа и помещали в среду, содержащую Г, Т и А (ГАТ-среда). Теперь в системе находились гибриды АОК и АОК, АОК и плазмоцитомы, а также оставшиеся свободными АОК и клетки плазмоцитомы. Из них нужно было отобрать только гибриды АОК и плазмоцитомы. После недолгого (несколько дней) культивирования одиночные АОК, а также гибриды АОК и АОК погибали, так как нормальные клетки смертны и быстро погибают в культуре.

Плазмоцитомные клетки и их гибриды также погибали, так как А блокировал основной путь синтеза предшественников нуклеиновых кислот, а Г и Т их не спасали. Выживали, следовательно, только гибриды АОК и плазматических клеток, так как бессмертие они унаследовали от плазмоцитомы, а резервный путь — от нормальной клетки. Такие гибриды — гибридомы — сохраняли способность синтезировать и секретировать антитела.

Рисунок 2. Иммунофлуоресцентное окрашивание клетки соединительной ткани (фибробласта) моноклональным антителом к тубулину — белку микротрубочек, образующих скелет клетки.

Следующий этап после получения гибридом — клонирование и отбор нужных клонов. Выжившие в ГАТ клетки рассевали в специальные пластиковые планшеты, содержащие обычно 96 лунок емкостью примерно по 0,2 см 3 . В каждую лунку помещали в среднем по 10 гибридомных клеток, которые культивировали в присутствии «кормящих» клеток, не имеющих отношения к гибридомам, но способствующих их росту. После нескольких дней культивирования содержимое каждой лунки проверяли на присутствие антител нужной специфичности. Для этого использовали микрометоды выявления антител к соответствующему антигену. Клетки из лунок, содержащих нужные антитела, клонировали (то есть повторно рассевали по таким же лункам, но из расчета 1 клетка на лунку), вновь культивировали и проверяли на присутствие нужных антител. Процедуру повторяли 1–2 раза. Таким образом, отбирали клоны, продуцирующие антитела только одной нужной специфичности, то есть моноклональные антитела [2]. Полученные клоны можно заморозить при −70 °С и хранить до того, пока они не потребуются. Их можно культивировать и накапливать антитела в культуральной среде, а можно привить мышам (так как гибридомы — это опухолевые клетки), где они будут расти и накапливать колоссальные количества моноклональных антител. От одной мышки можно получить антител не меньше, чем от кролика. Эти антитела не содержат посторонних антител и настолько однородны физико-химически, что могут рассматриваться как чистые химические реактивы.

Рисунок 3. Последовательные срезы через желудок (жел) и пищевод (пищ) мыши, окрашенные двумя моноклональными антителами: 1 — первое моноклональное антитело реагирует с эпителием пищевода и слабее с эпителием желудка; 2 — второе моноклональное антитело реагирует только с эпителием желудка.

Обычные поликлональные антитела давно и широко применяются для определения биологически активных веществ — белков крови и других биологических жидкостей, гормонов, ростовых факторов, клеточных рецепторов, медиаторов воспаления и иммунитета, бактериальных и вирусных антигенов, различных ядов и т.п. Моноклональные антитела из-за высочайшей специфичности, стандартности и технологичности получения успешно вытесняют и заменяют иммунные сыворотки.

Далее гибридомы создают уникальные возможности в аналитических целях: их можно применять как «иммунологический микроскоп» с чрезвычайно высоким разрешением. Так, например, если нужно сравнить две клеточные линии, отличающиеся одним или немногими антигенами, и надо выявить такие антигены, то метод гибридом предоставляет для этого исключительные возможности. Проиммунизировав мышей одной из линий и получив сотни гибридом, продуцирующих антитела к антигенам этой линии, можно найти одну или две с антителами только к данной линии. Размножив такую гибридому в пробирке или вырастив ее на мышах, можно получить огромное количество антител к уникальному антигену (или детерминантной группе), затерянному среди других компонентов клетки подобно иголке в стоге сена. Это будет продукт одного клона. В крови иммунизированного животного среди множества других антител он никак не проявится из-за чисто количественных отношений. Благодаря же гибридомам его можно не только обнаружить, но и вывести в линию и получить любое количество соответствующих антител. С помощью гибридом можно обнаружить антигены, характерные для опухолей определенных тканей, получить к ним антитела и использовать их для диагностики и типирования опухолей. Такие моноклональные антитела нашли широкое применение в онкологической клинике. Наконец, во всем мире ведутся активные исследования по использованию моноклональных антител в качестве специфических переносчиков токсических веществ в опухолевые клетки. Пока же с помощью моноклональных антител в опухоль и ее метастазы доставляются радиоактивные вещества, позволяющие обнаружить небольшие узелки опухоли по локализации в них радиоактивности.

Гибридомы сыграли и продолжают играть огромную роль в фундаментальной и прикладной иммунологии. Они созданы на основе клонально-селекционной теории иммунитета [3] и явились самым ярким и окончательным доказательством этой теории. Гибридомы сделали реальностью предполагаемые клоны антителообразующих клеток и позволили даже обнаружить их существование в организме до введения соответствующего антигена. Гибридомы революционизировали иммунологическую промышленность и создали в ней совершенно новые области. Благодаря гибридомам возникли новые методы диагностики многих заболеваний и открылись новые пути для изучения злокачественных опухолей. И хотя гибридомы скорее относятся к гениальным изобретениям, а не к открытиям, они были отмечены в 1984 году Нобелевской премией «за открытие и разработку принципов выработки моноклональных антител с помощью гибридом». Если бы Кёлер и Мильштейн запатентовали свой метод, они вскоре бы стали миллиардерами, так как все, кто использовал бы гибридомы в коммерческих целях, должны были бы платить за право пользоваться патентом. Авторы гибридом, несомненно, понимали это, но в интересах развития науки не пошли на такой шаг. Метод гибридом беспрепятственно вошел во все сферы иммунологии, и сами авторы всемерно способствовали этому, предоставляя свою клеточную линию плазмоцитомы для исследований всем желающим. И первые гибридомы в нашей стране, полученные в 1979–1980 годах, были созданы на основе клеток, ведущих происхождение из лаборатории этих авторов и с их любезного разрешения.

Первоначально статья была опубликована в Соросовском образовательном журнале [1], позже — на сайте автора.

Автор дополнительной главы — Жанна Олиферова.

В 1975 году, когда Кёлер и Мильштейн опубликовали статью о методе получения гибридом [4] и предположили, что этот метод может быть использован в медицине и промышленности, мало кто верил в возможность практического применения моноклональных антител. Как ни курьёзно это сейчас звучит, в ответе, полученном Мильштейном из национальной корпорации по исследованиям и разработкам в 1976 году, была фраза: «Нам, несомненно, трудно сейчас определить непосредственные практические применения [метода гибридом], которые имели бы коммерческий потенциал. » [5]. В наши дни моноклональные антитела стали одним из необходимых реагентов в биологической лаборатории, а объёмы продаж лекарств, созданных на их основе, превышают миллиарды долларов [6]. Развитие каких технологий сделало возможным такое широкое их применение? Этот раздел статьи посвящен истории создания популярного современного метода получения моноклональных антител, который пришёл на смену технологии гибридом, и виртуозному применению синтетических моноклональных антител для решения научных проблем.

Описанный выше метод гибридом позволил получать неограниченное количество моноклональных антител, специфичных к одной детерминантной группе. Их широкое применение в медицине и иммунологии поставило новые задачи:

  1. Мышиные антитела плохо подходят для использования в клинической практике — они вызывают иммунный ответ в организме человека точно так же, как введённый антиген приводит к выработке антител у мышей, из-за чего они быстро удаляются из организма. Стремление создать полностью человеческие антитела для клинической практики стало стимулом для разработки новых технологий.
  2. Иммунизация — необходимое условие для получения гибридомы, но не все молекулы могут легко активировать АОК. Например, они могут быть слишком токсичны для введения мышам. Каждая гибридома производит антитело только к одной детерминанте, но не всегда можно выбрать антитела с необходимой специфичностью к нужному белку даже из большого количества гибридом. Например, у исследователя могут быть такие требования к антителам: специфически связываться только с одним из двух похожих белков или узнавать только одну конформацию белка. Получить такие антитела при помощи метода гибридом очень трудно, потому что при иммунизации антитела могут вырабатываться к антигенным детерминантам, которые одинаковы у двух белков, так как они расположены на поверхности и более доступны для связывания антител. Требовался новый метод, который бы позволил получать антитела нужной аффинности и специфичности, не прибегая к иммунизации мышей.
Читайте также:  Рассеянный склероз анализы на антитела

Появление такого метода стало возможном благодаря развитию нескольких научных направлений. Прежде всего этому способствовал прогресс в понимании структуры и функции антител. Какой механизм обусловливает высокую аффинность и специфичность антител, которые производит гибридома? Во время дифференцирования B-лимфоцитов (в процессе соматической генетической рекомбинации) нуклеотидная последовательность гена, кодирующего вариабельный домен B-клеточного рецептора, собирается из нескольких сегментов (рис. 4). Эта последовательность уникальна у каждой B-клетки, как и рецепторы на её поверхности. Когда B-клетка узнаёт свой антиген, она активируется и становится АОК, часть из которых сразу начинает производить антитела низкой аффинности. Рецепторы других АОК проходят процесс аффинного созревания, в результате которого аффинность и специфичность рецептора АОК, а, следовательно, и антител, повышается.

Рисунок 4. Строение антител. Каждое антитело состоит из двух тяжёлых (Heavy) и двух легких (Light) цепей. Тяжелые цепи образованы вариабельным доменом (Variable Heavy) и тремя константными доменами (Constant Heavy 1, CH2, CH3). Лёгкие цепи содержат один вариабельный (Variable Light) и один константный (Constant Light) домен. Один вариабельный и один константный домен, соединённые дисульфидной связью, составляют Fab-фрагмент.
Сайт связывания антигена образован вариабельными доменами одной тяжёлой и одной лёгкой цепи. Участок антигена, который распознается антителом, называется эпитопом. Взаимодействующий с ним фрагмент поверхности антитела называют паратопом. Справа на рисунке показан вид «сверху» на паратоп антитела, специфичного к трансмембранному белку вируса иммунодефицита человека. Паратоп образован участками, определяющими комплементарность (complementarity-determining regions, CDR) вариабельных доменов. Каждый вариабельный домен содержит три таких CDR-участка, относящихся к тяжелой цепи ( CDRH1 , CDRH2 , CDRH3 ), и три — к легкой ( CDRL1 , CDRL2 , CDRL3 ).

Аффинное созревание основано на соматической гипермутации, в процессе которой в последовательности вариабельных доменов рецепторов специальные белки вносят 1–5 мутаций на каждое деление клетки. Большинство мутаций приводит к тому, что B-клетка перестает узнавать антиген и погибает. Редкие мутации повышают аффинность рецептора к антигену (такие мутации накапливаются в CDR-участках), и B-клетки, несущие такие рецепторы, выживают, размножаются и производят антитела с высокой аффинностью и специфичностью [7], [8]. К сожалению, этот процесс ещё недостаточно хорошо изучен, чтобы его можно было контролировать в пробирке и таким образом получать антитела с нужной специфичностью.

Развитие методов генной инженерии привело к появлению новых возможностей: вариабельные и константные участки генов, кодирующих антитела, можно комбинировать в пробирке, вносить в них мутации, отбирать необходимые варианты и экспрессировать в бактериях. Так можно получать антитела с нужными свойствами, не иммунизируя мышей. Для того чтобы это стало реальностью, сначала надо было создать библиотеки вариабельных доменов антител. Начало этому было положено в 1989 году, когда соответствующие гены были выделены из пяти гибридом и из активированных клеток селезёнки иммунизированных мышей. Эти гены были клонированы, и были определены их нуклеотидные последовательности. В настоящее время для создания библиотек используют вариабельные домены наивных (неактивированных) лимфоцитов мышей или человека и даже комбинируют фрагменты природных вариабельных доменов с синтезированными человеком [9].

В 1988 году Fab-фрагмент антитела впервые был экспрессирован в бактерии. Чтобы создавать антитела без использования гибридом, оставалось решить последнюю задачу: физически связать между собой антитело и кодирующий его ген, тогда выбрав из библиотеки антитело, специфичное к данной молекуле, можно клонировать его ген для экспрессии в бактерии и получать нужное количество антител. В 1990 году Г. Винтер и соавторы встроили в геном бактериофага нуклеотидную последовательность Fab-фрагмента антитела, объединив его с частью гена поверхностного белка III этого фага [10]. Это позволило экспрессировать на поверхности каждой вирусной частицы несколько копий этого гибридного белка, сохраняющего специфичность к своему антигену, — а значит, можно было проводить селекцию нужного антитела из фаг-дисплейной библиотеки (рис. 5). Один раунд селекции может увеличить частоту фага, специфичного к данному антигену, в 1000 раз. За несколько раундов можно из большой популяции выделить редкие фаги, специфичные к данному антигену, извлечь из них ДНК, определить нуклеотидную последовательность и клонировать для получения антител в бактерии.

Рисунок 5. Фаг-дисплейные библиотеки. Бактериофаги, несущие миллионы различных фрагментов антител, наносят на колонку, содержащую нужный антиген (1). После отмывания ненужных фагов (2), те, которые связывают данный антиген (3), снимают с колонки и размножают в бактериях (4). Нуклеотидная последовательность отобранных фагов может быть модифицирована (5), после чего мутированные фаги размножают в бактериях (6) и повторяют процесс селекции (7).

Кристаллографические структуры комплексов антиген—антитело позволили понять принципы организации, стоящие за кажущимся бесконечным разнообразием природных антител [11], [12]. Например, за исключением CDR-участков, структура антител довольно консервативна: известно всего несколько десятков различных структур, некоторые из которых более стабильны и встречаются в природных антителах чаще. При создании современных фаг-дисплейных библиотек выбирается одна наиболее стабильная структура вариабельных доменов тяжёлой и легкой цепи, разнообразие аминокислотных остатков CDR-участков создаётся искусственно [12]. Анализ природных антиген-связывающих сайтов антител выявил, что наиболее часто непосредственно взаимодействуют с поверхностью антигена аминокислотные остатки тирозин (Tyr) и серин (Ser), поэтому первые библиотеки синтетических антител получали, варьируя именно эти остатки в ключевых позициях CDR. В последующих поколениях библиотек начали варьировать также остатки, которые не взаимодействуют с поверхностью антигена непосредственно, но влияют на конформацию CDR-участков. Современные библиотеки содержат более 10 миллиардов фрагментов антител с уникальной специфичностью [12].

Пример успешного применения фаг-дисплейных библиотек — создание моноклональных антител, специфичных к различным конформациям белка убиквитина [13], [14]. В клетке встречаются полимеры убиквитина, связанные через боковые цепи разных остатков лизина (Lys). Lys48-связанные полимеры «помечают» белки, предназначенные для деградации в протеасомах, а Lys63-связанные цепи играют важную роль во многих клеточных процессах, — например, способствуют образованию сигнальных платформ рецепторов, включая рецептор фактора некроза опухолей 1 и рецептор интерлейкина 1 (ИЛ-1) (рис. 6). Для исследования убиквитиновых модификаций применялись дорогостоящие и трудоёмкие методы (такие как масс-спектроскопия), которые не позволяли следить за их быстрыми изменениями. Моноклональные антитела, специфично узнающие разные конформации полимеров убиквитина, стали бы незаменимым реагентом для исследования многих клеточных процессов. Долгое время попытки получить такие антитела были безуспешны.

Рисунок 6. Роль К63- и К48-связанных полимеров убиквитина в передаче сигнала от рецептора фактора некроза опухолей. Слева: К48- (вверху) и К63-связанный убиквитин (внизу) и их условные обозначения. Справа: Адаптерный белок RIP1 связывается с активированным рецептором, модификация К63-убиквитином важна для образования сигнальной платформы (5 мин). Через 10 мин деубиквитиназа А20 заменяет К63-связанные полимеры убиквитина на К48-связанные полимеры, что приводит к деградации сигнального комплекса. Антитела, узнающие две конформации убиквитина, показаны разными цветами.

Вишва Диксит и соавторы использовали фаг-дисплейные библиотеки для получения специфичных антител к Lys48- и Lys63-связанным полимерам убиквитина [15]. После четырех раундов из библиотеки были отобраны фрагменты антител, которые не связывались с моноубиквитином и были специфичны исключительно к Lys63- или Lys48-связанным полимерам, причем с наномолярной аффинностью. Выбранные антитела экспрессировали в бактериях и определили их аминокислотные последовательности. У антител к Lys48-связанным полимерам убиквитина вариабельность аминокислотных остатков была сконцентрирована в CDRH3, поэтому для повышения их аффинности в этот же участок внесли дополнительные мутации. Полученные после повторного отбора антитела к Lys48-связанным полимерам обладали очень высокой аффинностью (1,2 нМ).

Оптимизация антител к Lys63-связанным цепям потребовала, напротив, значительных усилий. Сначала, перед повторным отбором, мутации были внесены в CDRH1 и CDRH2, но аффинность полученных антител была на порядок ниже, чем у антител к Lys48-связанным цепям убиквитина. Для дальнейшей оптимизации была получена пространственная структура К63-связанных димеров убиквитина в комплексе с антителами, которая показала, что значительная часть паратопа составлена аминокислотными остатками CDRH2 и CDRL2, в которые и были внесены дополнительные мутации. Отобранные антитела имели высокое сродство к Lys63-связанному полимеру (6–7 нМ) и не связывались с другими конформациями убиквитина. Кристаллическая структура нового комплекса показала, что мутированные аминокислотные остатки не контактируют с поверхностью убиквитина, а повышение специфичности объясняется улучшением электростатической совместимости между поверхностями антигена и антитела.

Полученные антитела могут быть использованы для иммунопреципитации белков, модифицированных различными полимерами убиквитина, из клеточных лизатов, или для иммуннофлуоресцентного окрашивания клеток, что позволяет получить информация о пространственной организации модифицированных белков. С их помощью исследователям удалось проследить за быстрыми изменениями модификаций адаптерных белков в сигнальном каскаде, инициированном рецептором фактора некроза опухолей (ФНО) на поверхности клетки. Через пять минут после связывания ФНО со своим рецептором, киназа RIP1, модифицировнная К63-связанными полимерами убиквитина, связывается с рецептором. К63-полимеры убиквитина необходимы для взаимодействия с другими белками и передачи сигнала. Уже через 10 минут деубиквитиназа А20 начинает заменять К63- на К48-полимеры убиквитина, что приводит к деградации сигнального комплекса и прекращению сигнала (рис. 6). Такая же замена Lys63- на Lys48-связанные полимеры убиквитина происходит и во время передачи сигнала от других рецепторов, таких как рецептор ИЛ-1 и некоторых Толл-рецепторов. Время передачи сигнала варьирует в зависимости от рецептора: в случае рецептора ИЛ-1 замена K63→K48 происходит только через 30–60 минут после связывания лиганда [15].

Приведённый пример показывает, что развитие современных методов производства моноклональных антител превратило их в чрезвычайно точный научный инструмент, с помощью которого будет сделано ещё немало интересных открытий.

источник

Моноклональные антитела. Каждый В-лимфоцит и его потомки, образовавшиеся в ре­зультате пролиферации (т.е. клон), способны синтезировать антитела с паратопом строго определенной специфичности. Такие антитела получили название моноклональных. В природ­ных условиях макроорганизма получить моно­клональные антитела практически невозмож­но. Дело в том, что на одну и ту же антигенную детерминанту одновременно реагируют до 100 различных клонов В-лимфоцитов, незначи­тельно различающихся антигенной специфич­ностью рецепторов и, естественно, аффиннос­тью. Поэтому в результате иммунизации даже монодетерминантным антигеном мы всегда получаем поликлональные антитела.

Принципиально получение моноклональных антител выполнимо, если провести пред­варительную селекцию антителопродуцирующих клеток и их клонирование (т.е. выделение отдельных клонов в чистые культуры). Однако задача осложняется тем, что В-лимфоциты, как и другие эукариотические клетки, имеют ограниченную продолжительность жизни и число возможных митотических делений.

Проблема получения моноклональных ан­тител была успешно решена Д. Келлером и Ц. Милыптейном. Авторы получили гибридные клетки путем слияния иммун­ных В-лимфоцитов с миеломной (опухоле­вой) клеткой. Полученные гибриды обладали специфическими свойствами антителопродуцента и «бессмертием» раковотрансформированной клетки. Такой вид клеток полу­чил название гибридом. Гибридома хорошо размножается в искусственных питательных средах и в организме животных и в неогра­ниченном количестве вырабатывает антите­ла. В результате дальнейшей селекции были отобраны отдельные клоны гибридных кле­ток, обладавшие наивысшей продуктивнос­тью и наибольшей аффинностью специфи­ческих антител.

Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, размножают или в аппаратах, приспособленных для выращивания культур клеток или же вводя их внутрибрюшинно особой линии (асцитным) мышам. В послед­нем случае моноклональные антитела накап­ливаются в асцитной жидкости, в которой размножаются гибридомы. Полученные как тем, так и другим способом моноклональные антитела подвергают очистке, стандартиза­ции и используют для создания на их основе диагностических препаратов.

Гибридомные моноклональные антитела нашли широкое применение при создании диагностических и лечебных иммунобиоло­гических препаратов.

В диагностике инфекционных болезней широко применя­ются иммунные реакции при идентификации возбудителя: при установлении родовой, видовой и типовой принадлежности микроба (вируса). Для постановки таких реакций необходимы специфические диагностические сыворотки, которые в зависи­мости от содержания соответствующих антител называются агглютинирующие, преципитирующие, гемо­литические, противовирусные.

Агглютинирующие сыворотки. Агглютинирующую сыворотку получают иммунизацией кроликов (внутривенно, подкожно или внутрибрюшинно) взвесью убитых бактерий, начиная с дозы 200 млн., затем 500 млн., 1 млрд., 2 млрд., микробных тел в 1 мл, с интервалами 5 дней. Через 7—8 дней после последней иммунизации берут кровь и определяют титр антител. Титром агглютинирующей сыворотки называется то макси­мальное разведение сыворотки, при котором происходит агглютинация с соответствую­щим микроорганизмом.

Агглютинирующие сыворотки применяются при идентифи­кации микроба в развернутой реакции агглютинации. Если изучаемый микроорганизм агглютинируется сывороткой до титра или до половины значения титра, его можно считать принадлежащим к тому виду, название которого указано на этикетке ампулы.

Неадсорбированные агглютинирующие сыворотки облада­ют высоким титром — до 1 : 12 800 — 1 : 25 600.

Недостатком таких сывороток является то, что они способ­ны давать групповые реакции агглютинации, так как они содержат антитела к бактериям, имеющим общие антигены в пределах семейства, группы и рода.

Поэтому в настоящее время большинство агглютинирую­щих сывороток выпускаются адсорбированными, монорецепторными и адсорбированными поливалентными, содер­жащими только типовые или видовые антитела и соответст­вующими или определенному типу или виду микроорганизма. Эти сыворотки не подлежат разведению.

Для получения таких сывороток применяют метод Кастелляни — метод адсорбции, который состоит в том, что при насыщении агглютинирующей сыворотки родственны­ми гетерогенными бактериями происходит адсорбция групповых антител, а специфические антитела остаются в сыворот­ке. В зависимости от полноты истощения групповых агглюти­нинов можно получить монорецепторные сыворотки — сыво­ротки, имеющие антитела только к одному рецептору-антигену или адсорбированные, поливалентные, дающие реакции агглю­тинации с двумя — тремя родственными бактериями, имею­щими общий антиген, в отношении которого проводилась ад­сорбция.

Адсорбированные сыворотки применяют при идентифика­ции выделенных возбудителей в реакции агглютинации на стекле (пластинчатый метод).

Агглютинирующие сыворотки наиболее широко применя­ются при диагностике заболеваний, вызываемых бактериями семейства Enterobacteriaceae. Так, при идентификации эшерихий используются поливалентные и типовые ОК-сыворотки; при дифференциации сальмонелл — набор сывороток: агглю­тинирующая адсорбированная поливалентная сальмонеллезная О-сыворотка (групп А, В, С, Д, Е) — для определения принадлежности к роду Salmonella, при положительном ре­зультате — определяют отдельно с каждой сывороткой (входя­щей в смесь) серологическую группу и в заключение опреде­ляется серологический тип выделенного возбудителя с моно-рецепторными Н-сыворотками сальмонелл, входящих в данную группу.

источник

— иммунологические анализы биологических жидкостей и клеток организма, микроорганизмов, вирусов и т.п.;

— иммуногистохимическиие методы анализа;

— типирование групп крови и тканей;

— воздействие на отдельные клеточные популяции;

— влияние на иммунные регуляторные механизмы с помощью антител к лимфокинам;

— иммунорегуляция с помощью антиидиотипических антител;

— направленный транспорт лекарственных веществ;

— элиминация токсинов, иммунотоксинов и аллергенспецифичных антител.

— очистка молекул и клеток, несущих специфический антиген;

— исследования этиологии и патогенеза различных заболеваний;

— исследование системных и межсистемных механизмов регуляции;

— создание новых лекарственных средств и биопрепаратов.

Рассмотрим некоторые примеры практического использования моноклональных антител:

Поскольку гибридомы можно хранить в замороженном состоянии, в некоторых институтах и лабораториях для научных целей создаются так называемые гибридомные банки.

Многие фармацевтические фирмы кровно заинтересованы в увеличении масштабов производства моноклональных антител, поскольку сфера их применения помимо количественного определения различных веществ включает разнообразную диагностику(например, идентификация определенного гормона, вирусных или бактериальных антигенов, антигенов группы крови и тканевых антигенов).

Благодаря использованию моноклональных антител стало возможным определение дозы лекарственных средств. Надежность и экономичность такой иммунодозировки следует считать существенным достижением. В мае 1981 г. Управление по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств США впервые утвердило к продаже набор для диагностического скрининга на основе гибридом, предназначенный для установления аллергена. Такие же наборы разрабатываются для тестирования гормонов, диагностики вирусных заболеваний, обнаружения некоторых видов рака и т.п.

Еще одним направлением применения моноклональных антител является устранение неблагоприятных последствий, вызванных передозировкой лекарственными средствами. Антитела против лекарственных препаратов, например, дигоксина, могут оказаться полезными для снятия неблагоприятных последствий, вызванных его передозировкой, хотя сегодня до конца и не ясно, нужно ли применять их экстракорпорально, связанными с твердым носителем, через который циркулирует кровь, или вводить непосредственно в кровоток.

Диагностика злокачественных новообразований и наблюдение за ними:

На сегодняшний день известно несколько специфических опухолевых маркеров, которые используются в диагностике, прогнозировании и выявлении распространения опухолей.

Некоторые из них обнаруживаются в крови, а другие находят в препаратах опухолей. Так, например, L-фетопротеин является главным белком сыворотки плода: его содержание уменьшается в течение первого года жизни. Таким образом, определяя содержание L-фетопротеина в плазме при помощи метода РИА (радиоиммунологического анализа), было обнаружено, что оно повышается у многих больных гипатомой, а также при раке семенников.

У многих больных, страдающих раком прямой кишки, в плазме отмечается повышенное содержание карциноэмбрионального антигена. Дальнейшее его увеличение может служить указанием на неэффективность химио- и лучевой терапии.

Помимо того, что моноклональные тела применяются, как специфические реагенты в стандартных тестах, они могут использоваться и для идентификации новых, более специфических маркеров опухолей.

Так, например, Ритсу и его сотрудникам удалось получить моноклональные антитела к антигену клеток при остром лимфолейкозе человека.

Развитию новых способов лечения может способствовать направленное введение лекарственных препаратов, присоединяемых к антителам против других опухолей.

Направленное введение лекарственных препаратов.

Моноклональные антитела могут найти применение для введения лекарственных веществ и токсинов в определенную часть тела (например, в опухоль): либо путем их непосредственного присоединения к таким веществам, либо путем связывания с поверхностью липосом, содержащих внутри эти вещества.

Были получены комплексы антител к поверхностным антигенам раковых клеток со многими неспецифическими противораковыми средствами, но далеко не всегда они оказывались эффективными. Наиболее многообещающим является использование сильнодействующих растительных или бактериальных токсинов, одна молекула которых может вызывать гибель клетки.

Так, например, молекула токсина дифтерии: образована двумя полипептидными цепями, связанными дисульфидными мостиками. Цепь В связывается с клеточной поверхностью, а цепь А, обладающая ферментативной активностью, проникает внутрь клетки и нарушает работу механизма биосинтеза белка. Были предприняты попытки, заменить В-цепь токсина специфическими антителами, преимущественно гомогенными. Также недавно был получен препарат моноклональных антител к антигену раковых клеток прямой кишки, ассоциированных с А-цепью токсина, который избирательно действует на эти клетки в культуре.

С помощью моноклональных антител возможно также выделение биологически активных веществ (таких, например, как белки, гормоны, токсины) из сложных смесей. В случае интерферона Сичер и Берк из Уорвикского университета (Великобритания) с помощью метода иммуноадсорбции получили препарат со степенью около чистоты 1 %.

По этому методу антитела были пришиты к углеводным гранулам и исследованы для приготовления колонки с иммуносорбентом, на которой очищали грубый препарат интерферона. После одного пассажа через такую колонку с иммобилизованными моноклональными антителами препарат очищается в 5000 раз лучше.

Читайте также:  Расшифровать анализ на антитела к гепатиту

Можно также использовать моноклональные антитела точной идентификации специализированных клеток, таких, например, как нейтроны, чтобы глубже изучить способы их взаимодействия и функционирование (т.е. локализацию химических нейромедиаторов).

Очень ценна техника моноклональных антител и для изучения клеточных мембран. Мембранные белки трудно выделить в чистом виде. Они присутствуют в клетках в малом количестве, их биологическую активность трудно измерить или же она и вовсе исчезает при растворении мембран в аналитических экспериментах. Эти трудности можно преодолеть, если прибегнуть к иммунологическим методам изучения мембранных белков, как это было сделано в случае антигенов клеточной поверхности, являющихся маркерами разных стадий дифференцировки тканей. Обычные препараты антител против клеточных антигенов, как правило, сложные и не способные распознавать отдельные молекулы.

Кроме того, еще одной сферой применения моноклональных антител является терапия различных заболеваний, так, например, эффективность серотерапии может быть увеличена благодаря применению моноклональных антител.

Также с помощью моноклональных антител можно изготовлять высокоспецифичные вакцины, особенно против определенных штаммов и паразитов.

Моноклональные антитела способны также нейтрализовать действие лимфоцитов, ответственных за отторжение трансплантата. В сочетании с лекарственными средствами они могут значительно усиливать эффективность действия последних на клетки-мишени, позволяя при этом избегать серьезных побочных явлений, столь обычных при химиотерапии рака.

Дата добавления: 2018-04-04 ; просмотров: 609 ; ЗАКАЗАТЬ РАБОТУ

источник

Предлагаем нашим посетителям воспользоваться бесплатным программным обеспечением «StudentHelp» , которое позволит вам всего за несколько минут, выполнить повышение оригинальности любого файла в формате MS Word. После такого повышения оригинальности, ваша работа легко пройдете проверку в системах антиплагиат вуз, antiplagiat.ru, РУКОНТЕКСТ, etxt.ru. Программа «StudentHelp» работает по уникальной технологии так, что на внешний вид, файл с повышенной оригинальностью не отличается от исходного.


1.Общие свойства моноклональных антител.
Моноклональные антитела (монАТ), в отличие от поликлональных, являются продуктом секреции одной антитело- продуцирующей клетки, либо ее потомков (клона), образовавшихся в процессе деления этой клетки. Все монАТ, являющиеся продуктом одного клона, представлены идентичными молекулами, отсюда вытекают основные свойства моноклональных антител:
а) Все молекулы монАТ, являющиеся продуктом одного клона, имеют одинаковую специфичность, то есть, направлены против одинаковых мест связывания (антигенных детерминант) на каком-либо конкретном антигене, тогда как поликлональная сыворотка имеет в своем составе антитела к разным участкам связывания с антигенам и даже к разным антигенам.
б) Все молекулы монАТ, являющиеся продуктом одного клона, имеют одинаковое сродство к связываемому антигену (аффинность), то есть моноклональные антитела бывают высокоаффинными («прочно» связывающие антиген) и низкоаффинные (образующие легко диссоциирующий комплекс с антигеном). Поликлональная сыворотка всегда представлена антителами разной аффинности.
в) Все молекулы монАТ, являющиеся продуктом одного клона, имеют один изотип и субизотип иммуноглобулинов, чего нельзя сказать о поликлональной сыворотке.

2. Применение моноклональных антител.
Все вышеперечисленные свойства монАТ дают им преимущества перед поликлональными сыворотками в использовании их в диагностических целях, где монАТ нашли свое самое широкое применение.

2.1.Клиническая диагностика растворимых антигенов.
Почти все известные схемы анализа растворимых антигенов на основе монАТ можно отнести к двум типам: метод «двойного сэндвича» (рис.1.) и конкурентный анализ (рис.2.). В обоих случаях используют твердофазный носитель, на который прикрепляют (сорбируют) тем или иным способом монАТ. Далее, в случае «двойного сэндвича», этот носитель инкубируют с исследуемым раствором (чаще всего это биологические жидкости, которые хотят проверить на содержание в них какого-либо белка или низкомолекулярного соединения). Во время инкубации этот антиген (если он имеется в исследуемом растворе) связывается с монАТ, все несвязавшиеся компоненты образца удаляют, промывая твердый носитель буферными растворами или водой.Затем инкубируют со «вторыми» моноклональными антителами, которые, во-первых, должны быть направлены к другой части молекулы антигена, не экранированной первыми сорбированными монАТ, а, во-вторых, должны иметь на себе какую-либо метку, позволяющую регистрировать наличие или отсутствие присоединения «вторых» монАТ к твердому носителю и делать выводы о наличии и количественном содержании искомого антигена в растворе.
Недостатком этого метода является необходимость иметь два монАТ, направленных к разным участкам молекулы антигена и не мешающих друг другу связываться с антигеном. Существует ряд антигенов, как правило, низкомолекулярных, для которых невозможно получить такую пару монАТ по той причине, что антиген имеет только одну антигенную детерминанту, либо антигенные детерминанты расположены на недостаточном расстоянии друг от друга для того, чтобы две достаточно крупные молекулы антител могли независимо их связывать.
В таких случаях используют в среднем менее чувствительный конкурентный анализ. Для этого на твердофазный носитель прикрепляют монАТ, затем инкубируют его с исследуемым образцом, куда предварительно добавили меченый антиген, который хотят обнаружить в образце. При наличии в образце искомого антигена (естественно, немеченого) последний препятствует связыванию меченого антигена с сорбированными монАТ ( конкурирует с ним за связывание с монАТ). В результате самый сильный сигнал наблюдают при отсутствии в исследуемом растворе искомого антигена (отрицательный контроль), а о содержании антигена можно судить по уровню снижения сигнала по сравнению с отрицательным контролем.

2.2.Диагностика вирусов, бактерий и паразитов.
Для диагностики вирусов, бактерий и паразитов чаще применяют вышеописанный метод «двойного сэндвича». Все эти антигены относятся к крупным надмолекулярным образованиям, поэтому стерических проблем со связыванием антител не бывает, даже если и «первые», сорбированные, и «вторые» меченые монАТ направлены к одной и той же антигенной дереминанте, так как каждая антигенная детерминанта многократно повторена на целой клетке или вирусной частице.
Существуют некоторые особенности диагностики вирусов, бактерий и паразитов:
а) Многие из них могут представлять опасность для окружающей среды и людей, проводящих анализ, поэтому исследуемые образцы предварительно подвергают обработке, уменьшающую их возможную инфекционность.
б) Некоторые микроорганизмы представлены разными штаммами и линиями, среди которых могут быть и патогенные, и непатогенные (например, кишечная палочка Е.coli). Для диагностики конкретных патогенных штаммов необходимо использовать такие монАТ, которые избирательно связывают только искомые линии и штаммы. В этом случае применение моноклональных антител имеет особенную ценность, поскольку набор поверхностных антигенных детерминант у разных штаммов и линий микроорганизмов одного вида очень похож, и поликлональная сыворотка не в состоянии «отличать» патогенные штаммы одного вида от непатогенных.
в) Все грамотрицательные бактерии имеют на своей поверхности «шубу», состоящую из липополисахаридов (ЛПС) и предохраняющую бактериальную клетку от взаимодействия антител с бактериальными мембранными белками. Антитела против ЛПС являются не лучшими с точки зрения диагностики микроорганизмов, поскольку молекулы ЛПС очень похожи по структуре и даже часто идентичны не только у разных штаммов одного вида , но и у бактерий разных видов. В связи с этим для диагностики грамотрицательных бактерий необходимы монАТ со следующими свойствами: во-первых, они должны быть направлены против поверхностных бактериальных белков, а не ЛПС; во-вторых, избирательно связывать только искомые штаммы бактерий. Кроме того, иногда необходима предварительная обработка образца для того, чтобы удалить ЛПС и экспонировать белковые антигенные детерминанты.

2.3. Диагностика поверхностных антигенов эукариотических клеток, в частности CD антигенов.
В настоящее время только CD антигенов известно порядка сотни, кроме них на поверхности клеток имеются молекулы адгезии и разнообразные рецепторы. Качественный и количественный состав поверхностных антигенов может дать ценную информацию о функциях конкретной клетки, о ее принадлежности к опухолевым или вирус- инфицированным. Исследование поверхностных молекул клеток позволяет диагностировать ряд заболеваний человека или животного. И вновь моноклональные антитела оказываются незаменимыми в такой диагностике, так как направлены против конкретных поверхностных антигенов.

2.4. Персональные диагностические наборы.
Наиболее широко сейчас используются персональные наборы для определения беременности в домашних условиях. В их основе лежит цветная реакция взаимодействия хорионического гонадотропина мочи с соответствующими моноклональными антителами. Несомненно, большую перспективу могли бы иметь подобные наборы для ранней диагностики опухолевых и инфекционных заболеваний, для определения нежелательных примесей в воде, пищевых продуктах, лекарствах и парфюмерных товарах.

2.5. Использование моноклональных антител в препаративных целях.
С развитием методов генной инженерии особенно остро встал вопрос о необходимости наладить выделение генноинженерных продуктов из их источников (бактериальных и дрожжевых клеток и др.). Часто генноинженерные (или их еще называют рекомбинантные) белки используются в качестве компонентов фармакологических препаратов, производимых в промышленных масштабах, поэтому предъявляются особые требования к их чистоте и к стоимости их очистки . В этом случае выделение белков и пептидов с помощью моноклональных антител практически не имеет конкурентов, так как может производиться в один этап и с высокой степенью очистки.
Наиболее распространенным методом выделения белков с использованием моноклональных антител стала аффинная хроматография. Основной ее принцип заключается в следующем:
На полимерные гранулы (например, сефароза), называемые иначе сорбентом, химически пришивают молекулы моноклональных антител, и эти гранулы помещают в хроматографические колонки. Далее через эти колонки пропускают растворы (экстракты), из которых хотят выделить нужное вещество, при этом используют такие условия (величина ионной силы раствора, рН, температура и др.), когда с монАТ связываются только требуемые компоненты раствора, а все остальные вымываются. После тщательной промывки колонки от несвязавшихся веществ производят элюцию (смыв) тех веществ, которые специфически связались с монАТ на сорбенте, используя для этого предварительно подобранные условия элюции (изменяют рН раствора, ионную силу и др.). В результате относительно несложной процедуры получают практически чистый препарат белка или пептида. Примерно такой же подход применяют и в исследовательских целях, когда хотят обогатить образец конкретным веществом для последующего его использования в других методиках.

2.6. Применение моноклональных антител в терапии.
По сравнению с диагностикой и препаративным выделением, моноклональные антитела пока не очень широко используются для лечения заболеваний, и этому есть целый ряд причин:
а) бактериальные инфекции удобней лечить с помощью таких более доступных средств, как антибиотиков или солевых растворов (как, например, при лечении холеры);
б) вирусы, являясь внутриклеточными паразитами, плохо доступны для моноклональных антител.
Пожалуй, наиболее перспективным направлением для использования моноклональных антител в терапии- это нейтрализация токсинов и терапия опухолей, где антитела против опухоле-ассоциированных антигенов пытаются использовать в целенаправленной транспортировке лекарственных средств к раковым клеткам. В последнее время появились сообщения о получении человеческих монАТ, избирательно вызывающих апоптоз опухолевых клеток, и не действующих на здоровые.
Помимо этого ведутся работы по разработке вакцин на основе моноклональных антител. Теоретическая основа существования таких вакцин основана на концепции антиидиотипических антител «внутреннего образа»: если моноклональные антитела направлены против антиген- связывающего участка других моноклональных антител, они иногда копируют участок антигена, то есть несут «внутренний образ» этого антигена и способны вызывать антиген-специфический иммунный ответ. (Рис. 3). Именно такие антитела или их Fv-фрагменты и предложено использовать в составе вакцин вместо антигена.
Еще одним возможным аспектом применения моноклональных антител в терапии является использование антител, обладающих самостоятельной ферментативной активностью, либо способных влиять на активность различных ферментов. Механизм действия таких антител (иначе их называют абзимы) заключается в том, что а) антитело может быть направлено к активному участку фермента и мешать (помогать) осуществлению ферментом своей функции; б) антитело может быть направлено против молекулы субстрата или к переходному от субстрата к продукту соединению и таким образом может понижать (или повышать) энергетический барьер превращения субстрата в продукт (то есть фактически самостоятельно выполнять функции фермента).

Методы анализа на основе моноклональных антител : иммуноферментный (ИФА), иммунолюминесцентный, иммунорадиологический.

Высокая специфичность антител в отношении антигена превращает их в мощный инструмент для идентификации различных веществ, будь то макромолекулы, клеточные фрагменты или целые клетки.
Начало широкому использованию антител в диагностических целях положил в 1955 году американский иммунолог А. Кунс. Он присоединил к антителам светящийся краситель. Флюоресцирующие антитела сделали видимыми места расположения интересующих его молекул в клетке. Этот метод получил название иммунофлюоресцентного. Чувствительность метода можно повысить несколькими путями.
В первом случае иммунный ответ усиливается за счет применения антител нескольких порядков:

Антиген иммобилизуется на подложке, к нему добавляются антитела 1-го порядка, связывающиеся непосредственно с антигеном. В исследуемый образец добавляются антитела 2-го порядка, связывающиеся с антигенными детерминантами антител 1-го порядка. Антитела 2-го порядка имеют флюоресцирующую (или другую) метку. Поскольку участков связывания может быть несколько, то реакция проявляется более отчетливо.
Другая система усиления сигнала основана на высоком сродстве биотина (низкомолекулярного растворимого витамина) к стрептавидину (бактериальному белку). Здесь возможны два варианта:
А. Если возможно ковалентно связать биотин непосредственно с антителами, то стрептавидин метят маркером и используют аналогично антителам второго порядка:

Б. Система “биотин-антитело + стрептавидин + меченый биотин”:

В этом случае образуется целая сеть из молекул стрептавидина, связанного с меченым биотином. Следовательно, происходит многократное усиление сигнала.
Применение антител второго и третьего порядков позволяет также упрощать процедуру определения микроорганизмов в мазке. При этом не обязательно иметь меченые антитела против всех бактерий. Достаточно иметь обычные антитела кролика или мыши против интересующего микроорганизма и меченые МКА против этих иммуноглобулинов. Если микроорганизм в мазке присутствует, то к нему “приклеятся” специфические антитела, а к ним уже — меченые. В результате мазок будет светится при люминесцентной микроскопии. Фотометрические или флуоресцентные методы могут быть использованы не во всех случаях, например, если измерение проводят очень мутной среде.
Кроме красителя в качестве метки можно использовать фермент (иммуноферментный анализ) или радиоактивный изотоп (иммунорадиологический). От чувствительности детекции маркера зависит чувствительность метода анализа.

Радиоактивные метки.
Выбор маркера и способа его «привязки» к антигену является одним из важных этапов в проведении анализа. Первоначально широко применялись радиоизотопные метки (радиоиммунный анализ — РИА), предложенные американскими исследователями (С. А. Берсон, Р. С. Ялоу, 1959). Однако в последние годы все более широкое использование в Качестве маркеров находят ферменты. Это обусловлено рядом принципиальных трудностей, связанных с применением изотопныx маркеров. Так, изотоп 125 I имеет время полураспада 60 суток, чем ограничивается срок его использования. Изотоп 3 Н имеет длительное время жизни (12.5 лет), однако под действием бэта-излучения происходит распад молекул антигена, в результате чего время жизни меченых 3 Н-соединений тоже ограничено. Кроме того, эффективность счета трития существенно ниже, чем 125 I. Ограничивающими факторами РИА являются сложность и высокая стоимость оборудования, необходимость централизованной системы распределения иммунохимических наборов, меченных радиоактивными изотопами, определенная опасность изотопов для окружающей среды.
Учитывая трудности использования радиоизотопных меток, были предложены в качестве маркеров ферменты.
При иммуноферментном анализе антиген связывается с поверхностью лунки полистирольного планшета. В лунку добавляют антитела, несущие фермент в качестве метки, инкубируют и отмывают. Далее приливают субстрат, который меняет окраску при взаимодействии с этим ферментом. Изменение окраски можно измерить с помощью спектрофотометрии. Таким способом проводится индикация и количественная оценка биоорганических соединений с чувствительностью до 10 -12 г/литр.
В настоящее время известно более 2000 разных ферментов, однако только некоторые находят применение в иммуноферментном анализе. Это объясняется высокими требованиями, предъявляемыми к свойствам ферментов. Фермент должен быть высоко активен, а продукты его реакции детектироваться с высокой чувствительностью, он должен быть стабилен, так чтобы его активность сохранялась не менее одного года. Содержание фермента-маркера в определяемом образце должно быть минимальным. Именно из-за этого для разных объектов используют разные ферменты.
Во многих случаях, когда необходим качественный результат, оценка иммунохимической реакции может быть проведена визуально.
Для введения ферментативной метки разработано много разных химических, биохимических и иммунологических способов.
Первым реагентом, использованным для синтеза иммуноферментных конъюгатов, был глутаровый альдегид, реагирующий с аминогруппами лизина белковых молекул. С помощью глутарового альдегида получены конъюгаты антител и антигенов с пероксидазой, щелочной фосфатазой, глюкоамилазой. В настоящее время широко используются иммунопероксидазные конъюгаты и конъюгаты с бэта-галактозидазой.
Ковалентные методы получения иммуноферментных конъюгатов нашли весьма широкое распространение, однако к некоторых случаях действие сшивающего реагента отрицательно сказывается на ферментативной и иммунологической активности компонентов гибридной макромолекулы. В связи с этим определенный интерес представляют иммунологические методы введения ферментной метки.
Один из подходов получил название метода «гибридных антител». Ферментативным гидролизом получают Fab-фрагменты молекул антител против определяемого антигена и используемого фермента. Затем смесь продуктов гидролиза подвергают восстановлению меркаптоэтанодом; при этом Fab-фрагменты обратимо диссоциируют на симметричные части. После удаления восстанавливающего агента молекулы снова ассоциируют, образуя гибридные молекулы антител, специфичные к определяемому антигену и ферменту. При добавлении фермента образуется комплекс антитело—фермент (рис. 19, а). Гибридомная технология открывает принципиально новый путь получения гибридных антител, который заключается в том, что сливаются моноклональные клетки, специфичные против данного антигена и фермента-маркера, в результате чего образуются гибридомы второго поколения, синтезирующие антитела, с двумя специфичностями.
Другой путь заключается в том, что получают антитела одного и того же вида животного (например, кролика) против определяемого антигена и фермента, которые соединяют между собой через антитела другого вида животных (антитела барана против кролика). Добавление фермента к такой тройной молекуле также приводит к образованию комплекса антитело—фермент. В настоящее время разрабатываются подходы получения гибридных антител методами клеточной и генной инженерии, что позволит существенно упростить способ их получения.
Стабильность иммуноферментных конъюгатов при хранении — важнейший параметр, обусловливающий возможность их практического использования. Методы направленной стабилизации конъюгатов пока еще не разработаны. Не существует также корреляции между стабильностью конъюгатов и методом их получения. Однако высокая стабильность гибридных молекул обеспечивает их применение на практике и значительно превосходит стабильность антител и антигенов, меченных радиоактивными изотопами. В лиофилизованном состоянии ферментные конъюгаты сохраняют свои свойства до двух лет.
Кроме ферментов в качестве маркеров могут быть использованы субстраты. В частности, в иммунокофакторном анализе применяются в качестве меток АТФ и НАД, которые могут быть «пришиты» к молекуле антигена через адениновый остаток таким образом, что сохраняется их способность взаимодействовать с ферментом. Аналогично были использованы субстраты пероксидазы (люминол, изолюминол), которые могут быть окислены пероксидом водорода в реакции хемилюминесценции, катализируемой пероксидазой.

Основные проблемы, возникающие при использовании монАТ в терапии:

а) Подавляющее большинство получаемых монАТ имеет животное происхождение (мышиные или крысиные), в результате чего иммунная система человека воспринимает их как чужеродный белок и быстро разрушает. МонАТ при этом не успевают проявить свое лекарственное действие.
б) Некоторые монАТ нечеловеческого происхождения могут связывать и выводить из строя жизненно важные молекулы в организме человека, иногда это может привести к летальному исходу (например, агглютинация (склеивание) клеток крови под воздействием антител против поверхностных антигенов).
в) Мышиные и крысиные монАТ являются для человека сильным иммуногеном, и введение их в терапевтических дозах может вызывать аллергические реакции вплоть до анафилактического шока.
Во избежание всех этих неприятностей необходимо использовать для лечения антитела не животного, а человеческого происхождения.
Масштаб использования моноклональных антител в современном мире таков, что, если бы создатели технологии по получению монАТ запатентовали свое открытие, то суммарный патентный сбор превысил бы годовой бюджет всей Великобритании.

Читайте также:  Расшифровать анализ антитела к toxoplasma gondii

3.Основные этапы получения моноклональных антител методом гибридомной технологии.

Долгое время единственным источником монАТ были опухолевые линии антитело- продуцирующих клеток миеломы и плазмацитомы, выделенные из больных людей и животных. Такие клетки могли быть адаптированы к росту в культуральных средах и секретировать моноклональные антитела, но было очень трудно и зачастую даже невозможно определить антиген, к которому эти антитела были направлены. Понятно, что использование таких монАТ было очень ограничено. Ситуация кардинально изменилась в 1975 году, когда ученые Kohler и Milshtein предложили метод получения моноклональных антител предопределенной специфичности, за что позднее были удостоены Нобелевской премии.
Смысл гибридомной технологии заключается в создании гибридной клетки (получившей название «гибридома»), получаемой путем слияния антитело- продуцирующего В-лимфоцита и опухолевой клетки миеломного или плазмацитомного ряда. (Рис.4). Такая гибридома обладает свойством секретировать антитела, взятой у В-лимфоцита, и способностью к бесконечному делению, взятой у опухолевой клетки.
Источником В-лимфоцитов для получения гибридомы служат лимфоидные органы животного, гипериммунизированного тем антигеном, против которого хотят получить монАТ. Гипериммунизация сильно повышает процентное содержание В-лимфоцитов, продуцирующих антитела желаемой специфичности, в общей популяции клеток лимфоидного органа. Лимфоциты, выделенные из тканей селезенки, лимфоузлов, периферической крови, не способны к самостоятельному делению и живут в культуре всего 10-14 дней. Миеломные клетки, напротив, могут жить и делиться в культуре сколь угодно долго, но не продуцируют антитела нужной специфичности (чаще используют линии миелом или плазмацитом, вообще не продуцирующие никаких антител).
В результате процедуры гибридизации (слияния) образуется гетерогенная популяция клеток, состоящая, во-первых, из неслившихся клеток лимфоидного органа; во-вторых, изнеслившихся клеток миеломы; в-третьих, из гибридов лимфоцит+лимфоцит и миелома+миелома; в четвертых, из гибридов лимфоцит+миелома, из которых лишь часть (часто весьма небольшая) стабильно продуцирует антитела нужной специфичности. Понятно, что необходимо отделить интересующие клетки от всех остальных. От неслившихся лимфоцитов и гибридов лимфоцит+лимфоцит избавляться не нужно: через несколько дней они умрут сами; от неслившихся опухолевых клеток и гибридов миелома+ миелома избавляются с помощью селективных сред (подробности ниже); среди оставшихся клеток (гибридов лимфоцит+миелома) отбирают нужные путем клонирования, когда из одной клетки выращивают популяцию клеток (клеточный клон) и отбирают среди таких клонов лишь те, которые стабильно продуцируют антитела требуемой специфичности.
Секрецию антител определяют различными методами скрининга супернатантов гибридом, другими словами, проводят анализ той культуральной среды, в которой рос конкретный клон. При наличии в супернатанте желаемых антител проводят еще одно или несколько клонирований, затем клетки нарабатывают для получения большего количества антител либо в культуре, либо в перитонеальной полости мышей (крыс). Далее антитела выделяют из культуральной или асцитной жидкости и проводят более детальные исследования на предмет их пригодности для использования в тех целях, для которых монАТ были получены. Клетки–продуценты можно заморозить и хранить в жидком азоте долгое время.

Рассмотрим теперь подробнее каждый из этапов получения монАТ:

3.1. Иммунизация.
Иммунизация — самый «творческий» этап в процессе получения моноклональных антител, именно эффективностью иммунизации определяется в наибольшей степени конечный успех всего предприятия. Тут невозможно дать какой-то единый рецепт, поскольку выбор схемы иммунизации и использование различных приемов, повышающих эффективность иммунизации, целиком зависят от свойств конкретного антигена.

3.1.1.Выбор объекта иммунизации.
В первую очередь необходимо выбрать объект иммунизации. На сегодняшний день известны три вида гибридомных систем: мышиная, крысиная и человеческая. Самой распространенной сегодня является мышиная гибридома, а самая редкая- человеческая, чему имеется ряд причин:
а) Мыши- наиболее хорошо изученный и доступный объект для работы в лаборатории, то же относится и к линиям мышиных миелом, используемых для слияния.
б) Все линии крысиных миелом, адаптированные для гибридомных работ, запатентованы, поэтому коммерческое использование крысиных гибридом регламентируется соответствующими патентами. Все мышиные линии миелом свободны от патентных ограничений.
в) Гипериммунизацию грызунов провести проще, чем иммунизацию человека. В большинстве случаев гипериммунизация человека вообще невозможна по этическим соображениям.
г) Источником иммунных В-лимфоцитов грызунов могут служить ткани любых лимфоидных органов, тогда как у человека возможно лишь взять периферическую кровь, где общее содержание В-лимфоцитов не превышает 20% от всех клеток. В редких случаях можно использовать удаленные миндалины пациентов, где содержание В-лимфоцитов может достигать 60%, но они, как правило, инфицированы и секретируют антитела именно против этого инфекционного агента.
д) При получении человеческой гибридомы существует проблема гистосовместимости клеток миеломы и В-лимфоцитов: у грызунов для слияния берутся В-лимфоциты и клетки миеломы, полученные от одной линии животных, и поэтому имеющих сходный репертуар антигенов гистосовместимости на клеточных поверхностях. Для человека это условие недостижимо, что в конечном итоге выражается очень низкой эффективностью слияния и крайне нестабильной антителопродукцией человеческих гибридом.
е) Мышиные и крысиные антитела достаточно просто нарабатывать в асцитных жидкостях; для человеческих гибридом возможна наработка лишь в культуре, либо с применением генноинженерных методов.
Для иммунизации мышей чаще всего используют линию BALB/c, все линии мышиных миелом происходят от этой линии. В случае низкоиммуногенных антигенов можно попытаться иммунизировать мышей другой линии, к некоторым антигенам они дают более сильный иммунный ответ по сравнению с BALB/c. Наработку таких гибридом в асцитных жидкостях производят на потомках первого поколения, полученных от скрещивания BALB/c и линии, использованной для иммунизации.
Для иммунизации крыс литература настойчиво рекомендует линию LOU/C, но вполне удовлетворительные результаты получаются с более доступными в нашей стране крысами линииWISTAR.
4.1.Схемы иммунизации мышей.

4.1.1.Короткая схема иммунизации.
Наиболее любима нашей лабораторией короткая схема иммунизации, когда антиген вводят дважды с двухнедельным интервалом в подушечки задних лап. Количество вводимого антигена берут в пределах от 5 до 200мкг на мышь в зависимости от его доступности и иммуногенности, для токсичных антигенов доза может быть понижена до 0,1мкг. Для первого введения антигена (раунда иммунизации) раствор антигена объемом 50-200 мкл смешивают с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ), представляющего собой минеральное масло со взвесью убитых микобактерий. При активном перемешивании раствора антигена с ПАФ получается мелкодисперсная эмульсия, призванная замедлить и пролонгировать поступление антигена в ткани. Считается, что убитые микобактерии усиливают иммунный ответ, что, однако, у многих исследователей вызывает сомнение. Второй раунд иммунизации проводят так же, как и первый, но с использованием неполного адъюванта Фрейнда (НАФ), в котором отсутствуют микобактерии.
В случае проблемных антигенов полезно иммунизировать группу животных разными дозами антигена и с использованием разных схем иммунизации. На третий или четвертый день после второго раунда иммунизации нужно взять пробы крови и проанализировать их на содержание антител против требуемого антигена. Для дальнейшей работы выбирают животное с максимальным титром, исключение составляют антигены- белковые токсины, где иногда высокий титр специфических антител сочетается с большим процентом убитых токсином В-лимфоцитов. В таких случаях нужно брать животное, имеющее не самый высокий титр и/или обращать внимание на жизнеспособность клеток, берущихся для слияния.
На четвертый день после второго раунда иммунизации животное забивают, и клетки подколенных лимфоузлов сливают с клетками миеломы.

4.1.2. Длинные схемы иммунизации.
В случае неэффективности короткой схемы иммунизации пробуют различные виды длинных схем. При этом обычно животных иммунизируют с интервалом 2-4 недели либо внутрибрюшинно, либо подкожно (реже внутривенно или орально), используя для первого раунда иммунизации ПАФ, а для последующих- НАФ.
На 10-14 день после каждого раунда иммунизации (начиная со второго) кровь иммунизируемых животных проверяют на содержание специфических антител. Если титр антител достиг желаемого уровня, проводят последний раунд иммунизации (называемый бустированием), вводя раствор антигена внутривенно без адъювантов, в количестве 1/10 от предыдущих доз. В результате бустирования избирательно стимулируются клоны, продуцирующие антитела высокой аффинности к антигену.

4.2. Некоторые приемы, позволяющие усилить иммунный ответ.

4.2.1. Конъюгация (химическая сшивка) низкомолекулярного антигена (гаптена) с белком- носителем.
Существует целый ряд низкомолекулярных соединений, не способных самостоятельно вызвать иммунный ответ по причине малого размера молекулы. В таких случаях гаптен конъюгируют с белком- носителем (часто в качестве белка- носителя берут бычий сывороточный альбумин, яичный альбумин или гемоцианин улитки) и такой конъюгат используют для иммунизации. При этом возникает целый ряд проблем:
а) Основной иммунный ответ будет направлен на белок- носитель, а не на молекулу гаптена, и это нужно будет учитывать при тестировании сывороток иммунизируемых животных и супернатантов гибридом. Тестирование должно отражать содержание антител именно к гаптену, а не к конъюгату в целом.
б) Пространственное строение гаптена (конформация), как правило, существенно изменяется в процессе конъюгирования с носителем, иногда настолько, что все антитела против участков гаптена, находящегося в составе конъюгата, не способны узнавать свободную молекулу гаптена. В таких случаях пробуют разные варианты конъюгирования, которые затрагивают при сшивке разные функциональные группы молекулы гаптена, либо используют разные «линкеры»- органические соединения, связывающие функциональные группы гаптена и белка- носителя и увеличивающие экспонированность гаптена на поверхности носителя.
В целом метод конъюгирования хорошо зарекомендовал себя при получении антител против низкомолекулярных соединений.

4.2.2. Иммунизация иммунными комплексами ( антиген- антитело).
Метод применяют, когда антигеном является консервативный низкоиммуногенный белок, либо, когда хотят получить антитела против минорных антигенных детерминант, на которые при иммунном ответе направлен очень низкий процент всех специфических антител. В первом случае антительным компонентом иммунного комплекса могут служить монАТ с неудовлетворительной аффинностью, полученные ранее после обычной иммунизации. Во втором случае берут монАТ против сильных антигенных детерминант, получение которых не представляет большой сложности.
Примером успешного использования такого подхода может служить получение антител против человеческого эритропоэтина, ? и ? интерферонов, иммуноглобулинов близкородственных видов (крысиные монАТ против IgG мыши).

4.2.3. Конъюгация с адъювантным белком (hsp70).
Встречаются антигены, которые в силу своей сверх-консервативности не способны вызвать сколько-нибудь заметный иммунный ответ, несмотря на свою белковую природу и достаточный молекулярный вес (например, гемоглобин, некоторые ферменты). Выходом здесь может стать конъюгирование их с белком теплового шока (heat shock protein 70kDa, hsp70). Имеются данные, что hsp70 облегчает презентацию пептидных фрагментов, экспонируя их определенным образом, на практике же конъюгирование белков и пептидов с hsp70 приводит, как правило, к резкому усилению выработки антител против этих белков и пептидов.
Однако, случается полное подавление иммунного ответа в результате конъюгирования с hsp70, которое мы неоднократно наблюдали при иммунизации конъюгатом hsp70- интерферон ?.

4.3. Предварительная обработка антигенов перед иммунизацией.
а) Токсичные антигены часто подвергают денатурации нагреванием или добавлением денатурирующих агентов (мочевины, гуанидилхлорида и др.). Токсичность при этом снижается (не всегда), но утрачиваются многие антигенные детерминанты, присущие неденатурированному (нативному) антигену. В результате получаемые монАТ узнают лучше денатурированный антиген.
б) Иногда молекулы антигена сшивают друг с другом (полимеризуют) с целью увеличения молекулярного веса и/или уменьшения токсичности.
в) Вирусы и бактерии перед иммунизацией, как правило, инактивируют нагреванием, либо обработкой фенолом, формальдегидом, глутаральдегидом и др. для уменьшения их токсичности и эпидемиологической опасности. Грамотрицательные бактерии, кроме того, иногда обрабатывают лизоцимом, чтобы убрать ЛПС с их поверхности и обеспечить иммунный ответ против бактериальных белков.

5. Гибридизация В-лимфоцита с клеткой миеломы.

«Отцы» гибридомной технологии Келер и Мильштейн добивались слияния клеток при помощи вируса Сендай. Сейчас для этой цели все используют полиэтиленгликоль (ПЭГ), как более удобное, эффективное и безопасное средство. Формула ПЭГ:
HO(CH2CH2O)n CH2CH2OH , молекулярный вес ПЭГ, пригодного для слияния, от 20 до 20000, но чаще используют ПЭГ массой 600-6 000.
Полиэтиленгликоль токсичен для клеток, и его токсичность возрастает с уменьшением молекулярного веса. Слияние клеток происходит во время инкубации их в 35-50% ПЭГ, время инкубации зависит от концентрации ПЭГ и от его молекулярного веса (для 50% ПЭГ мол. веса 1 500 это приблизительно 1 минута). Недостаточное время инкубации приведут к очень низкому проценту слившихся клеток, а избыточное- к большому проценту погибших клеток вследствие токсичности ПЭГ. Хорошо работает такой компромиссный вариант, когда клетки сначала инкубируются при мягком перемешивании в 50% ПЭГ в течение 1 мин, затем процент ПЭГ снижается до 35% медленным добавлением бессывороточной среды, и клетки инкубируются еще 5-7 минут. Затем медленно, но с нарастающим темпом и при аккуратном перемешивании суспензия клеток далее разбавляется средой, потом центрифугируется и высевается на культуральные планшеты.
Точный механизм гибридизации клеток еще недостаточно изучен. Вначале, по-видимому, происходит агглютинация (склеивание) клеток, затем слияние клеточных мембран и, наконец, слияние ядер и перестройки хромосомного материала. Имеются данные, что сливаются, в основном, клетки, находящиеся в стадии интенсивного деления. По этой причине клетки миеломы за 12-24 часа до гибридизации переводят в условия, способствующие максимальной скорости роста клеток (повышение содержания фетальной сыворотки, витаминов и ростовых факторов в культуральной среде). Иммунизация в свою очередь стимулирует рост клонов В-лимфоцитов- продуцентов специфических к антигену антител.

Обычные условия культивирования миеломных и гибридомных клеток- 37°С и 5% СО2. Основа культуральной среды- это разные варианты предлагаемых на рынке сред DMEM или RPMI1640, представляющих собой раствор солей, аминокислот, витаминов, углеводов и питательных добавок в разных концентрациях и цветового индикатора кислотности (как правило, феноловый красный). Кроме этого к среде добавляют эмбриональную телячью сыворотку или ее синтетические или полусинтетические заменители до концентрации 3-20% как источник белка и ростовых факторов. Качество сыворотки в наибольшей степени влияет на скорость роста клеток, особенно гибридомных, как более капризных по сравнению с миеломными. Помимо сыворотки в среду добавляют пируват натрия, антибиотики, глутамин (если он не содержался в исходной среде), реже- оксалоацетат, бета-меркаптоэтанол, инсулин и др.
Для культивирования клеток при низкой клеточной плотности (особенно при клонировании, когда из одной- единственной клетки в лунке необходимо вырастить целый клон) используют так называемый фидерный слой клеток (или просто фидер), облегчающий эту задачу. Клетки фидера не должны самостоятельно делиться, они призваны обеспечивать гибридомные клетки необходимыми для роста цитокинами и создавать клеточные контакты. В качестве фидера можно использовать клетки тимуса, селезенки, лимфоузлов, перитонеальной полости животных того вида, который использовался для получения иммунных В-лимфоцитов. Фидер от животных другого вида тоже может быть использован, но с меньшей эффективностью.
Культивирование клеток необходимо проводить в условиях, максимально приближенных к стерильным. Попавшие в культуру клеток бактерии и грибы, опережая гибридомы в скорости роста, очень быстро исчерпают питательные вещества ростовой среды и насытят ее своими токсинами. Это приведет к неизбежной гибели гибридомных клеток. Во избежание инфицирования пользуются стерильными ростовыми средами и стерильной культуральной посудой, применяют антибиотики, а все манипуляции с клетками проводят в условиях минимальной осемененности микробами (в ламинарном боксе с принудительной подачей стерильного воздуха).
Особую проблему представляет заражение клеток внутриклеточными паразитами- вирусами и микоплазмой. Детектировать их достаточно сложно, они, как правило, не убивают всю культуру гибридомных клеток и с легкостью переносятся от одной культуры к другой. Вирусы и микоплазма фильтруются сквозь бактериальные фильтры, поэтому фильтрование ростовых сред и воздуха в ламинарном боксе становятся неэффективными при борьбе с ними. Заражение клеток вирусами или микоплазмой приводит к резкому замедлению роста клеток, особенно в малой их плотности, а также к усиленной потере гибридомами их способности секретировать антитела. Против микоплазмы существуют специальные антибиотики, а против вирусов- интерфероны, но они помогают лишь снизить степень инфицированности клеток, не избавляя их от инфекции полностью. Более действенным является сочетание антибиотиков с неоднократным проведением зараженной культуры через организм животного, где клетки могут расти в виде асцитной жидкости и использовать иммунную систему животного против инфекции.

7. Методы селекции слившихся клеток.

7.1. Использование селективных сред.
Считается неплохим результатом гибридизации, когда сливается одна пара клеток из 10 000. Для удаления неслившихся миеломных клеток (неслившиеся В-лимфоциты отмирают сами через несколько дней) чаще всего используют негативную селекцию на селективных средах, смысл которой заключается в следующем: В клетках млекопитающих имеется два пути синтеза пуринов (предшественников нуклеотидов)- основной и запасной. Для осуществления запасного пути требуется фермент гипоксантинфосфорибозилтрансфе раза (ГФРТ), который отсутствует у миеломных клеток. Линии миеломных клеток, пригодные для гибридомной технологии, имеют мутацию, в результате которой клетки не способны синтезировать ГФРТ и осуществлять запасной путь синтеза пуринов. Отбор мутантов и удаление спонтанно возникающих нормальных миеломных клеток производят с помощью 8-азагуанина или 6-тиогуанина. В-лимфоциты, как изначально нормальные, способны использовать оба пути синтеза пуринов.
После процедуры гибридизации клетки высевают в среде, содержащей аминоптерин, который блокирует основной путь синтеза пуринов. В результате неслившиеся клетки миеломы (и гибриды миелома+миелома) погибают, так как оказываются лишенными и основного (блокированного аминоптерином) и запасного (потерянного в результате мутации) путей синтеза пуринов. Способными к росту оказываются лишь гибриды миелома+лимфоцит, взявшие у исходных лимфоцитов способность к осуществлению запасного пути синтеза пуринов.
После отмирания основной массы неслившихся клеток ростовую среду постепенно заменяют на свежую, не содержащую аминоптерин, так как он мешает нормальному функционированию клеток.

7.2.Использование проточного цитофлуориметра.
Проточный цитофлуориметр позволяет отсортировывать клетки, которые несут на своей поверхности флуоресцентную метку. Использование проточного цитофлуориметра для отбора гибридных клеток состоит в следующем: Смесь иммунных лимфоцитов и клеток миеломы подвергают стандартной процедуре слияния; затем полученную суспензию клеток инкубируют с раствором антигена, против которого хотят получить монАТ, предварительно конъюгированного с флуоресцентной меткой (например, ФИТЦ- флуоресцеинизотиоцианат) . В-лимфоциты и гибриды лимфоцит+миелома имеют на своей поверхности молекулы иммуноглобулинов. В том случае, когда эти иммуноглобулины направлены против требуемого антигена, происходит связывание несущих их клеток с антигеном, а через него с флуоресцентной меткой. Затем с помощью прибора отсортировывают меченые клетки от всех остальных и получают популяцию клеток, состоящую в основном из гибридом, секретирующих антитела против желаемого антигена, и неслившихся В-лимфоцитов, не способных к делению.
Достоинства этого метода селекции по сравнению с методом селективных сред состоят в следующем:
и т.д.

* Примечание. Уникальность работы указана на дату публикации, текущее значение может отличаться от указанного.

источник