Метод определение белков аминокислотный анализ гидролиз

Для определения природы С-концевой аминокислоты часто используют ферментативные методы. Обработка полипептида карбоксипептидазой, которая разрывает пептидную связь с того конца пептида, где содержится свободная СООН-группа, приводит к освобождению С-концевой аминокислоты, природа которой может быть идентифицирована методом хроматографии.

Предложен также химический метод Акабори (S. Akabori), который основан на гидразинолизе полипептида:

Гидразин, вызывая распад чувствительных к нему пептидных связей полипептида, реагирует со всеми аминокислотами, за исключением С-концевой аминокислоты, поскольку ее карбоксильная группа не участвует в образовании пептидной связи. При этом образуется смесь аминоацил-гидразинов и свободной С-концевой аминокислоты. Последнюю после обработки всей смеси ДНФБ отделяют и идентифицируют хроматографи-чески, для чего образовавшиеся динитрофенилпроизводные аминоацил-гидразинов предварительно экстрагируют уксусно-этиловым эфиром.

С-концевую аминокислоту идентифицируют также путем обработки полипептида восстанавливающим агентом, например боргидридом натрия. В простейшей форме эту процедуру можно представить в следующем виде:

Видно, что в указанных условиях только одна, а именно С-концевая, аминокислота будет превращаться в α-аминоспирт, легко идентифицируемый методом хроматографии. Таким образом, при помощи указанных методов определяют природу N- и С-концевых аминокислот.

Следующий этап работы связан с определением чередования (последовательности) аминокислот внутри полипептидной цепи. Для этого сначала проводят избирательный, частичный (химический и ферментативный), гидролиз полипептидной цепи на короткие пептидные фрагменты, последовательность аминокислот в которых может быть точно определена описанными ранее методами.

Химические методы избирательного и неполного гидролиза основаны на применении таких химических реактивов, которые вызывают селективный, высокоспецифический разрыв пептидных связей, образованных определенными аминокислотами, оставляя незатронутыми остальные пептидные связи. К этим избирательно гидролизующим веществам относятся цианогенбромид, CNBr (по остаткам метионина), гидроксиламин (по связям между остатками аспарагиновой кислоты и глицина), N-бромсукцинамид (по остаткам триптофана). Метионина в составе белков содержится обычно меньше, чем других аминокислот, поэтому обработка CNBr предпочтительнее, так как при этом образуется небольшое число пептидов, первичную структуру которых определяют с помощью рассмотренных ранее методов, всякий раз начиная с определения природы N- и С-концевых аминокислот.

Ферментативные методы гидролиза основаны на избирательности действия протеолитических (вызывающих распад белков) ферментов, расщепляющих пептидные связи, образованные определенными аминокислотами. В частности, пепсин ускоряет гидролиз связей, образованных остатками фенилаланина, тирозина и глутаминовой кислоты, трипсин – аргинина и лизина, химотрипсин – триптофана, тирозина и фенилаланина. Ряд других ферментов, например папаин, субтилизин, проназа и другие бактериальные протеиназы, также используется для неполного гидролиза белков. В результате полипептидная цепь расщепляется на мелкие пептиды, содержащие иногда всего несколько аминокислот, которые отделяют друг от друга сочетанными электрофоретическими и хроматографическими методами, получая своеобразные пептидные карты. Далее определяют чередование аминокислот в каждом индивидуальном пептиде. Завершается работа воссозданием первичной структуры полной полипептидной цепи на основании определения последовательности аминокислот в отдельных пептидах.

Метод составления пептидных карт, получивший образное название «метод отпечатков пальцев», используется при определении сходства или различия гомологичных белков по первичной структуре. Белок инкубируют с каким-либо протеолитическим ферментом. Часто порции белка инкубируют как с пепсином, так и с трипсином. При этом вследствие гидролиза строго определенных пептидных связей образуется смесь коротких пептидов, легко разделяемых с помощью хроматографии в одном направлении и электрофореза – в другом , под углом 90° от первого (пептидная карта).

Дальнейшие задачи – установление последовательности расположения аминокислот в каждом из выделенных пептидов (фенилтиогидантоиновым или другими методами), сопоставление полученных данных и установление первичной структуры всей молекулы.

Возможность применения рентгеноструктурного анализа для определения последовательности аминокислот в белковой молекуле была рассмотрена ранее. Следует отметить совершенно новый подход к решению этой важной проблемы – определение последовательности аминокислот в белковой молекуле с использованием данных о комплементарной нуклеотидной последовательности ДНК. Этому способствуют как методы быстрого секвенирования ДНК, так и техника изолирования и доступности самого гена.

В настоящее время выяснение первичной структуры белков является вопросом времени и технического оснащения лабораторий. Полностью выяснена первичная структура многих природных белков и прежде всего инсулина, содержащего 51 аминокислотный остаток [Сэнджер Ф., 1954]. Более крупным белком с выясненной первичной структурой оказался иммуноглобулин, в четырех полипептидных цепях которого насчитывается 1300 аминокислотных остатков. За эту работу Дж. Эдельман и Р. Портер были удостоены Нобелевской премии (1972).

Рис. 1.14. Структура проинсулина.

Расшифрованы первичные структуры миоглобина человека (153 аминокислотных остатка), α-цепи (141) и β-цепи (146) гемоглобина человека, цитохрома С из сердечной мышцы человека (104), лизоцима молока человека (130), химотрипсиногена быка (245) и многих других белков, в том числе ферментов и токсинов. На рис. 1.14 представлена последовательность аминокислотных остатков проинсулина. Видно, что молекула инсулина (выделена темными кружками), состоящая из двух цепей (А – 21 и В – 30 аминокислотных остатков), образуется из своего предшественника – про-инсулина (84 аминокислотных остатка), представленного одной полипептидной цепью, после отщепления от него пептида, состоящего из 33 аминокислотных остатков. Строение молекулы инсулина (51 аминокислотный остаток) схематически можно представить следующим образом:

Между цепями А и В и внутри А-цепи инсулина образуются дисуль-фидные (—S—S—) связи. Выяснена первичная структура более 18 инсули-

нов, выделенных из разных источников. Близкими по первичной структуре оказались инсулины из поджелудочной железы человека, свиньи и кашалота. Единственным отличием инсулина человека является нахождение треонина в положении 30 В-цепи вместо аланина.

Вторым белком, первичная структура которого расшифрована С. Муром и У. Стейном, является рибонуклеаза (рис. 1.15) из поджелудочной железы, катализирующая расщепление РНК. Фермент состоит из 124 аминокислотных остатков с N-концевым лизином и С-концевым валином, между остатками цистеина образуются дисульфидные (—S—S—) связи в 4 участках.

Полностью расшифрована последовательность аминокислот полипептидной цепи фермента лизоцима, имеющего важное защитное и медицинское значение, так как он вызывает лизис ряда бактерий, расщепляя основное вещество их клеточной оболочки. Лизоцим белка куриного яйца содержит 129 аминокислот (рис. 1.16) с N-концевым лизином и С-концевым лейцином.

Отечественными исследователями установлена первичная структура многих белков и полипептидов, в том числе крупного белка РНК-полимера-зы (в частности, последовательности ее β- и β 1 -субъединиц, 1342 и 1407 аминокислотных остатков соответственно фактора элонгации G из Е.coli (701 аминокислота) (Ю.А. Овчинников и др.), фермента аспартатамино-трансферазы, состоящей из 412 аминокислотных остатков (А.Е. Браун-штейн, Ю.А. Овчинников и др.), леггемоглобина, белка L25 из рибосом E.coli, нейротоксинов из яда кобры (Ю.А. Овчинников и др.), пепсиногена и пепсина (В.М. Степанов и др.), L-липотропина и лактогенного гормона быка (Н.А. Юдаев, Ю.А. Панков) и др.

Рис. 1.15. Первичная структура РНКазы. Цветом выделены четыре дисульфидные связи.

Рис. 1.16. Первичная структура полипептидной цепи лизоцима (схема).

Исследования первичной структуры α- и β-цепей гемоглобина способствовали выяснению структуры необычных, так называемых аномальных, гемоглобинов, встречающихся в крови больных гемоглобинопатиями. Иногда развитие болезни, как и изменение пространственной структуры гемоглобина человека, обусловлено заменой лишь одной какой-либо аминокислоты в структуре β-цепей (реже α-цепей) гемоглобина (см. главу 2).

Анализ данных о первичной структуре белков позволяет сделать следующие общие выводы.

1. Первичная структура белков уникальна и детерминирована генетически. Каждый индивидуальный гомогенный белок характеризуется уникальной последовательностью аминокислот: частота замены аминокислот приводит не только к структурным перестройкам, но и к изменениям физико-химических свойств и биологических функций.

2. Стабильность первичной структуры обеспечивается в основном глав-новалентными пептидными связями; возможно участие небольшого числа дисульфидных связей.

3. В полипептидной цепи могут быть обнаружены разнообразные комбинации аминокислот; в полипептидах относительно редки повторяющиеся последовательности.

4. В некоторых ферментах, обладающих близкими каталитическими свойствами, встречаются идентичные пептидные структуры, содержащие неизменные (инвариантные) участки и вариабельные последовательности аминокислот, особенно в областях их активных центров. Этот принцип структурного подобия наиболее типичен для ряда протеолитических ферментов: трипсина, химотрипсина и др. (см. главу 4).

5. В первичной структуре полипептидной цепи детерминированы вторичная, третичная и четвертичная структуры белковой молекулы, определяющие ее общую пространственную конформацию.

источник

Один из способов определения структуры белка включает его гидролиз, а затем качественный и количественный анализ образовавшейся при этом смеси аминокислот. Ниже обсуждается несколько методов такого анализа.

Смесь известных аминокислот наносится в виде пятна на стеклянную пластину, покрытую тонким слоем оксида кремния или оксида алюминия (рис. 15-2). В качестве пластины можно также использовать специальную бумагу без всякого покрытия. Пластину помещают в стеклянную камеру, на дно которой налито небольшое количество растворителя. Благодаря действию капиллярных сил растворитель начинает постепенно подниматься по пластине, увлекая за собой компоненты нанесенной на пластину смеси. Различные вещества движутся по пластине с различными скоростями. Относительная скорость движения компонентов смеси определяется относительной полярностью вещества, покрывающего пластину (неподвижной фазы), и растворителя (подвижной фазы). Например, если подвижная фаза малополярна, то менее полярные аминокислоты будут

Рис. 15-2. (см. скан) Тонкослойная хроматография: 1 — стеклянная или алюминиевая пластина, покрытая тонким слоем неподвижной фазы или нанесенное на точку старта пятно анализируемой смеси; 3 — стеклянная камера; 4 — крышка; 5 — растворитель (подвижная фаза) растворитель медленно поднимаете и по пластинке; фиолетовые (после обработки нингидрином) пятна аминокислот: 7 — лизин; 8 — пролин; 9 — серин; 10 — тирозии; 11 — место, где должно было бы оказаться пятно аланина, которого в анализируемой смеси нет; 12 — точка старта

двигаться по пластине сравнительно быстро, тогда как более полярные аминокислоты будут сильнее удерживаться неподвижной фазой. Различие в скорости движения приводит к разделению смеси на компоненты. После того как фронт подвижной фазы достигнет верхнего края пластины, ее вынимают из камеры, высушивают и опрыскивают раствором специального вещества — нингидрина. При этом бесцветные (и потому невидимые) аминокислоты образуют фиолетовые комплексы с нингидрином, что позволяет увидеть пятна аминокислот на пластине. Зная заранее положение на хроматограмме пятен каждой из двадцати аминокислот (при использовании определенных подвижной и неподвижной фаз),

легко определить, какие именно аминокислоты содержатся в исследуемой смеси. На рис. 15-2 показана хроматограмма смеси тирозина, серина, пролина и лизина.

Тонкослойная хроматография (ТСХ) позволяет провести лишь качественный анализ белков или смесей аминокислот. Очень приблизительно относительное содержание аминокислот в смеси можно оценить по интенсивности окраски пятен. Чем темнее пятно, тем выше содержание аминокислоты в изучаемом образце.

Еще одним методом определения аминокислот служит электрофорез, который имеет значительное сходство с ТСХ. Анализируемую смесь аминокислот помещают в центр расположенного горизонтально бумажного листа, который смочен буферным раствором, обеспечивающим желаемое значение рН. Под действием внешнего электрического поля молекулы аминокислот, в зависимости от знака заряда, начинают двигаться либо к катоду, либо к аноду (рис. 15-3, табл. 15-3). Если значение рН буферного раствора выше данной аминокислоты, то аминокислота существует в виде аниона и в электрическом поле будет двигаться к аноду. Наоборот, если аминокислота находится в катионной форме и будет двигаться к катоду. Чем больше разница между тем быстрее (дальше) будет двигаться аминокислота. В табл. 15-3 приведены значения и относительные подвижности некоторых аминокислот при

На рис. 15-4 показана электрофореграмма, полученная после проявления нингидрином.

Электрофорез используется для анализа смесей аминокислот, полученных в результате гидролиза белков. В некоторых случаях электрофоретическое обнаружение необычных аминокислот в плазме крови позволяет поставить больному правильный диагноз.

Рис. 15-3- Схема установки для электрофореза: а — вид сбоку; б — вид сверху; 1 — бумажный лист; 2 — пятно исследуемой смеси; 3 — буферный раствор

Рис. 15-4, Электрофореграмма: 1 — точка старта; 2 — лейцин; 3 — фенил аланин; 4 — аспарагиновая кислота; 5 — лизин

На рис. 15-5 показана принципиальная схема аминокислотного анализатора, который позволяет устанавливать как качественный, так и количественный состав смесей аминокислот, полученных в результате гидролиза белка.

Белок, чей аминокислотный состав анализируется, смешивают с соляной кислотой. Нагревание смеси приводит к гидролизу белка до аминокислот. Затем смесь аминокислот пропускают через колонку, заполненную оксидом алюминия или ионообменной смолой. В колонке аминокислоты разделяются и выходят из нее с различной скоростью. Разделенные аминокислоты смешивают с нингидрином и снова нагревают для ускорения образования окрашенного комплекса. Затем раствор проходит через фотометр, который регистрирует наличие и интенсивность окраски и изображает график зависимости оптической плотности раствора от времени. Поскольку время удерживания каждой из двадцати аминокислот в колонке известно, можно установить, какие именно аминокислоты входят в состав исследуемого белка. Площадь пика пропорциональна количеству данной аминокислоты, что позволяет установить относительное содержание аминокислот в белке.

Аминокислотный состав белка может быть установлен несколькими способами. После гидролиза белка до аминокислот смесь последних можно анализировать с помощью тонкослойной хроматографии или электрофореза. Оба эти метода дают только качественный состав смеси аминокислот. С помощью автоматического аминокислотного анализатора можно установить и качественными количественный аминокислотный состав белка.

Таблица 15-3. (см. скан) Относительные подвижности некоторых аминокислот в электрическом поле

источник

Первичная структура белков. Гидролиз белков, определение аминокислотного состава. Анализ N- и С-концевых аминокислот.

Синтез белка происходит на рибосомах в виде первичной структуры, т.е. расположенных в определенном количестве и определенной последовательности аминокислот, соединенных пептидными связями, образованными карбоксильной и α-аминогруппами соседних аминокислотных остатков Пептидная связь — жесткая, ковалентная, генетически детерминированная.В структурных формулах изображается в виде одинарной связи: ,однако на самом деле эта связь между углеродом и азотом носит характер частично двойной связи:

Вокруг нее вращение невозможно и все четыре атома лежат в одной плоскости, т.е. компланарны. Вращение же других связей вокруг полипептидного остова достаточно свободно.

Первичная структура открыта в 1898 году профессором казанского университета Данилевским. В 1913 году Эмилем Фишером были синтезированы первые пептиды.

Такая последовательность аминокислот является уникальной для каждого белка и закреплена генетически. При нарушении процесса синтеза первичной структуры белка на рибосоме могут развиваться различные гететические заболевания. Например, при нарушении двух аминокислот в гемоглобине развивается серповидноклеточная анемия.

Для изучения аминокислотного состава белков пользуются сочетанием (или одним из них) кислотного (НСl), щелочного (Ва(ОН)2) и реже ферментативного гидролиза. Установлено, что при гидролизе чистого белка, не содержащею примесей, освобождается 20 различных а-аминокислот. Все другие открытые в тканях животных, растений и микроорганизмов аминокислоты (более 300) существуют в природе в свободном состоянии или в виде коротких пептидов или комплексов с другими органическими веществами.

α-аминокислоты представляют собой производные карбоновых кислот, у которых один водородный атом, у α -углерода, замещен на аминогруппу (-NH2), например: следует подчеркнуть, что все аминокислоты, входящие в состав природных белков являются а-аминокислотами, хотя аминогруппа в свободных аминикарбоновых кислотах может находиться, как увидим ниже, в β, γ, δ, ε -положениях.

9. Вторичная структура белков — α-спирали и β-структуры. Строение и функциональная роль доменов.

Вторичная структура — это пространственное расположение полипептидной цепочки в виде α-спирали или β-складчатости безотносительно к типам боковых радикалов и их конформации. Она стабилизирована водородными связями, которые замыкаются между пептидными, амидными (-N-H) и карбонидными (-C=O) группами, т.е. входят в пептидную единицу, и дисульфидными мостиками между остатками цистеина

Полинг и Кори предложили модель вторичной структуры белка в виде левозакрученной α-спирали, в которой водородные связи замыкаются между каждой первой и четвертой аминокислотой, что позволяет сохранять нативную структуру белка, осуществление им простейших функций, защищать от разрушения. На один виток спирали приходится 3,6 аминокислотных остатка, шаг спирали составляет 0,54 нм. В образовании водородных связей принимают участие все пептидные группы, что обеспечивает максимальную стабильность, снижает гидрофильность и увеличивает гидрофобность белковой молекулы. Альфа-спираль образуется самопроизвольно и является наиболее устойчивой конформацией, отвечающей минимуму свободной энергии

Полинг и Кори предложили и другую упорядоченную структуру — складчатый β-слой. В отличие от конденсированной α-спирали β- слои почти полностью вытянуты и могут располагаться как параллельно , так и антипараллельно

В стабилизации данных структур также принимают участие дисульфидные мостики и водородные связи.

Супервторичная структура — это более высокий уровень организации белковой молекулы, представленный ансамблем взаимодействующих между собой вторичных структур: α-спираль — два антипараллельных участка, взаимодействуют гидрофобными комплементарными поверхностями (по принципу впадина-выступ) αсα, сверхспирализация α-спирали, (βхβ)-элементы в глобулярных белках, представленные двумя параллельными β-цепями, связанные сегментом х, βαβαβ-элементы, представленные двумя сегментами α-спирали, вставленными между тремя параллельными β-цепями.

источник

Первый этап в определении первичной структуры белков заключается в качественной и количественной оценке аминокислотного состава данного индивидуального белка.

Для определения аминокислотного состава необходимо провести разрушение всех пептидных связей в белке. Анализируемый белок гидролизуют в 6 мол/л НС1 при температуре около 110 °С в течение 24 ч. В результате разрушаются пептидные связи в белке, а в гидролизате присутствуют только свободные аминокислоты

Разделение аминокислот с помощью ионообменной хроматографииСмесь аминокислот, полученных кислотным гидролизом белков, разделяют в колонке с катионообменной смолой.

Количественный анализ полученных фракций.нагреваютотдельные фракции аминокислот с нингидрином, образующим соединение красно-фиолетового цвета. Интенсивность окраски в пробе пропорциональна количеству находящейся в ней аминокислоты.

Определение N-концевой аминокислоты в белке и последовательности аминокислот в олигопептидах

Изучение первичной структуры белков имеет важное общебиологическое и медицинское значение. Изучая порядок чередования аминокислотных остатков в индивидуальных, можно выявить общие фундаментальные закономерности формирования пространственной структуры белков.многие генетические болезни — результат нарушения в аминокислотной последовательности белков. Информация о первичной структуре нормального и мутантного белка может быть полезна для диагностики и прогнозирования развития заболевания.

Установление первичной структуры белков включает 2 основных этапа:

определение аминокислотного состава изучаемого белка;

аминокислотной последовательности в белке.

Например, при серповидноклеточной анемии в шестом положении β-цепи гемоглобина происходит замена глутаминовой кислоты на валин. Это приводит к синтезу гемоглобина S (HbS) – такого гемоглобина, который в дезоксиформеполимеризуется и образует кристаллы. В результате эритроциты деформируются, приобретают форму серпа, теряют эластичность и при прохождении через капилляры разрушаются. Это в итоге приводит к снижению оксигенации тканей и их некрозу.

Последовательность и соотношение аминокислот в первичной структуре определяет формирование вторичной, третичной и четвертичной структур.

8. Вторичная структура белка–пространственная структура, образующаяся в результате взаимодействий между функциональными группами, входящими в состав пептидного остова.регулярные структуры двух типов: а-спираль и б-структура.

Вторичная структура образуется только при участии водородных связеймежду пептидными группами: атом кислорода одной группы реагирует с атомом водорода второй, одновременно кислород второй пептидной группы связывается с водородом третьей и т.д.

пептидный остов закручивается в виде спирали за счёт образования водородных связей между атомами кислорода карбонильных групп и атомами азота аминогрупп. Водородные связи ориентированы вдоль оси спирали. На один виток а-спирали приходится 3,6 аминокислотных остатка.

В образовании водородных связей участвуют практически все атомы кислорода и водорода пептидных групп. В результате ?-спираль «стягивается» множеством водородных связей. связи относят к слабых, их количество обеспечивает максимально возможную стабильность ?-спирали. гидрофильность ?-спиралей уменьшается, а их гидрофобность увеличивается.

?-Спиральная структура — наиболее устойчивая конформация пептидного остова, отвечающая минимуму свободной энергии. В результате образования ?-спиралей полипептидная цепь укорачивается.

Радикалы аминокислот находятся на наружной стороне ?-спирали и направлены от пептидного остова в сторонынекоторые из них могут нарушать формирование ?-спирали. К ним относят:

пролин. Его атом азота входит в состав жёсткого кольца, что исключает возможность вращения вокруг -N-CH- связи. Кроме того, у атома азота пролита, образующего пептидную связь с другой аминокислотой, нет атома водорода. В результате пролин не способен образовать водородную связь в данном месте пептидного остова, и ?-спиральная структура нарушается. Обычно в этом месте пептидной цепи возникает петля или изгиб;

участки, где последовательно расположены несколько одинаково заряженных радикалов, между которыми возникают электростатические силы отталкивания;

участки с близко расположенными объёмными радикалами, механически нарушающими формирование ?-спирали, например метионин, триптофан

β-Складчатый слойСтруктура формируется за счёт образования множества водородных связей между атомами пептидных групп линейных областей одной полипептидной цепи, делающей изгибы, или между разными полипептидными цепями, ?-Структура образует фигуру, подобную листу, сложенному «гармошкой» Когда водородные связи образуются между атомами пептидного остова различных полипептидных цепей, их называют межцепочечными связями. Водородные связи, возникающие между линейными участками внутри одной полипептидной цепи, называют внутрицепочечными. В ?-структурах водородные связи расположены перпендикулярно полипептидной цепи.

Если связанные полипептидные цепи направлены противоположно, возникает антипараллельная ?-структура, если же N- и С-концы полипептидных цепей совпадают, образуется структура параллельного ?-складчатог

9. Третичная структура – это укладка полипептидной цепи в глобулу («клубок»). Четкой границы между вторичной и третичной структурами провести нельзя, в основе третичной структуры лежат стерические взаимосвязи между аминокислотами, отстоящими далеко друг от друга в цепи. Благодаря третичной структуре происходит еще более компактное формирование цепи. В стабилизации третичной структуры белка принимают участие:

ковалентные связи(между двумя остаткамицистеина—дисульфидные мостики);

ионные связимежду противоположно заряженными боковыми группами аминокислотных остатков;

гидрофильно-гидрофобныевзаимодействия. При взаимодействии с окружающими молекулами воды белковая молекула «стремится» свернуться так, чтобы неполярные боковые группы аминокислот оказались изолированы от водного раствора; на поверхности молекулы оказываются полярныегидрофильныебоковые группы.

Связь с первичной структурой. Третичная структура в значительной степени предопределенапервичной структурой. Усилия по предсказанию третичной структуры белка основываясь на первичной структуре известна как задачапредсказания структуры белка. Однако, окружающая среда, в которой белок сворачивается существенно определяет конечную форму, но обычно непосредственно не принимается во внимание текущими методами предсказания. Большинство таких методов полагаются на сравнения с уже известными структурами, и таким образом включают окружающую среду косвенно. Супервторичная структура белков. сравнение конформаций разных по структуре и функциям белков выявило наличие у них похожих сочетаний элементов вторичной структуры. Такой специфический порядок формирования вторичных структур называют супервторичной структурой белков.она формируется за счёт межрадикальных взаимодействий. Определённые характерные сочетания а-спиралей и б-структур часто обозначают как «структурные мотивы».

источник

Определение аминокислотного состава белков может быть осуществлено различными методами: химическим, хроматографическим, микробиологическим и изотопным. Чаще используются хроматографические методы.

Бумажная хроматография. Бумажная хроматография используется для идентификации компонентов смеси аминокислот с ди- и три-пептидами, получаемой при частичном гидролизе белков и полипептидов.

Гидролиз может быть осуществлен кислотным, щелочным или ферментативным методом. Кислотный метод используется чаще (6 н. HCl, 8 н. H₂SO₄). Гидролиз проводят при нагревании, иногда при повышенном давлении. Показателями окончания гидролиза могут служить: прекращение нарастания карбоксильных или аминных групп в гидролизате, либо отрицательная биуретовая реакция. Избыток гидролизующего реагента удаляют: серную кислоту осаждают Ca(OH)₂, соляную кислоту отгоняют в вакууме, а остаток кислоты осаждают нитратом серебра.

Компоненты гидролизата распределяются между водой, адсорбированной на целлюлозе и являющейся неподвижной фазой, и органическим растворителем, подвижной фазой, которая движется вдоль листа вверх или вниз. В качестве подвижной фазы используется смесь бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:5). Более липофильные аминокислоты сильнее увлекаются органическим растворителем, более гидрофильные – проявляют большую тенденцию связываться с неподвижной фазой. Гомологические соединения, отличающиеся даже на одно метиленовое звено, движутся с различной скоростью и легко могут быть разделены. По окончании хроматографии бумагу высушивают и обрабатывают проявителем (0,5% раствор нингидрина в смеси ацетон-ледяная уксусная кислота-вода) и нагревают в течение нескольких минут. Аминокислоты проявляются в виде окрашенных пятен. Подвижность – постоянная величина, характерная для каждого соединения возрастает с увеличением молекулярной массы. Для аминокислот с неразветвленной цепью величина подвижности несколько больше, чем для соответствующих изомеров. Введение в молекулу полярных групп снижает подвижность соединения. Аминокислоты с объемными неполярными боковыми цепями (лейцин, изолейцин, фенилаланин, триптофан и др.) перемещаются быстрее, чем аминокислоты с более короткими неполярными боковыми цепями (пролин, аланин, глицин) или с полярными боковыми цепями (треонин, аргини, цистеин, гистидин, лизин). Это обусловлено большей растворимостью полярных молекул в гидрофильной стационарной фазе и неполярных – в органических растворителях.

Бумажная хроматография может быть использована для количественной оценки содержания аминокислот. Каждое пятно вырезают и элюируют подходящим растворителем; затем проводят количественный колориметрический (нингидриновый) анализ. В другом варианте бумагу опрыскивают нингидрином и измеряют с помощью фотометра интенсивность окрашивания пятна в отраженном или проходящем свете. При полуколичественной оценке содержание аминокислот оценивают по площади пятен на хроматограмме, которые пропорциональны концентрациям аминокислот в разделяемой смеси.

Тонкослойная хроматография. Для разделения и определения аминокислот может быть также использована тонкослойная хроматография. ТСХ, как известно, существует в двух вариантах. Распределительная ТСХ сходна с распределительной на бумаге и адсорбционная ТСХ, основана совершенно на других принципах.

При проведении РТСХ на порошке целлюлозы или других относительно инертных носителях можно использовать такие же системы растворителей и такие же проявляющие реагенты, как и при хроматографии на бумаге.

Разделение с помощью АТСХ определяется способностью растворителя (этот растворитель не обязательно является бинарной или более сложной смесью) элюировать компоненты образца с места его адсорбции на активированном сорбенте. Например, на нагретом силикагеле. АТСХ применима для разделения таких неполярных соединений, как липиды, но не для разделения аминокислот и большинства пептидов. Для разделения аминокислот используют РТСХ, которая позволяет достаточно быстро разделять и определять 22 аминокислоты белковых гидролизатов.

Аминокислоты в белковом гидролизате могут быть определены также методом газовой хроматографии, но перед хроматографическим анализом аминокислоты как правило переводят в летучие соединения.

-Взаимодействие с нингидрином. Образуются соответствующие альдегиды.

Таким образом, получают смесь альдегидов и анализируют ее. Это простейший случай, пригоден лишь для некоторых аминокислот.

-Переводят аминоксилоты в летучие эфиры (алкильные эфиры, метильные эфиры оксикислот, метиловые эфиры хлорзамещенных кислот и др.).

Выбор производных зависит от исследуемой смеси аминокислот.

Ионообменная хроматография. В настоящее время аминокислотный состав пищевых продуктов определяется исключительно с помощью автоматической ионообменной хроматографии.

В методе Мура и Штейна используют короткую и длинную колонки, заполненные смолой из сульфонированного полистирола в Na + – форме. Когда кислотный гидролизат при рН = 2 наносят на колонку, аминокислоты связываются в результате катионного обмена с ионами натрия. Далее колонку элюируют раствором цитрата натрия при заранее запрограммированных значениях рН и температуры. Короткую колонку элюируют одним буфером, длинную – двумя. Элюат обрабатывают нингидрином, измеряя интенсивность окраски с помощью проточного колориметра. Данные автоматически регистрируются на ленте самописца и могут передаваться в компьютер для вычисления площади под пиком.

Высоковольтный электрофорез на инертных носителях. В биохимии широкое применение нашло разделение аминокислот, полипептидов и других амфолитов (молекул, суммарный заряд которых зависит от рН среды) под действием наложенного постоянного электрического поля. Это метод высоковольтного электрофореза на инертных носителях. При разделении аминокислот в качестве инертных носителей чаще всего используют полоски бумаги или тонкие слои целлюлозного порошка. Разделение проводят в течение 0,5–2 ч при напряжении 2000–5000 В в зависимости от суммарных зарядов амфолитов и их молекулярных масс. Среди молекул, несущих одинаковый заряд, более легкие мигрируют быстрее. Но более важным параметром при разделении является суммарный заряд. Метод применяется для разделения аминокислот, низкомолекулярных пептидов, некоторых белков, нуклеотидов. Образец помещают на носитель, смачивают буфером при соответствующем рН и соединяют с буферным резервуаром полоской фильтровальной бумаги. Бумагу прикрывают стеклянной пластинкой или погружают в углеводородный растворитель для охлаждения. В электрическом поле молекулы, несущие при данном рН отрицательный заряд, мигрируют к аноду, а те, которые несут положительный заряд, – к катоду. Далее высушенную электрофореграмму «проявляют» нингидрином (при работе с аминокислотами, пептидами) или измеряют поглощение в УФ-свете (при работе с нуклеотидами).

Выбор рН определяется значениями рК диссоциирующих групп, входящих в состав молекул смеси. При рН 6,4 глутамат и аспарат несут заряд –1 и движутся к аноду; разделение их осуществляется благодаря различию в молекулярной массе. Лизин, аргинин и гистидин движутся в противоположном направлении, а все другие аминокислоты, входящие в состав белка, остаются вблизи места нанесения. При разделении пептидов, образовавшихся в результате ферментативного расщепления, уменьшение рН до 3,5 приводит к увеличению заряда катионных групп и обеспечивает лучшее разделение.

Методы бумажной, тонкослойной хроматографии, микробиологические, газохроматографические и ряд других, в настоящее время практически не используются вследствие худшей воспроизводимости и большой длительности. Современные хроматографы позволяют определять аминокислотный состав смеси, содержащей лишь 10 –7 –10 –9 моль каждого компонента с воспроизводимостью до 5% за 2–4 часа.

Анализ аминокислотного состава включает полный гидролиз исследуемого белка или пептида и количественное определение всех аминокислот в гидролизате. Поскольку при нейтральных рН пептидные связи стабильны, применяют кислотный или щелочной катализ. Ферментативный катализ для полного гидролиза менее пригоден. Полный гидролиз белка на составляющие аминокислоты неизбежно сопровождается частичной потерей некоторых аминокислотных остатков. Для гидролиза обычно используется 6 н. водный раствор соляной кислоты (110ºС), в вакуумированной ампуле. Количественное определение аминокислот в гидролизате проводят с помощью аминокислотного анализатора. В большинстве таких анализаторов смесь аминокислот разделяют на сульфокатионитах, а детектирование осуществляют спектрофотометрически по реакции с нингидрином или флуориметрически с о-фталевым диальдегидом.

Однако данные по аминокислотному составу однотипных продуктов, полученные в разных лабораториях по отдельным аминокислотам, иногда различаются до 50%.

Эти различия обусловлены не только сортовыми, видовыми или технологическими различиями, а главным образом условием проведения гидролиза пищевого продукта. При стандартном кислотном гидролизе (6 н. HСl, 110–120ºС, 22–24 часа) происходит частичное разрушение некоторых аминокислот, в том числе треонина, серина (на 10–15% и тем больше, чем дольше проводится гидролиз) и особенно метионина (30–60%) и цистина 56–60%, а также практически полное разрушение триптофана и цистеина. Этот процесс усиливается в присутствии больших количеств углеводов в продукте. Для количественного определения метионина и цистина рекомендуется проводить предварительное их окисление надмуравьиной кислотой. При этом цистин превращается в цистеиновую кислоту, а метионин в метионин-сульфон, которые весьма устойчивы при последующем кислотном гидролизе.

Цистин Цистеиновая кислота

Трудной задачей в аминокислотном анализе является определение триптофана. Как уже говорилось, при кислотном гидролизе происходит почти полное его разрушение (до 90%). Поэтому для определения триптофана проводят один из вариантов щелочного гидролиза 2 н. NaOH, 100ºС, 16–18 часов в присутствии 5% хлорида олова или 2 н. гидроокиси бария, при которых он разрушается незначительно (до 10%). Минимальное разрушение происходит в присутствии тиогликолевой кислоты и предварительно гидролизованного крахмала. (При щелочном гидролизе происходит разрушение серина, треонина, аргинина и цистеина). Гидролизат после нейтрализации смесью лимонной и соляной кислот немедленно (во избежание студнеобразования) анализируют на аминокислотном анализаторе. Что касается многочисленных химических методов определения триптофана, то они, как правило, в пищевых продуктах плохо воспроизводимы и поэтому их использовать не рекомендуется.

Для мясных продуктов дополнительной необходимой аминокислотой является оксипролин, который характеризует количество соединительных тканных белков в мясе. Его можно определять ионообменной хроматографией с помощью автоматических анализаторов или химическим колориметрическим методом. Метод основан на нейтрализации кислотного гидролизата до рН 6,0, последующем окислении оксипролина с помощью 1,4% раствора хлорамина Т (или хлорамина Б) в смеси пропилового спирта и буфера, колориметрическом определении при 533 нм продуктов окисления оксипролина после реакции с 10%-ным раствором пара-диметиламинобензальдегида в смеси хлорной кислоты и пропилового спирта (1:2).

В связи с тем, что тирозин, фенилаланин и пролин в присутствии кислорода могут частично окисляться, стандартный кислотный гидролиз рекомендуется проводить в атмосфере азота. Ряд аминокислот, в том числе лейцин, изолейцин и валин, требуют для своего полного выделения из белков более длительного кислотного гидролиза – до 72 ч. В биохимии при анализе белков гидролизуют параллельные пробы в течение 24, 48, 72 и 96 ч.

Для точного количественного определения всех аминокислот требуется проводить 5 различных гидролизов, что весьма удлиняет определение. Обычно же проводят 1–2 гидролиза (стандартный с соляной кислотой и с предварительным оксилением надмуравьиной кислотой).

Во избежание потерь аминокислот удаление избытка кислоты при кислотном гидролизе следует проводить немедленно многократным выпариванием в вакуум-эксикаторе с добавлением дистиллированной воды.

При правильной работе анализатора ионообменные колонки работают без замены смолы довольно долго. Однако, если образцы содержат заметные количества красящих веществ и липидов, то колонка быстро забивается и для восстановления ее разделительных способностей требуется многократная регенерация, иногда с перенабивкой колонки. Поэтому, для продуктов, содержащих более 5% жира, рекомендуется предварительно удалять липиды экстракцией. В таблице 2.3 приведены условия пробоподготовки основных пищевых продуктов при анализе аминокислотного состава.

Таблица 2.3. – Условия подготовки проб пищевых продуктов к анализу

Контрольные вопросы:

1. Дайте определение понятию «белки».

2. На какие группы делят белки по их функциям в организме?

3. Какова роль белков в питании человека?

4. Каковы рекомендуемые нормы белка в питании?

5. Каково рекомендуемое соотношение белков растительного и животного происхождения и как белки различного происхождения отличаются по своему аминокислотному составу?

6. Какие незаменимые аминокислоты вы знаете и какие аминокислоты могут стать незаменимыми?

7. Как определяют содержание общего азота в продуктах питания?

8. Как определяют аминокислотный состав белков?

9. Какие методы определения аминокислот вы знаете?

§ 2.4. Углеводы

Углеводы широко представлены в растениях и животных, где они выполняют как структурные, так и метаболические функции. В растениях в процессе фотосинтеза из углекислого газа и воды синтезируется глюкоза, которая далее запасается в виде крахмала или превращается в целлюлозу – структурную основу растений. Животные способны синтезировать ряд углеводов из жиров и белков, но большая часть углеводов поступает с пищей растительного происхождения.

Дата добавления: 2015-05-29 ; Просмотров: 2821 ; Нарушение авторских прав? ;

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

источник

Можно выделить следующие этапы выяснения первичной структуры белков и пептидов:

1. Выделение белка в чистом виде и определение его молекулярной массы

2. Определение аминокислотного состава

3. Определение N-концевой аминокислоты

4. Определение С-концевой аминокислоты

5. Определение аминокислотной последовательности

Выделение белка в чистом виде. Как правило, исходный материал содержит много различных белков. В связи с этим возникает проблема выделения из этой смеси интересующего белка в чистом виде. При очистке белков используются методы, которые основаны на разнице:

1.Поверхностного заряда белков

2.Молекулярного размера белков (зависящего от их молекулярной массы)

3.Биологической активности вследствие связывания с субстратами или ингибиторами

Разделение белков по разнице величины поверхностного заряда. Суммарный поверхностный электрический заряд белка при данном значении рН может быть отрицательным, нейтральным или положительным. Для разделения белков с различным зарядом, подобно тому, как это было в случае аминокислот, может быть использован метод ионообменной хроматографии (см. выше). Концентрацию белка в пробирках с элюатом определяют с помощью спектрофотометра по интенсивности поглощения ультрафиолетового света и строят графическую зависимость её от объема вытекшей из хроматографической колонки жидкости.

Разделение белков по молекулярной массе. Если представить молекулы белков в виде шариков различной величины, размер которых зависит от их молекулярной массы, то окажется, что у больших шариков будет большей молекулярная масса или размер молекул. Это означает, что белки можно разделить подобно частичкам в сите — молекулярном сите, образованном гелем. Такой способ часто называют гель-фильтрацией или хроматографией исключения размером. Ниже приводится иллюстрация того, как с помощью гель-фильтрации удается разделить смесь белков различного размера (рис.1.12).

Хроматографическую колонку заполняют набухшим гелем. Частицы геля приготовлены из связанного поперечными сшивками полисахаридного материала и содержат большое количество микропор. Размер микропор подбирают таким образом, чтобы в них проникали меньшие из разделяемых молекул, в то время как большие этого сделать не могли. Смесь разделяемых белков наносят на верхнюю часть колонки и элюируют буферным раствором. Увлекаемые током нисходящей жидкости большие молекулы, не имея возможности проникнуть в поры гелевых частиц, будут двигаться быстрее. Меньшие молекулы проникают в поры и задерживаются там. Если собирать вытекающий из колонки раствор равными порциями в пробирки, то окажется, что в более ранних порциях вытекающей жидкости будут содержаться белки больших размеров, а в более поздних — меньших размеров. Путем подбора размера пор можно добиться разделения самых разных смесей белков.

Рис.1.12. Схематическое изображение разделения белков методом гель-фильтрации

Если учесть, что размер молекулы зависит от молекулярной массы, то оказывается, что разделяя белки методом гель-фильтрации, одновременно можно установить его молекулярную массу.

Рис.1.13. График зависимости молекулярной массы белков от объема выхода их из хроматографической колонки в ходе гель-фильтрации

Объем вытекающего из колонки элюата обратнопропорционален логарифму молекулярной массы белка. Таким образом, достаточно знать объем жидкости, в котором вышел из колонки интересующий белок, чтобы, пользуясь подобным графиком, можно было установить его молекулярную массу (рис.1.13).

Ещё одним методом, который позволяет разделить белки в зависимости от их молекулярной массы, является гель-электрофорез (см. выше).

Ультрацентрифугирование. Если встряхнуть сосуд, заполненный песком с водой, а затем поставить его на ровную поверхность, то песок быстро осядет на дно благодаря силе земного притяжения. С высокомолекулярными веществами, находящимися в растворе, этого не произойдет, так как тепловое (броуновское) движение сохраняет их равномерное распределение в растворе. Оседание макромолекул, подобно песчинкам, произойдет, только если их подвергнуть значительному ускорению.

В 1923 году шведский биохимик Т. Сведберг впервые использовал ультрацентрифугирование. При скорости вращения ротора 80000 об/мин ему удалось показать, что многие белки состоят из субъединиц. Позже ультрацентрифугирование стало незаменимым методом для разделения белков, нуклеиновых кислот и субклеточных частиц.

Рис.1.14. Схематическое изображение зонального ультрацентрифугирования.

Образец наслаивают на градиент сахарозы (слева). После центрифугирования (середина) каждая частица осаждается на уровне, зависящем от его массы. После остановки ротора центрифужную пробирку прокалывают и разделенные частицы (зоны) собирают в пробирки (справа).

Осаждение проводят в растворе химически инертного вещества (сахарозы или CsCl), концентрация которого и, следовательно, плотность увеличивается в направлении от поверхности до дна центрифужной пробирки. Использование таких градиентов плотности значительно усиливает разрешающую способность ультрацентрифуги. Различают зональное препаративное ультрацентрифугирование (рис.1.14) и ультрацентрифугирование в равновесном градиенте плотности (изократное ультрацентрифугирование) (рис.1.15).

Разделение белков по разнице биологической активности вследствие связывания с лигандами. Характерной особенностью белков является их способность прочно связываться с различными молекулами, но нековалентными связями. На этом основан метод разделения белков аффинной хроматографией (рис.1.16).

Рис.1.16. Схематическое изображение принципа иммуноаффинной хроматографии

Антиген — лиганд для выделяемого белка. Антитело — выделяемый белок.

Молекулы веществ, с которыми специфически связываются определенные белки, ковалентно соединяют с частицами инертного матрикса. Тогда они выполняют роль своеобразных «рыболовных крючков», задерживающих необходимый белок. Все остальные белки транзитом проходят через колонку. Задержанный белок затем можно вымыть из колонки с помощью буферного раствора, содержащего в свободном состоянии такие же молекулы, которые выполняли роль «рыболовных крючков», или с помощью какого-нибудь другого реактива, способного нарушить это взаимодействие. Одним из вариантов этого метода является иммуноаффинная хроматография. Тогда антитела к определенному белку присоединяют к частицам сорбента. Они обеспечивают с очень высокой специфичностью задержку в колонке этого белка (рис.1.16).

Определение аминокислотного состава белка.До определения аминокислотной последовательности выделенного белка желательно иметь представление о его аминокислотном составе, то есть знать, какие аминокислоты и в каком количестве входят в состав его молекулы. Для этого проводят полный гидролиз белка с последующим количественным анализом высвободившихся аминокислот. Чаще используют кислотный гидролиз. Полипептид растворяют в 6N НCl в отсутствие кислорода, чтобы предотвратить окисление серусодержащих аминокислот. Смесь нагревают до 100-120 0 С и выдерживают при этой температуре в течение 10-100ч. К сожалению при этом способе гидролиза некоторые аминокислоты (Сер, Три, Тир, Глн, Асн) разрушаются.

Аминокислотный состав полипептидного гидролизата определяют с помощью автоматического аминокислотного анализатора. Прибор разделяет аминокислоты посредством ионообменной хроматографии (см. выше). Их идентифицируют по элюционному объему и количественно учитывают по интенсивности флюоресценции после проведения реакции с дансилхлоридом. Современные аминокислотные анализаторы проводят анализ гидролизата белка в течение 1ч с чувствительностью, которая позволяет определить до 1 пикомоля аминокислоты.

Определение N-концевой аминокислоты.Имеется несколько эффективных подходов, с помощью которых можно идентифицировать N-концевую аминокислоту. 1-Диметиламинонафталин-5-сульфонилхлорид (дансил хлорид) взаимодействует с первичными аминами с образованием дансилированного полипептида. Последующее проведение кислотного гидролиза позволяет высвободить из полипептидной цепи N-концевую аминокислоту в виде дансил-аминокислоты, обладающей интенсивной желтой флюоресценцией (рис.1.17).

Рис.1.17. Этапы определения N-концевой аминокислоты методом дансилирования

Благодаря этому дансил-производное аминокислоты можно идентифицировать хроматографически.

Ещё более популярным методом идентификации N-концевой аминокислоты является разрушение по Эдману (Pehr Edman — автор метода). Фенилизотиоцианат (ФИТЦ, реактив Эдмана) взаимодействует с N-концевой аминогруппой белков в слабо щелочной среде (рис.1.18). В результате образуется фенилтиокарбамильный продукт. Его обрабатывают безводной сильной кислотой, такой как трифторуксусная кислота. При этом тиазолиновое производное N-концевой аминокислоты отщепляется, в то время как остальные пептидные связи не подвергаются гидролизу. Тем самым разрушение по Эдману заключается в отщеплении остатка только N-концевой аминокислоты и сохранении оставшейся части полипептидной цепи.

Тиазолиновое производное аминокислоты избирательно экстрагируют органическим растворителем и превращают в более стабильное фенилтиогидантоиновое производное. Последнее можно идентифицировать сравнением с известными стандартами при проведении тонкослойной хроматографии, электрофореза, высокоэффективной жидкостной хроматографии или газо-жидкостной хроматографии.Наиболее важным преимуществом расщепления по Эдману по сравнению с другими методами определения N-концевой аминокислоты является то, что, проводя повторно с одним и тем же пептидом эту процедуру, каждый раз можно идентифицировать новую N-концевую фенилгидантоин-аминокислоту, выясняя таким образом аминокислотную последовательность.

Идентификация С-концевой аминокислоты. Один из подходов заключается в использовании ферментов — карбоксипептидаз (катализирует отщепление от пептида С-концевой аминокислоты). Карбоксипептидазы, подобно другим ферментам, обладают субстратной специфичностью, то есть они катализируют отщепление определенных аминокислот. Вместе с тем, наличие рядом с С-концевой аминокислотой остатка Про делает невозможной её отщепление под влиянием карбоксипептидазы. В этом случае наиболее надежным считается метод гидразинолиза. Полипептид обрабатывают безводным гидразином при температуре 90 0 С в течение 20-100ч в присутствии ионообменного сорбента (в качестве катализатора). При этом разрушаются все пептидные связи, а из высвобождающихся аминокислот образуются гидразиды. Но С-концевая аминокислота высвобождается как свободная и поэтому её можно идентифицировать хроматографически.

Определение аминокислотной последовательности. Установление концевых аминокислот в исследуемом пептиде позволяет в дальнейшем определить всю его аминокислотную последовательность. Для этого обычно проводят повторное разрушение по Эдману (см. выше) в автоматическом приборе — секвенаторе, который был предложен П. Эдманом и Г. Бэгом. Современный такой прибор определяет 1 аминокислотный остаток в час. Таким способом можно установить последовательность расположения 40-60 остатков аминокислот. Затем накапливаются незавершенные реакции, продукты побочных реакций. Наряду с потерей самого пептида они делают малоинформативной и ненадежной дальнейшую идентификацию аминокислот. Чтобы установить последовательность их расположения в больших полипептидных молекулах, их подвергают расщеплению ферментативным или химическим путем на фрагменты с размерами, достаточными для проведения секвенирования (рис.1.19).

Рис.1.19. Аминокислотную последовательность полипептидной цепи определяют, совмещая перекрывающиеся последовательности фрагментов пептида. В данном случае после расщепления исследуемого пептида трипсином (катализирует разрыв пептидных связей, в образовании которых участвует карбоксильные группы Арг и Лиз), а в другом случае — бромцианом (CNBr) (катализирует разрыв пептидных связей, в образовании которых участвует Мет) были получены два набора пептидных фрагментов. Порядок связывания первых двух фрагментов, образовавшихся в результате действия трипсина, устанавливается на основании того наблюдения, что фрагмент Гли-Ала-Лиз-Лей-Про-Мет (результат расщепления CNBr) имеет последовательность аминокислот на N и С — концах, включающую N и С — концы двух трипсиновых фрагментов. Иными словами, обнаружение накладывающихся участков позволяет установить последовательность расположения пептидных фрагментов, то есть аминокислотную последовательность всего исследуемого пептида.

Исследование последовательности нуклеотидов ДНК — рутинная операция в молекулярной биологии.Этот метод в последнее время вытеснил другие методы исследования первичной структуры белков. Зная последовательность нуклеотидов, можно легко установить последовательность аминокислот (более подробное описание этого метода см. в главе 13).

Метод пептидных карт.Процесс определения аминокислотной последовательности в белке — процедура достаточно длительная. Её можно существенно ускорить в случае выяснения аминокислотной последовательности гомологичного белка[2], если у сравниваемого белка она уже известна. Метод носит название «метод пептидных карт» или «метод отпечатков пальцев». Он включает в себя сочетание хроматографии и электрофореза на бумаге продуктов неполного гидролиза сравниваемых белков. При этом пептидные фрагменты, отличающиеся аминокислотной последовательностью, будут обладать разной подвижностью по сравнению с таковыми у исходного белка (рис.1.21).

Рис.1.21. Сравнение «отпечатков пальцев» (окраска нингидрином) продуктов расщепления трипсином (а) гемоглобина А и (б) гемоглобина S. Пептиды, отличающиеся по подвижности, обведены квадратом. Они включают в себя 98 аминокислот, расположенных на N-конце b-субъединицы гемоглобина. Различие заключается в замене 6-ой аминокислоты (Глю) в составе Hb A на Вал в составе Hb S.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник