Нейтрализующие антитела к интерферону бета анализ

Способ определения нейтрализующих антител в сыворотке крови больных рассеянным склерозом, леченных препаратами интерферона-бета

Владельцы патента RU 2626832:

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для определения нейтрализующих антител (HAT) в сыворотке крови больных рассеянным склерозом, леченных препаратами интерферона-бета (ИФНβ). Для этого применяют цитопатический тест с использованием чувствительной к вирусу энцсфаломиокардита мышей (ЕМС) культуры клеток фибробластов легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ). Определение HAT к препарату ИФНβ проводят при помощи реакции нейтрализации антивирусной активности методом титрования сыворотки рефрактерного к лечению соответствующим препаратом пациента, определением HAT к препарату ИФНβ. Проводят культивирование клеток ФЛЭЧ в условиях 37±2°С в атмосфере CO₂ 5,0±0,5% и 90±5% влажности в среде DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) в течение 1 суток в ячейках плоскодонного 96-луночного планшета в количестве 20-50 тыс.кл./яч. В день постановки теста разводят контрольную ЭТС и испытуемую сыворотку пациента в 10 или в 20 раз. Затем в ячейках круглодонного планшета готовят по 100 мкл разведений препарата ИНФβ в нсобогащенной сывороткой среде RPMI-1640: 2000; 1000; 500; 250; 125; 63; 31; 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25; 0 МЕ/мл; в ячейки с двумя приготовленными разведениями препарата ИФНβ параллельно вносят по 100 мкл разведенные в 10 или 20 раз сыворотки пациента и контрольной ЭТС. Инкубируют планшет 1 час в условиях CO₂-инкубатора. Далее удаляют среду из культуральных планшетов с преинкубированными клетками ФЛЭЧ и в ячейки вносят по 100 мкл приготовленных разведений препарата с сывороткой пациента. Проводят инкубацию планшетов с клетками в течение 22-24 часов, далее в необогащенную сывороткой основу среды DMEM вносят вирус-индикатор ЕМС или VSV (вирус энцефаломиокардита мышей/вирус везикулярного стоматита, штамм «Индиана») в дозе составляющей 10 2±0,25 ТЦД50 в 0,1 мл. Проводят инкубирование в термостате 22-24 часа. Через сутки оценивают цитопатическое действие вируса в зависимости от наличия нейтрализующей ИНФβ активности сыворотки пациента по формуле: HAT (НЕ/мл)=А (МЕ/мл)×Z, где А (МЕ/мл) — максимальная нейтрализуемая активность препарата ИНФ-бета, при которой наблюдается цитодеструктивное действие вируса на монослой чувствительной культуры ФЛЭЧ, выраженная в международных единицах на 1 мл; Z — разведение сыворотки пациента. Использование данного способа позволяет оценку эффективности лечения препаратами у пациентов, в течение длительного времени подвергавшихся лечению препаратами ИФНβ путем количественного определения ИНФβ нейтрализующих антител. 1 з.п. ф-лы, 3 пр., 2 табл.

Изобретение относится к иммунологии, медицине, а именно к лабораторной диагностике наличия и количественной оценки уровня нейтрализующих антител (HAT) в сыворотке крови больных рассеянным склерозом (PC), получавших терапию препаратами интерферона-бета (ИФНβ). Описанный способ исследования направлен на оценку эффективности лечения препаратами у пациентов, в течение длительного времени подвергавшихся лечению препаратами ИФНβ. Практическим результатом диагностической процедуры с использованием заявленного способа является коррекция выбранной схемы лечения по назначению/замене и количеству используемого препарата.

Рассеянный склероз (PC) — хроническое, этиологически мультифакториальное прогрессирующее демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы [1, 2]. Превентивная терапия, основанная на применении препаратов интерферона бета (ИФНβ) и используемая с 1990-х годов, позволила совершить поистине революционный переворот и изменить течение и прогноз этой болезни. Она проводится в период ремиссии и стабилизации (вне обострения PC) и нацелена на предупреждение обострений при прогрессировании инвалидизации, при ремиттирующем и вторично прогрессирующем течении болезни [1, 2, 3].

ИФНβ (1а и 1b), используемые в терапии PC, как продукты генноинженерных технологий, являются белковыми субстанциями. В этой связи они потенциально иммуногенны. HAT против ИФНβ возникают в результате нарушения иммунотолерантности, ассоциированной с процессами повторного представления антигена [2, 4]. Эффекторами иммунного ответа на введение терапевтических препаратов ИФНβ выступают т.н. нейтрализующие антитела (HAT), блокирующие активность молекул ИФН на этапе их связывания со специфическими рецепторами [5]. Сообщается, что HAT могут быть обнаружены в крови пациентов с PC, получающих ИФНβ, уже по прошествии 3-6 мес после инициации лечения [1, 4]. Частота их появления зависит от используемых препаратов ИФН-бета. Так, по данным Т.Е. Шмидт и Н.Н. Яхно (2010), HAT к ИФНβ-1b появляются у 28-45% больных, к ИФНβ-1а для подкожного введения — у 11-24%, а к ИФНβ-1a для внутримышечного введения — лишь у 2-5% пациентов [1, 2].

В различных публикациях сообщается, что у НАТ-позитивных пациентов с PC (особенно с высокими титрами) существенно снижается эффективность терапии ИФНβ [1, б].

Определение HAT является чрезвычайно трудоемким процессом, поскольку использование скрининг-исследований на основе методы ELISA, белкового иммуноблота, радиоиммунопреципитации или аффинной хроматографии не позволяет дифференцировать обнаруженную активность связывания ИФНβ между связывающими антителами (CAT) и HAT [1]. Поэтому выявление HAT основано на специфических функциональных клеточных тестах.

При исследовании HAT in vitro D. Hess и соавт. (2007, 2009) использовали тест, получивший название «индукции МхА» [1, 7, 8]. Этот метод позволяет определить способность HAT, присутствующих в сыворотке крови пациентов, к снижению ИФНβ-индуцированной экспрессии специфического маркера ИФН — МхА (в форме мРНК или на белковом уровне). МхА — это белок резистентности к миксовирусам. Предполагается, что мРНК маркера МхА является наиболее чувствительным показателем при исследовании HAT; он получает все большее распространение [1,4].

В настоящее время перспективным методом исследования является так называемое люциферазное исследование, основанное на использовании клеток фибросаркомы человека с внесенной люциферазной кассетой гена-репортера (при наличии HAT связывания молекулы ИФНβ с соответствующим рецептором и активации трансклеточного сигнального механизма с последующей транкрипцией гена люциферазы не происходит) [1,9].

К традиционным методам определения активности HAT к ИФНα, β и γ относится биологическое тестирование путем титрования сыворотки пациента с ИФН-содержащим препаратом на газоне культуры клеток с последующей обработкой тест-вирусом и исследования эффектов цитопатических свойств патогена [10]. Практическое применение данного метода основано на владении основами техники культивирования клеток эукариот и вирусологических исследований.

Из уровня техники известны патенты с описанием лечебного эффекта ИФН-НАТ при системных заболеваниях аутоимунной природы.

Патент RU 2431638 «Моноклональные антитела против интерферона-альфа» описывает разработку фармакологического препарата HAT, которые избирательно нейтрализуют биоактивность по крайней мере двух подтипов белка интерферона-альфа (ИФНα). Антитела согласно изобретению эффективны для выявления подтипов ИФНα в образце или ткани и/или для терапевтического применения, включающего в себя лечение и/или улучшение состояния при связанных с ИФНα заболеваниях, таких как системная красная волчанка, диабет типа I, псориаз, СПИД и реакция «трансплантат против хозяина».

Аналогичное по направлению применения и способу реализации изобретение описано в патенте RU 2314317 «АНТИТЕЛА ПРОТИВ ИНТЕРФЕРОНА-АЛЬФА». Использование изобретения позволяет одновременно подавлять биологическую активность, по крайней мере, семи подтипов ИФНα человека, а именно ИФНα1, ИФНα2, ИФНα4, ИФНα5, ИФНα8, ИФНα10, ИФНα21, что может найти применение в диагностике и терапии различных заболеваний человека, опосредуемых ИФНα, таких как инсулинозависимый сахарный диабет или системная красная волчанка.

Наиболее близкий к заявленному способу определения ИФНβ-НАТ с использованием постоянной линии клеток фибросаркомы трансфецированных репортерной системой активности ИФНβ основан на измерении индуцированной экспрессии гена люциферазы и требует наличия специальных реактивов и оборудования [Lallemand С, Meritet J.F., Erickson R., et al., Quantification of neutralizing antibodies to human type I interferons using division-arrested frozen cells carrying an interferon-regulated reporter-gene, J. Interferon Cytokine Res., V. 28, N 6, 393-404, 2008].

Несмотря на возрастающую актуальность проблемы, в доступной базе данных отсутствуют патенты, связанные с описанием системам обнаружения HAT против лекарственных субстанций, обладающих потенциальной иммуногенностью.

Задача изобретения: своевременное выявление и количественное определение интерферон-нейтрализующих антител (ИФН-НАТ).

Технический результат изобретения: обеспечивается качественное и количественное определения ИНФβ нейтрализующих антител, основанное на оценке индуцированного тест-вирусом цитопатического эффекта в отношении чувствительных культур прикрепляемых клеток фибробластов легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ) и бессывороточной линии клеток эпителия почечных канальцев зеленой мартышки (Vero-SF).

Указанный технический результат достигается за счет того, что заявлен способ определения нейтрализующих антител (HAT) в сыворотке крови больных рассеянным склерозом, леченных препаратами интерферона-бета (ИФНβ), характеризующийся применением цитопатического теста с использованием чувствительной к вирусу энцсфаломиокардита мышей (ЕМС) культуры клеток фибробластов легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ), причем определение HAT к препарату ИФНβ проводят при помощи реакции нейтрализации антивирусной активности методом титрования сыворотки рефрактерного к лечению соответствующим препаратом пациента, определением HAT к препарату ИФНβ путем культивирования клеток ФЛЭЧ в условиях 37±2°С в атмосфере CO₂ 5,0±0,5% и 90±5% влажности в среде DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) в течение 1 суток в ячейках плоскодонного 96-луночного планшета в количестве 20-50 тыс.кл./яч., а в день постановки теста разводят контрольную ЭТС и испытуемую сыворотку пациента в 10 или в 20 раз; затем в ячейках круглодонного планшета готовят по 100 мкл разведений препарата ИНФβ в нсобогащенной сывороткой среде RPMI-1640: 2000; 1000; 500; 250; 125; 63; 31; 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25; 0 МЕ/мл; в ячейки с двумя приготовленными разведениями препарата ИФНβ параллельно вносят по 100 мкл разведенные в 10 или 20 раз сыворотки пациента и контрольной ЭТС; инкубируют планшет 1 час в условиях СО₂-инкубатора; удаляют среду из культуральных планшетов с преинкубированными клетками ФЛЭЧ и в ячейки вносят по 100 мкл приготовленных разведений препарата с сывороткой пациента; проводят инкубацию планшетов с клетками в течение 22-24 часов, далее в необогащенную сывороткой основу среды DMEM вносят вирус-индикатор ЕМС или VSV (вирус энцефаломиокардита мышей/вирус везикулярного стоматита, штамм «Индиана») в дозе, составляющей 10 2±0,25 ТЦД50 в 0,1 мл; проводят инкубирование в термостате 22-24 часа; через сутки оценивают цитопатическое действие вируса в зависимости от наличия нейтрализующей ИНФβ активности сыворотки пациента по формуле: HAT (НЕ/мл)=А (МЕ/мл)×Z, где: А (МЕ/мл) — максимальная нейтрализуемая активность препарата ИНФ-бета, при которой наблюдается цитодеструктивное действие вируса на монослой чувствительной культуры ФЛЭЧ, выраженная в международных единицах на 1 мл; Z — разведение сыворотки пациента.

Способ может отличаться использованием чувствительных к вирусу везикулярного стоматита (VSV) клеток бессывороточной линии Vero-SF, причем в качестве среды культивирования клеток и последующего внесения вируса используют бессывороточную среду для прикрепляемых клеток Гибрис-1-П.

Изобретение реализуется за счет комбинированного введения сыворотки пациентов с ИФНβ в сосуды с чувствительными к ИФН клеточными культурами и последующей обработкой тест-вирусом. Наличие HAT в сыворотке блокирует активность ИФН и способствует цитодеструктивному поражению монослоя тест-культуры клеток. Таким образом, определение HAT к препарату ИФНβ связано с реакцией нейтрализации индуцируемой антивирусной активности методом биологического титрования с сывороткой рефрактерного к лечению соответствующим препаратом пациента. В целом заявленный способ определения нейтрализующих антител (HAT) в сыворотке крови больных рассеянным склерозом, леченных препаратами интерферона-бета (ИФНβ), основан на применении цитопатического теста с использованием чувствительной к вирусу энцефаломиокардита мышей (ЕМС) культуры псеадолинии клеток фибробластов легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ). Проведенные авторами исследования показали, что использование чувствительных к вирусу везикулярного стоматита (VSV) клеток бессывороточной линии Vero-SF демонстрирует более точные и стабильные результаты теста при определении активности HAT.

С целью проведения теста определения HAT к препарату ИФНβ получают газон клеток тест-культуры (ФЛЭЧ, Vero-SF) путем посева и инкубации в течение 1 суток в ячейках плоскодонного 96-луночного планшета 20-50 тыс.кл./яч в условиях (37±2)°С, атмосфере С02 (5,0±0,5)% и (90±5)% влажности, в среде DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) для клеток ФЛЭЧ или Гибрис-1-П для клеток Vero-SF. В день постановки теста разводят контрольную (эмбриональную телячью — ЭТС) и испытуемую сыворотку пациента в 10 или в 20 раз; затем в ячейках круглодонного планшета готовят по 100 мкл разведений препарата ИНФβ в необогащенной сывороткой среде RPMI-1640: 2000; 1000; 500; 250; 125; 63; 31; 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25; 0 МЕ/мл; в ячейки с двумя приготовленными разведениями препарата ИФНβ параллельно вносят по 100 мкл разведенных в 10 или 20 раз сыворотки пациента и контрольной ЭТС; инкубируют планшет 1 час в условиях СО₂-инкубатора; удаляют среду из культуральных планшетов с преинкубированными клетками ФЛЭЧ и в ячейки вносят по 100 мкл приготовленных разведений препарата с сывороткой пациента; проводят инкубацию планшетов с клетками в течение 22-24 часов. Для выявления/количественного определения ИФНβ-НАТ, в необогащенной сывороткой основе среды DMEM или бессывороточной среде Гибрис-1-П, вносят рабочую дозу тест-вируса или вируса-индикатора EMC/VSV (вирус энцефаломиокардита мышей/вирус везикулярного стоматита, штамм «Индиана»), составляющую 10(2±0,25) ТЦД50 в 0,1 мл; проводят инкубирование в термостате 22-24 ч; через сутки оценивают цитопатическое действие вируса в зависимости от наличия нейтрализующей ИНФβ активности в сыворотке пациента; при этом определяется максимальная концентрация препарата, при которой наблюдается цитодеструктивное действие вируса на монослой чувствительной культуры в соответствие со схемой, представленной в Примере 1.

Определение HAT к препарату ИФНβ проводят при помощи реакции нейтрализации антивирусной активности методом биологического титрования с сывороткой рефрактерного к лечению соотв. препаратом пациента, с использованием культуры клеток псевдолинии ФЛЭЧ (фибробласты легких эмбриона человека). Для этого клетки ФЛЭЧ культивируют в условиях (37±2)°С в атмосфере СО₂ (5,0±0,5)% и (90±5)% влажности в среде DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) течение 1 сут в ячейках плоскодонного 96-луночного планшета в количестве 20-50 тыс./яч. В день постановки теста разводят контрольную (эмбриональную телячью — ЭТС) и испытуемую сыворотку пациента в 10 или в 20 раз.

В ячейках круглодонного 96-луночного планшета готовят по 100 мкл разведений препарата ИНФβ в необогащенной сывороткой среде RPMI-1640: 2000; 1000; 500; 250; 125; 63; 31; 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25; 0 МЕ/мл.

В ячейки с двумя приготовленными разведениями препарата ИФНβ параллельно вносят по 100 мкл разведенных в 10 или 20 раз сыворотки пациента и контрольной ЭТС. Инкубируют планшет 1 час в условиях СО₂-инкубатора. Удаляют среду из культуральных планшетов с преинкубированными клетками ФЛЭЧ и в ячейки вносят по 100 мкл приготовленных разведений препарата с сывороткой пациента. Проводят инкубацию планшетов с клетками в течение 22-24 часов.

Для выявления/количественного определения ИФНβ-НАТ, в необогащенной сывороткой основе среды DMEM вносится рабочая доза тест-вируса или вируса-индикатора EMC/VSV (вирус энцефаломиокардита мышей/вирус везикулярного стоматита, штамм «Индиана»), составляющая 10 (2±0,25) ТЦД50 в 0,1 мл. Проводится инкубирование в термостате 22-24 ч. Через сутки оценивают цитопатическое действие вируса в зависимости от наличия нейтрализующей ИНФβ активности в сыворотке пациента. При этом определяется максимальная концентрация препарата, при которой наблюдается цитодеструктивное действие вируса на монослой чувствительной культуры ФЛЭЧ.

Общая схема титрования препарата ИФНβ с исследуемой сывороткой крови пациента представлена в Табл. 1.

Активность нейтрализующих антител в сыворотке пациента выражается ее нейтрализующей активностью (НА), выраженной в нейтрализующих единицах:

где А (МЕ/мл) — максимальная нейтрализуемая активность препарата ИНФ-бета, выраженная в международных единицах на 1 мл; Z — разведение сыворотки пациента (10 или 20-кратное).

Отличается использованием адаптированной бессывороточной линии клеток Vero-SF (ООО НПП «ПанЭко»). Поддержание линии и все манипуляции при исследовании проводят в специальной бессывороточной среде для прикрепляемых клеток «Гибрис-1-П» (ООО НПП «ПанЭко»). Использование постоянной линии Vero-SF позволяет максимально стандартизовать метод «цитопатического теста» в условиях контролируемого роста клеток в бессывороточной среде, а также отсутствия дополнительных интерферирующих и связывающих сывороточных субстанций ксеногенного происхождения. Наиболее близкий к заявленному способу определения ИНФ-бета-НАТ с использованием постоянной линии клеток фибросаркомы трансфецированных репортерной системой активности ИНФ-бета основан на измерении индуцированной экспрессии гена люциферазы и требует наличия специальных реактивов и оборудования [11].

В качестве тест-вируса для заражения клеток Vero-SF в бессывороточной среде «Гибрис-1-П» эффективен вирус везикулярного стоматита VSV (штамм «Индиана»).

Все манипуляции по нейтрализации препарата ИФНβ, индукции противовирусной резистентности клеток, инфекции тест-вирусом, учета результатов исследования проводят аналогично описанным в Примере 1.

Проводили исследование статуса ИФНβ-НАТ в сыворотке крови 28 больных PC, получавших длительное лечение препаратами ИНФ-бета.

У всех пациентов был поставлен диагноз PC, согласно обновленным критериям W.J. MacDonald в модификации 2010 г., (ремиттирующее течение у 23 пациентов, вторично-прогредиентное течение (ВПТ), у 5 в стадии неполной ремиссии заболевания. Все пациенты проходили лечение в неврологическом отделении Моники.

Результаты объективного неврологического обследования оценивались по общепринятой шкале клинической оценки функционального состояния проводящих систем при этом заболевании, предложенной J.Kurtzke, и шкале инвалидизации EDSS (Expanded Disability Status Scale). Пациенты: женщины n=16, мужчины n=12, с продолжительностью болезни 7,63±4,87 лет, легкой и в основном средней степени тяжести ремиттирующего течения (EDSS в ремиссии в среднем составила 2,96±1,14 баллов); тяжелой степени при ВПТ (EDSS 6,2±0,27 баллов).

Пациенты получали препараты рекомбинантного ИФНβ-1b в дозе 8-9 млн ME. Все пациенты были разделены на 3 группы в зависимости от продолжительности приема препарата: 1 группа — 0.5-1 год; 2 группа — 1-2 года; 3 группа — более 2 лет.

Проведено определение содержания HAT в сыворотках пациентов по результатам реакции нейтрализации антивирусной активности препарата ИФНβ методом цитопатического теста. Оценку анти-ИФНβ нейтрализующей активности (НА) в сыворотках пациентов проводили параллельно на клеточных культурах ФЛЭЧ и Vero-SF и измеряли в нейтрализующих единицах (НЕ/мл) (см. Пример 1). Результаты определения статуса ИНФβ-НАТ у пациентов всех 3 групп представлены в Табл. 2.

Данные нашего исследования показывают, что вероятность образования специфических HAT и их содержание в сыворотке периферической крови пациентов увеличивается в течение более длительного применения ИФНβ препаратов. В связи с этим определение статуса ИФНβ-НАТ является важным критерием оценки эффективности ИФН-терапии при PC.

С точки зрения патентной ценности в рамках заявки на изобретение, полученные результаты демонстрируют высокую сходимость результатов цитопатического теста для систем тестирования использующих диплоидные клетки ФЛЭЧ и бессывороточную культуру постоянной клеточной линии Vero-SF. Отмечено, что использование бессывороточной системы тестирования обеспечивает более высокие показатели нейтрализующей активности сыворотки пациентов при низких титрах лекарственного препарата ИФНβ. Это, очевидно, связано с увеличенным временем репликации вируса в клетках бессывороточной культуры Vero-SF. Вместе с тем линия клеток приматов Vero-SF является наиболее удобным инструментом вследствие неограниченной способности к пассированию в контролируемых условиях бессывороточного культивирования.

1. Б.И. Бурсагова, и др., Проблема нейтрализующих антител в терапии рассеянного склероза, Педиатрическая фармакология, т. 8, №5, 61-64, 2011.

2. Шмидт Т.Е., Яхно Н.Н. Рассеянный склероз: руководство для врачей. 2-е изд. — М.: МЕДпресс-информ, 2010. — 272 с.

3. Damal К., Stoker Е., Foley J.F. Optimizing therapeutics in the management of patients with multiple sclerosis: a review of drug efficacy, dosing, and mechanisms of action. Biologies, V. 7, 247-258, 2013.

4. Sorensen P.S. Neutralizing antibodies against interferon-beta, Ther. Adv. Neurol. Disord. — 2008; 1: 62-78.

5. Noronha A., Neutralizing antibodies to interferon, Neurology, V. 68, N 12, 16-22, 2007.

6. Bertolotto A., Capobianco M, Amato MP, et al., Guidelines on the clinical use for the detection of neutralizing antibodies (NAbs) to IFN beta in multiple sclerosis therapy: report from the Italian Multiple Sclerosis Study group, Neurol. Sci., V. 35, N 2, 307-16, 2014.

7. Hesse D., Sorensen P. S. Using measurements of neutralizing antibodies: the challenge of IFN-beta therapy, Eur. J. Neurol., V. 14, 850-859, 2007.

8. Hesse D., Sellebjerg F., Sorensen P.S. Absence of MxA induction by interferon beta in patients with MS reflects complete loss of bioavailability, Neurology, V. 73, 372-377, 2009.

9. Farrell, R., Espasandin, M., Lakdawala, et al., Incorporation of an interferon-beta neutralizing antibody assay into routine clinical practice. Mult. Scler., V. 17, 1333-1340, 2011.

10. Massart C, Gibassier J., Oger J., et al., Neutralizing antibodies to interferon beta in multiple sclerosis: analytical evaluation for validation of a cytopathic effect assay. Clin. Chim. Acta, V. 377, 185-191, 2006.

1. Способ определения нейтрализующих антител (HAT) в сыворотке крови больных рассеянным склерозом, леченных препаратами интерферона-бета (ИФНβ), характеризующийся применением цитопатического теста с использованием чувствительной к вирусу энцсфаломиокардита мышей (ЕМС) культуры клеток фибробластов легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ), причем определение HAT к препарату ИФНβ проводят при помощи реакции нейтрализации антивирусной активности методом титрования сыворотки рефрактерного к лечению соответствующим препаратом пациента, определением HAT к препарату ИФНβ путем культивирования клеток ФЛЭЧ в условиях 37±2°С в атмосфере CO₂ 5,0±0,5% и 90±5% влажности в среде DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) в течение 1 суток в ячейках плоскодонного 96-луночного планшета в количестве 20-50 тыс.кл./яч., а в день постановки теста разводят контрольную ЭТС и испытуемую сыворотку пациента в 10 или в 20 раз; затем в ячейках круглодонного планшета готовят по 100 мкл разведений препарата ИНФβ в нсобогащенной сывороткой среде RPMI-1640: 2000; 1000; 500; 250; 125; 63; 31; 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25; 0 МЕ/мл; в ячейки с двумя приготовленными разведениями препарата ИФНβ параллельно вносят по 100 мкл разведенные в 10 или 20 раз сыворотки пациента и контрольной ЭТС; инкубируют планшет 1 час в условиях CO₂-инкубатора; удаляют среду из культуральных планшетов с преинкубированными клетками ФЛЭЧ и в ячейки вносят по 100 мкл приготовленных разведений препарата с сывороткой пациента; проводят инкубацию планшетов с клетками в течение 22-24 часов, далее в необогащенную сывороткой основу среды DMEM вносят вирус-индикатор ЕМС или VSV (вирус энцефаломиокардита мышей/вирус везикулярного стоматита, штамм «Индиана») в дозе, составляющей 10 2±0,25 ТЦД50 в 0,1 мл; проводят инкубирование в термостате 22-24 часа; через сутки оценивают цитопатическое действие вируса в зависимости от наличия нейтрализующей ИНФβ активности сыворотки пациента по формуле HAT (НЕ/мл)=А (МЕ/мл)×Z, где А (МЕ/мл) — максимальная нейтрализуемая активность препарата ИНФ-бета, при которой наблюдается цитодеструктивное действие вируса на монослой чувствительной культуры ФЛЭЧ, выраженная в международных единицах на 1 мл; Z — разведение сыворотки пациента.

2. Способ по п. 1 отличающийся использованием чувствительных к вирусу везикулярного стоматита (VSV) клеток бессывороточной линии Vero-SF, причем в качестве среды культивирования клеток и последующего внесения вируса используют бессывороточную среду для прикрепляемых клеток Гибрис-1-П.

источник

Контролированное по плацебо рандомизированное исследование по применению интерферона бета-1 b в лечении второй, прогрессирующей фазы рассеянного склероза

Опубликовано в журнале:
Международный Медицинский Журнал »» 4 / 2000 Европейская исследовательская группа по применению интерферона бета-1b в лечении второй, прогрессирующей фазы рассеянного склероза под руководством Людвига Каппоса

Отделение невропатологии, Университетская больница Базеля, Базель, Швейцария

Обоснование исследования. Благоприятное действие интерферона бета наблюдалось ранее только у пациентов в фазе чередования ремиссий и обострений рассеянного склероза (PC). Но до сих пор не оценивалась роль этого препарата при второй, прогрессирующей фазе данного заболевания (ВП-РС), эффективного лекарственного лечения которой до сих пор разработано не было.

Методы. В настоящем многоцентровом, с двойным сокрытием информации, контролированном по плацебо исследовании амбулаторные больные с баллом 3,0-6,5 по Расширенной шкале статуса инвалидности (Extended Disability Status Scale — EDSS) получали либо 8 млн. ME (IV) интерферона бета-1b подкожно через день, либо плацебо сроком до 3 лет. Эффективность лечения оценивалась, главным образом, по сроку до подтвержденного усугубления инвалидности величиной в 1,0 EDSS, которое сохранялось в течение 3 месяцев, либо величиной в 0,5 балла, если исходно EDSS составляла 6,0-6,5. Заранее запланированный промежуточный анализ безопасности и эффективности в популяции, получавшей лечение, был проведен после того, как все пациенты уже участвовали в исследовании, по крайней мере, 2 года.

Результаты. 358 больных с ВП-РС были распределены на получение плацебо, а 360 — на прием интерферона бета-1b; 57 пациентов (31 из группы плацебо и 26 из группы, получавшей интерферон бета-1b) были потеряны из наблюдения. Выявлено в высокой степени достоверное различие в пользу интерферона бета-1b по сроку до наступления подтвержденного усугубления инвалидности (р=0,0008). Интерферон бета-1b задерживал прогрессирование на 9-12 месяцев в период исследования 2-3 года. Соотношение различия для подтвержденного прогрессирования составило 0,65 (95% доверительный интервал 0,52-0,83). Этот благоприятный эффект наблюдался как при повторных рецидивах, так и при неуклонном прогрессировании заболевания без рецидивов. Положительные результаты были получены и судя по времени до прикованности к креслу-каталке, а также в отношении частоты и тяжести рецидивов, числа курсов стероидов, числа госпитализаций и данных магнитно-резонансной томографии. Применение препарата было безопасным, характер и частота побочных действий соответствовали предшествующему опыту с интерфероном бета-1b. Исследование было прекращено после того, как промежуточные результаты позволили ясно судить об эффективности.

Выводы. Терапия интерфероном бета-1b задерживает прогрессирование у больных с ВП-РС. Этот препарат представляет собой первое средство, оказывающее терапевтический эффект при ВП-РС.

Введение в 1993 году интерферона бета-1b в схемы лечения рассеянного склероза (PC) явилось значительным шагом вперед в помощи таким больным [I]. Имеется 3 препарата, содержащих интерферон бета, и испытания III фазы каждого из них показали снижение частоты рецидивов на 18-34% у больных с PC в фазе чередований рецидивов и ремиссий [1-3]. Такое уменьшение активности заболевания сопровождалось поразительным влиянием на патологические изменения, выявляемые при магнитно-резонансной томографии (МРТ), в особенности, на развитие новых участков поражения, накапливающих контрастное вещество.

У больных с PC и у их врачей большую озабоченность вызывает усугубление инвалидности, когда наступает вторая, прогрессирующая (ВП-РС) фаза заболевания. При ВП-РС беспомощность пациента становится доминирующим фактором, который определяет уровень и стоимость необходимого ухода [4]. Результаты трех исследований [1-3] указывают на то, что интерферон (3 задерживает усугубление инвалидности, но на основании их данных трудно достоверно судить об этом эффекте. Дело в том, что больные в этих работах были в ранней стадии заболевания с очень слабой степенью инвалидности или вообще без нее, что отражалось в низких баллах по Расширенной шкале статуса инвалидности (Extended Disability Status Scale — EDSS). При этом было маловероятно, что у этих больных инвалидность начнет нарастать в ближайшие 2-3 года. У пациентов с самыми низкими показателями EDSS (0-3,0), скорее, отражала легкие функциональные нарушения, а не инвалидность [5, 6]. В единственной работе, в которой срок до развития стойких изменений в EDSS использовался как главный показатель исхода, больные в начале исследования имели только самые низкие баллы EDSS, и длительность этой работы была минимальной.

Инвалидность при PC обусловлена двумя различными, хотя во многих случаях действующими одновременно механизмами: когда рецидив не проходит полностью (неполная ремиссия), или когда болезнь исподволь неуклонно прогрессирует. Эти механизмы, возможно, имеют в своей основе различные патоморфологические изменения [7]. При чередовании рецидивов и ремиссий неполное восстановление после рецидива — единственная причина нарастающей беспомощности пациента, в то время как у больных с вторичным прогрессирующим PC инвалидизация обусловлена как рецидивами, так и неуклонным, постепенным прогрессированием.

В 1994 году мы начали контролированное по плацебо, многоцентровое, европейское исследование для изучения эффекта интерферона бета-1b на прогрессирование заболевания у больных с ВП-РС [8]. Главные клинические результаты, полученные при промежуточном анализе, представлены в настоящей статье.

Методы Организация исследования

Настоящая работа — это европейское, многоцентровое, двойное-слепое, контролированное по плацебо исследование двух групп больных с ВП-РС, получающих лечение параллельно (одновременно). Предполагалось, что данное исследование будет состоять из 36-месячного периода терапии с последующим наблюдением без лечения в течение 3 месяцев. Посещения больных планировались в 1, 3, 5 и 15 дни 1-3 месяцев, а затем каждые 3 месяца до месяца 36 (то есть, до конца лечения), и еще раз — на 39 месяце (то есть, в конце периода наблюдения без лечения). Больные посещали врачей и вне этого графика — при возникновении рецидивов и других, не связанных с PC заболеваний, при этом диагнозы и проводимое лечение документировались. За пациентами наблюдали путем регулярных обследований до конца настоящей работы, за исключением тех больных, которые решали больше не участвовать в ней, или если связь с ними терялась по другим причинам.

Это исследование координировалось управляющим комитетом исследователей и представителей спонсоров. На протяжении всего времени проведения работы от них скрывались получаемые результаты. Обработка данных и весь статистический анализ производился во внешнем учреждении. Независимый консультативный комитет изучил результаты промежуточного анализа безопасности, который провели после того, как все пациенты уже участвовали в данном исследовании, по крайней мере, в течение 24 месяца.

Пациенты и лечение

Амбулаторные больные, подходящие для рандомизации, имели клинически или лабораторно подтвержденный диагноз PC [9]. Под вторичным прогрессированием подразумевали период ухудшения, независимого от рецидивов, который сохранялся, по крайней мере, в течение 6 месяцев, и следовал за периодом чередования рецидивов и ремиссий. Допускалось возникновение на этом фоне дополнительных рецидивов [10]. Возраст больных составлял 18-55 лет. Исходный балл EDSS колебался от 3,0 до 6,5 включительно. При этом у них за предшествующие 2 года были зарегистрированы либо ≥ 2 рецидивов, либо повышение балла EDSS на ≥ 1,0. Лечение иммунодепрессантами или иммуномодуляторами и другая мнимая терапия по поводу PC не позволялись в течение определенного времени до вступления в исследование. Полностью критерии включения больных в настоящую работу были опубликованы ранее [8]. Пациенты давали письменное согласие после соответствующего разъяснения.

По центральной схеме рандомизации назначали плацебо или интерферон бета-1b группам больных по 6 человек в соотношении 1/1. Согласно протоколу исследования, доступ к шифру был строго ограничен. Подкожно вводили через день 0,5 мл. интерферона бета-1b (4 млн. ME) или плацебо в течение первых 2 недель, с последующим повышением разовой дозы до 1,0 мл. (8 млн. ME интерферона бета-1b или плацебо). Интерферон бета-1b было невозможно отличить от плацебо. Лечение должно было прекращаться при неприемлемых побочных эффектах или при значительных отклонениях лабораторных показателей, при беременности, использовании запрещенных врачом медикаментов, или если шифр предавался огласке.

При появлении симптомов, сходных с таковыми при гриппе, а также при повышенной чувствительности больного к лихорадке назначались нестероидные противовоспалительные препараты или парацетамол. Системные стероиды применялись по стандартной схеме (1г. метилпреднизолона внутривенно в течение 3 дней с последующим оральным приемом преднизона, либо преднизолона с постепенным понижением дозы или без такого понижения), причем лечение этими препаратами проводилось только при рецидивах. За каждый год участия в исследовании пациент получал не более 3 курсов терапии стероидами.

Эффективность оценки и сокрытие информации

Подсчет баллов функциональных систем и EDSS проводился так, как было описано Kurtzke [5]. Эти баллы отражали работу отдельных неврологических систем: зрительной, пирамидальной, мозжечковой, стволовой, чувствительной, систем управления кишечником и мочевым пузырем, системы коры головного мозга (психической) и других. EDSS предусматривает оценку по 20 оценкам-баллам — от 0 (норма) до 10 (смерть от PC), при этом баллы считаются так: 0, 1 и далее баллы возрастают на 0,5 (1,5, 2,0 и т. д.) вплоть до 10; они основаны на сочетании оценки функциональных систем в баллах, а также на степени независимости больного при передвижении и в быту. Расплывчатость определений в первоначальных публикациях об этих системах привела к тому, что разные лица, проводившие оценку, давали разные результаты [II]. Поэтому врачи, вычислявшие EDSS в настоящем исследовании, прошли обучение в главном методическом центре по EDSS. Это обеспечило стандартные подходы в оценке отдельных функциональных систем, дальности передвижения и баллов EDSS [12].

Для более надежного обеспечения одинаковых подходов к оценке EDSS методический центр по EDSS проводил обучение специалистов до начала исследования и ежегодно во время него; им предоставляли видеопленки, учебники и пособия. Те специалисты, которые впервые приступали к оценке уже во время осуществления настоящей работы, обязательно сначала проходили подготовку в указанном методическом центре. Когда было возможно, один и тот же специалист, оценивающий EDSS, проводил все заранее определенные неврологические тесты у данного больного в течение всего срока настоящего исследования.

Чтобы избежать того, чтобы информация о характере лечения раскрывалась бы из-за весьма характерных побочных эффектов интерферона бета-1b [1, 2], назначаемые лечащие врачи отвечали только за общий медицинский уход, оценку безопасности лечения и за терапию рецидивов. В то же время, врачи, оценивающие EDSS осуществляли стандартизованные неврологические тесты; они не получали никакой потенциально раскрывающей информации от лечащих врачей; им позволяли разговаривать с больным только в той мере, насколько это было необходимо для проведения неврологических тестов. Во время оценки EDSS все возможные места инъекций были закрыты. Врачи, определявшие балл EDSS, отдельно хранили документацию по неврологическому обследованию, по баллам функциональных систем и по EDSS.

Для выяснения, насколько успешным было сокрытие информации, в конце исследования лечащих врачей, а также специалистов, оценивавших EDSS, и больных просили ответить на специальный вопросник.

Инвалидность

Главным критерием оценки служило время от начала исследования до первого запланированного ежеквартального посещения, при котором фиксировалось повышение EDSS, по крайней мере, на 1,0 (или на 0,5 при исходном EDSS 6,0-6,5), при условии, что такое повышение подтверждалось и при следующем запланированном посещении 3 месяца спустя (по крайней мере, через 70 дней). Посещение на 33 месяце было последним, после которого можно было получить подтверждение (на 36 месяце). Баллы EDSS, записанные во время рецидива, подтвержденного врачом-исследователем, рассматривались как ценные лишь в тех случаях, когда они были собраны после 90-го дня текущего рецидива.

Другим, связанным с EDSS показателем был срок, который проходил до прикованности больного к креслу-каталке (а именно, до достижения балла EDSS ≥ 7,0). Для этого критерия не требовалось подтверждения, поскольку ожидалось, что число больных при исходном EDSS £6,0, у которых EDSS достигнет ≥ 7,0, окажется гораздо меньше, и что это состояние будет происходить гораздо позднее, чем наступление ухудшения в EDSS, являвшегося главным критерием. Дополнительными показателями являлись: доля больных с подтвержденным прогрессированием, доля больных, которые становились прикованными к креслу-каталке, и балл EDSS при завершающем обследовании.

Показатели, связанные с рецидивами

Под рецидивом понимали острое или подострое возникновение, либо повторное возникновение неврологического нарушения, непосредственно перед которым в течение 30 дней неврологическое состояние не изменялось, улучшалось или медленно ухудшалось. Диагноз «рецидив» ставился, только если ухудшение держалось не менее 24 часов, при этом у больного должны были отсутствовать лихорадка и прочие признаки инфекции. Такой диагноз был правомочен только в то время, когда больному не проводили отмены стероидного препарата. Больных просили обращаться в центр по проведению исследования при возникновении любого симптома, подозрительного на рецидив. Лечащий врач проводил оценку рецидива, в том числе, записывал дату его начала, симптомы и степень тяжести (слабо выраженный, умеренный и тяжелый), а также исследовал состояние функциональных систем, вычислял баллы EDSS для рецидива. Только те рецидивы, которые были подтверждены лечащими врачами, считались пригодными для анализа эффективности терапии.

Изучались следующие показатели, связанные с рецидивом: ежегодная частота рецидивов (их число, разделенное на число дней в исследовании, умножалось на 365), срок до первого рецидива и доля больных с умеренным или тяжелым рецидивом.

Изучение других показателей

Оценивались связанные с PC применение стероидов и госпитализации. Ежегодно проводилась МРТ. У 125 больных (v 61 из группы, получавшей плацебо, и у 64, которым вводился интерферон бета-1b) МРТ выполнялась ежемесячно в период с 0 по 6 месяцы и с 18 по 24 месяцев, при этом обязательно использовались T1-взвешенные сканы с контрастированием гадолинием. Магнитно-резонансные томограммы анализировались в едином учреждении, причем каждый год оценивался объем поражения и появление новых активных патологических очагов.

При регулярных обследованиях у больных проводили анализ на нейтрализующие антитела к интерферону бета-1b с помощью теста с протеином МхА [13]; анализ считался положительным при двух последовательных титрах 1:20 или более.

О степени безопасности приема препарата судили по неблагоприятным реакциям, по функции жизненно важных органов, а также по данным физикального обследования и необходимости в назначении других препаратов. Стандартные лабораторные анализы проводились в центральной лаборатории при каждом очередном посещении врача. Электрокардиографию выполняли в начале и в конце исследования. При каждом ежеквартальном обследовании для оценки изменений настроения и риска суицида применялась шкала рейтинга депрессии по Montgomery и Asberg (Montgomery Asberg Depression Rating Scale — MADRS) [14], которая основывается на наблюдениях врача.

Статистический анализ

Общее количество больных, необходимое для исследования, было определено, исходя из допущения, что доля пациентов с подтвержденным прогрессированием в группе, получавшей плацебо, через 3 года составит 50%. Ожидалось, что терапевтическая разница 12,5% будет выявлена с помощью двустороннего логарифмического-рангового теста (log-rank test) при а=0,029 и мощности 80% при использовании метода Pocock для поправки на запланированный промежуточный анализ. Требовалось 355 больных на каждую группу, с учетом поправки на ожидаемые 20% потерь больных. Поправка а для промежуточного анализа эффективности позднее основывалась на адаптации по DeMets к «затратам a» [a spending] (а=0,048 для конечного анализа и а=0,0133 для промежуточного анализа, принимая за информационную фракцию 83% данных EDSS). Весь статистический анализ основывался на популяции, которую предполагалось пролечить, включая все данные о всех рандомизированных пациентах без каких-либо ограничений.

Исходные характеристики анализировались с помощью рангово-суммарного теста (rank-sum test) по Wilcoxon для сравнения порядковых (ordinal) и непрерывных показателей, и с помощью теста точности по Fisher для сравнения дихотомичных или непорядковых (non-ordinal) категорийных переменных.

Показатели эффективности анализировались посредством непараметрических методов, учитывающих нелинейность шкалы EDSS [6]. Основной метод оценки срока, прошедшего до подтвержденного прогрессирования, был анализ ковариации (covariапсе) [15] с поправкой на центр (т.е., на клинику, где проводилось исследование) и на исходный балл EDSS. Применялась также стратификационная поправка на центр. Логарифмические-ранговые баллы для оценки информации по наблюдению за больными после подтвержденного прогрессирования сравнивались между группами с использованием расширенного таста по Mantel-Haenszel со стратификационной поправкой на центр.

Производилась оценка выживаемости больных, при этом их группы, получавшие разные препараты, сравнивались между собой с помощью логарифмического-рангового теста Mantel-Cox, стратифицированного для исходных категорий EDSS (£3,5, 4,0-5,5 и ≥ 6). Соотношение различия оценивалось путем использования «кусочной» (piecewise) модели логистической регрессии, включающей факторы, кроме лечения: исходный балл EDSS, исследовательский центр и время [16]. В расширенные модели включались такие факторы, как продолжительность PC, возраст, пол и площадь поверхности тела, при этом проверялось их взаимодействие с лечением. Было также изучено прогрессирование, подтвержденное спустя 3 и 6 месяцев, независимо от сопутствующих рецидивов. Другие показатели эффективности анализировались по таким тестам, как тест Mantel-Haenszel, расширенный тест Mantel-Haenszel или логарифмический-ранговый тест Mantel-Cox с поправкой на исходный балл EDSS, а также на рецидив до начала исследования, исходную картину МРТ или на то, какой исследовательский центр наблюдал данного больного (таблица 1).

Продольный (longitudinal) анализ с обобщающими оценочными уравнениями применялся для того, чтобы ответить на вопрос, связано ли появление нейтрализующих антител с ослаблением эффекта лечения [17]. Как для построения таблиц, так и для проведения анализа использовалась программа SAS (версия 6,12).

Таблица 1. Основные статистические методы.

* Исходные категории EDSS : ≤ 3,5, 4,0-5,5 и ≥ 6. Поправка на центр — поправка на клинику, участвующую в исследовании. Результаты Популяция исследования

Как показано на схеме 1, 718 из 768 больных, выявленных в 32 европейских клинических центрах, рандомизированно распределялись на получение интерферона бета-1b (n[число больных]=360) или на прием плацебо (п=358). Среднее время наблюдения при промежуточном анализе равнялось 892 дням исследования в группе плацебо и 901 дню в группе интерферона бета-1b. Это составляло 85% информации по EDSS, которую ожидалось получить за 3 года проведения работы. Группы больных были сходны между собой по всем исходным показателям (таблица 2). Из них 57 пациентов (31 получавших плацебо [8,7%] и 26 принимавших интерферон бета-1b [7,2%]) вышли из исследования (таблица 3). Причины, по которым это произошло, существенно между группами не различались. В целом 130 больных (66 получавших плацебо и 64 принимавших интерферон бета-1b) прекратили лечение, но за ними продолжали наблюдение согласно протоколу (таблица 3). Суммарно 531 больной (группа плацебо 261 [72,9%], группа интерферона бета-1b 270 [75,0%] либо завершил 3 года терапии, либо все еще проходил лечение на момент промежуточного анализа (схема 1).

Cхема 1. Схема исследования.

Больше отклонений от протокола зафиксировано в группе плацебо (73 пациентов [23,5%], чем в группе интерферона бета-1b (58 больных [17,2%]. Причины для отклонений от протокола были одинаково распределены между группами. Исключение составило существенно более частое использование запрещенных медикаментов в группе плацебо (33 по сравнению с 15 пациентами в группе интерферона бета-1b, р=0,0071), в том числе: избыточные дозы стероидов, лечение иммунодепрессантами или явное для пациента (с открытой этикеткой) применение интерферона бета. Только 11 отклонений от протокола были связаны с определением EDSS.

Группы существенно различались по следующим причинам прекращения лечения: неблагоприятные эффекты на фоне терапии (плацебо 15 [4,2%], интерферон бета-1b 45 [12,5%]); неохотное сотрудничество больного с врачами или его отказ от лечения (плацебо 19 [5,3%], интерферон бета-1b 8 [2,2%]); неэффективность испытуемого медикамента, по мнению врача или пациента (плацебо 44 [12,3%], интерферон бета-1b 23 [6,4%]) — таблица 3.

Таблица 2. Популяция больных (исходные характеристики).

* Нет статистического различия между группами (р>0,05).
** Данные отсутствуют у 7 пациентов (4 в группе плацебо, 3 в группе, пролеченной интерфероном бета-1b), которые были включены в подгруппу больных без рецидива. СО — стандартное отклонение.

Таблица 3. Причины выхода из исследования и прекращения лечения.

источник

Активное вещество: интерферон — b-1b (IFN- бета1b) — негликолизированная форма человеческого интерферона бета. Представляет собой очищенный, стерильный, лиофилизированный белковый продукт, получаемый методом рекомбинации ДНК из штамма Е.Соli.

В каждом флаконе содержится 0,3 мг (9,6 млн. МЕ) рекомбинантного интерферона бета-1b при расчетном излишке заполнения 20%. В 1 мл водного растворителя для приготовления раствора для инъекций содержится 5,4 мг натрия хлорида. В 1 мл приготовленного раствора содержится 0,25 мг (8,0 млн. МЕ) рекомбинантного интерферона бета-1b.

Неактивные компоненты: лиофилизат: лиофилизированная масса белого цвета человеческий альбумин, декстроза или маннитол (в качестве неактивных стабилизаторов); растворитель: прозрачный, свободный от частиц раствор — натрия хлорид, вода для инъекций.

• ремиттирующий рассеянный склероз: для уменьшения частоты и тяжести обострений рассеянного склероза у амбулаторных больных (т.е. пациентов, способных передвигаться без посторонней помощи) при наличии не менее двух обострений заболевания за последние 2 года и последующим полным или неполным восстановлением неврологического дефицита;
• вторично-прогрессирующий рассеянный склероз с активным течением заболевания, характеризующийся обострениями или выраженным ухудшением неврологических функций в течение 2 последних лет: для уменьшения частоты и тяжести обострений, а также для замедления темпов прогрессирования заболевания.
• в ряде стран используется при клинически изолированном синдроме (КИС) для предупреждения развития достоверного рассеянного склероза.

Противопоказания:

• беременность и лактация
• повышенная чувствительность к природному или рекомбинантному интерферону-бета или человеческому альбумину в анамнезе

Бетаферон следует применять с осторожностью у пациентов с следующими заболеваниями:

• заболевания сердца, в частности, сердечная недостаточность III-IV стадии по классификации Нью-Йоркской Кардиологической Ассоциации (NYHA), кардиомиопатия;
• депрессии и суицидальные мысли (в т.ч. в анамнезе), эпилептические припадки в анамнезе;
• моноклональная гаммапатия;
• анемия, тромбоцитопения, лейкопения;
• нарушение функции печени.
• необходим контоль состояния щитовидной железы при наличии ее аутоиммунной патологии

В связи с отсутствием достаточного опыта применения необходима осторожность при применении у пациентов моложе 18 лет.

Интерферон бета-1b обладает противовирусной и иммуномодулирующей активностями. Механизмы действия интерферона бета-1b при рассеянном склерозе окончательно не установлены. Однако известно, что биологический эффект интерферона бета-1b опосредуется его взаимодействием со специфическими рецепторами, которые обнаружены на поверхности клеток человека. Связывание интерферона бета-1b с этими рецепторами индуцирует экспрессию ряда веществ, которые рассматриваются в качестве медиаторов биологических эффектов интерферона бета-1b. Содержание некоторых из этих веществ определяли в сыворотке и фракциях клеток крови больных, получавших интерферон бета-1b. Интерферон бета-1b снижает связывающую способность и экспрессию рецепторов к гамма-интерферону, усиливает их распад. Кроме того, интерферон бета-1b повышает супрессорную активность мононуклеарных клеток периферической крови. За счет блокады матриксной металлопротеиназ стабилизирует состояние гемато-энцефалического барьера, что во многом обуславливает противовоспалительный эффект. Таким образом, Бетаферон препятствует развитию воспалительного и деструктивного процесса в миелине.

Бетаферон стал первым иммуномодулирующим препаратом для лечения рассеянного склероза и в настоящее время считается признанным лекарственным средством во всем мире. Среди всех препаратов для лечения рассеянного склероза Бетаферон имеет самый длительный клинический опыт применения. В США, Европе и Японии Бетаферон был зарегистрирован для лечения всех ремиттирующих форм рассеянного склероза. Данный препарат способен снижать на одну треть общее количество обострений рассеянного склероза и на 50% частоту умеренных и тяжелых обострений.

Препарат стал доступен на рынке, начиная с 1993 г., и продемонстрировал высокую эффективность при незначительном числе побочных явлений. К настоящему времени представление об эффективности, безопасности и переносимости Бетаферона основано на результатах контролируемых клинических испытаний с участием больных с ремитирующей и вторично-прогрессирующей формами течения рассеянного склероза.

Клинические исследования при ремитирующем рассеянном склерозе, проведенные в 90-х годах XX века, показали, что интерферон бета-1b снижает частоту и тяжесть обострений, а также предотвращает развитие воспалительных очагов в головном мозге [6, 10]. Проведенные в начале нынешнего столетия плацебо-контролируемые исследования продемонстрировали, что терапия высокими дозами интерферона бета-1b, начатая при клинически изолированном синдроме (после первого эпизода демиелинизации, подозрительного на рассеянный склероз), увеличивает время до постановки диагноза клинически достоверного рассеянного склероза [3, 7].

Как при ремиттирующем, так и при вторично-прогрессирующем рассеянном склерозе лечение Бетафероном снижает частоту (при ремиттирующем рассеянном склерозе снижение частоты обострений через 2 года — на 34% (в сравнении с плацебо), при вторично-прогрессирующем на 30% (в сравнении с плацебо)) и тяжесть клинических обострений болезни, число госпитализаций и потребность в лечении стероидами, а также удлиняет продолжительность ремиссии. У больных с вторично-прогрессирующим рассеянным склерозом применение Бетаферона позволяет задержать дальнейшее прогрессирование заболевания и наступление инвалидности (в т.ч. тяжелой, когда больные вынуждены постоянно пользоваться инвалидным креслом) на срок до 12 месяцев. Этот эффект наблюдается у больных как с обострениями заболевания, так и без обострений, а также с любым индексом инвалидизации (в исследовании участвовали пациенты с оценкой от 3,0 до 6,5 баллов по расширенной шкале инвалидизации EDSS (Expanded Disability Status Scale — расширенная шкала оценки инвалидизации). Результаты магнитно-резонансной томографии (МРТ) головного мозга больных с ремиттирующим и вторично-прогрессирующим рассеянным склерозом на фоне лечения Бетафероном показали значительное положительное влияние препарата на тяжесть патологического процесса, а также значительное уменьшение образования новых активных очагов.

Данные по естественному течению рассеянного склероза дают основания полагать, что высокая частота обострений и активность на МРТ на начальных стадиях заболевания связаны с быстрым прогрессированием рассеянного склероза, а необратимые изменения со стороны ЦНС могут появляться иногда даже до клинического дебюта рассеянного склероза [1, 9]. Терапия интерферонами бета оказывает положительное влияние на патофизиологические процессы при рассеянном склерозе [2], и это влияние может быть выраженным при максимально раннем начале терапии [5].

Исследование BENEFIT (Betaferon In Newly Emerging Multiple Sclerosis For Initial Treatment — Бетаферон в качестве метода начальной терапии впервые диагностированного рассеянного склероза) — первое исследование у пациентов с первым эпизодом демиелинизации, предположительно рассеянным склерозом (клинически изолированный синдром – КИС), которое было спланировано для оценки влияния раннего начала лечения по сравнению с отложенным началом на прогрессирование инвалидизации.

BENEFIT – многоцентровое, двойное слепое рандомизированное исследование проводится с 2002 года в 98 клинических центрах в 20 странах и включает, в общей сложности, 468 пациентов с первым клиническим эпизодом, предполагающим рассеянный склероз (с клиническим подтверждением одного или более очагов, т.е. демиелинизации моно- или многоочагового характера). Включение в исследование пациентов обеих групп имеет большое значение, поскольку они отражают общую популяцию пациентов, перенесших единственный эпизод демиелинизации.

Перед исследованием стояли следующие основные вопросы: действительно ли бетаферон замедляет прогрессирование до клинически достоверного рассеянного склероза (КДРС) у пациентов с первым клиническим эпизодом предположительно рассеянного склероза? Какова эффективность раннего начала лечения по сравнению с отсроченным и влияние на прогрессирование заболевания – особенно на прогрессирование инвалидизации? Какие факторы являются прогностически значимыми (для перехода в клинически достоверный рассеянный склероз, прогрессирования заболевания и ответа на лечение) — клинические параметры, очаги на исходных МРТ изображениях и на ранних стадиях фазы наблюдения, новые диагностические критерии рассеянного склероза, антитела к миелину?

Фаза двойного слепого исследования (I) продолжалась 24 месяца, пациенты считались закончившими исследование, когда им ставился диагноз клинически достоверного рассеянного склероза или по истечении 2 лет, затем пациентам предлагалось включение в открытую фазу (II) лечения (без плацебо), которая продолжается до 5 лет.

Основными критериями включения в исследование были:

• возраст 18-45 лет
• единственный клинический эпизод демиелинизации, предположительно рассеянный склероз, в течение последних 60 дней
• 0-5 баллов по расширенной шкале инвалидизации (EDSS) на скрининге или рандомизации
• 2 или более не проявляющихся клинически Т2-очагов на МРТ размером 3 или более мм, хотя бы один из которых – перивентрикулярный или инфратенториальный очаг овальной формы

В исследование не допускались пациенты с любым, кроме рассеянного склероза, заболеванием, которое может вызвать имеющиеся неврологические симптомы и клиническим событием в анамнезе, которое могло быть вызвано острой демиелинизацией, в критериях исключения были полный поперечный миелит, двухсторонний оптический неврит.

Пациенты были рандомизированы в 2 группы: бетаферон 250 мкг (8 ММЕ) или плацебо в виде подкожных инъекций через день в соотношении 5:3 (292 и 176 человек соответственно). Для оптимальной переносимости в течение первых 3 недель проводилось титрование дозы, также назначалась сопутствующая терапия для снижения выраженности гриппоподобного синдрома.

В первые 3 месяца клинические осмотры проводились ежемесячно, затем ежеквартально до месяца 12, затем каждые 6 месяцев до месяца 24. МРТ с контрастированием проводилась при скрининге, затем через 3, 6, 9, 12, 18 и 24 месяца. В открытой фазе (фазе наблюдения) клинические осмотры осуществлялись каждые 6 месяцев, МРТ сканирование – ежегодно, также один раз в 6 месяцев проводилось функциональное исследование MSFC (Multiple Sclerosis Functions Composite – комплексная функциональная оценка при рассеянном склерозе) [4], пациенты заполняли специальные анкеты-опросники, в которых оценивали состояние здоровья, каждые 6 месяцев определялись нейтрализующие антитела.

В 2007 году опубликованы результаты трехлетнего интегрального анализа двух фаз исследования [8]. Подчеркивая сильные стороны BENEFIT, следует отметить, что в исследовании минимизирована предвзятость оценки по количеству выбывших из исследования, проспективно спланирована фаза наблюдения. Также отмечается высокий уровень сохранения пациентов ввисследовании, сохранение сведений рандомизации «слепой» фазыфазыисследования, неизвестноопервоначальное распределение пациентов,,схема титрацииивозобновляласьвввначаленефазы наблюдения. Также был заранее спланирован статистический анализ, план утвержден до начала анализа плацебо-контролируемой фазы.

Из общего числа пациентов (468 человек), включенных в исследование (в фазу I), 89% (418 человек) решили участвовать в открытой фазе (фаза II), 392 пациента (84%) выполнили протокол трехлетнего периода наблюдения, 343 пациента в течение 3 лет получали бетаферон.

Следует подчеркнуть, что между пациентами двух групп первой фазы исследования не было значимых различий по демографическим и МРТ характеристикам (см. табл.).

Характеристики пациентов исследования BENEFIT

Основные результаты, полученные в ходе плацебо-контролируемой фазы исследования, заключаются в следующем.

После 24 месяцев лечения общее количество пациентов с клинически достоверным рассеянным склерозом было 28% в группе Бетаферона и 45% в группе плацебо, Бетаферон значительно задерживал развитие клинически достоверного рассеянного склероза по модифицированным критериям Позера и критериям МакДональда (снижение риска развития клинически достоверного рассеянного склероза составляло 50% и 46% соответственно).

Выраженный и стойкий эффект наблюдался у пациентов с менее диссеминированным и менее активным течением на момент первого клинического эпизода. Бетаферон на 55% снижает риск развития клинически достоверного рассеянного склероза при моноочаговом дебюте, на 57% — у пациентов без активных очагов на МРТ при скрининге, на 60% — у больных с менее чем 9 Т2-очагами на скрининговой МРТ. Полученные результаты доказывают, что пациенты после первого эпизода демиелинизации с ограниченной распространенностью процесса могут получить большую пользу от раннего назначения лечения.

Суммарная вероятность развития достоверного рассеянного склероза по критериям МакДональда, как показало исследование, была 69% для группы Бетаферона и 85% — для группы плацебо, кроме того, суммарная вероятность отсутствия трансформации заболевания в клинически достоверный рассеянный склероз была в два раза выше в группе Бетаферона, чем в группе плацебо.

Статистический анализ данных, касающихся МРТ-эффективности, также свидетельствует в пользу Бетаферона, таким образом, подтверждая сильное и стойкое влияние на первичные параметры эффективности.

Касаясь проблемы безопасности и переносимости терапии, следует подчеркнуть, что только 7.2% пациентов, получавших Бетаферон, прервали участие в исследовании и лишь 2.7% — выбыли из исследования из-за нежелательных явлений (побочных эффектов). Частота и виды возникавших нежелательных явлений были в пределах ранее известных данных, наиболее часто встречались реакции в местах инъекций, гриппоподобный симптомокомплекс, головная боль. Важно подчеркнуть, что частота возникновения связанных с Бетафероном местных реакций в местах инъекций и гриппоподобного синдрома значительно (в 1.5 и 3 раза соответственно) снизилась на втором году лечения. Низкий процент выбывания из исследования BENEFIT показывает, что Бетаферон в дозе 250 мкг п/к через день хорошо переносится даже при неподтвержденном диагнозе рассеянного склероза, о чем свидетельствует и высокое число пациентов (95%), принявших решение продолжить участие во второй фазе исследования и получать лечение Бетафероном.

При анализе результатов исследования применялись следующие критерии эффективности.

Использовались два первичных критерия эффективности: 1) время до клинически достоверного рассеянного склероза, установленного после развития второго клинического эпизода демиелинизации или прогрессирования заболевания по расширенной шкале инвалидизации EDSS в виде увеличения на 1,5 или более баллов; 2) время до достоверного рассеянного склероза в соответствии с критериями МакДональда.

Результаты трехлетнего интегрального анализа BENEFIT свидетельствуют, что пациенты, получавшие Бетаферон с самого начала исследования, через 3 года продемонстрировали снижение на 40% риска прогрессирования инвалидизации, 84% пациентов, получавших Бетаферон с первого клинического эпизода, не имели признаков прогрессирования инвалидизации в течение трех лет. Пациенты, лечившиеся Бетафероном, демонстрировали значительное улучшение по оценочной шкале MSFC от группы плацебо, что особенно проявлялось при исследовании когнитивных функций в aудиовизуальном тесте PASAT. Кроме того, отмечалось достоверное отличие в объеме поражения головного мозга, выявляемое на Т2 взвешенных изображениях МРТ. Бетаферон снижал риск перехода в клинически достоверный рассеянный склероз на 50%, риск перехода в рассеянный склероз (по МакДональду) на 46%. Трехлетний интегральный анализ показал, что несмотря на как минимум полный год лечения Бетафероном, в группе отсроченного начала терапии, у пациентов в группе раннего лечения частота обострений в год после 3 лет была ниже по сравнению с группой отсроченного лечения.

источник