Анализ крови на антитела сдают по многим показаниям. Врач может назначить такое исследование при частых инфекционных заболеваниях пациента, подозрении на венерические инфекции, глистные инвазии, болезни щитовидной железы. Антитела в крови беременной женщины могут указывать на наличие резус-конфликта. Так что собой представляет данное исследование и когда необходимо сдать анализ крови на антитела?
Человеческий организм постоянно атакуют разные инфекции. Для защиты организма и предотвращения заболеваний иммунная система человека вырабатывает антитела. Анализ на антитела дает возможность определить состояние иммунной системы человека, причину патологических изменений в организме.
Антитела – это особые специфические белки (иммуноглобулины), которые способны связывать инфекционные антигены. Они вырабатываются лимфоцитами крови. Во время проведения исследования определяют наличие антител к определенным возбудителям заболеваний. Результаты анализа на антитела указывают на наличие инфекций в настоящем времени и на перенесенные ранее заболевания.
Различают антитела пяти классов – IgA, IgG, IgD, IgE, IgM. Каждый класс антител действует на строго определенные антигены.
Антитела IgM называют «иммуноглобулинами тревоги». Их количество резко увеличивается в самом начале заболевания. Данные антитела быстро реагируют на внедрение в организм инфекции и обеспечивают первичную защиту от нее.
Антитела IgA отвечают за местный иммунитет слизистых тканей. Эти иммуноглобулины активизируются при инфекциях на коже, ОРЗ. Кроме того, уровень антител IgA повышается при интоксикациях, хронических патологиях печени, алкоголизме.
Антитела IgE являются антипаразитарными и антиинфекционными иммуноглобулинами. Они обеспечивают защиту организма от патогенных вирусов, бактерий, грибков. Также данные антитела обезвреживают токсины, которые вырабатывает возбудитель инфекции, отвечают за иммунитет плода у беременной женщины. Благодаря их воздействию у человека формируется длительный иммунитет, предотвращающий повторное инфицирование.
На основании результата анализа крови на антитела специалист может определить, какие антигены негативно воздействуют на организм пациента, и какие иммуноглобулины смогут устранить инфекцию. Иногда антитела к определенным возбудителям навсегда остаются в организме человека. Данное исследование дает возможность с высокой точностью установить те болезни, которыми человек переболел раньше.
Обычно анализ на антитела назначают для выявления вирусного гепатита, вируса герпеса, хламидиоза, уреаплазмоза, лептоспироза, цитомегаловируса, столбняка, ВИЧ-инфекции, дифтерии, сифилиса и некоторых других заболеваний.
С помощью данного исследования можно определить еще один чрезвычайно важный показатель – наличие в крови аутоантител. Эти антитела образуются к антигенам самого человеческого организма – рецепторам, фосфолипидам, фрагментам ДНК, гормонам. Определение присутствия аутоантител дает возможность диагностировать аутоиммунные заболевания. Без проведения данного анализа на антитела выявить аутоиммунные патологии достаточно трудно.
Сдать анализ крови на антитела можно в диагностических, медицинских центрах, лабораториях при специализированных отделениях больниц. Обязательно для этого нужно иметь направление от врача, в котором будет указано, какие именно иммуноглобулины необходимо определить.
За сутки до проведения анализа необходимо исключить из питания острую, жареную, соленую, жирную пищу, алкогольные напитки, а также избегать курения и приема лекарственных препаратов. Данный анализ не нужно сдавать после физиотерапевтических процедур, томографии, УЗИ, флюорографии. Кровь из вены для исследования сдается утром натощак.
Расшифровку анализа крови на антитела должен проводить врач, который учитывает все дополнительные факторы для постановки диагноза. Но каждый может проверить свои показатели самостоятельно, чтобы определить, насколько они соответствуют норме.
Данные антитела находятся на поверхности слизистых тканей, в моче, желчи, слюне, молоке, молозиве, а также в слезном, желудочно-кишечном, бронхиальном секрете. Основной функцией данных антител является нейтрализация вирусов. Они защищают дыхательные и мочеполовые пути, желудочно-кишечный тракт от проникновения инфекции.
В норме уровень иммуноглобулинов IgA в крови детей до 12 лет составляет 0,15–2,5 г/л, у старших детей и взрослых – 0,4–3,5 г/л.
Повышение данного показателя бывает при алкоголизме, муковисцидозе, туберкулезе, ревматоидном артрите, циррозе печени, хроническом гепатите, хронических гнойных инфекциях пищеварительной системы.
Понижение иммуноглобулинов IgA может наблюдаться при злокачественных анемиях, атопическом дерматите, радиационном облучении, приеме некоторых лекарственных препаратов (цитостатиков, иммунодепрессантов).
Эти иммуноглобулины первыми реагируют на попадание в организм инфекции и запускают иммунную защиту. Они производятся в клетках плазмы, нейтрализуют бактерии и вирусы в сыворотке крови.
Согласно расшифровке анализа крови на антитела, нормальное значение иммуноглобулинов IgM в крови детей до 10 лет составляет 0,8–1,5 г/л, у мужчин – 0,6–2,5 г/л, у женщин – 0,7–2,8 г/л.
Повышение содержания антител IgM бывает при внутриутробных инфекциях у новорожденных, паразитарных заболеваниях, болезнях пищеварительной и дыхательной систем острого и хронического течения. Понижение уровня данных антител может быть при гастроэнтеропатиях, ожогах, лимфоме.
Данные антитела активизируются при возникновении аллергических реакций и бактериальной инфекции в организме.
Нормальные показатели уровня IgG для детей младше 10 лет составляют 7,3–13,5 г/л, для старших детей и взрослых – 8,0–18,0 г/л.
Уровень антител IgG повышается при саркоидозе, системной красной волчанке, ревматоидном артрите, туберкулезе, ВИЧ-инфекции. Пониженный уровень данных антител бывает при новообразованиях лимфатической системы, аллергических реакциях, наследственной мышечной дистрофии.
Резус-антитела (резус-фактор) – особый белок, который находится на поверхности эритроцитов. Те люди, которые имеют данный белок, называются резус-положительными. Но у 15% людей, которых называют резус-отрицательными, данного белка нет. Отрицательный резус не причиняет вред здоровью человека. Опасной становится ситуация, когда у резус-отрицательной беременной женщины малыш имеет резус-положительную кровь. В таком случае существует возможность попадания в кровоток ребенка антител резус-отрицательной матери. В результате этого у малыша могут развиться достаточно тяжелые патологии печени, головного мозга, почек.
Для контроля таких ситуаций всем резус-отрицательным беременным женщина проводят анализ крови на резус антитела. Уже при первом обращении к врачу женщине рекомендуют сдать анализ крови на антитела. После этого в первой половине беременности будущая мама сдает анализ крови на резус антитела каждый месяц. Во второй половине беременности данное исследование проводится два раза в месяц. При необходимости плоду и новорожденному проводится специальная терапия.
источник
Иммунная система человека способна не только самостоятельно бороться с различными заболеваниями, но и запоминать патогенные микроорганизмы и «вредоносные агенты», с которыми ей пришлось столкнуться. В результате этого в сыворотке крови появляются специфические белки, которые на профессиональном языке называются антителами.
Одним из самых информативных обследований является анализ крови на антитела, позволяющий определить, с какими заболеваниями раньше сталкивался человек и чем он болеет сейчас. Кроме того, обследование помогает выявить общий уровень иммунной системы и сбои в ее функционировании.
Антитела – это иммуноглобулины или глобулины, которые вырабатываются иммунной системой с целью выявления и уничтожения вредоносных и патогенных микроорганизмов. Но их продуцирование не всегда направлено на защиту от различных типов возбудителей. При разных патологиях и аутоиммунных заболеваниях они могут атаковать здоровые ткани организма. Анализ крови на антитела помогает выявить, с чем именно столкнулся пациент.
Формирование специфических белков в крови человека начинается только в следующих случаях:
- организм подвергается атаке вредоносных агентов, ведущих к дальнейшему инфицированию;
- при вакцинации (введение в организм искусственно ослабленных бактерий).
Развитие памяти иммунитета – важнейший для человека процесс, при котором глобулины запоминают антигены с прикрепленными к ним антителами. Если они попадут в организм повторно, иммунная система сможет обезвредить их. Медики предупреждают о том, что присутствие антител в сыворотке крови – важнейший показатель состояния иммунной системы. Любые отклонения от референсных значений указывают на развитие патологии.
На протяжении жизни человеческий организм сталкивается с различными возбудителями заболевания, химическими компонентами (средства бытовой химии, лекарства), продуктами переработки собственных клеток. В качестве ответной реакции организм начинает вырабатывать собственные иммуноглобулины. Антитела формируются из лимфоцитов и выступают как стимулятор иммунной системы.
В международной медицине различают 5 типов антител, каждый из которых реагирует только на определенные антигены:
- IgM . Иммуноглобулин этого типа вырабатывается, если в организм попала инфекция. Его основная задача – стимуляция иммунной системы и оказание сопротивления болезни;
- IgG . Их выработка начинается через несколько суток после начала болезни. Антитела IgG формируют устойчивый к инфекциям иммунитет, также от них зависит эффект от вакцинации. Клетки этой фракции отличаются крошечными размерами, поэтому они могут проникать сквозь плацентарный барьер, формируя первичный иммунитет плода;
- IgA . Отвечают за безопасность ЖКТ (желудочно-кишечного тракта), органов мочевыделительной системы и дыхательных путей. Такие тела обнаруживают и «фиксируют» между собой патогенные организмы, мешая им прикрепиться к стенкам слизистой оболочки;
- IgE . Отвечают за защиту от грибков, паразитов и аллергенов. Антитела IgE обитают в бронхах, кишечном тракте и желудке. Также от них зависит формирование вторичного иммунитета. В свободной форме их практически невозможно найти в плазме крови;
- IgD . Эта фракция до сих пор изучена лишь частично. Последние исследования показали, что агенты IgD отвечают за местный иммунитет и обычно начинают вырабатываться при обострении хронических инфекций. Их количество составляет менее 1% от всех антител, присутствующих в сыворотке крови.
Специалисты утверждают, что вне зависимости от типа все антигены могут присутствовать как в плазме крови, так и фиксироваться к инфицированным клеткам. Обнаружив тип антигена, специфические белки прикрепляются к ним. После этого иммунной системе поступает сигнал о присутствии чужеродных объектов, которые необходимо уничтожить.
В международной медицине антитела также различаются с учетом того, как именно они взаимодействуют с антигенами:
- антиинфекционные и антипаразитарные. Прикрепляются к телу микроорганизма, приводя к его гибели;
- антитоксические. Антитела этого типа нейтрализуют токсины, продуцируемые инородными телами, но сами по себе они неспособны уничтожать патогенные микроорганизмы;
- аутоантитела. Приводят к развитию аутоиммунных заболеваний, поскольку атакуют здоровые клетки организма;
- аллореактивные. Конфликтуют с антигенами тканей и клетками других организмов того же биологического типа. Анализ на эту фракцию всегда проводится, если человеку назначена трансплантация почек, печени или костного мозга;
- антиидиотипические. Вырабатываются для нейтрализации собственных антител (только при их избытке).
Врачи часто назначают пациентам проведение анализа на антитела. Такое исследование помогает выявить, что стало причиной повышения или снижения уровня глобулинов. После расшифровки результатов врач сможет понять, что значит и с чем связано отклонение от нормы.
Также анализ часто назначается для отслеживания динамики развития некоторых патологий. Исследование необходимо, если у медика есть подозрение на дефицит иммуноглобулинов, что становится причиной ослабления иммунитета и увеличивает вероятность развития разных заболеваний.
Чаще всего анализ на антитела назначается при подозрении на следующие заболевания:
- гепатит C;
- заболевания щитовидной железы аутоиммунного происхождения. Определяется по количеству антител к тиреопероксидазе (ТПО);
- вирус иммунодефицита человека. Для постановки достоверного диагноза пациенту придется сдать кровь на исследование не менее 3 раз;
- ветрянка;
- краснуха;
- корь;
- воспаление щитовидной железы, хронический тиреоидит. При этих заболеваниях сильно повышается продуцирование антител к тиреоглобулину;
- паразитарные заболевания, вызванные глистами, аскаридами, круглыми и колючеголовыми червями;
- дифтерия, столбняк;
- полиомиелит;
- герпес, вирус Эпштейна-Барра (ВЭП);
- коклюш;
- заболевания инфекционного происхождения, вызванные хламидиями.
Также исследование на иммуноглобулины определенного класса может быть назначено при следующих заболеваниях:
- ревматоидный артрит;
- рак;
- цирроз печени;
- заражение крови;
- отит, воспаление легких, менингит хронической формы;
- дисфункция иммунной системы;
- ВИЧ-инфекции.
Исследование незаменимо и при выявлении причин бесплодия. При сложностях с зачатием ребенка обычно назначается анализ на антитела к ХГЧ и на антиспермальные антитела. Во время беременности всегда назначается анализ на антитела к резус-фактору. Также беременным женщинам нужно сдавать кровь на групповые антитела.
Один из наиболее распространенных анализов этого типа – изучение крови на присутствие антител к тиреоглобулину. Повышение выработки подобных антител указывает на патологии щитовидной железы и помогает определить присутствие воспалительного процесса. Несомненным преимуществом этого исследования является то, что оно дает возможность выявить заболевание на начальном этапе и свести к минимуму риск нежелательных осложнений.
Если пациенту назначен анализ на антитела, врач обязательно должен рассказать, зачем проводится исследование и как к нему подготовиться. Состав сыворотки крови человека постоянно меняется. На него влияет образ жизни, особенности питания, психическое состояние.
Пациентам необходимо запомнить следующие правила:
- забор крови осуществляется утром натощак (только в условиях стационара). Кушать перед анализом запрещено;
- за 3 суток до анализа нужно отказаться от потребления жирной и жареной пищи, солений и копченостей, концентрированных соков. Категорически запрещено употреблять спиртные напитки и курить. По возможности в подготовительный период рекомендуется отказаться от потребления лекарственных средств;
- если анализ назначен для определения наличия венерического заболевания, гепатита или паразитных заболеваний, за 2 дня до сдачи биоматериала рекомендуется перейти на молочную диету.
Кровь нельзя сдавать, если за несколько дней до предполагаемого анализа пациент перенес эмоциональное потрясение или стресс. Также существует повышенная вероятность ложного результата, если накануне проводилось ультразвуковое исследование, МРТ или делалась флюорография.
Наиболее современным и эффективным методом выявления антител в сыворотке крови считается иммунофлюоресцентный анализ. При помощи такого лабораторного исследования можно определить тип и титр (активность) иммуноглобулинов, а также выявить, насколько сильно развилась патология. Исследование включает в себя следующие этапы:
- лаборант забирает у пациента биологический материал;
- несколько капель полученной крови капают на специальную планшетку с лунками, в которых содержатся очищенные антигены предполагаемого возбудителя;
- далее лаборант добавляет в лунки специальный реагент;
- с учетом окрашивания медик делает выводы о результате анализа.
Само исследование может быть 2 типов:
- качественное. Назначается для подтверждения присутствия или отсутствия искомого антигена;
- количественное. Этот тип анализа считается более сложным и показывает концентрацию антител в изучаемой сыворотке. При помощи него можно оценить, насколько быстро развивается инфекция.
Вне зависимости от типа анализа расшифровка результатов занимает от 1 до 3 суток.
Анализ проводится с целью определения присутствия и числа глобулинов различных типов. Если количество антител повышено, это означает присутствие определенного заболевания. Для выявления общей клинической картины и назначения подходящей схемы лечения пациенту назначают дальнейшую диагностику. Норма иммуноглобулинов в крови отличается в зависимости от пола и возраста.
IgA | IgM | IgG | |
Дети | 0,15-2,5 | 0,8-1,6 | 7,2-13,4 |
Женщины | 0,53-3,44 | 0,38-1,96 | 5,88-16,2 |
Мужчины | 1,02 | 0,55-1,43 | 6,63-14,01 |
Антитела этого типа находятся на слизистых оболочках (желудок, ротовая полость). Они присутствуют в секрете, выделяемом бронхами, и молоке кормящей женщины. Их повышенная концентрация может свидетельствовать о суставных патологиях, гнойных инфекционных процессах, заболеваниях желудочно-кишечного тракта и хронических недугах гипатобилиарной системы.
Если количество и активность антител IgA сильно снижены, это может быть признаком заболеваний кровеносной системы и кожных патологий. Также уровень антител к тканевой трансглютаминазе может быть сильно снижен у пациентов, которые длительное время принимали иммунодепрессанты или цитостатики.
Глобулины IgM отличаются повышенной активностью, именно они первыми начинают атаковать вредоносные микроорганизмы и бактерии, проникшие в организм. Их концентрация в крови начинает увеличиваться в первые недели развития инфекционного заболевания:
- повышение антител класса M может наблюдаться при внутриутробных инфекциях, паразитарных заболеваниях, патологиях органов дыхания и желудочно-кишечного тракта;
- снижение антител. Часто обнаруживается у людей, перенесших тяжелые кожные ожоги. Также их нехватка может указывать на лимфому.
Продуцирование глобулинов класса G увеличивается при бактериальных инфекциях и аллергии. Повышенный уровень антител IgG может быть признаком красной волчанки, вируса иммунодефицита человека, туберкулеза, суставных заболеваний. Снижение иммунных белков наблюдается при мышечной дистрофии генетической природы, аллергии и опухолевых процессах лимфатической системы.
Определение уровня антител в крови имеет важнейшее значение при диагностировании различных заболеваний. Также исследование незаменимо во время вынашивания ребенка, поскольку оно помогает выявить различные патологии у плода. Но необходимо учитывать, что результат исследования зависит от того, насколько правильно была проведена подготовка. Именно поэтому перед сдачей крови пациенту необходимо строго соблюдать все врачебные рекомендации.
источник
Методика проведения выявления антител: исследование сыворотки на наличие антител с применением желатина.
Оборудование и реактивы:
· тест-эритроциты для скрининга антител
· раствор натрия хлорида 0,9%
· термостат лабораторный на +48°С или водяная баня на +48°С
· пробирки вместимостью 5-10 мл
Порядок проведения исследования:
1. В штатив устанавливают тонкостенные пробирки высотой около 10 см, которые нумеруют. Число и нумерация пробирок должны соответствовать числу и нумерации образцов эритроцитов, с которыми исследуется сыворотка.
2. В пробирки в соответствии с их нумерацией вводят по одной капле (0,05 мл) эритроцитов, приготовленных в качестве стандартов.
3. Во все пробирки прибавляют по две капли (0,1 мл) 10% раствора желатина, подогретого до разжижения. Раствор желатина необходимо тщательно просмотреть перед применением. При помутнении или появлении хлопьев, а также при потере свойств застудневать при температуре +4-8°С, желатин не пригоден.
4. После этого во все пробирки вводят по 1-2 капли (0,1 мл) испытуемой сыворотки, пробирки встряхивают для перемешивания их содержимого и помещают в водяную баню при температуре +46-48°С на 15 минут или в суховоздушный термостат на 45 минут.
5. В пробирки, по извлечении их из водяной бани или термостата, наливают 5-8 мл раствора NaCl 0,9%. Содержимое пробирок перемешивают путем одно-двукратного перевертывания их и наблюдают результат в виде наличия или отсутствия агглютинации эритроцитов.
Трактовка результата:
Содержимое пробирок просматривают в проходящем свете.
Содержимое пробирок, в которых при просмотре невооруженным глазом агглютинация не видна, необходимо микроскопировать.
Для этого каплю содержимого помещают на предметное стекло и просматривают под малым увеличением.
Наличие агглютинации в пробирках с образцами резус-положительных эритроцитов и отсутствие с резус-отрицательными и собственными эритроцитами указывает на содержание в испытуемой сыворотке анти- D антител.
Отсутствие агглютинации со всеми образцами эритроцитов указывает на то, что антитела не выявлены.
Если антитела к антигенам эритроцитов выявлены, а специфичность их подтверждается в лаборатории, имеющей панель типированных эритроцитов, в антиглобулиновом тесте, то, зная их специфичность, можно обеспечить совместимость при переливании крови специальным выбором донора. Если у больного выявлены антитела, но определить их специфичность невозможно, совместимость переливаний крови можно обеспечить индивидуальным подбором донора.
При обнаружении антител к антигенам эритроцитов выписывают ответ, который переносится в историю болезни.
Результаты исследования заносятся в регистрационный журнал с обязательным указанием серии, сроков вскрытия и сроков годности используемых реагентов.
Бланк ответа остается у больного, хранится в течение всей жизни и предъявляется при госпитализации.
Современным подходом к выполнению всего спектра иммуногематологических исследований является Гелевая технология. Метод основан на агглютинации эритроцитов в полиакриламидном геле, помещенном в микропробирки пластиковых диагностических карт. Гель может быть нейтральным, либо содержащим специфические моноклональные антитела или антиглобулиновый реагент.
Исследуемые эритроциты или стандартные эритроциты и исследуемая сыворотка (плазма) помещаются в соответствующие микропробирки, где происходит реакция агглютинации, затем диагностические карточки центрифугируются для разделения результатов реакции. При этом неагглютинированные эритроциты свободно проходят между частицами геля и образуют осадок на дне микропробирки, в то время как агглютинированные располагаются на поверхности или в толще геля. Расположение агглютинатов в геле определяется силой агглютинации и положительный результат может быть оценен от 1+ до 4+. Размер частиц геля, специальный подбор моноклональных или поликлональных антител позволяет достичь наилучших результатов чувствительности и специфичности. А его прозрачность делает считывание результатов более надежными и позволяет интерпретировать самые сложные диагностические случаи.
Виды исследований, которые можно выполнить с помощью гелевой технологии:
· определение групп крови (прямая и двойная реакция)
· широкое типирование антигенов эритроцитов всех известных систем
· скрининг и идентификация аллоантиэритроцитарных антител
· диагностика аутосенсибилизации к антигенам эритроцитов
· индивидуальный подбор гемокомпонентов для переливания и пробы на совместимость
· диагностика посттрансфузионных осложнений и гемолитической болезни новорожденных.
Гелевый тест является простым, воспроизводимым, быстрым и очень чувствительным методом, позволяющим сразу выявлять слабые варианты антигенов. Тест оценивается только макроскопически. После короткого обучения персонала, необходимого для правильного выполнения теста, сводятся к минимуму затраты рабочего времени и ошибки, встречающиеся при использовании традиционных методик. Гелевый тест позволяет стандартизировать лабораторные методики, дать объективную оценку результатов реакции гемагглютинации. Стабильность результатов теста позволяет перепроверять полученные данные, что необходимо для контроля. Результаты тестов могут быть фотокопированы для сохранения их в архиве или для обучения в сложнодиагностируемых случаях. Для теста используется небольшое количество сыворотки или эритроцитов, что чрезвычайно важно для педиатрических клиник.
Использование гелевой системы позволяет снизить риск заражения персонала при работе с потенциально инфицированными образцами. Гелевый тест может быть использован для проведения проб на совместимость по антигенам эритроцитов перед переливанием крови. Для этого используются непрямой антиглобулиновый тест и одностадийный ферментный метод. Гелевый тест выполняется и оценивается по вышеприведенным правилам. Отсутствие этапов отмывание эритроцитов при выполнении непрямого антиглобулинового теста позволяет более эффективно использовать рабочее время, а также благодаря стабильности результатов теста контролировать все полученные данные.
5. Правила взятия крови у пациента и оформления документации.
Для иммуногематологических исследований кровь берется из вены в сухую чистую пробирку, на которой предварительно стеклографом (маркером) надписывается фамилия и инициалы пациента.
Количество зависит от объема исследований, но не менее 3-4 мл.
Сроки хранения крови перед исследованием: не более 72 часов при температуре +4-+8ºС.
С образцом крови в лабораторию передается направление, оформленное следующим образом:
Направление
Поперечные профили набережных и береговой полосы: На городских территориях берегоукрепление проектируют с учетом технических и экономических требований, но особое значение придают эстетическим.
Папиллярные узоры пальцев рук — маркер спортивных способностей: дерматоглифические признаки формируются на 3-5 месяце беременности, не изменяются в течение жизни.
Общие условия выбора системы дренажа: Система дренажа выбирается в зависимости от характера защищаемого.
источник
5.1 Сущность и классификация ИФА.
ИФА появился в середине 60-х годов и первоначально был разработан как метод для индификации антигена в гистологическом препарате, а также для визуализации линий преципитации в тесте иммунодиффузии и иммуноэлектрофореза, а затем стал использоваться для количественного определения антигенов и антител в биологических жидкостях. В разработке метода принимали участие Е.Энгвалл и Р.Пэлман, а также независимо от них В. Ван Вееман и Р.Шурс.
Рис. 6 Основной принцип ИФА:
для выявления антигенов; 2) для выявления антител
Метод основан на специфическом связывании антитела с антигеном, при этом один из компонентов конъюгирован с ферментом, в результатереакции с соответствующим хромогенным субстратом образовывается окрашенный продукт, количество которого можно определить спектрофотометрически (рис. 6).
Открытие возможности иммобилизации антигена и антитела на различных носителях с сохранением их связывающей активности позволило расширить использование ИФА в различных областях биологии и медицины.
Появление моноклональных антител послужило дальнейшему развитию ИФА, что позволило повысить его чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов.
Теоретически ИФА основывается на данных современной иммунохимии и химической энзимологии, знании физико-химических закономерностей реакции антиген-антитело, а также на главных принципах аналитической химии. Чувствительность ИФА и время его проведения определяется несколькими основными факторами: кинетическими, термодинамическими характеристиками реакции антиген-антитело, соотношением реагентов, активностью фермента и разрешающей способностью методов его детекции. В общем виде реакция антиген-антитело может быть описана простой схемой:
Разнообразие объектов исследования от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, а также необычайно широкий круг задач, связанных с многообразием условий применения ИФА, обусловливают разработку чрезвычайно большого количество вариантов этого метода.
Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии:
1. стадия узнавания тестируемого соединения специфическим к нему антителом, что ведет к образованию иммунного комплекса;
2. стадия формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания;
3. стадия превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал. В основу классификации методов ИФА положено несколько подходов:
1. По типу реагентов, присутствующих на первой стадии ИФА, различают конкурентный и неконкурентный методы.
А) В конкурентном ИФА на первой стадии в системе присутствуют одновременно анализируемое соединение и его аналог, меченный ферментном и конкурирующий за центры специфического связывания с ним.
Б) Для неконкурентных методов характерно присутствие в системе на первой стадии только анализируемого соединения и специфичных к нему центров связывания.
2. Все методы ИФА делются на гомогенные и гетерогенные.
Если все три стадии ИФА проходят в растворе и между основными стадиями нет дополнительных этапов разделения образовавшихся иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов, метод относится к группе гомогенных.
В основе гомогенного ИФА, применяемого, как правило, для определения низкомолекулярных субстанций, лежит ингибирования активности фермента при его соединении с антигеном или антителом. Активность фермента восстанавливается в результате реакции антиген-антитело.
При связывании антитела с антигеном, содержащим ферментную метку, происходит ингибирование активности фермента на 95% по отношению к высокомолекулярному субстрату, что обусловлено стерическим исключением субстрата из активного центра фермента. По мере увеличения концентрации антигена связывается все больше антител и сохраняется все больше свободных конъюгатов антиген-фермент, способных гидролизовать высокомолекулярный субстрат. Анализ проводят очень быстро, для одного определения требуется 1 минута. Чувствительность метода достаточно высока. С его помощью можно определить вещество на уровне пикомолей.
Для гетерогенных методом характерно проведение анализа в двухфазной системе с участием твердой фазы – носителя, и обязательная стадия разделения иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов (отмывка), которые находятся в разных фазах (образовавшиеся иммунные комплексы находятся на твердой фазе, а непрореагировавшие комплексы – в растворе). Гетерогенные методы, в которых формирование иммунных комплексов на первой стадии протекает на твердой фазе, называют твердофазными методами.
Методы относятся к гомогенно- гетерогенным, если 1 стадия – образование специфических комплексов происходит в растворе, а затем для разделения компонентов используют твердую фазу с иммобилизированным реагентом.
3. По принципу определения тестируемого вещества:
А) Прямое определение концентрации вещества (антигена или антитела) по числу провзаимодействующих с ним центров связывания. В этом случае ферментная метка будет находиться в образовавшемся специфическом комплексе АГ-АТ. Концентрация определяемого вещества будет прямо пропорциональна регистрируемому сигналу.
Б) Определение концентрации вещества по разности общего числа мест связывания и оставшихся свободными центров связывания. Концентрация определяемого вещества при этом будет возрастать, а регистрируемый сигнал снижаться, следовательно, в данном случае прослеживается обратная зависимость от величины регистрируемого сигнала.
5.2 Характеристика компонентов, используемых в ИФА.
Ферментные метки обладают чрезвычайно мощьным каталитическим действием, одна молекула фермента может реагировать с большим количеством молекул субстрата. Таким образом, фермент, присутствующий в ничтожных количествах, можно выявить и количественно определить по образованию продуктов, катализируемой им реакции. Другое преимущество применения ферментов в качестве меток обусловлено наличием в молекуле многочисленных функциональных групп (сульфгидрильных, карбоксильных, остатков тиразина и др.), через которые можно ковалентно присоединить молекулы лиганда.
Ферментные маркеры, используемые в ИФА, должны обладать следующими свойствами:
– высокая активность и стабильность фермента в условиях анализа, при модификации и в конъюгате с антителами или другими белками;
– наличие чувствительных субстратов и простота метода определения продуктов или субстратов ферментативной реакции;
– возможность адаптации субстратных систем к дальнейшему усилению;
– отсутствие фермента и его ингибиторов в исследуемой биологической жидкости.
В ИФА может использоваться не менее 15 различных ферментов. Наибольшее применение, в соответствии с вышеназванными требованиями, нашли пероксидаза хрена (ПХ), щелочная фосфотаза (ЩФ) и β-D-галактозидаза. Все три стабильны и катализируют высокочувствительные реакции. Кроме того, продукты, получаемые в результате реакций, катализируемых этими ферментами, в зависимости от используемого субстрата, могут выявляться не только колориметрическими методами, но также флуоресцентными методами. Другие ферменты используются значительно реже. Это объясняется их более низкой в сравнении с ПХ и ЩФ удельной активностью.
Выбор субстрата в первую очередь определяется используемым в качестве метки ферментом, так как реакция фермент-субстрат высоко специфична.
Основные требования к субстрату:
– обеспечение высокой чувствительности метода при выявлении фермента в конъюгате;
– образование хорошо учитываемых (например, окрашенных) продуктов реакции фермент-субстрат;
– субстрат должен быть безопасным, дешевым, доступным и удобным для применения.
Чаще используют хромогенные субстраты, которые, разрушаясь, образуют окрашенное вещество. Перспективным является использование высокоэнергетических субстратов – флуоресцентных, хемипюминесцентных. Применение таких субстратов позволяет теоретически повысить чувствительность ИФА на два порядка.
Конъюгат – это антиген или антитело, меченные ферментной меткой. Образование коньюгата – один из важных этапов проведения ИФА.
При формировании конъюгата подбирают такой оптимальный метод введения ферментной метки, чтобы оба компонента конъюгата сохраняли свою биологическую активность: фермент — способность взаимодействовать с субстратом, а антиген или антитело — антигенность и антигенсвязывающую активность, соответственно. Наличие меченого, высокоочищенного антигена позволяет использовать конкурентные методы. В этом случае на конечном этапе можно измерять активность конъюгата, не связанного с иммобилизованными антителами, что позволяет избежать процедуры отмывки и делает анализ более удобным. Однако антигены разнообразны по своим физико-химическим свойствам и строению, а значит невозможно разработать универсальные методики для получения конъюгата с антигеном. В этом случае получение конъюгата антигена с ферментом представляет собой отдельную сложную задачу. Приготовление меченых антител для ИФА методически более доступно.
Конъюгирование фермента с иммунохимически активными белками производится различными методами: химическая сшивка, ковалентное связывание молекулы фермента с АГ или AT и образование соединений через нековалентные связи, например, когда связь между ферментом и АГ или AT осуществляется иммунологически, через взаимодействие антиген-антитело.
Наиболее широкое распространение получили ковалентные способы приготовления конъюгатов. Выбор реакции связывания определяется типом доступных функциональных групп в данных белковых молекулах. В качестве реагентов, используемых для введения фермента в молекулы антигенов и антител, используют глутаровый альдегид, периодат натрия и др.
Существует одноэтапный и двухэтапный методы получения конъюгатов с помощью глутарового альдегида. Могут образовываться конъюгаты различных размеров с редуцированной ферментативной активностью (15 — 60 % от свободного фермента). Образовавшийся конъюгат больших размеров может стерически затруднять определение тестируемого вещества. Конъюгаты с относительно низкой молекулярной массой состоят из Fab-фрагмента и одной молекулы фермента.
В результате двухэтапного синтеза, который заключается в поэтапном получении сначала модифицированного с помощью сшивающего агента фермента, его выделении, а затем последующем взаимодействии его с антигеном (антителом), образуются молекулы однородного состава, содержащие 1-2 молекулы фермента на молекулу иммуноглобулина и сохраняющие высокую ферментативную и иммунологическую активность. Однако количество таких образовавшихся конъюгатов невелико (для пероксидазы хрена составляет 5 — 10 %).
Наибольшее практическое применение нашел метод получения иммунопероксидазных конъюгатов, основанный на окислении углеводного компонента фермента периодатом натрия (связывание пероксидазы в конъюгат достигает 70-90 % от начального количества фермента).
Надежный конъюгат должен обладать следующими свойствами:
— высоким антительным тигром и высокой афинностью к антигену, чтобы его можно было использовать в большом разведении, и таким образом, уменьшить неспецифическое связывание;
— достаточной специфичностью в рабочем разведении;
— преобладанием мономерных форм над полимерными, т.к. полимерные формы имеют тенденцию к неспецифической адгезии на пластике, что приводит к высокому фоновому уровню реакции;
— оптимальным молярным соотношением между ферментом и антителами (оптимальное соотношение составляет около 1:1);
— достаточной ферментативной активностью конъюгата. Это свойство определяется главным образом условиями конъюгации и соотношением молекул фермента и антител в конъюгате.
5.3 Гетерогенные методы ИФА.
Гетерогенные ИФА (или твердофазные ИФА) включают методы, в которых анализируемое соединение находится в двух фазах. Для разделения компонентов иммунохимической реакции используют твердую фазу (нерастворимый носитель, как правило, пластик) с иммобилизованными на ней антителами или антигеном, которую отмывают на каждой стадии с целью удаления промежуточных продукто непрореагировавших компонентов.
Иммобилизацию можно проводить путем ковалентного связывания антител (антигенов) с активированным носителем, используя химические подходы, а также путем физической адсорбции антител (антигенов) на поверхности твердых полимеров (например, полистирольных пластин). В зарубежной литературе это направление получило название ELISA-тест или энзимсвязанный иммуносорбентный метод (от англ. enzyme-linked immunosorbent assay).
Неконкурентный ИФА определения антигенов на примере использования меченых ферментом специфических антител и иммобилизованных антител.
К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген. В процессе инкубации образуется специфический комплекс антиген-антитело. Затем носитель отмывают от несвязавшихся антигенов и добавляют меченые антитела – конъюгат. При этом количество связавшегося конъюгата прямо пропорционально количеству антигена в исследуемом образце. После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата добавляют хромогенный субстрат для используемого фермента, который изменяет цвет под действием фермента, т. е. происходит ферментативная реакция с окрашиванием раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна количеству меченых ферментом специфических антител, фермента и, соответственно, исследуемого антигена. Измерения оптической плотности раствора в лунках при определенной волне (в зависимости от используемого субстрата) проводят с помощью специальных спектрофотометров, адаптированных для микропланшетов – ридеров. Количественную оценку концентрации антигена в пробе определяют, сравнивая результаты с калибровочной кривой зависимости оптической плотности раствора от концентрации стандартного раствора антигена.
Поскольку на стадии выявления специфического иммунокомплекса антиген оказывается связанным с молекулами иммобилизованных и меченых антител, в литературе этот метод часто называют «сэндвич»-метод (от англ. sandvich) или двухцентровый метод ИФА (от англ. two-site assay).
Этот метод может быть использован для анализа только тех антигенов, на поверхности которых имеется, по крайней мере, две антигенные детерминанты. Для анализа большого количества моновалентных антигенов (лекарственных соединений, пестицидов и др.) он неприемлем.
Основное достоинство данного метода – высокая чувствительность. Предел обнаружения соединений данным методом в настоящее время достигает величины порядка 10-21 моль, что соответствует обнаружению в образце всего 600 молекул анализируемого вещества. Максимальная чувствительность достигается при проведении каждой иммунологической реакции в равновесном режиме, что сказывается на длительности проведения анализа, которая в среднем составляет 4 – 6 часов. Неконкурентный ИФА определения антител на примере использования меченых ферментом вторичных антител и иммобилизованных антигенов.
К иммобилизованному антигену добавляют исследуемую сыворотку. После инкубации и отмывания от несвязавшихся антител добавляют меченые вторичные антитела, которые специфичны к анализируемым антителам. После вторичной инкубации и удаления избытка меченых вторичных антител содержание ферментной метки на носителе пропорционально концентрации специфических антител в сыворотки.
Данная схема является одной из наиболее распространенных ИФА определения антител, поскольку позволяет выявлять антитела к разным антигенам.
Гетерогенный конкурентный ИФА определения антигена на примере использования меченого антигена и иммобилизованных антител.
К иммобилизованным на носителе антителам добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген и фиксированную концентрацию конъюгата антигена с ферментом. После проведения инкубации носитель отмывают от несвязавшихся свободного и меченого антигена и регистрируют ферментативную активность на носителе, которая обратно пропорциональна концентрации определяемого антигена.
Гомогенный иммуноферментный анализ (ГИФА) — наиболее простой в методическом отношении вид ИФА. При его постановке один из участников иммунной реакции (обычно это низкомолекулярный антиген) метится ферментом и за ходом формирования комплекса антиген-антитело следят, регистрируя изменение активности фермента.
Такое нарушение ферментативной активности может возникать либо за счет пространственного разобщения фермента и субстрата, либо за счет конформационных изменений в молекуле фермента, сопровождающих формирование иммунного комплекса. ГИФА имеет ряд существенных преимуществ перед другими иммунохимическими методами. Во-первых, высокая экспрессия (весь анализ с помощью ГИФА , занимает минуты и даже доли минут).
Рис.8 Варианты гомогенного иммуноферментного анализа(А- эффект разобщения фермента (Ф) и субстрата (С) за счет стерических препятствий при взаимодействии антигена (Аг) и антитела (Ат); Б- эффект изменения конформации фермента при формировании комплекса антиген- антитело).
Во-вторых, метод имеет одну стадию и не требует трудоемких и требующих времени этапов промывки. И наконец, в-третьих, метод требует минимальных объемов (8-50 мкл) и количеств биологического или клинического образца. Однако у метода ГИФА имеется один крайне существенный недостаток — на его основе можно создавать диагностические тест-системы только для низкомолекулярных антигенов. Только, в этом случае антитело, взаимодействуя с антигеном, может эффективно экранировать или модифицировать связанную с этим антигеном молекулу фермента. Именно в связи с этим, ( несмотря на кажущуюся простоту и очевидные преимущества перед другими методами, на основе ГИФА были созданы диагностикумы для выявления только гормонов, пептидов, лекарственных и наркотических веществ и некоторых низкомолекулярных белков.
5.5 «Сэндвич» — вариант ИФА для выявления антигенов.
Антигены, определяемые с помощью данного варианта ИФА, должны иметь несколько эпитопов, способных связывать антитела, или обладать повторяющимися, пространственно разделенными эпитопами одинаковой специфичности.
При проведении этого варианта ИФА высокоспецифичные поли- или моноклональные антитела, адсорбированные на твердой фазе, инкубируют с исследуемым образцом. После процедуры отмывания в лунки вносят меченные ферментом антитела (конъюгат) к тому же антигену и далее проводят все остальные этапы реакции. Эффективность образования специфического комплекса на каждой стадии анализа зависит от константы связывания реакции антиген-антитело.
источник
Анализ крови на антитела показывает, какие заболевания ранее перенес человек, и чем болен на момент проведения. Количественный показатель глобулинов позволяет определить тип возбудителя, и выяснить, почему больной страдает той или иной патологией. Антитела в крови появляются при иммунизации, когда человек переносит инфекцию и при искусственной вакцинации.
Антитела — иммуноглобулины или глобулины, задачей которых является улавливание и уничтожение чужеродных микроорганизмов. Они вырабатываются как с целью защиты от возбудителей, так и для атаки здоровых тканей, что уже является отклонением.
Анализ на антитела выдает их уровень, что позволяет судить о различных заболеваниях, или аутоиммунном процессе. Высокий уровень глобулинов указывает на реакцию, вызванную попаданием антител.
Формирование белков в крови начинается в двух случаях:
- Когда человека впервые атакуют болезнетворные агенты и он переносит инфекцию.
- Когда специально вводятся ослабленные бактерии (прививки).
Развитие иммунологической памяти является важным процессом, когда глобулины запоминают антигены (антитела прикрепляются к ним), и обезвреживают их при повторном попадании. Важный показатель состояния иммунной системы — антитела и их число.
Есть несколько классов иммуноглобулинов, число которых и определяется при анализе. Это IgG, IgA, IgE, IgM, IgD. Классификация антител делит их на те, которые появляются сразу с развитием инфекции и через определенное время, то есть при хроническом процессе. Влияние их на организм может быть нейтральным, положительным и вредным. Вред заключается в аутоиммунных болезнях, когда антитела начинают атаковать здоровые ткани организма, принимая их за чужеродные.
Проведение анализа позволяет проследить за динамикой развития некоторых патологий. Исследование помогает определить, почему глобулины снижены или повышены, что это значит, и что с этим делать в дальнейшем.
Исследование на антитела в крови будет проведено при подозрении на недостаток иммуноглобулинов. Их дефицит становится причиной ослабленного иммунитета и развития вторичного иммунодефицита.
Исследование на уровень иммуноглобулинов может назначаться при следующих патологиях:
- количество антител к ТПО (тиреопероксидазе, направленной против клеток щитовидной железы) позволяет определить патологии щитовидки аутоиммунного происхождения;
- гепатиты разных видов;
- вирус иммунодефицита — анализ назначается 3 раза, после чего можно поставить диагноз;
- дифтерия, столбняк;
- хламидиоз, герпес, сифилис;
- лептоспироз, цитомегаловирус, уреаплазмоз.
- рецидивирующие инфекционные болезни;
- слабый иммунитет, что проявляется частыми болезнями, плохим самочувствием, проблемами с ногтями и волосами;
- тяжелые системные заболевания любого происхождения;
- постоянные воспалительные заболевания слизистой полости рта — стоматиты, гингивиты, пародонтиты;
- сыпь на коже неизвестного происхождения, появление язвочек на слизистой полости рта и половых органов;
- мужское аутоиммунное бесплодие;
- подготовка к хирургическому вмешательству;
- послеоперационное восстановление;
- прохождение иммуноглобулиновой терапии.
Выявление числа антител происходит путем исследования сыворотки. Такой анализ позволяет оценить иммунитет, подтвердить или опровергнуть наличие инфекционного или паразитарного заболевания.
По тому, какие глобулины определяются в крови, специалист может поставить диагноз и определить период патологии. Так, при обнаружении класса G, специалист может судить о наличии грибка, вируса и токсинов, выделяемых различными микроорганизмами.
Именно глобулины G формируют иммунитет, предупреждающий повторное инфицирование уже перенесенными заболеваниями. Также эти иммунные белки отвечают за формирование защиты в период внутриутробного формирования.
Для определения специфических белков забирается венозная кровь. Процедура выполняется натощак. При подготовке к анализу следует отказаться от спиртных напитков. Забирать кровь можно только через 4 часа после приема еды, если анализ назначен в дневное время.
Исследование, направленное на определение уровня антител, называется иммунофлюоресцентным анализом или ИФА. Антиген и антитело присоединяются друг другу, затем в материал добавляется специальное вещество, окрашивающее эти иммунные комплексы. По окрасу определяется концентрация иммунных белков в крови.
ИФА обладает высокой специфичностью, дает правильный результат даже при наличии небольшого числа иммунных комплексов. Для получения результатов необходимо подождать около 2 дней. Срочное заключение можно получить уже в течение нескольких часов.
Иммуноглобулиновый анализ крови выполняется с целью определения числа глобулинов IgA, IgG, IgM. Норма будет отличаться у детей, женщин и мужчин.
IgA (г/л) | IgM (г/л) | IgG (г/л) | |
---|---|---|---|
Дети | 0,15 — 2,5 | 0,8 — 1,6 | 7,2 — 13,4 |
Женщины | 0,53 — 3,44 | 0,38 — 1,96 | 5,88 — 16,2 |
Мужчины | 1,02 — 4,05 | 0,55 — 1,43 | 6,63 — 14,01 |
Глобулины IgA содержатся на слизистых, в ротовой жидкости, молоке кормящей женщины, слезах, секрете бронхов, желудке. Их задачей будет нейтрализация вирусных агентов. Иммуноглобулины этого класса защищают от попадания возбудителя через органы дыхания, выделительную систему и пищеварительный тракт.
О чем свидетельствует показатель класса A:
- Повышение содержания в крови. Наблюдается при алкоголизме, заболеваниях суставов, хронических патологиях гепатобилиарной системы, гнойных инфекционных процессах. Высокий уровень также регистрируется при болезнях желудочно-кишечного тракта.
- Снижение титра антител — при болезнях крови, злокачественной анемии, при дерматологических патологиях, облучением радиацией. Низкий уровень возможен при длительном приеме иммунодепрессантов. Также происходит снижение белка при лечении цитостатиками.
Глобулины класса М первыми начинают атаковать патологические микроорганизмы, которые проникают в организм. Содержание IgM в сыворотке крови повышается в начале первого месяца инфекционного заболевания. Эти глобулины имеются в плазме, они нейтрализуют вирусные и бактериальные агенты в крови.
О чем свидетельствует уровень класса М:
- Повышение в крови. Высокий уровень определяется при внутриутробных инфекциях, паразитарных патологиях, болезнях органов дыхания и желудочно-кишечного тракта. Повышение говорит о хроническом течении.
- Снижение в крови. Свидетельствует о заболеваниях ЖКТ, лимфоме. Низкий уровень определяется о людей, пострадавших от ожогов.
Глобулины класса G появляются при бактериальных инфекциях и аллергии.
О чем свидетельствует показатель класса G:
- Повышение в крови. Происходит при системной красной волчанке, туберкулезе, ВИЧ, саркоидозе, заболеваниях суставов.
- Снижение иммунных белков в крови. Наблюдается в случае мышечной дистрофии (генетически обусловленной), аллергии, при лимфадените и новообразованиях лимфатической системы.
Аутоантитела представляют собой иммунные белки, которые в отличие от иных глобулинов направлены на уничтожение собственных тканей организма. Их образование нередко происходит спонтанно, и определить причину невозможно. Чаще же они появляются после перенесения инфекций.
Их образование происходит при аутоиммунных болезнях — ревматоидный артрит, склероз, системная красная волчанка, бесплодие. В некоторых случаях появление аутоантител происходит задолго до развития симптомов заболевания.
К Torch-инфекциям относятся токсоплазмоз, герпес, краснуха и цитомегаловирус.
- о необходимости прививки свидетельствуют отрицательные титры М и G;
- о том, что прививка не нужна говорят положительные титры G и отрицательные M;
- об остром начальном периоде говорят положительные титры М и отрицательные G;
- об остром процессе в поздний период говорят положительные титры М и G.
Расшифровка комбинаций антител в крови к вирусам:
- Минус IgM, IgG — иммунитета нет, организм еще не встречался с возбудителем. Это повод пройти вакцинацию и заняться укреплением защитных сил. Такой результат говорит о высоком риске заражения.
- Плюс IgM, минус IgG — произошло первичное заражение, вирусное заболевание находится в острой стадии. В таком случае начинается лечение, предварительно определяется возбудитель.
- Минус IgM, плюс IgG — болезнь была перенесена ранее, также это может указывать на хроническое течение патологии, которая находится в ремиссии. Результат говорит о приобретенном иммунитете.
- Плюс IgG, IgM — хроническое вирусное заболевание в стадии обострения. Реже такой результат выдается при прохождении курса терапии.
Резус антитела — белок, находящийся на поверхности таких кровяных телец, как эритроциты. Он может отсутствовать, тогда людей называют резус-отрицательными.
Отсутствие не сказывается на состоянии здоровья и не влияет на функционирование иммунитета. Риск есть в том случае, когда резус не совпадает у беременной и плода. Наличие резус конфликта становится причиной патологий почек, гепатобилиарной системы и головного мозга у новорожденного.
Анализы на резус и группу крови показаны в начале беременности и затем каждые 30 дней. При необходимости женщине назначаются специальные лечебные мероприятия.
Резус конфликт становится причиной выкидыша и гемолитического заболевания. Для определения вероятности этого женщине следует проходить исследование еще в период планирования беременности и уже во время вынашивания плода.
Важно! Конфликт возможен только тогда, когда беременная резус-отрицательная, а будущий ребенок резус-положительный. Частота случаев составляет 1 на 200 родов. Когда плод резус-отрицательный, а женщина резус-положительная иммунологический конфликт и гемолитическая болезнь исключены.
Поводами к проведению исследования на резус будут:
- планирование беременности;
- первый триместр;
- осложненная беременность;
- назначение к проведению гемотрансфузии;
- гемолитическое заболевание у новорожденного.
Результат бывает отрицательным и положительным. Во втором случае в отдельной графе будет указано, что обнаружены аллоиммунные тела в определенном титре.
При инфицировании лямблиями глобулина класса М обнаруживаются спустя 1-2 недели. Два других класса появляются через 20 дней. После двух месяцев их число падает при условии успешно подобранной терапии.
Положительный результат не всегда говорит о болезни в настоящее время. Антитела будут выявлены и в том случае, когда человек ранее переболел, ведь долгое время они сохраняются в крови. Нормой будут титры в пределах 1/100.
Для ранней диагностики сифилиса применяется метод выявления суммарных антител. В отличие от альтернативных вариантов исследований, такой способ практически полностью исключает ложный результат.
Суммарность антител — обнаружение глобулинов М и G. При заражении в острой фазе заболевания выявляется глобулин М. При хроническом течении обнаруживается класс G. В результате исследования выдается коэффициент, определяющий итог.
Результат плюс указывает либо на наличие сифилиса, либо на выздоровление после медикаментозного лечения. Отрицательный показатель говорит либо об отсутствии бледной трепонемы, либо о инфицировании незадолго до теста.
Показания к проведению — подозрение на сифилис для его диагностики или опровержения, комплексное обследование, подготовка к хирургическому вмешательству. Исследование также назначается донорам крови.
Сдать кровь на выявление количественного показателя иммунных белков можно в диагностической лаборатории. Лучше выбирать клинику, расположенную недалеко от дома, ведь дорога будет стрессом, что может сказаться на результатах тестирования.
Стоимость в среднем варьирует от 370 до 600 рублей. При этом учитывается вид исследования, ведь цена существенно отличается при проведении анализа на Torch-инфекции, определении резус антител, выявлении отдельных возбудителей.
Выявление Torch-инфекций, что назначается во время планирования беременности, обойдется в 2500 рублей. На определенные конкретной инфекции уйдет не более 600 и не менее 350 рублей. Также учитывается стоимость самого забора крови, которая в клиниках варьирует от 100 до 200 рублей.
Пройти исследование можно по назначению врача или по собственному желанию с целью выяснения наличие той или иной инфекции. Чтобы результаты были достоверными, важно соблюдать правила подготовки. Важным условием будет информирования врача о принимаемых лекарствах в последние дни перед процедурой. Также нужно сообщить о самочувствии, качестве сна и питания накануне исследования.
источник
Иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA). Суть, принцип метода и этапы исследования. Анализ на антитела, классы антител, иммунный комплекс.
В связи с развитием клеточных технологий, молекулярной биологии, генетики, физики, химии и ряда других высокотехнологичных дисциплин в повседневную практику внедряются новые высокоточные и высокотехнологичные методы. Данные междисциплинарные тенденции затрагивают и область медицинских знаний, и смежные области биологических, биохимических проблем. За последние десять лет получил широкое распространение и внедрение в массовую практику метод клинической лабораторной диагностики под названием иммуноферментный анализ.
Вообще технологии иммунологических ферментативных и радиологических реакций широко использовались в типировании клеток, культур клеток, различных тканей с начала 80-х годов XX столетия. Однако методы эти были очень трудоемкими, не унифицированными, не стандартизированными, что исключало их использование в лечебно-диагностических целях в массовом порядке. Такими методами пользовались лишь узкие, наукоемкие и высокоспециализированные лаборатории.
Однако с развитием техники, микротехники, производства различных биополимерных материалов стало возможным производить готовые наборы иммуноферментной диагностики, которыми смогут пользоваться лаборатории лечебно-профилактических учреждений широкого профиля. ИФА широко используется для диагностики всевозможных инфекций (хламидиоз, сифилис, цитомегаловирус, токсоплазмоз, герпес и т.д.), как острых, так и хронических, а также скрытых форм, которые протекают без клинических симптомов.Также этот метод применяют для контроля над хроническими заболеваниями. Давайте постараемся разобраться, что это за метод, и какие принципы лежат в его основе?
Что такое иммунная реакция? Что такое антиген?
В первую очередь разберем, что такое иммунные реакции. Иммунные реакции – это специфические реакции связывания антигена с антителом с образованием иммунного комплекса. Что это значит? На поверхности каждой клетки любого организма имеются особые структуры, которые называются антигены. Антигены в целом – это молекулы, которые несут информацию о клетке (подобно информации на бейдже у человека, где указываются основные данные этого человека).
Индивидуальные и видовые антигены – что это? Зачем нужны эти антигены?
Имеются антигены индивидуальные, то есть присущие только данному конкретному организму. Эти индивидуальные антигены разные у всех людей, есть похожие друг на друга, но все равно отличающиеся. Двух одинаковых копий индивидуальных антигенов в природе не существует!
Второй основной тип антигенов – это видовые антигены, то есть присущие какому-либо конкретному виду живых существ. Например, у человека присутствует свой видовой антиген, общий для всех людей, у мышей имеется свой мышиный видовой антиген и т.д. На поверхности каждой клетки обязательно присутствуют видовой и индивидуальный антиген.
Видовой антиген используют клетки иммунной системы для опознавания «свой – чужой».
Как происходит узнавание антигена?
Иммунная клетка связывается с подозрительной клеткой и проводит опознание именно по индивидуальному антигену. В памяти иммунной клетки «записано» как выглядит «свой антиген». Таким образом, если антиген подозрительной клетки совпадает с описанием «свой антиген», значит, эта клетка собственного организма и опасности не представляет. Тогда иммунная клетка «отвязывается» и уходит. А если антиген не совпадает с описанием «свой», тогда иммунная клетка идентифицирует эту клетку как «чужой», а значит потенциально опасный для всего организма. В этом случае иммунная клетка не «отвязывается», а начинает уничтожать опасный объект. Точность такого иммунологического узнавания поражает воображение – 99,97%. Ошибок практически не бывает!
Что такое антитело, иммунный комплекс?
А что представляет собой антитело?
Антитело – это особая молекула, расположенная на поверхности иммунной клетки. Именно антитело и связывается с антигенами подозрительной клетки. Далее антитело передает информацию внутрь клетки, где происходит опознавание, и получает обратный сигнал двух видов «свой» или «чужой». При сигнале «свой» антитело разрушает связь с антигеном и отпускает клетку.
Что такое иммунный комплекс?
При сигнале «чужой» ситуация разворачивается иначе. Антитело не разрывает связь с антигеном, а наоборот, посылая специфические сигналы, вызывает «подкрепление». Биологически это означает, что другие антитела, находящиеся в другой части клетки, начинают перемещаться к участку, откуда идет сигнал опасности, и также образуют связь между собой и пойманным антигеном. В конце концов, антиген оказывается, окружен со всех сторон и прочно привязан.Такой комплекс антиген + антитело называется иммунный комплекс. С этого момента начинается утилизация антигена. Но сейчас подробности процесса нейтрализации антигена нас не интересуют.
Виды антител (IgA, IgM, IgG, IgD, IgE)
Антитела – это белковые структуры, которые, соответственно, имеют химическое название, которое и используется как синоним слова антитела. Итак, антитела = иммуноглобулины.
Существуют 5 типов иммуноглобулинов (Ig), которые связываются с разными видами антигенов в разных местах человеческого организма (например, на коже, на слизистых, в крови и т. д.). То есть антитела имеют разделение труда. Эти иммуноглобулины называются буквами латинского алфавита – A, M, G, D, E и обозначаются следующим образом – IgA, IgM, IgG, IgD, IgE.
В диагностике используют только один вид антител, который наиболее специфичен в отношении определяемого микроба. То есть связывание данного вида антител с определяемым антигеном происходит всегда. Чаще всего применяются IgG и IgM.
Именно этот принцип иммунной реакции (уникальная точность и специфичность узнавания определяемого биологического объекта) лежит в основе иммуноферментного анализа.В силу высокой точности антител в узнавании антигенов, точность всего метода иммуноферментного анализа оказывается также высочайшей.
Какая реакция – ферментативная? Что такое сродство, субстрат и продукт реакции?
Перейдем к рассмотрению ферментативной реакции в работе метода иммуноферментного анализа.
Что такое ферментативная реакция?
Ферментативная реакция – это химическая реакция, при которой одно вещество под действием фермента превращается в другое. Вещество, на которое действует фермент,называется субстратом. А вещество, которое получается в результате воздействия фермента, называется продуктом реакции. Причем особенность ферментативной реакции такова, что определенный фермент действует только на определенный субстрат. Такое свойство фермента узнавать «свой» субстрат называется сродством.
Таким образом, каждый фермент проводит только одну, специфичную для него реакцию. Ферментов в биологическом мире известно великое множество, равно как и ферментативных реакций. В иммуноферментной диагностике используется лишь несколько ферментативных реакций – не более 10.При этом выбирали такие ферментативные реакции, продуктом которых являются окрашенные вещества. Почему же продукты ферментативной реакции должны быть окрашенными? Потому что для вычисления концентрации вещества по окрашенному раствору существует простой химический метод – колориметрия.
Колориметрия применяет измерение плотности окраски раствора, а по плотности окраски вычисляют концентрацию вещества.При этом специальный прибор – колориметр измеряет плотность окраски раствора. В колориметрии возможны два варианта зависимости плотности окраски от концентрации вещества – это прямо пропорциональная зависимость или обратно пропорциональная зависимость. При прямо пропорциональной зависимости, чем выше концентрация вещества, тем интенсивнее плотность окраски раствора. При обратно пропорциональной зависимости, чем выше концентрация вещества, тем ниже плотность окраски раствора. Технически это происходит так: берется несколько растворов с известной концентрацией вещества, измеряется плотность этих растворов, строится график зависимости концентрации от плотности окраски (калибровочный график).
Далее измеряют плотность окраски раствора, концентрацию которого выясняют, и по калибровочному графику находят значение концентрации, соответствующее уровню измеренной плотности окраски раствора.В современных автоматических колориметрах только один раз проводят калибровку, далее аппарат сам строит калибровочную кривую, которая остается в памяти прибора, и измерение происходит автоматически.
В иммуноферментном анализе чаще всего применяются следующие ферменты: пероксидаза, щелочная фосфатаза, авидин.
Как же совмещаются иммунологическая и ферментативная реакция в иммуноферментном анализе? Сейчас мы перейдем к рассмотрению собственно иммуноферментного анализа. Какие этапы он включает и что происходит при протекании этих реакций? Иммуноферментный анализ бывает прямой и непрямой.
В прямом иммуноферментном анализе используют антитела к выявляемому антигену, соединенные со специфической меткой. Эта специфическая метка и есть субстрат ферментативной реакции.
Прикрепление антигенов к поверхности лунки и соединение антигена с антителом
Как проходит прямой иммуноферментный анализ? Берется биологический материал (кровь, соскобы со слизистых, мазки) и помещается в специальные лунки. Биологический материал оставляют в лунках на 15-30 минут, чтобы антигены могли приклеиться к поверхности лунок. Далее в эти лунки добавляют антитела к выявляемому антигену. Это значит, что выявляя антигены, например, сифилиса, добавляются антитела против антигенов сифилиса. Эти антитела получают промышленным способом, а лаборатории покупают уже готовые наборы.Данную смесь исследуемого материала и антител оставляют на некоторое время (от 30 минут до 4-5 часов), чтобы антитела смогли найти и связаться со «своим» антигеном.Чем больше в биологической пробе антигенов, тем больше антител свяжется с ними.
Удаление «лишних» антител
Как было указано, антитела к тому же связаны со специфической меткой.Поскольку антитела добавляются в избытке, то не все они свяжутся с антигенами, а если антигена вообще нет в пробе, то, соответственно, ни одно антитело не свяжется с искомым антигеном. Для того чтобы убрать «лишние» антитела, содержимое из лунок просто выливают. В результате этого все «лишние» антитела убираются, а остаются те, которые связались с антигенами, поскольку антигены «приклеены» к поверхности лунок. Лунки несколько раз ополаскивают специальным раствором, который позволяет вымыть все «лишние» антитела.
Ферментативная реакция – образование окрашенного соединения
Далее начинается второй этап – ферментативная реакция. В промытые лунки добавляют раствор с ферментом и оставляют на 30-60 минут. Данный фермент имеет сродство к веществу (специфической метке), с которым связаны антитела. Фермент проводит реакцию, в результате которой эта специфическая метка (субстрат) превращается в окрашенное вещество (продукт). Затем методом колориметрии находят концентрацию этого окрашенного вещества. Поскольку данная специфическая метка связана с антителами, значит, концентрация окрашенного продукта реакции равна концентрации антител. А концентрация антител равна концентрации антигенов. Таким образом, в результате проведенного анализа мы получаем ответ, какова концентрация выявляемого микроба или гормона.
Именно так проходит прямой иммуноферментный анализ. Однако сегодня чаще используют непрямой иммуноферментный анализ, поскольку чувствительность и точность непрямого выше, чем прямого. Итак, перейдем к непрямому иммуноферментному анализу.
В непрямом иммуноферментном анализе два этапа. При проведении первого этапа используют немеченые антитела к выявляемым антигенам, а во втором этапе применяют меченые антитела к первым немеченым антителам. То есть получается не прямое связывание антитела с антигеном, а двойной контроль: связывание антител с антигеном, после чего связывание вторых антител с комплексом антитело + антиген. Как правило, антитела для первого этапа – мышиные, а для второго – козьи.
Фиксация антигенов на поверхности лунки и связывание антигена с немеченым антителом
Так же как и для прямого иммуноферментного анализа производится забор биологического материала – кровь, соскобы, мазки. Исследуемый биологический материал вносят в лунки и оставляют на 15-30 минут для приклеивания антигенов к поверхности лунок. Затем в лунки вносят немеченые антитела к антигенам и оставляют на промежуток времени (1-5 часов), чтобы антитела связались со «своими» антигенами и образовали иммунный комплекс (первый этап). После чего удаляют «лишние», не связавшиеся антитела, путем выливания содержимого лунок. Производят промывку специальным раствором для полного удаления всех не связавшихся антител.
Связывание меченого антитела с комплексом антиген + немеченое антитело
После чего берут вторые антитела – меченые, добавляют в лунки и опять оставляют на некоторое время – 15-30 минут (второй этап). За это время меченые антитела связываются с первыми – не мечеными и образуют комплекс – антитело + антитело + антиген. Однако и меченые, и не меченые антитела вносятся в лунки в избытке. Поэтому нужно опять удалить «лишние», уже меченые антитела, которые не связались с немечеными антителами. Для этого повторяют процедуру выливания содержимого лунок и промывки специальным раствором.
Ферментативная реакция – образование окрашенного соединения
После чего вносят фермент, осуществляющий реакцию превращения «метки» в окрашенное вещество. Окраска развивается в течение 5-30 минут. Затем проводят колориметрию и вычисляют концентрацию окрашенного вещества. Поскольку концентрация окрашенного вещества равна концентрации меченых антител, а концентрация меченых равна концентрации немеченых антител, которая, в свою очередь равна концентрации антигена. Таким образом, получаем концентрацию выявляемого антигена.
Такой двойной контроль в виде использования двух видов антител позволил повысить чувствительность и специфичность метода иммуноферментного анализа. Несмотря на удлинение времени проведения анализа и включение дополнительных этапов, эти потери компенсируются точностью результата. Именно поэтому в настоящее время подавляющее большинство методик иммуноферментного анализа – это непрямой иммуноферментный анализ.
Перейдем к рассмотрению того, какие заболевания и какие биологически активные вещества выявляются методом иммуноферментного анализа. Вещества, выявляемые методом иммуноферментного анализа, представлены в таблице.
источник