Анализ белка по методу кьельдаля

Методом Кьельдаля определяют количество общего азота и раздельно белкового и небелкового азота. Принцип метода заключается в том, что навеску исследуемого продукта минерализуют (сжигают) концентрированной серной кислотой в присутствии катализатора. При минерализации навески все органические вещества окисляются до СО₂ , Н₂О и NH_3/ Углекислота и вода удаляются, а аммиак сохраняется в растворе, так как реагирует с избытком серной кислоты и образует с ней сульфат аммония:

После окончания сжигания навески избыток кислоты нейтрализуют щелочью, избыток которой вытесняет аммиак из сульфата аммония:

Выделившийся аммиак количественно определяют методами кислотно-щелочного титрования, йодометрии, колориметрии.

В различных модификациях метод Кьельдаля является самым распространенным стандартным и арбитражным методом определения азота в биологических объектах. При определении азота макрометодом масса навески продукта, предназначенного для сжигания, устанавливают с таким расчетом, чтобы в ней содержалось 20-70 мг азота. При определении азота микрометодом для отгонки аммиака используют только часть кислотной смеси, полученной после минерализации указанной выше навески, или всю смесь, полученную при сжигании навески, содержащей 2-3 мг азота.

Для определения общего азота навеску берут массой 0,3-0,5 г в маленьий бумажный кулек из фильтровальной бумаги. Кулек с навеской опускают в колбу Кьельдаля, предназначенную для сжигания(минерализации). В колбу с навеской продукта добавляют 15-20 мл концентрированной серной кислоты и катализатор (соли меди, калия, селена, перекись водорода, марганцевокислый калий или хлорную кислоту).

Для сжигания колбу укрепляют на штативе в наклонном положении под углом 40°, помещают в вытяжной шкаф на асбестовые с электрическим или газовым обогревом сетки. Во избежание выкипания и разбрызгивания жидкости в горло колбы Кьельдаля рекомендуется вставлять стеклянную грушу или небольшую воронку. Выходящие пары воды и серной кислоты , образующиеся при сжигании, конденсируются на них и стекают обратно в колбу.

Минерализация продолжается 5-6 часов. Конец сжигания определяют по внешнему виду реакционной смеси- по полному ее просветлению, по получению прозрачного бесцветного или зеленовато-голубоватого раствора.. сожженная смесь разбавляется водой еще в теплом состоянии, так как при полном охлаждении и выпадают сернокислые соли, которые медленно растворяются водой.

Для полной нейтрализации смеси и вытеснения аммиака в отгонную колбу добавляют 33% -ный раствор едкого натра:

В модифицированных методиках для отгонки аммиака используют разные по конструкции приборы. Общим для всех приборов является прочное сочленение всех частей прибора, исключающее потери аммиака при отгонке; наличие приемной колбы с раствором кислоты, в которую из отгонной колбы по трубкам через каплеуловитель и холодильник поступает дистиллят. Отгонку продолжают до тех пор, пока дистиллят не покажет отрицатекльной реакции на аммиак. Это можно проверить индикаторной бумагой. Обычно процесс от гонки заканчивается через 40-60 мин.. После полной отгонки трубку смывают дистиллированной водой, приемную колбу снимают от прибора и отгонку прекращают. Выделившийся аммиак связывают раствором 0,05 моль/дм 3 серной кислоты, налитой в приемную колбу в количестве 30 мл:

По окончании отгонки избыток серной кислоты в приемной колбе оттитровывают 0,1 н едким натром в присутствии смешанного индикатора до перехода окраски в зеленую. Параллельно с определением азота в исследуемой пробе необходимо проводить определение азота в реактивах («холостой опыт» для внесения соответствующей поправки в результат анализа. Массовую долю азота (Х) в испытуемой пробе в процентах от ее массы при проведении отгонки аммиака вычисляют по формуле:

Х = ;

где V₂ – объем 0,1 моль/дм 3 раствора гидроокиси натрия, израсходованной на титрование 0,5 моль/дм 3 серной кислоты в контрольном опыте, см 3

V₁ – объем моль/дм 3 раствора гидроокиси натрия, израсходованной на титрование 0,5 моль/дм 3 серной кислоты в исследуемом рабочем опыте, см 3 ;

К- поправка к титру 0,1 моль/дм 3 раствора гидроокиси натрия;

0,0014- количество азота, эквивалентное 1см 3 0,05 моль/дм 3 ; М- масса навески, г

Установка для определения общего азота по Кьельдалю показана на рисунке 1.

источник

Одним из важнейших показателей качества продукции, определяющим ее пищевую ценность, является содержания белка. Классическим способом определения белка является метод, разработанный еще в 1883 году датским химиком Иоганном Кьельдалем, который впоследствии был назван его именем. Это очень трудоемкий и продолжительный анализ, и потому в современной лабораторной практике метод Кьельдаля часто пытаются заменить альтернативными методами определения белка, в том числе, с использованием дорогостоящих программно-аппаратных комплексов. Но метод Кьельдаля, несмотря на его сложность, до сих пор остается единственным общепризнанным арбитражным методом определения белка, и чаще всего используется в качестве эталонного для калибровки и настройки других методик анализа сырья и готовой продукции.

Почему же методу Къельдаля, не смотря на более чем 120-летнюю историю, до сих пор не найдено достойной альтернативы? Причиной тому — высокая специфичность выбранной реакции окисления белка серной кислотой, в результате которой разрушаются пептидные связи в его молекуле и образуются ионы аммония, которые в последующем и могут быть легко проанализированы стандартными методами. Однако воспроизводимость и точность метода Кьельдаля в существенной степени зависит от опыта аналитика. Стремясь свести к минимуму влияние человеческого фактора на результаты анализа, ускорить выполнение методики и повысить ее безопасность, ведущие производители аналитического оборудования разработали специализированные комплекты оборудования для анализа по методу Кьельдаля. Метод включает в себя несколько основных этапов: отбор и подготовку проб, мокрое озоление, отгонку с паром и определение концентрации аммония (фотометрически или титриметрически). Для каждого этапа предусмотрены свои аппаратные решения, которые в настоящее время фактически стали стандартом де-факто и практически полностью заменили действия, выполняемые лаборантом вручную.

Этап 1. Отбор и подготовка проб. Необходимое условие получения точных результатов анализа по Кьельдалю — тщательная подготовка образцов. Процедура подготовки проб должна обеспечивать гомогенизацию образца, т. к. размер частиц в анализируемых пробах не должен превышать 1 мм. Взвешивание образцов для последующего анализа по Къельдалю должно проводиться на аналитических весах с точностью до 0,1 мг. Важно знать влажность образца и всегда анализировать либо предварительно высушенные образцы, либо образцы с точно установленным содержанием влаги.
Этап 2. Мокрое озоление. Самым трудоемким и продолжительным этапом в методе Кьельдаля является стадия мокрого озоления, в результате которого происходит полное «сжигание» образца в серной кислоте. Однако использовать для озоления чистую серную кислоту нецелесообразно из-за низкой скорости протекания процесса. Скорость озоления и разрушения образца зависят не только от свойств кислоты, но и от температуры обработки. Чем выше температура, тем меньше времени уходит на разложение. При использовании чистой серной кислоты температура озоления ограничивается, в основном, её точкой кипения (338°С), в то время как для полного разложения необходима более высокая температуры. Скорость мокрого озоления можно значительно увеличить за счет добавления солей и катализаторов. В классическом приборе Кьельдаля на каждый грамм образца обычно необходимо 25 мл кислоты и несколько часов для проведения разложения. Основной эксплуатационной проблемой для данной стадии анализа является выделение большого количества ядовитых паров диоксида и триоксида серы.

Этап 3. Отгонка с паром. Полученный после стадии разложения прозрачный раствор не годится для непосредственного определения в нем аммонийного азота из большого содержания мешающих компонентов. Для отделения аммонийного азота он переводится в аммиачную форму (добавлением щелочи) и отгоняется с паром на специальных приборах, называемых дистилляторами.

Этап 4. Определения содержания аммонийного азота. Результаты по определению белка принято представлять в мг/л аммонийного азота, поэтому метод определения белка по Кьельдалю (что более распространено в пищевой промышленности) часто еще называют методом определения общего азота по Кьельдалю (используется, например, в экологическом анализе). Пересчет на содержание белка осуществляется по известному коэффициенту, который в общем случае равен 6.25, но может несколько отличаться для различных типов белка. Перегоняемый с паром аммиак собирается в колбе, в которую предварительно помещают раствор борной или серной кислоты с известной нормальностью. Полученный чистый раствор бората или сульфата аммония может быть легко оттитрован прямым или обратным методом.

Специалистами ФГБУ «Центральная научно-производственная ветеринарная радиологическая лаборатория» проводится определение белка по методу Къельдаля в пищевых продуктах и кормах с помощью автоматической установки для разложения KJELDATHERM GERHARDT и автоматической установки для перегонки с водяным паром VAPODEST-20 GERHARDT.

источник

Метод основан на минерализации пробы по Кьельдалю, отгонке аммиака в раствор серной кислоты с последующим титрованием исследуемой пробы.

1. На пергаментной бумаге отвешивают около 2 г пробы с погрешностью не более 0.001 г. Для проб с большой массовой долей жира масса навески не должна превышать 1,5 г.

2. Навеску помешают в колбу Кьельдаля, добавляя несколько стеклянных или карборундовых бус или несколько кусочков фарфора, 15.5 г медного катализатора, взвешенного с погрешностью не более 0,1 г. и не более 25 см 3 серной кислоты. Содержимое колбы осторожно перемешивают и колбу укрепляют пол углом около 40? относительно вертикали на установке для сжигания. Содержимое колбы обогревают осторожно, до появления пенообразования и полного растворения пробы.

3. Затем обогревают интенсивно и выдерживают в состоянии кипения, вращая периодически колбу вокруг ее оси. После полного осветления содержимого колбы продолжают обогрев в течение 90 мин. Общая продолжительность минерализации должна быть не менее 120 мин. Затем содержимое колбы охлаждают до температуры около 40 ?С, осторожно добавляют 50 см3 воды, перемешивают и охлаждают до комнатной температуры.

Во избежание потерь во время минерализации пробы следует избегать проникновения пены в горло колбы, испытание проводить в условиях, не удлиняющих чрезмерно его продолжительность, но гарантирующих полную минерализацию пробы.

4. Содержимое колбы Кьельдаля подвергают перегонке с водяным паром или простой перегонке, для чего монтируют соответствующую установку.

В стадии перегонки следует соблюдать плотность установки для перегонки, добавлять раствор гидроокиси натрия по стенке колбы Кьельдаля и смешивать оба слоя только после подключения колбы к установке.

В качестве приемника применяют коническую колбу вместимостью 500 см 3 (при применении титратора химический стакан вместимостью 500 см 3 ), в которую наливают 50 см 3 раствора борной кислоты и 4 капли индикатора Таширо. Колбу помешают под холодильник установки для перегонки таким образом, чтобы нижний конец холодильника был полностью погружен в жидкость.

5. После сбора не менее 150 см 3 дистиллята, полученного после перегонки коническую колбу (приемник) опускают таким образом чтобы нижний конец холодильника находился над уровнем дистиллята, споласкивают конец холодильника водой и проверяют при помощи лакмусовой бумажки или универсального индикатора изменение окраски конденсата, стекающею из холодильника. При отсутствии изменений окраски перегонку заканчивают.

6. Содержимое конической колбы (приемника) титруют раствором соляной или серной кислоты (0.1 моль/дм 3 — 0.05 моль/дм 3 ), применяя бюретку, и отмечают с погрешностью не более 0.02 см 3 количество израсходованной кислоты.

7. Полученные результаты титрования используют для вычисления массовой доли общего азота и последующего пересчета на белок.

Массовую долю общего азота (Х), в процентах, вычисляют по формуле:

V₁— объем точно 0.1 моль/дм 3 — 0,05 моль/дм 3 кислоты (0,1 и. — 0,1 н.), израсходованный на титрование исследуемой пробы, см 3 ;

V₂— объем точно 0.1 моль/дм 3 — 0,05 моль/дм 3 кислоты (0,1 и. — 0,1 н.), израсходованный на титрование контрольной пробы, см 3 ;

Если разница между двумя параллельными определениями не превышает 0,1 % по азоту, то за результат принимают среднеарифметическое значение двух параллельных определений с точностью до 0.01 %. Если разница больше, определение повторяют.

При применении соляной или серной кислоты другой концентрации, в формулу следует ввести соответствующий корректирующий коэффициент.

Массовую долю общего белка (X₁). в процентах, вычисляют по формуле:

где X — средняя массовая доля общего азота в испытуемой пробе.

источник

А знаете ли вы, что……

метод Кьельдаля, несмотря на его сложность, до сих пор остается единственным общепризнанным арбитражным методом определения белка!

Метод был разработан в 1883 году пивоваром Иоганном Кьельдалем. Сущность методики заключается в том, что образец продукта разлагается (сжигается) серной кислотой в присутствии катализатора, после чего полученный после разложения связанный в виде сульфата аммония азот определяется титрованием. В таком виде метод все еще используется и сегодня, хотя существует ряд усовершенствований для ускорения процесса и получения более точных результатов.

Метод Кьедаля очень трудоемкий и затратный по времени, поэтому в современной лабораторной практике метод часто пытаются заменить альтернативными методами определения белка. Но метод Кьельдаля, несмотря на его сложность, до сих пор остается единственным общепризнанным арбитражным методом определения белка, и чаще всего используется в качестве эталонного для калибровки и настройки других методик анализа. По этой причине аппараты для определения белка по методу Кьельдаля есть практически в каждой лаборатории по анализу пищевой продукции.

Почему же методу Къельдаля, не смотря на более чем 130-летнюю историю, до сих пор нет достойной альтернативы? Причиной тому — высокая специфичность выбранной реакции окисления белка серной кислотой, в результате которой разрушаются пептидные связи в его молекуле и образуются ионы аммония, которые затем могут быть легко проанализированы стандартными методами. Однако воспроизводимость и точность метода Кьельдаля в существенной степени зависит от опыта аналитика. Стремясь свести к минимуму влияние человеческого фактора на результаты анализа, ускорить выполнение методики и повысить ее безопасность, ведущие производители аналитического оборудования разработали специализированные комплекты оборудования для анализа по методу Кьельдаля. Метод включает в себя несколько основных этапов: подготовку проб, мокрое озоление, отгонку с паром и определение концентрации аммония (фотометрически или титриметрически). Для каждого этапа предусмотрены свои аппаратные решения, которые в настоящее время практически полностью заменили действия, выполняемые лаборантом вручную.

МЕТОД КЬЕЛЬДАЛЯ И РЕКОМЕНДУЕМОЕ ОБОРУДОВАНИЕ

Для превращения органического азота в аммонийную соль используется метод мокрого озоления (минерализация) исходного продукта концентрированной серной кислотой.

Использование специализированных приборов для озоления в концентрированной серной кислоте преследует следующие цели:

а) скорость минерализации сильно зависит от температуры реакции. В обычном классическом методе Кьельдаля поддержание температуры на уровне 400-450 о С – серьезная проблема, легко решаемая при использовании специально разработанного минерализатора фирмы Velp Scientifica. Время реакции снижается в несколько раз.

б) полнота и скорость озоления сильно зависит от воспроизводимости температурных режимов. Специальные дигесторы Velp Scientifica полностью решают эту проблему благодаря микропроцессорному контролю температуры и специальной конструкции нагревательных гнезд.

в) в стандартном методе Къельдаля озоление серии из нескольких образцов требует значительного пространства на рабочем столе. В небольшом корпусе специализированного дигестора Velp Scientifica можно одновременно анализировать серии из 6, 8, 12 или 20 проб.

Для разложения сульфата аммония добавляется избыток щелочи, и аммиак отгоняется с водяным паром. Отогнанный аммиак поглощается борной кислотой.

Дистилляционные аппараты Velp Scientifica предназначены для количественной отгонки аммиака и добавления необходимых количеств реактивов и полностью соответствуют требованиям, прописанным в официальных методиках анализа.

Автоматизация всех позволяет сократить время дистилляции одной пробы до 3-4 минут.

Например, автоматический дистиллятор UDK 159 после установки пробирки в рабочее положение управляет всеми процессами: разбавление образца, добавление щелочи, отгонка в течение заданного времени с заданной мощностью, добавление в титровальную ячейку борной кислоты, колориметрическое титрование, удаление остатков дистилляции, расчет результатов анализа. Управление осуществляется через сенсорный дисплей, данные всех проведенных анализов сохраняются в памяти прибора, запуск всех процессов производится одной кнопкой в соответствии с выбранной программой.

Если ежедневное количество проб при определении белка не большое, то будет достаточно самого простого варианта: магнитная мешалка и бюретка (она может быть обычная стеклянная или цифровая). Для титрования большого количества проб и для повышения точности результатов рекомендуется использовать внешние автоматические титраторы, которые можно подключить к UDK 149 или использовать полностью автоматический дистиллятор UDK 159, со встроенным колориметрическим титратором.

Несмотря на сложность комплекса оборудования для определения белка по Кьельдалю, использование именного этого метода анализа гарантирует достоверность результатов, в то время как предложенное приборное решение позволяет существенно увеличить воспроизводимость, снизить расход реактивов и обеспечить безопасность персонала.

источник

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ПРОДУКТЫ МОЛОЧНЫЕ, МОЛОЧНЫЕ СОСТАВНЫЕ И МОЛОКОСОДЕРЖАЩИЕ

Определение массовой доли белка методом Кьельдаля

Мilk and milk-containing products. Determination of mass fraction of protein by Kjeldahl method

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ «О техническом регулировании», а правила применения национальных стандартов Российской Федерации — ГОСТ Р 1.0-2004 «Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения»

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Государственным научным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом молочной промышленности Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии)

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 470 «Молоко и продукты переработки молока»

4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячно издаваемых информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

Настоящий стандарт распространяется на молочные, молочные составные и молокосодержащие продукты: творог и творожные продукты, сметану и продукты на ее основе, консервы молочные и молокосодержащие сухие, консервы молочные и молокосодержащие сгущенные, молочную сыворотку и продукты на ее основе (далее по тексту — продукты) и устанавливает метод определения массовой доли белка по Кьельдалю.

Диапазоны измерений массовой доли белка от 0,10% до 100,00%.

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения

ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений

ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ Р 12.1.019-2009 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3622-68 Молоко и молочные продукты. Отбор проб и подготовка их к испытаниям

ГОСТ 3769-78 Реактивы. Аммоний сернокислый. Технические условия

ГОСТ 4145-74 Реактивы. Калий сернокислый. Технические условия

ГОСТ 4165-78 Реактивы. Медь (II) сернокислая 5-водная. Технические условия

ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 5833-75 Реактивы. Сахароза. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 9656-75 Реактивы. Кислота борная. Технические условия

ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 19908-90 Тигли, чаши, стаканы, колбы, воронки, пробирки и наконечники из прозрачного кварцевого стекла. Общие технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 25794.1-83 Реактивы. Методы приготовления титрованных растворов для кислотно-основного титрования

ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу

ГОСТ 27752-88 Часы электронно-механические кварцевые настольные, настенные и часы-будильники. Общие технические условия

ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 29251-91 Посуда лабораторная стеклянная. Бюретки. Часть 1. Общие требования

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

В настоящем стандарте применены термины, установленные нормативным правовым актом Российской Федерации [1].

Метод основан на минерализации органического вещества анализируемой пробы продукта концентрированной серной кислотой в присутствии катализатора с образованием сернокислого аммония, переведении его в аммиак, отгонке последнего в раствор борной кислоты, количественном учете аммиака титриметрическим методом и расчете массовой доли белка в анализируемой пробе.

Весы лабораторные с пределами допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания ±0,0001 г и ±0,01 г.

Термометр лабораторный жидкостный диапазоном измерения от 0 °C до 100 °C, ценой деления шкалы 1 °C по ГОСТ 28498.

Часы 2-го класса точности по ГОСТ 27752.

Плитка электрическая мощностью 1000 Вт по ГОСТ 14919; электронагреватели или газовые горелки, позволяющие поддерживать температуру от 450 °C до 500 °C с допустимой погрешностью ±25 °C.

Гомогенизатор роторный с четырехлопастным ножом, угловой скоростью вращения ножей 1000-10000 мин , включающий емкость вместимостью 1,0 дм .

Баня водяная термостатируемая, позволяющая поддерживать температуру от 0 °C до 100 °C с допустимой погрешностью ±2 °C.

Шкаф сушильный лабораторный, обеспечивающий поддержание температуры от 50 °C до 150 °C с допустимой погрешностью ±2 °C.

Колбы мерные 1-100-2, 1-500-2, 1-1000-2 или 2-100-2, 2-500-2, 2-1000-2 по ГОСТ 1770.

Цилиндры мерные 1-25-1, 1-50-1, 1-100-1, 1-1000-1, или 1-25-2, 1-50-2, 1-100-2, 1-1000-2, или 3-25-1, 3-50-1, 3-100-1, 3-1000-1, или 3-25-2, 3-50-2, 3-100-2, 3-1000-2 по ГОСТ 1770.

Бюретки 1-1-2-25-0,1 или 1-2-2-25-0,1 по ГОСТ 29251.

Холодильник по ГОСТ 25336 шариковый или с прямой трубкой исполнений 1, 2, 3, длиной кожуха 400 мм.

Бачок-парообразователь или колба из термостойкого стекла вместимостью 2000 см по ГОСТ 25336.

Колбы Кьельдаля 2-250-ТС по ГОСТ 25336.

Пробирки из кварцевого стекла.

Каплеуловитель исполнения КО-60 по ГОСТ 25336.

Стаканчики для взвешивания типа СВ (бюксы) диаметром 20 или 25 мм по ГОСТ 25336.

Колбы конические исполнения 2, вместимостью 250 см по ГОСТ 25336.

Колбы плоскодонные с притертыми пробками вместимостью 250 и 500 см ТС по ГОСТ 25336.

Стакан вместимостью 500 см по ГОСТ 25336.

Воронки В-25-38 ХС, В-36-50 ХС, В-36-80 ХС по ГОСТ 25336.

Ступка фарфоровая с пестиком по ГОСТ 9147.

Стакан фарфоровый вместимостью 1000 см по ГОСТ 9147.

Капельница стеклянная лабораторная по ГОСТ 25336.

Палочки стеклянные оплавленные.

Шпатель металлический (фарфоровый) или ложка.

Кислота серная концентрированная по ГОСТ 4204 плотностью 1830-1840 кг/м , х.ч.

Кислота соляная, стандарт-титр по [2], водный раствор молярной концентрации (НС1)=0,1 моль/дм .

Кислота борная по ГОСТ 9656, ч.д.а.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, ч.д.а.

Медь сернокислая 5-водная по ГОСТ 4165, ч.д.а.

Калий сернокислый по ГОСТ 4145, ч.д.а.

Водорода перекись 30%-ная.

Аммоний сернокислый по ГОСТ 3769.

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ Р 51652.

Метиловый красный, ч.д.а.

Метиленовый голубой, ч.д.а.

Бромкрезоловый зеленый, ч.д.а.

Сахароза по ГОСТ 5833, содержащая не более 0,002% азота.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

L-триптофан по [3] или лизин моногидрохлорид по [4].

Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающих необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.

7.1 Приготовление растворов

7.1.1 Приготовление смешанного катализатора

В фарфоровой ступке смешивают одну весовую часть сернокислой меди и 30 весовых частей сернокислого калия, тщательно растирают пестиком и перемешивают до получения мелкозернистого порошка.

Срок хранения смешанного катализатора — не более 1 мес.

7.1.2 Приготовление водного раствора соляной кислоты молярной концентрацией (НС1)=0,1 моль/дм

Используют стандарт-титр соляной кислоты. Водный раствор готовят в соответствии с прилагаемой инструкцией.

Срок хранения раствора в темной посуде — не более 1 мес.

7.1.3 Приготовление водного раствора борной кислоты массовой концентрацией 40 г/дм

В мерную колбу вместимостью 1000 см помещают (40,000±0,005) г борной кислоты и растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды температурой (45±5) °C. После охлаждения раствора до температуры (20±5) °C объем раствора доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают.

Срок хранения раствора — не более 14 дней.

7.1.4 Приготовление смешанного индикатора

В мерную колбу вместимостью 100 см помещают (0,200±0,001) г метилового красного и (0,100±0,001) г метиленового голубого или (0,100±0,001) г бромкрезолового зеленого, растворяют в небольшом количестве этилового спирта. Объем раствора доводят этиловым спиртом до метки и перемешивают.

Срок хранения смешанного индикатора в плотно укупоренной темной посуде — не более 10 дней.

7.1.5 Приготовление водного раствора гидроокиси натрия массовой концентрацией 400 г/дм

В фарфоровый стакан помещают (400,000±0,005) г гидроокиси натрия, растворяют в 700 см дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения гидроокиси натрия и охлаждают до комнатной температуры.

Срок хранения раствора — не более 14 сут.

7.1.6 Подготовка сернокислого аммония

Перед использованием сернокислый аммоний высушивают при (102±2) °C не менее 2 ч.

7.2 Подготовка прибора для отгонки аммиака

Прибор для отгонки аммиака собирают в соответствии с рисунком, приведенным в приложении А.

В бачок-парообразователь 1 через воронку 2 наливают дистиллированную воду (примерно 2/3 объема) и открывают кран 3 и зажим 4. Нагревают воду в бачке на газовой горелке или электрической плитке 11 . Присоединяют пустую колбу Кьельдаля 10 к каплеуловителю 7 и воронке для гидроокиси 5 и после того, как вода в бачке закипит, закрывают кран 3 . Включают холодильник 8 , подставляют под него пустую коническую колбу 9 и прибор «пропаривают» 5-10 мин.

7.3 Подготовка пробы анализируемого продукта

7.3.1 Подготовка проб проводится по ГОСТ 26809.

7.3.4 Пробу продукта с отделяемыми пищевкусовыми компонентами и декорированными (орехи, фруктовые наполнители в виде кусочков, печенье, вафли в виде декора, глазурь, начинки и другие отделяемые компоненты) полностью освобождают от этих компонентов и далее подготавливают по 7.3.2.

При выполнении измерений в лаборатории должны соблюдаться следующие условия:

источник

При выборе наиболее оптимального метода определения белка в пищевых продуктах особое внимание следует уделить его безопасности для оператора и окружающей среды, времени анализа, вопросу подготовки специалиста, соответствию международным стандартам и пр. Кроме того, выбор должен базироваться на возможностях лаборатории в подборе оборудования, соответствующего поставленным задачам.

Метод был разработан в 1883 году датским химиком Иоганном Кьельдалем в лаборатории Carlsberg. Он позволяет количественно определять содержание органического белка в пробе. Основан на разрушении пептидной связи с последующим высвобождением молекулы азота и его количественного анализа с помощью титрования.

Классический метод Кьельдаля предусматривает три простых этапа: разложение, дистилляцию и титрование. После титрования использованное количество титранта соответствует концентрации азота, который был в образце. Перерасчет на белок происходит с помощью коэффициента перерасчета F (6,25 = 0,16 г азота на 1 г белка). Полное время анализа одного составляет образца составляет около 2 часов. Метод достаточно чувствительный, предел определения – 0,1 мг азота.

Нагреватели, колбы, стеклянные холодильники – когда метод только открыли, все исполнялось исключительно в ручном режиме. Сегодня же все три этапа – разложение, дистилляция и титрование – могут быть легко выполнены с помощью автоматических систем для анализа белка по Кьельдалю:

Минерализатора для разложения образца.
Дистиллятора для отгонки аммиака.
Скруббера для нейтрализации газов.

Это референтный метод, который соответствует всем международным стандартам.
Доступность оборудования, возможность поэтапной комплектации. Например, сначала можно приобрести анализатор, а потом дистиллятор.
Все современные приборы анализа белка по методу ИК-спектрометрии калибруются на основе метода Кьедаля как эталонного.

Создан химиком Жаном Батистом Дюма в 1848 году. Метод обеспечивает определение общего азота в образце благодаря его полному сжиганию в сфере кислорода. Является альтернативой методу Кьельдаля. Но кроме органического определяет еще и неорганический азот.

Как и по Кьельдалю, так и по Дюма используются коэффициенты пересчета азота на белок. После открытия метод Дюма широкого распространения не получил. Возможно из-за того, что физически выполнить его сложнее. Он предполагает очень высокую температуру сгорания – около 1000-1300 ⁰С.

Сегодня различные производители предлагают анализаторы по этому методу. Как они работают?

Вы берете образец (достаточно 100 мг, чтобы провести анализ) и заворачиваете его в фольгу. Он сгорает при высокой температуре. Далее образец восстанавливается в следующей камере, где есть соединения меди. Потом азот проходит очищение: побочные продукты сгорания абсорбируются путем прохождения через скрубберы. В результате получаем чистый восстановленный азот, который определяется с помощью детектора теплопроводимости (TCD).

Нет необходимости использовать прекурсоры, а значит, оформлять горы документации.
Отсутствие потери азота на стадии переноса образцов.
Существенно короче время анализа, включая этап пробоподготовки: Дюма – до 1 часа, Кьельдаля – до 3 часов.
Исключение ошибки оператора. Забота о его здоровье и состоянии окружающей среды.

Метод Кьельдаля

Высокая производительность Относительно низкая производительность Короткое время анализа Значительные затраты времени Отсутствие больших затрат на обслуживание Доступное по стоимости оборудование Работает без присмотра Требует вмешательство оператора Отсутствие кислот или другой мокрой химии Использование кислот и щелочей Отсутствие вредных выбросов Дорогостоящая утилизация выбросов

Инфракрасное излучение с помощью светофильтров открыл Уильям Гершель в 1800 году. Прорыв в NIR-спектрометрии был сделан благодаря работе Уильяма Эбнея и Эдварда Фестинга. Они первыми сняли ИК-спектр органической жидкости в диапазоне 1-1,2 µм в 1881 году.

В основе метода лежит пропускание или отражение в ближнем инфракрасном диапазоне и последующее сравнение полученного спектра с результатами базы данных калибровок.

Значительное меньшие затраты времени по сравнению с другими методами: полный анализ можно сделать за 10 минут.
За короткое время можно получить большое количество показателей.
Отсутствие расходных материалов или реактивов.
Малые затраты труда.
Высокая точность может быть достигнута постоянным усовершенствованием калибровок.

Этот метод наиболее востребован на производстве цельнозерновых, комбикормов и мукомольной продукции.

Лидер среди предлагаемого на рынке оборудования NIR-спектрометрии – Infratec 1241/Nova от компании FOSS. Наличие в приборе большой базы калибровок, а также специальных модулей и кювет позволяет очень точно определять: влажность, белок, жир, зольность, клейковину, крахмал, бушельный вес, абсорбционную способность муки после помола и многие другие показатели.

Этап	Продукты/Напитки	Корма для животных
R&D	Разработка продукта	Разработка рецептуры
Хранение	Определение качества сырья, проверка товаров	Определение качества сырья, проверка товаров
Производство	Контроль промежуточных этапов производства	Оптимизация рецептуры
Готовая продукция	Проверка соответствия состава маркировке	Соответствие маркировке

Особенно важно использовать эффективный экспресс-метод для готовой продукции. Это дает возможность за короткий промежуток времени увидеть, насколько завершенным является ваш конечный продукт.

Метод ИК-спектрометрии предполагает анализ без разрушения образца.
Отсутствует пробоподготовка, а результаты вы получите уже через 20-40 секунд.
При анализе содержания белка методом ИК-спектрометрии не нужны расходные материалы.
Нет необходимости специально обучать оператора – все операции здесь предельно просты.
Прибор вы можете использовать как в лаборатории, так и на производстве.
Отсутствие прекурсоров и вреда для окружающей среды избавляет от необходимости оформления большого количества документов.
В отличие от двух других описанных методов ИК-спектрометрия не предполагает использования высоких температур.

Обозначения	Кьельдаля	Дюма	ИК-спектрометрия
Представление образца	Разрушение (сжигание)	Разрушение (сжигание)	Без разрушения
Пробоподготовка	Да	Да	Отсутствует
Время анализа	2-4 ч	5 мин (подготовка – 1 час)	20-40 с
Необходимость расходных материалов	Да	Да	Отсутствует
Подготовка специалиста	Высокая	Высокая	Низкая или отсутствует
Место анализа	Лаборатория	Лаборатория	Лаборатория или производство
Необходимость прекурсоров	Да	Нет	Нет
Работа с высокой температурой	Да (420 ⁰С)	Да (900 ⁰С)	Нет
Вред для окружающей среды	Высокий	Средний	Отсутствует

Таким образом, владея полной информацией о возможностях и недостатках каждого метода и оценив задачи и объем работы собственной лаборатории, производитель сможет выбрать наиболее подходящий метод количественного определения белка и соответствующее оборудование для его надлежащего выполнения. А значит – доказать качество и установить правильную цену на свою продукцию.

Анар Рахметов,
эксперт группы пищевых технологий

источник

На протяжении последних лет отечественная пищевая промышленность развивается весьма динамично. Эта тенденция является, несомненно, позитивной, потому что предопределяет формирование зрелого внутреннего рынка пищевых продуктов, усиление конкуренции и, как следствие, повышение их качества. Действительно, при возможности широкого выбора претендовать на потребительский спрос может лишь тот товар, который отвечает высоким требованиям качества. Вот почему в последние годы производители продуктов питания уделяют все более пристальное внимание вопросам контроля за качеством сырья и конечного продукта, причем не только давно известные, но и молодые предприятия, с первых ступеней развития бережно относящиеся к своей репутации.

Одним из важнейших показателей качества продукции, определяющим ее пищевую ценность, является содержание белка. Классическим способом определения белка является метод, разработанный еще в 1883 году датским химиком Иоганном Кьельдалем, который в последствии был назван его именем. Это очень трудоемкий и продолжительный анализ, и потому в современной лабораторной практике метод Кьельдаля часто пытаются заменить альтернативными методами определения белка, в том числе, с использованием дорогостоящих программно-аппаратных комплексов. Но метод Кьельдаля, несмотря на его сложность, до сих пор остается единственным общепризнанным арбитражным методом определения белка, и чаще всего используется в качестве эталонного для калибровки и настройки других методик анализа сырья и готовой продукции. По этой причине аппараты для определения белка по методу Кьельдаля есть практически в каждой лаборатории по анализу пищевой продукции, а альтернативные методики применятся только как вспомогательные при очень большом количестве ежедневных анализов. Для предприятия, только начинающего становление своей лаборатории, безусловно, предпочтительным является именно метод Кьельдаля.

Почему же методу Къельдаля, не смотря на более чем 120-летнюю историю, до сих пор не найдено достойной альтернативы? Причиной тому – высокая специфичность выбранной реакции окисления белка серной кислотой, в результате которой разрушаются пептидные связи в его молекуле и образуются ионы аммония, которые в последующем и могут быть легко проанализированы стандартными методами. Однако воспроизводимость и точность метода Кьельдаля в существенной степени зависит от опыта аналитика. Стремясь свести к минимуму влияние человеческого фактора на результаты анализа, ускорить выполнение методики и повысить ее безопасность, ведущие производители аналитического оборудования разработали специализированные комплекты оборудования для анализа по методу Кьельдаля. Метод включает в себя несколько основных этапов: отбор и подготовку проб, мокрое озоление, отгонку с паром и определение концентрации аммония (фотометрически или титриметрически). Для каждого этапа предусмотрены свои аппаратные решения, которые в настоящее время фактически стали стандартом де-факто и практически полностью заменили действия, выполняемые лаборантом вручную.

Необходимое условие получения точных результатов анализа по Кьельдалю – тщательная подготовка образцов. Процедура подготовки проб должна обеспечивать гомогенизацию образца, т. к. размер частиц в анализируемых пробах не должен превышать 1 мм. Однородность образца повышает воспроизводимость метода, а также позволяет уменьшить объём пробы. Обычно при использовании частиц малых размеров повышается скорость озоления. Для измельчения мягких образцов (таких как субстрат или сами грибы) рекомендуется использование специальных лабораторных мельниц, но чаще всего бывает достаточно обычной кофемолки. Взвешивание образцов для последующего анализа по Къельдалю должно проводиться на аналитических весах с точностью до 0,1 мг, например KERN ALS 120-4. Важно знать влажность образца и всегда анализировать либо предварительно высушенные образцы, либо образцы с точно установленным содержанием влаги. Для определения содержания влаги рекомендуется использовать термогравиметрические анализаторы, такие как KERN MRS 120-3 или его аналоги, имеющие погрешность на уровне 0.05-0.1%.

Самым трудоемким и продолжительным этапом в методе Кьельдаля является стадия мокрого озоления, в результате которого происходит полное “сжигание” образца в серной кислоте. Однако использовать для озоления чистую серную кислоту нецелесообразно из-за низкой скорости протекания процесса. Скорость озоления и разрушения образца зависят не только от свойств кислоты, но и от температуры обработки. Чем выше температура, тем меньше времени уходит на разложение. При использовании чистой серной кислоты температура озоления ограничивается, в основном, её точкой кипения (338°С), в то время как для полного разложения необходима более высокая температуры. Скорость мокрого озоления можно значительно увеличить за счет добавления солей и катализаторов. В классическом приборе Кьельдаля на каждый грамм образца обычно необходимо 25 мл кислоты и несколько часов для проведения разложения, в то время как, например, в блочных термореаторах серии DK (пр-ва итальянской фирмы VELP), благодаря повышенной температуре разложения (420°С) и оптимизации процесса термообработки, для разложения 1 грамма вещества требуется в среднем 30 минут и лишь 10 мл кислоты. Термореактор DK позволяет не только снизить расход серной кислоты, но и уменьшить расход гидроксида натрия, используемого для последующей нейтрализации разложившегося образца. Основной эксплуатационной проблемой для данной стадии анализа является выделение большого количества ядовитых паров диоксида и триоксида серы. Для сбора и нейтрализации вредных выбросов рекомендуется использовать специальный поглотитель, такой как скрюбер SMS, и вакуумный насос, например, кольцевой водоструйный насос JP. Эффективность системы SMS+JP настолько высока, что позволят использовать термореакторы DK без вытяжного шкафа, хотя наличие последнего все же желательно.

Полученный после стадии разложения прозрачный раствор не годится для непосредственного определения в нем аммонийного азота из большого содержания мешающих компонентов. Для отделения аммонийного азота он переводится в аммиачную форму (добавлением щелочи) и отгоняется с паром на специальных приборах, называемых дистилляторами. Компания VELP, один из ведущих производителей это типа аппаратов, предлагает несколько вариантов дистилляторов, отличающихся уровнем автоматизации и функциональным наполнением: от простейшего UDK126D с ручным управлением, который используется при необходимости проведения нескольких определений белка в день, до полностью автоматического программируемого UDK152 со встроенным фотометрическим титратором, производительность которого составляет до 20 проб в час и позволяет полностью исключить участие оператора на 3-ем и 4-ом этапах анализа. Дистилляторы могут также использоваться для отгонки аммонийного азота непосредственно из образцов без их предварительного разложения, что позволяет выделить содержание аммонийного азота из общего азота по Кьельдалю.

Результаты по определению белка принято представлять в мг/л аммонийного азота, поэтому метод определения белка по Кьельдалю (что более распространено в пищевой промышленности) часто еще называют методом определения общего азота по Кьельдалю (используется, например, в экологическом анализе). Пересчет на содержание белка осуществляется по известному коэффициенту, который в общем случае равен 6.25, но может несколько отличаться для различных типов белка. Перегоняемый с паром аммиак собирается в колбе, в которую предварительно помещают раствор борной или серной кислоты с известной нормальностью. Полученный чистый раствор бората или сульфата аммония может быть легко оттитрован прямым или обратным методом. Если ежедневно производится анализ небольшого количество проб, то можно довольствоваться обычным бюреточным титрованием, но для титрования большого количества проб и для повышения точности результатов рекомендуется использовать автоматические титраторы. Хорошей альтернативой титриметрии может стать фотометрическое определение аммонийного азота при помощи готовых реактивов. Так компания HACH-LANGE предлагает спектрофотометры и фотометры серии DR, которые комплектуются наборами реагентов, позволяющих получить результат за считанные минуты. Например, в память спектрофотометра DR/2500 помимо 5 различных методик определения аммонийного азота и азота по Кьельдалю, занесено еще более 100 различных методов определения целого ряда металлов, различных форм азота и фосфора, практически всех важнейших анионов.

В рамках этой статьи вполне осознано не рассматривались другие методики определения белка, поскольку все они вторичны и требуют калибровки по методу Кьельдаля. Несмотря на кажущуюся сложность комплекса оборудования для определения белка по Кьельдалю, использование именного этого метода анализа гарантирует достоверность результатов, в то время как предложенное приборное решение позволяет существенно увеличить воспроизводимость, снизить расход реактивов и обеспечить безопасность персонала. Указанные в качестве примеров модели приборов характеризуются, прежде всего, приемлемой ценой, высокой надежностью и, главное, имеют большой практический опыт эксплуатации на множестве пищевых производств в различных регионах России, хотя для реализации метода Кьельдаля конечно могут использовать приборы и других производителей, выбор которых зависит от предпочтений и финансовых возможностей конкретной лаборатории.

источник

Необходимые реактивы и посуда:

33 % раствор ΝаОН, катализатор для сжигания белка, содержащий селен, концентрированная серная кислота, смешанный индикатор для титрования, 0,1 М раствор ΝаОН, 0,1 М раствор Н₂SO₄.

Колба Кьельдаля, коническая колба вместимостью 250 см³, цилиндры вместимостью 25 и 50 см³, перегонная колба вместимостью 500 см³, пипетки вместимостью 25 и 10 см³, электрическая плитка, каплеуловитель, водяной холодильник.

Расход зерна 1г на один анализ.

В стеклянной пробирке взвешивают 1 г муки исследуемого образца зерна с точностью до четвертого знака. Содержимое пробирки точно переносится в сухую колбу Кьельдаля. Пустую пробирку взвешивают и по разнице между первым и вторым взвешиванием находят массу взятой для сжигания навески муки. Цилиндром отмеривают 15 см³ концентрированной серной кислоты. Кислотой смывают стенки колбы и смачивают навеску муки. Добавляют 1-1,5 г катализатора сжигания, колбу закрывают специальной стеклянной насадкой или воронкой. Колбу наклонно устанавливают на электрической плите и сжигают образец обязательно под тягой. Когда жидкость в колбе приобретет зеленоватый цвет, сжигание продолжают еще 10 — 15 минут, затем дают колбе остыть. После охлаждения приступают к перегонке. В колбу Кьельдаля небольшими порциями по стенке приливают 30-50 см³ дистиллированной воды, собирают специальную установку для перегонки и начинают перегонку. При отсутствии установки содержимое колбы Кьельдаля переносят в термостойкую перегонную колбу вместимостью 500 см³, в которой будет осуществляться перегонка, при этом колбу Кьельдаля несколько раз ополаскивают дистиллированной водой и соединяют с исследуемым образцом. Перегонная колба устанавливается на плитке, присоединяется к каплеуловителю и холодильнику. Конец холодильника должен быть опущен в приемную колбу вместимостью 250 см³, содержащую 25 см³ 0,1 М серной кислоты с несколькими каплями смешанного индикатора. Перегонную колбу закрывают пробкой, в которой вместе с каплеуловителем вставлена делительная воронка или резиновая трубка со стеклянной воронкой. Через воронку в перегонную колбу в начале нагревания приливается 50 см³ 33 % раствора ΝаОН для нейтрализации кислоты. Перегонку проводят в течение 30 минут, чтобы объем жидкости в приемной колбе удвоится, затем приемную колбу опускают так, чтобы конец холодильника был выше уровня жидкости в приемной колбе, продолжают перегонку еще 5 минут. Избыток кислоты в приемной колбе оттитровывают 0,1 М раствором серной кислоты до перехода малиновой окраски смешанного индикатора в зеленую. Титрованием определяется количество серной кислоты, нейтрализованной выделившимся при отгонке аммиаком. При этом 1 см³ 0,1 М раствора гидроксида натрия соответствует 1,4 мг или 0,0014 г азота. Содержание белка в исследуемом образце зерна рассчитывают по формуле 1.1:

N= = , (1.1)

где: а- количество 0,1 М раствора Н₂SO₄, взятого на анализ, см³ ;

б- количество 0,1 М раствора гидроксида натрия, пошедшего на

титрование избытка кислоты, см³ ;

W- массовая доля влаги в муке, % а.с.в.;

6,25 – коэффициент пересчета содержания азота на белок для

Содержание белка в ячмене не должно превышать 12,0 %.

1.2 Определение растворимого белка (Число Кольбаха)

Необходимые посуда и реактивы.

Реактивы и посуда аналогичны определению белка по методу Кьельдаля.

Расход сусла 20 см³ на один анализ.

20 см³ лабораторного сусла упаривают на медленном огне в колбе Кьельдаля до сиропообразного состояния, в колбу вносят 3 г катализатора и 20 см³ концентрированной серной кислоты, сжигание и перегонку проводят аналогично определению белка в зерне по методу Кьедьдаля. Для расчета необходимо знать массовую долю сухих веществ и относительную плотность сусла. Содержание растворимого белка рассчитывают по формуле 1.2:

N_р = , (1.2)

где: N_р – количество растворимого белка в 100 г экстракта, г;

а — количество 0,1 М раствора серной кислоты, взятой на

б — количество 0,1 М раствора гидроксида натрия,

пошедшего на титрование избытка кислоты, см³;

6,25 – коэффициент пересчета содержания азота на

е — массовая доля сухих веществ в сусле, %;

d — относительная плотность сусла;

20 – объем сусла взятый на анализ.

Содержание растворимого азота в солоде хорошего качества должно составлять 570-630 мг или растворимого белка 3,5- 4,0 г на 100 г сухого вещества солода.

Показателем качества солода является число Кольбаха или показатель белкового растворения солода, он определяется отношением растворимого белка в лабораторном сусле к общему белку солода и выражается в процентах. Число Кольбаха (степень белкового растворения) рассчитывают по формуле 1.3:

N_р – количество растворимого белка в 100 г экстракта солода, г;

N_c – количество белка в солоде, %.

Число Кольбаха в солоде составляет:

Степень растворения солода Отношение, %

Последнее изменение этой страницы: 2016-04-26; Нарушение авторского права страницы

источник

3.2.4. Метод определения массовой доли белка по Кьельдалю

2. Навеску помешают в колбу Кьельдаля, добавляя несколько стеклянных или карборундовых бус или несколько кусочков фарфора, 15.5 г медного катализатора, взвешенного с погрешностью не более 0,1 г. и не более 25 см 3 серной кислоты. Содержимое колбы осторожно перемешивают и колбу укрепляют пол углом около 40˚ относительно вертикали на установке для сжигания. Содержимое колбы обогревают осторожно, до появления пенообразования и полного растворения пробы.

3. Затем обогревают интенсивно и выдерживают в состоянии кипения, вращая периодически колбу вокруг ее оси. После полного осветления содержимого колбы продолжают обогрев в течение 90 мин. Общая продолжительность минерализации должна быть не менее 120 мин. Затем содержимое колбы охлаждают до температуры около 40 ˚С, осторожно добавляют 50 см 3 воды, перемешивают и охлаждают до комнатной температуры.

Массовую долю общего азота (Х), в процентах, вычисляют по формуле:

Массовую долю общего белка (X₁). в процентах, вычисляют по формуле:

где X — средняя массовая доля общего азота в испытуемой пробе.

3.2.5 Анализ аминокислотного состава муки бобов нута

Анализ проводят методом ВЭЖХ на хроматографе Knauer Smartline 5000 с использованием обратнофазовой хроматографии на колонке Диасфер -110 С18 5 мкм 2*150 мм с предколоночной модификацией аминокислот 6-аминоквинолин гидроксисукцинамидил карбамата по методу Waters WAT 052880. Детекция фотометрическая при λ 248 нМ.

Навеску массой 200 мг (мука нута) переносят в пробирки для гидролиза. Анализ проводят в 3 повторностях. Вливают 5 мл 6 н HCL, продувают азотом и укупоривают. Гидролиз проводят 24 часа при 110 °С.

Затем образцы нейтрализуют эквимолярным количеством 2 н NaOH и доводят бидистилятом до 80 мл.

Для анализа отбирают 10 мкл образца, добавляют 70мкл буфера и 20 мкл модифицирующего реактива. Выдерживают 10 мин при t=50 °С. Объем инжекции — 20 мкл.

Количественный расчет проводят по соотношению площадей пиков стандарта и образца.

источник