Многие белки в своем составе, помимо аминокислот, могут содержать и небелковые компоненты. Эти соединения в составе белков называют простетической группой. Простетические группы с белком соединяются разными типами связей.
В зависимости от химического состава простетической группы сложные белки можно разделить на несколько классов.
1. Хромопротеины. Это белки, простетическая группа которых имеет окраску. К ним относятся многие белки, содержащие металлы. Например, церулоплазмин — белок, содержащий медь, имеет синюю окраску. Белки, содержащие железо: гемоглобин, миоглобин, цитохромы. Они имеют красную окраску. Присутствие витамина B2 придает белкам желтый цвет (флавопротеины).
Простетическая группа хромопротеинов связана с гистидином полипептидной цепи координационными связями.
2. Гликопротеины. Это белки, простетическая группа которых содержит углеводы. Углевод соединяется с белковой частью ковалентными связями. В соединении с углеводом участвует OH-группа аминокислоты серина или треонина. Гликопротеины — это часть белково-углеводных комплексов. Этим белкам принадлежит важная роль в структурной организации клеток и тканей, они выполняют защитные функции. Основная часть внеклеточных белков — это гликопротеины.
3. Липопротеины. Это белки, простетическая группа которых содержит липиды. Они обеспечивают транспорт липидов в крови, являются компонентами биологических мембран. Связи между белковой частью молекулы и липидом — гидрофобные или ионные.
4. Металлопротеины. Это белки, простетическая группа которых представлена металлами. Они транспортируют или участвуют в депонировании металлов (ферритин, трансферрин). Между белком и простетической группой образуются координационные связи.
5. Нуклеопротеины. Простетическая группа у таких белков — нуклеиновая кислота. Различают дезоксирибонуклеопротеины (простетическая группа — ДНК) и рибонуклеопротеины (простетичесая группа — РНК). Им принадлежит важная роль в хранении, передаче и реализации генетической информации. Между белком и молекулой нуклеиновой кислоты образуются ионные связи.
6. Фосфопротеины. Белки, которые содержат в своем составе фосфорную кислоту. Используются для регуляции процессов жизнедеятельности (фосфорилирование / дефосфорилирование). Между белком и остатком фосфорной кислоты формируются сложноэфирные связи, в образовании которых участвует OH-группа серина.
Аминокислоты, соединяясь пептидной связью, образуют полипептидные цепи. Линейная последовательность аминокислотных остатков, соединенных между собой пептидными связями, определяет первичную структуру белковой молекулы.
I. Выделение белка из смеси в чистом виде (по одному из признаков: размер молекулы, заряд, специфическое сродство связывания). Определение М.
II. Определение N-концевой АК.
III. Определение С-концевой АК.
IV. Определение АК-последовательности белковой цепи.
Выделение белка из биологического материала основано на его физико-химических свойствах. Чаще всего для этих целей используют кислотно-основные свойства белков (амфотерность, заряд молекулы, изоэлектрическое состояние).
От заряда белковых молекул зависит их:
растворимость (минимальна в ИЗС);
структура и биологическая активность.
При растворении в водной среде на поверхности белковой молекулы формируется гидратная оболочка.
Устойчивость белка в растворе зависит от:
наличия гидратной оболочки;
Для выделения нативных белков (без изменения пространственной структуры) из биологического раствора используют методы:
высаливание (осаждение солями щелочноземельных металлов: хлорид натрия, сульфат аммония); не нарушается первичная структура белка;
осаждение (использование водоотнимающих веществ: спирт или ацетон при низких температурах, около –20С).
При использовании этих методов белки лишаются гидратной оболочки и выпадают в осадок в растворе.
Денатурация — нарушение пространственной структуры белков (первичная структура молекулы сохраняется). Может быть обратимая (структура белка восстанавливается после устранения денатурирующего агента) или необратимая (пространственная структура молекулы не восстанавливается, например, при осаждении белков минеральными концентрированными кислотами, солями тяжелых металлов).
источник
Понятие белков и пептидов, характеристика основных методов разделения: высаливание, тепловая денатурация, осаждение органическими растворителями, хроматография. Особенности концентрации солей сульфата аммония. Гель-фильтрация или метод молекулярных сит.
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
1. Методы разделения белков и пептидов
3. Гель-фильтрация, или метод молекулярных сит
5. Ионообменная хроматография
7. Аффинная хроматография, или хроматография по сродству
Список использованной литературы
1. Методы разделения белков и пептидов
Для разделения белков и пептидов применяют разнообразные методы: высаливание, тепловую денатурацию, осаждение органическими растворителями, хроматографию, электрофорез, распределение в двухфазных системах и др.
Растворение белков в воде связано с гидратацией каждой молекулы, что приводит к образованию вокруг белковой глобулы гидратных оболочек, состоящих из ориентированных в определенной форме в пространстве молекул воды. Растворы белков отличаются крайней неустойчивостью, и под действием разнообразных факторов, нарушающих гидратацию, белки легко выпадают в осадок. Поэтому при добавлении к раствору белка любых водоотнимающих средств (спирт, ацетон, концентрированные растворы нейтральных солей щелочных металлов), а также под влиянием физических факторов (нагревание, облучение и др.) наблюдаются дегидратация молекул белка и их выпадение в осадок. На этих принципах основывается метод высаливания.
Метод очистки белков, основанный на различиях в их растворимости при разной концентрации соли в растворе. Соли щелочных и щелочноземельных металлов вызывают обратимое осаждение белков, т.е. после их удаления белки вновь приобретают способность растворяться, сохраняя при этом свои нативные свойства.
Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют разные концентрации солей сульфата аммония. Чем выше растворимость белка, тем большая концентрация соли необходима для его высаливания. Этот метод нашел широкое применение в клинике для разделения глобулинов (выпадают в осадок при 50% насыщении) и альбуминов (выпадают при 100% насыщении).
Наибольшее распространение получили хроматографические и электрофоретические методы разделения белков.
Хроматографические методы, основанны на распределении веществ между двумя фазами, одна из которых подвижная, а другая неподвижная. В основу хроматографических методов положены разные принципы: гель-фильтрации, ионного обмена, адсорбции, биологического сродства.
белок пептид молекулярный
3. Гель-фильтрация, или метод молекулярных сит
Метод разделения белков с помощью гель-фильтрационной хроматографии основан на том, что вещества, отличающиеся молекулярной массой, по-разному распределяются между неподвижной и подвижной фазами.
Хроматографическая колонка заполняется гранулами пористого вещества (сефадекс, агароза и др.). В его структуре образуются поперечные связи и формируются гранулы с «порами», через которые легко проходят вода и низкомолекулярные вещества. В зависимости от условий можно формировать гранулы с разной величиной «пор».
Неподвижная фаза — жидкость внутри гранул, в которую способны проникать низкомолекулярные вещества и белки с небольшой молекулярной массой. Смесь белков, нанесённую на хроматографическую колонку, вымывают, пропуская через колонку растворитель. Вместе с растворителем движутся и самые крупные молекулы.
Более мелкие молекулы диффундируют внутрь гранул сефадекса и на некоторое время попадают в неподвижную фазу, в результате чего их движение задерживается. Величина пор определяет размер молекул, способных проникать внутрь гранул.
Так как гелевая структура сефадекса легко деформируется под давлением, гели стали заменять более жёсткими матрицами (сефактил, той-оперл), представляющими сферические гранулы с разными размерами пор. Выбор размеров пор в гранулах зависит от целей хроматографии.
Метод основан на том, что при определённом значении рН и ионной силы раствора белки двигаются в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду, а положительно заряженные белки — к катоду.
Электрофорез проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакриламидном геле и др. В отличие от электрофореза на бумаге, где скорость движения белков пропорциональна только их суммарному заряду, в полиакриламидном геле скорость движения белков пропорциональна их молекулярным массам.
Разрешающая способность электрофореза в полиакриламидном геле выше, чем на бумаге. Так, при электрофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге обнаруживают только 5 главных фракций: альбумины, б1 глобулины, б2-глобулины, в-глобулины и г-глобулины. Электрофорез тех же белков в полиакриламидном геле позволяет получить до 18 различных фракций. Для обнаружения белковых фракций полоски бумаги или столбики геля обрабатывают красителем (чаще всего бромфеноловым синим или амидовым чёрным). Окрашенный комплекс белков с красителем выявляет расположение различных фракций на носителе.
5. Ионообменная хроматография
Так же как и электрофорез, метод основан на разделении белков, различающихся суммарным зарядом при определённых значениях рН и ионной силы раствора. При пропускании раствора белков через хроматографическую колонку, заполненную твёрдым пористым заряженным материалом, часть белков задерживается на нём в результате электростатических взаимодействий.
В качестве неподвижной фазы используют ионообменники — полимерные органические вещества, содержащие заряженные функциональные группы.
Различают положительно заряженные анионообменники, среди которых наиболее часто используют диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ-целлюлозу), содержащую катионные группы, и отрицательно заряженные катионообменники, например карбоксиметилцеллюлозу (КМ-целлюлозу), содержащую анионные группы.
Выбор ионообменника определяется зарядом выделяемого белка. Так, для выделения отрицательно заряженного белка используют анионообменник. При пропускании раствора белка через колонку прочность связывания белка с анионообменником зависит от количества отрицательно заряженных карбоксильных групп в молекуле. Белки, адсорбированные на анионообменнике, можно смыть буферными растворами с различной концентрацией соли, чаще всего NaCI, и разными значениями рН. Ионы хлора связываются с положительно заряженными функциональными группами анионообменника и вытесняют карбоксильные группы белков.
Метод разделения основан на различии в молекулярных массах белков. Скорость оседания веществ в процессе вращения в ультрацентрифуге пропорционально их молекулярной массе.
На поверхность буферного раствора, помещённого в кювету, наносят тонкий слой смеси белков. Кювету помещают в ротор ультрацентрифуги. При вращении ротора в течение 10-12 ч более крупные молекулы (с большей молекулярной массой) оседают в буферном растворе с большей скоростью. В результате в кювете происходит расслоение смеси белков на отдельные фракции с разной молекулярной массой. После расслоения белковых фракций дно кюветы прокаливают иглой и по каплям собирают содержимое небольшими порциями в пробирки.
7. Аффинная хроматография, или хроматография по сродству
Это наиболее специфичный метод выделения индивидуальных белков, основанный на избирательном взаимодействии белков с лигандами, прикреплёнными к твёрдому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т.д. Через колонку, заполненную иммобилизованным лигандом, пропускают раствор, содержащий смесь белков. К лиганду присоединяется только белок, специфично взаимодействующий с ним; все остальные белки выходят с элюатом. Белок, адсорбированный на колонке, можно снять, промыв её раствором с изменённым значением рН или изменённой ионной силой.
Аффинная хроматография отличается высокой избирательностью и помогает очистить выделяемый белок в тысячи раз.
Список использованной литературы
1. Биохимия: Учеб. для вузов, Под ред. Е.С. Северина., 2003. 779 с. (http://www.biochemistry.ru/biohimija_severina/B5873Content.html)
Общие принципы препаративной химии белков, особенности их выделения. Удаление небелковых примесей, разделение между собой собственно белковых компонентов. Характерные свойства белков, на которых основано разделение, гель-хроматография (гель-фильтрация).
научная работа [1,8 M], добавлен 17.12.2009
Аминокислоты, входящие в состав пептидов и белков. Моноаминодикарбоновые кислоты и их амиды. Энантиомерия аминокислот, образование солей. Мезомерия и строение пептидной связи. Методы выделения и анализа белков. Электрофорез в полиакриламидном геле.
презентация [351,2 K], добавлен 16.12.2013
Роль в живой природе. Состав и свойства белков. Классификация белков. Определение строения белков. Определение наличия белка. Идентификация белков и полипептидов. Синтез пептидов. Искусственное получение белка. Аминокислоты.
реферат [16,2 K], добавлен 01.12.2006
Хроматографическая система — метод разделения и анализа смесей веществ. Механизм разделения веществ по двум признакам. Сорбционные и гельфильтрационные (гельпроникающие) методы. Адсорбционная, распределительная, осадочная и ситовая хроматография.
реферат [207,8 K], добавлен 24.01.2009
Хроматографический метод разделения и анализа сложных смесей был открыт русским ботаником М.С. Цветом. Хроматография — многократное повторение актов сорбции и десорбции вещества при перемещении его в потоке подвижной фазы вдоль неподвижного сорбента.
курсовая работа [1,7 M], добавлен 13.03.2011
Классификация биополимеров. Аминокислоты, входящие в состав пептидов и белков, строение и свойства. Моноаминодикарбоновые кислоты и их амиды. Образование солей. Пептидная связь. Уровни структурной организации белка. Нуклеиновые кислоты и их производные.
презентация [1,2 M], добавлен 28.02.2012
Белки как высокомолекулярные природные соединения, состоящие из остатков аминокислот, которые соединены пептидной связью. Качественный состав белков, их структура и функции. Процессы гидролиза (кислотно-основного, ферментативного) и денатурация белков.
презентация [212,1 K], добавлен 11.02.2015
Место гель-фильтрации среди методов колоночной хроматографии. Основные материалы гранул («матриц») для нее. Гели на основе целлюлозы. Использование детекторов вещества и коллектора фракций. Аппаратура для жидкостной хроматографии высокого давления.
реферат [287,1 K], добавлен 11.12.2009
Белки как полимеры с пептидной связью. Образование макрокомплекса (олигопротеина), состоящий из нескольких полноценных белковых субъединиц. Фибриллярные и глобулярные группы. Анализ и синтез белков. Метод Меррифилда — твердофазный синтез пептидов.
реферат [83,2 K], добавлен 21.02.2009
Общая характеристика, классификация, строение и синтез белков. Гидролиз белков с разбавленными кислотами, цветные реакции на белки. Значение белков в приготовлении пищи и пищевых продуктов. Потребность и усвояемость организма человека в белке.
курсовая работа [29,7 K], добавлен 27.10.2010
Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.
источник
Третичная структура белков. Представление об изучении пространственного строения пептидов и белков методами рентгеноструктурного анализа и ядерного магнитного резонанса.
Полипептидная цепь, содержащая определенное число участков вторичной структуры, обычно укладывается в пространстве в относительно компактную систему, в которой элементы вторичной структуры взаимодействуют между собой и с участками неупорядоченной структуры, образуя глобулу (глобулярные белки) или достаточно вытянутое волокно (фибриллярные белки). В этих случаях принято говорить о формировании третичной структуры. Для многих белков третичная структура эквивалентна полной пространственной структуре. Каждый белок обладает своей уникальной пространственной структурой.
Главным методом, с помощью которого в настоящее время определяется третичная структура белка, является рентгеноструктурный анализ кристаллических образцов. Рентгеноструктурный анализ сегодня является самым точным и мощным методом расшифровки пространственного строения белков (нередко разрешение достигает 0,15 — 0,2 нм). Этим методом к настоящему времени расшифровано строение более 200 белков.
Метод основан на дифракции рентгеновских лучей на периодической решетке, создаваемой упорядоченно расположенными атомами кристалла. В большинстве случаев самым трудным является получение кристалла биополимера требуемого размера и качества. Необходимым условием является использование излучения с длиной волны, соизмеримой с межатомными расстояниями в кристалле. Поэтому основное применение для решения такого рода задач нашли рентгеновские дифрактометры. В аппаратах этого типа пучок рентгеновского излучения рассеивается на атомах кристаллической решетки, создавая интерференционную картину. В некоторых направлениях происходит гашение волнового сигнала, в некоторых — усиление, создающее интенсивное рентгеновское пятно. Рассеянное излучение может быть зарегистрировано либо с помощью фотопленки, чувствительной к рентгеновскому излучению, либо с помощью счетчиков рентгеновского излучения. Изменяя направление падающего излучения, можно получить информацию обо всех возможных вариантах интерференционной картины. Обычно направление излучения варьируют, вращая кристалл. Измеряемыми параметрами являются координаты реплик и интенсивность рассеянного излучения. Соответствующий математический аппарат и программное компьютерное обеспечение позволяют перейти от дифракционных реплик к координатам атомов. Все полученные к настоящему времени структуры хранятся в международной базе данных белковых структур Protein Data Bank (PDB), к которой имеется свободный доступ. Рассеяние рентгеновского излучения происходит за счет его взаимодействия с нековалентными внутренними электронами атомов вещества. Поэтому часто в исследуемый объект вводят атомы тяжелых элементов, проводя так называемое изоморфное замещение. Если тяжелый атом обладает значительной электронной плотностью, изменение дифракционной картины будет существенным. По этой причине рентгеноструктурный анализ не дает информацию о положении протонов или атомов водорода. Достижение высокой (0,2 нм) и низкой (0,5 нм) плотности разрешения зависит от многих факторов, таких как качество кристалла и степень упорядоченности молекул в кристаллической упаковке. Большую роль играет точность измерения интенсивности излучения. В белках существуют области с высокой подвижностью, такой, что даже при полной кристаллизации не происходит «замораживания» структуры. Эти области в рентгеноструктурном анализе проявляются как участки с пониженным разрешением. Для характеристики разрешения вводится так называемый В-фактор, который позволяет идентифицировать области высокой подвижности. Ограничение рентгеноструктурного анализа связано с тем, что структурная информация может быть получена только для кристаллического вещества. В кристалле белка молекулы плотно упакованы; состояние кристалла характеризуется большими концентрациями компонентов. Это может повлиять на качество результатов рентгеноструктурного анализа биополимерных молекул. В течение долгого времени шла дискуссия о том, можно ли на основе рентгеноструктурных данных делать вывод о строении молекул белка в растворе. Пришли к мнению, что искажения, которые вносит кристаллизация, относительно невелики, и можно считать, что рентгеноструктурный анализ дает адекватную атомарную структуру белка.
ЯМР-спектроскопия — спектроскопический метод исследования химических объектов, использующий явление ядерного магнитного резонанса. Образец вещества для ЯМР помещается в тонкостенную стеклянную трубку (ампулу). Когда ее помещают в магнитное поле, ЯМР активные ядра (такие как 1 H или 13 C) поглощают электромагнитную энергию. Резонансная частота, энергия абсорбции и интенсивность испущенного сигнала пропорциональны силе магнитного поля. Большинство последних инноваций в ЯМР спектроскопии сделаны в так называемой ЯМР спектроскопии белков, которая становится очень важной техникой в современной биологии и медицине. Общей задачей является получение 3-мерной структуры белка в высоком разрешении, подобно изображениям получаемым в рентгеновской кристаллографии. Из-за присутствия большего числа атомов в белковой молекулы в сравнении с простым органическим соединением, базовый 1 H спектр переполнен перекрывающимися сигналами, поэтому прямой анализ спектра становится невозможным. Поэтому были разработаны многомерные техники, чтобы решить эту проблему. Чтобы улучшить результаты этих экспериментов применяют метод меченых атомов, используя 13 С или 15 N. Таким образом становится возможным получить 3D-спектр белкового образца.
Метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР) при использовании современных подходов позволяет полностью расшифровать пространственное строение пептида или небольшого белка с молекулярной массой до 10 000 — 15 000. Конечно, необходимыми условиями являются наличие хорошей приборной базы (прибор с рабочей частотой для протонов 300 — 500 МГц), правильная стратегия исследования применительно к конкретному объекту и достаточное количество вещества (
1 мкмоль пептида или белка).
Важнейшим этапом является отнесение сигналов в спектре ‘Н-ЯМР. Сначала анализируются двумерные спектры, например COSY (корреляционная спектроскопия химических сдвигов, COSY), которые содержат всю информацию о спин-спиновых взаимодействиях (передаваемых через химические связи) между протонами молекулы. Эффективность такого взаимодействия протонов, характеризуемая константой спин- спинового взаимодействия, быстро падает с увеличением числа разделяющих их ковалентных связей и обычно становится ненаблюдаемой уже для четырех связей. Поэтому сигналы протонов аминокислотных остатков можно классифицировать по типам спиновых систем в зависимости от числа атомов водорода при углеродных
атомах Сα, Сβ, Сγи т. д. Затем анализируются двумерные спектры ядерного эффекта
Оверхаузера (сокращенно NOESY), которые содержат всю информацию о диполь- дипольных взаимодействиях между пространственно сближенными протонами молекулы. Величина ядерного эффекта Оверхаузера обратно пропорциональна шестой степени расстояния между ядрами и для пептидов и для небольших белков становится
пренебрежимо малой при расстояниях ^ 0,4 — 0,5 нм. Основываясь на известной аминокислотной последовательности белка или пептида, спиновые системы протонов (отнесенные к определенным типам аминокислотных остатков) «соединяют» между собой, выявляя диполь- дипольные взаимодействия между протоном NH (i + 1)- го остатка и протонами NH, СαН и СβН предыдущего i- ro остатка. Следуя таким образом вдоль полипептидной цепи, получают полное отнесение сигналов в спектре ‘Н- ЯМР
к определенным остаткам аминокислотной последовательности. Одновременно с отнесением сигналов в двумерных спектрах ‘Н- ЯМР получают практически всю необходимую информацию для реконструкции пространственной структуры белка в растворе. Анализ ядерного эффекта Оверхаузера между протонами удаленных по аминокислотной последовательности остатков дает возможность выявить элементы вторичной структуры белка (α-спирали, β-структуры, β-изгибы). Существенное значение имеет обнаружение внутримолекулярных водородных связей, характерных для вторичной структуры белков и пептидов. Для этого изучают скорость обмена атомов водорода группы NH с растворителем (например, дейтерообмен) и таким образом получают
данные об их доступности внешней среде. На заключительном этапе вся совокупность полученных данных (константы спин- спинового взаимодействия, ядерный эффект Оверхаузера, доступность протонов NH внешней среде) анализируется с помощью специальных программ на ЭВМ, учитывающих длины валентных связей, валентные углы, ван- дер- ваальсовы радиусы атомов и т. д. Как правило, при этом удается достаточно точно выяснить конформацию основной полипептидной цепи и наиболее вероятную ориентацию боковых радикалов. Особую ценность представляет информация, получаемая с помощью спектроскопии ЯМР, о динамических характеристиках пространственной структуры молекулы, ее изменениях в результате изменения среды (рН, температура, ионная сила) или взаимодействия с другими молекулами.
Четвертичная структура белков. Примеры гомомерных и гетеромерных белков. Методы исследования четвертичной структуры
Многие белки состоят из субъединиц, одинаковых или различных, образующих трехмерные ассоциаты или более сложные ансамбли. В этом случае принято говорить о четвертичной структуре белков. Специфичность четвертичной структуры данного белка
обусловливается выполняемой им биологической функцией, а взаимодействие субъединиц обеспечивает дополнительный механизм ее регуляции.
Примеры гомомерных белков: глутаминсинтетаза (12 субъединиц образуют два гексагональных кольца), белок оболочки вируса табачной мозаики (2130 субъединиц)б микрофиламенты (актин).
Примеры гетеромерных белков: гемоглобин (α2β2), аспартат-транскарбамоилаза (12 субъединиц — 6 каталитических (С- субъединицы) и 6 регуляторных (R- субъединицы), С- субъединицы объединены в тримеры, расположенные один над другим, а R-субъединицы находятся на периферии молекулы, взаимодействуют друг с другом и с С- субъединицами), ДНК-зависимая РНК-полимераза (2 α, 1 β, 1 β’, 1 δ субъединицы), нуклеосомы (гистоны H2A, H2B, H3, H4), микротрубочки (α и β субъединицы тубулина).
Первый этап исследования четвертичной структуры белка — анализ его субъединичного состава. Для этого необходимо провести диссоциацию белка на отдельные субъединицы, что обычно достигается с помощью гидрохлорида гуанидина, мочевины или додецилсульфата натрия (с добавлением меркаптоэтанола для восстановления дисульфидных связей). Во многих случаях диссоциации способствуют изменение рН среды, добавление соли, замена воды на органические растворители, а также химическая модификация белка. Субстраты, различные метаболиты и кофакторы в разных белках влияют как на ассоциацию, так и диссоциацию субъединиц. Субъединичный состав белка может быть выяснен путем сопоставления его суммарной молекулярной массы с молекулярными массами отдельных субъединиц (установленными с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия), а также с числом N- и С- концевых аминокислотных остатков. Другой метод анализа заключается в сравнении числа пептидов (N), ожидаемых на основании данных аминокислотного состава, с числом реально образующихся при том или ином специфическом гидролизе молекулы белка.
Процесс формирования четвертичной структуры белков проходит в соответствии со строгими законами термодинамики. Силы, способствующие ассоциации белка, должны быть скомпенсированы таким образом, чтобы активные группировки, расположенные в
областях, имеющих тенденции к ассоциации, не оставались экспонированными наружу. В белках, построенных из одинаковых субъединиц, последние практически всегда находятся в эквивалентном (или идентичном) окружении. Взаимодействие между комплементарными участками субъединиц в четвертичной структуре осуществляется с помощью ван-дер-ваальсовых сил, ионных и водородных связей. Формирование четвертичной структуры из трех и более субъединиц протекает с промежуточным образованием агрегатов меньшего размера. Агрегация первых мономеров часто облегчает присоединение последующих — в этом смысле образование четвертичной структуры является кооперативным процессом.
Имеется ряд физико- химических методов исследования геометрии субъединиц в белках, обладающих четвертичной структурой. Наиболее информативный среди них — метод рентгеноструктурного анализа. Классическими являются рентгеноструктурные исследо-
вания гемоглобина, проводившиеся в Кембридже М. Перутцем и сотр. в течение 25 лет, начиная с 1937 г. Была установлена субъединичная структура гемоглобина — α2β2. С каждой субъединицей связано по одной гем-группе, атом железа которой может обратимо связывать молекулу О 2 . Контакты образуются преимущественно между α- и β- и в меньшей степени между α—α- и β—β- цепями белка. Большинство контактов возникает за счет взаимодействия гидрофобных боковых цепей аминокислотных остатков, часть из них обусловлена водородными и электростатическими связями.
Электронная микроскопия — информативный метод анализа четвертичной структуры белков, особенно крупных молекул со многими субъединицами. Главные ограничения метода — сравнительная «прозрачность» белков по отношению к пучку электронов и
их недостаточная стабильность в условиях эксперимента. Обычно удается проводить структурный анализ с разрешением до 2 нм, а при соблюдении определенных предосторожностей — до 1 нм.
Совместное использование электронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа дало возможность установить четвертичную структуру еще более сложно устроенного фермента — аспартат-транскарбамоилазы E.coli, катализирующего основную реакцию в
биосинтезе пиримидиновых нуклеотидов — образование N- карба-
моиласпарагиновой кислоты из аспарагиновой и карбамоилфосфор-
Для исследования четвертичной структуры белков широко используется химическая модификация, в частности, бифункциональными реагентами. С помощью такого подхода была изучена пространственная структура ДНК- зависимой РНК- полимеразы E.coli.
Проводилась модификация бифункциональными реагентами как самого фермента, так и его комплекса с фрагментами ДНК- матрицы, содержащими промоторные участки. В последнем случае использовались фрагменты ДНК, несущие фоточувствительные группировки (частично депуринизованные или содержащие остатки 5- бромурацила).
Возникает вопрос: почему многие белки состоят из субъединиц? Какие преимущества это дает по сравнению с одной длинной пептидной цепью? Во-первых, наличие субъединичной структуры позволяет «экономить» генетический материал. Для олигомерных белков, состоящих из идентичных субъединиц, резко уменьшается размер структурного гена и соответственно длина матричной РНК. Во- вторых, при сравнительно небольшой величине цепей уменьшается влияние случайных ошибок, которые могут возникнуть в процессе биосинтеза белковых молекул. В- третьих, наличие субъединичной структуры у многих белков позволяет клетке легко регулировать их активность, например, путем смещения равновесия ассоциация — диссоциация в ту или иную сторону. Наконец, субъединичная структура облегчает и ускоряет процесс молекулярной эволюции. Мутации, приводящие лишь к небольшим конформационным изменениям на уровне третичной структуры за счет многократного усиления этих изменений при переходе к четвертичной структуре, могут способствовать появлению у белка новых свойств.
Характерной особенностью белков с четвертичной структурой является их способность к самосборке. Легко происходит, например, самосборка гемоглобина из смеси α- и β- цепей. Таким образом, в аминокислотной последовательности полипептидных цепей олиго-
мерного белка закодированы как бы два уровня информации: один из них определяет трехмерную структуру отдельных полипептидных цепей, а второй, поскольку каждая субъединица содержит специфические участки связывания с другими субъединицами, определяет четвертичную структуру всей многокомпонентной молекулы в целом.
Последнее изменение этой страницы: 2016-08-16; Нарушение авторского права страницы
источник
Можно выделить следующие этапы выяснения первичной структуры белков и пептидов:
1. Выделение белка в чистом виде и определение его молекулярной массы
2. Определение аминокислотного состава
3. Определение N-концевой аминокислоты
4. Определение С-концевой аминокислоты
5. Определение аминокислотной последовательности
Выделение белка в чистом виде. Как правило, исходный материал содержит много различных белков. В связи с этим возникает проблема выделения из этой смеси интересующего белка в чистом виде. При очистке белков используются методы, которые основаны на разнице:
1.Поверхностного заряда белков
2.Молекулярного размера белков (зависящего от их молекулярной массы)
3.Биологической активности вследствие связывания с субстратами или ингибиторами
Разделение белков по разнице величины поверхностного заряда. Суммарный поверхностный электрический заряд белка при данном значении рН может быть отрицательным, нейтральным или положительным. Для разделения белков с различным зарядом, подобно тому, как это было в случае аминокислот, может быть использован метод ионообменной хроматографии (см. выше). Концентрацию белка в пробирках с элюатом определяют с помощью спектрофотометра по интенсивности поглощения ультрафиолетового света и строят графическую зависимость её от объема вытекшей из хроматографической колонки жидкости.
Разделение белков по молекулярной массе. Если представить молекулы белков в виде шариков различной величины, размер которых зависит от их молекулярной массы, то окажется, что у больших шариков будет большей молекулярная масса или размер молекул. Это означает, что белки можно разделить подобно частичкам в сите — молекулярном сите, образованном гелем. Такой способ часто называют гель-фильтрацией или хроматографией исключения размером. Ниже приводится иллюстрация того, как с помощью гель-фильтрации удается разделить смесь белков различного размера (рис.1.12).
Хроматографическую колонку заполняют набухшим гелем. Частицы геля приготовлены из связанного поперечными сшивками полисахаридного материала и содержат большое количество микропор. Размер микропор подбирают таким образом, чтобы в них проникали меньшие из разделяемых молекул, в то время как большие этого сделать не могли. Смесь разделяемых белков наносят на верхнюю часть колонки и элюируют буферным раствором. Увлекаемые током нисходящей жидкости большие молекулы, не имея возможности проникнуть в поры гелевых частиц, будут двигаться быстрее. Меньшие молекулы проникают в поры и задерживаются там. Если собирать вытекающий из колонки раствор равными порциями в пробирки, то окажется, что в более ранних порциях вытекающей жидкости будут содержаться белки больших размеров, а в более поздних — меньших размеров. Путем подбора размера пор можно добиться разделения самых разных смесей белков.
Рис.1.12. Схематическое изображение разделения белков методом гель-фильтрации
Если учесть, что размер молекулы зависит от молекулярной массы, то оказывается, что разделяя белки методом гель-фильтрации, одновременно можно установить его молекулярную массу.
Рис.1.13. График зависимости молекулярной массы белков от объема выхода их из хроматографической колонки в ходе гель-фильтрации
Объем вытекающего из колонки элюата обратнопропорционален логарифму молекулярной массы белка. Таким образом, достаточно знать объем жидкости, в котором вышел из колонки интересующий белок, чтобы, пользуясь подобным графиком, можно было установить его молекулярную массу (рис.1.13).
Ещё одним методом, который позволяет разделить белки в зависимости от их молекулярной массы, является гель-электрофорез (см. выше).
Ультрацентрифугирование. Если встряхнуть сосуд, заполненный песком с водой, а затем поставить его на ровную поверхность, то песок быстро осядет на дно благодаря силе земного притяжения. С высокомолекулярными веществами, находящимися в растворе, этого не произойдет, так как тепловое (броуновское) движение сохраняет их равномерное распределение в растворе. Оседание макромолекул, подобно песчинкам, произойдет, только если их подвергнуть значительному ускорению.
В 1923 году шведский биохимик Т. Сведберг впервые использовал ультрацентрифугирование. При скорости вращения ротора 80000 об/мин ему удалось показать, что многие белки состоят из субъединиц. Позже ультрацентрифугирование стало незаменимым методом для разделения белков, нуклеиновых кислот и субклеточных частиц.
Рис.1.14. Схематическое изображение зонального ультрацентрифугирования.
Образец наслаивают на градиент сахарозы (слева). После центрифугирования (середина) каждая частица осаждается на уровне, зависящем от его массы. После остановки ротора центрифужную пробирку прокалывают и разделенные частицы (зоны) собирают в пробирки (справа).
Осаждение проводят в растворе химически инертного вещества (сахарозы или CsCl), концентрация которого и, следовательно, плотность увеличивается в направлении от поверхности до дна центрифужной пробирки. Использование таких градиентов плотности значительно усиливает разрешающую способность ультрацентрифуги. Различают зональное препаративное ультрацентрифугирование (рис.1.14) и ультрацентрифугирование в равновесном градиенте плотности (изократное ультрацентрифугирование) (рис.1.15).
Разделение белков по разнице биологической активности вследствие связывания с лигандами. Характерной особенностью белков является их способность прочно связываться с различными молекулами, но нековалентными связями. На этом основан метод разделения белков аффинной хроматографией (рис.1.16).
Рис.1.16. Схематическое изображение принципа иммуноаффинной хроматографии
Антиген — лиганд для выделяемого белка. Антитело — выделяемый белок.
Молекулы веществ, с которыми специфически связываются определенные белки, ковалентно соединяют с частицами инертного матрикса. Тогда они выполняют роль своеобразных «рыболовных крючков», задерживающих необходимый белок. Все остальные белки транзитом проходят через колонку. Задержанный белок затем можно вымыть из колонки с помощью буферного раствора, содержащего в свободном состоянии такие же молекулы, которые выполняли роль «рыболовных крючков», или с помощью какого-нибудь другого реактива, способного нарушить это взаимодействие. Одним из вариантов этого метода является иммуноаффинная хроматография. Тогда антитела к определенному белку присоединяют к частицам сорбента. Они обеспечивают с очень высокой специфичностью задержку в колонке этого белка (рис.1.16).
Определение аминокислотного состава белка.До определения аминокислотной последовательности выделенного белка желательно иметь представление о его аминокислотном составе, то есть знать, какие аминокислоты и в каком количестве входят в состав его молекулы. Для этого проводят полный гидролиз белка с последующим количественным анализом высвободившихся аминокислот. Чаще используют кислотный гидролиз. Полипептид растворяют в 6N НCl в отсутствие кислорода, чтобы предотвратить окисление серусодержащих аминокислот. Смесь нагревают до 100-120 0 С и выдерживают при этой температуре в течение 10-100ч. К сожалению при этом способе гидролиза некоторые аминокислоты (Сер, Три, Тир, Глн, Асн) разрушаются.
Аминокислотный состав полипептидного гидролизата определяют с помощью автоматического аминокислотного анализатора. Прибор разделяет аминокислоты посредством ионообменной хроматографии (см. выше). Их идентифицируют по элюционному объему и количественно учитывают по интенсивности флюоресценции после проведения реакции с дансилхлоридом. Современные аминокислотные анализаторы проводят анализ гидролизата белка в течение 1ч с чувствительностью, которая позволяет определить до 1 пикомоля аминокислоты.
Определение N-концевой аминокислоты.Имеется несколько эффективных подходов, с помощью которых можно идентифицировать N-концевую аминокислоту. 1-Диметиламинонафталин-5-сульфонилхлорид (дансил хлорид) взаимодействует с первичными аминами с образованием дансилированного полипептида. Последующее проведение кислотного гидролиза позволяет высвободить из полипептидной цепи N-концевую аминокислоту в виде дансил-аминокислоты, обладающей интенсивной желтой флюоресценцией (рис.1.17).
Рис.1.17. Этапы определения N-концевой аминокислоты методом дансилирования
Благодаря этому дансил-производное аминокислоты можно идентифицировать хроматографически.
Ещё более популярным методом идентификации N-концевой аминокислоты является разрушение по Эдману (Pehr Edman — автор метода). Фенилизотиоцианат (ФИТЦ, реактив Эдмана) взаимодействует с N-концевой аминогруппой белков в слабо щелочной среде (рис.1.18). В результате образуется фенилтиокарбамильный продукт. Его обрабатывают безводной сильной кислотой, такой как трифторуксусная кислота. При этом тиазолиновое производное N-концевой аминокислоты отщепляется, в то время как остальные пептидные связи не подвергаются гидролизу. Тем самым разрушение по Эдману заключается в отщеплении остатка только N-концевой аминокислоты и сохранении оставшейся части полипептидной цепи.
| Рис.1.18. Этапы определения N-концевой аминокислоты методом Эдмана |
Тиазолиновое производное аминокислоты избирательно экстрагируют органическим растворителем и превращают в более стабильное фенилтиогидантоиновое производное. Последнее можно идентифицировать сравнением с известными стандартами при проведении тонкослойной хроматографии, электрофореза, высокоэффективной жидкостной хроматографии или газо-жидкостной хроматографии.Наиболее важным преимуществом расщепления по Эдману по сравнению с другими методами определения N-концевой аминокислоты является то, что, проводя повторно с одним и тем же пептидом эту процедуру, каждый раз можно идентифицировать новую N-концевую фенилгидантоин-аминокислоту, выясняя таким образом аминокислотную последовательность.
Идентификация С-концевой аминокислоты. Один из подходов заключается в использовании ферментов — карбоксипептидаз (катализирует отщепление от пептида С-концевой аминокислоты). Карбоксипептидазы, подобно другим ферментам, обладают субстратной специфичностью, то есть они катализируют отщепление определенных аминокислот. Вместе с тем, наличие рядом с С-концевой аминокислотой остатка Про делает невозможной её отщепление под влиянием карбоксипептидазы. В этом случае наиболее надежным считается метод гидразинолиза. Полипептид обрабатывают безводным гидразином при температуре 90 0 С в течение 20-100ч в присутствии ионообменного сорбента (в качестве катализатора). При этом разрушаются все пептидные связи, а из высвобождающихся аминокислот образуются гидразиды. Но С-концевая аминокислота высвобождается как свободная и поэтому её можно идентифицировать хроматографически.
Определение аминокислотной последовательности. Установление концевых аминокислот в исследуемом пептиде позволяет в дальнейшем определить всю его аминокислотную последовательность. Для этого обычно проводят повторное разрушение по Эдману (см. выше) в автоматическом приборе — секвенаторе, который был предложен П. Эдманом и Г. Бэгом. Современный такой прибор определяет 1 аминокислотный остаток в час. Таким способом можно установить последовательность расположения 40-60 остатков аминокислот. Затем накапливаются незавершенные реакции, продукты побочных реакций. Наряду с потерей самого пептида они делают малоинформативной и ненадежной дальнейшую идентификацию аминокислот. Чтобы установить последовательность их расположения в больших полипептидных молекулах, их подвергают расщеплению ферментативным или химическим путем на фрагменты с размерами, достаточными для проведения секвенирования (рис.1.19).
Рис.1.19. Аминокислотную последовательность полипептидной цепи определяют, совмещая перекрывающиеся последовательности фрагментов пептида. В данном случае после расщепления исследуемого пептида трипсином (катализирует разрыв пептидных связей, в образовании которых участвует карбоксильные группы Арг и Лиз), а в другом случае — бромцианом (CNBr) (катализирует разрыв пептидных связей, в образовании которых участвует Мет) были получены два набора пептидных фрагментов. Порядок связывания первых двух фрагментов, образовавшихся в результате действия трипсина, устанавливается на основании того наблюдения, что фрагмент Гли-Ала-Лиз-Лей-Про-Мет (результат расщепления CNBr) имеет последовательность аминокислот на N и С — концах, включающую N и С — концы двух трипсиновых фрагментов. Иными словами, обнаружение накладывающихся участков позволяет установить последовательность расположения пептидных фрагментов, то есть аминокислотную последовательность всего исследуемого пептида.
Исследование последовательности нуклеотидов ДНК — рутинная операция в молекулярной биологии.Этот метод в последнее время вытеснил другие методы исследования первичной структуры белков. Зная последовательность нуклеотидов, можно легко установить последовательность аминокислот (более подробное описание этого метода см. в главе 13).
Метод пептидных карт.Процесс определения аминокислотной последовательности в белке — процедура достаточно длительная. Её можно существенно ускорить в случае выяснения аминокислотной последовательности гомологичного белка[2], если у сравниваемого белка она уже известна. Метод носит название «метод пептидных карт» или «метод отпечатков пальцев». Он включает в себя сочетание хроматографии и электрофореза на бумаге продуктов неполного гидролиза сравниваемых белков. При этом пептидные фрагменты, отличающиеся аминокислотной последовательностью, будут обладать разной подвижностью по сравнению с таковыми у исходного белка (рис.1.21).
Рис.1.21. Сравнение «отпечатков пальцев» (окраска нингидрином) продуктов расщепления трипсином (а) гемоглобина А и (б) гемоглобина S. Пептиды, отличающиеся по подвижности, обведены квадратом. Они включают в себя 98 аминокислот, расположенных на N-конце b-субъединицы гемоглобина. Различие заключается в замене 6-ой аминокислоты (Глю) в составе Hb A на Вал в составе Hb S.
Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:
источник
| Название | Методы исследования структуры белков и пептидов |
| Анкор | МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ. |
| Дата | 09.12.2016 |
| Размер | 2,34 Mb. |
| Формат файла | |
| Имя файла | METODY_ISSLEDOVANIYa_STRUKTURY_BELKOV_I_PEPTIDOV.doc |
| Тип | Документы #6910 |
| Каталог |
| МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ Аминокислоты, соединяясь пептидной связью, образуют полипептидные цепи. Линейная последовательность аминокислотных остатков, соединенных между собой пептидными связями, определяет первичную структуру белковой молекулы. I. Выделение белка из смеси в чистом виде (по одному из признаков: размер молекулы, заряд, специфическое сродство связывания). Определение М. II. Определение N-концевой АК. III. Определение С-концевой АК. IV. Определение АК-последовательности белковой цепи. От заряда белковых молекул зависит их: — растворимость (минимальна в ИЗС); — структура и биологическая активность. При растворении в водной среде на поверхности белковой молекулы формируется гидратная оболочка. Устойчивость белка в растворе зависит от: 1) заряда белковой молекуы; 2) наличия гидратной оболочки; 3) молекулярной массы белка. Для выделения нативных белков (без изменения пространственной структуры) из биологического раствора используют методы: ▪ высаливание (осаждение солями щелочноземельных металлов: хлорид натрия, сульфат аммония); не нарушается первичная структура белка; ▪ осаждение (использование водоотнимающих веществ: спирт или ацетон при низких температурах, около –20°С). При использовании этих методов белки лишаются гидратной оболочки и выпадают в осадок в растворе. Денатурация — нарушение пространственной структуры белков (первичная структура молекулы сохраняется). Может быть обратимая (структура белка восстанавливается после устранения денатурирующего агента) или необратимая (пространственная структура молекулы не восстанавливается, например, при осаждении белков минеральными концентрированными кислотами, солями тяжелых металлов). МЕТОДЫ РАЗДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ Метод мембранных сит (диализ) Используют диализную мембрану, которая является полимером и имеет поры определенной величины. Малые молекулы (низкомолекулярные примеси) проходят через поры в мембране, а крупные (белки) задерживаются. Таким образом, белки отмывают от примесей. Хроматографическую колонку заполняют гранулами геля (сефадекс), который имеет поры определенной величины. В колонку вносят смесь белков. Белки, размер которых меньше, чем размер пор сефадекса, задерживаются в колонке, так как «застревают» в порах, а остальные свободно выходят из колонки. Размер белка зависит от его молекулярной массы. Этот метод основан на различной скорости седиментации (осаждения) белковых молекул в растворах с различным градиентом плотности (сахарозный буфер или хлорид цезия). Данный метод основан на различной скорости миграции белков и пептидов в электрическом поле в зависимости от заряда. Носителями для электрофореза могут служить гели, ацетатцеллюлоза, агар. Разделяемые молекулы движутся в геле в зависимости от размера: те из них, которые имеют большие размеры, будут задерживаться при прохождении через поры геля. Меньшие молекулы будут встречать меньшее сопротивление и, соответственно, двигаться быстрее. В результате, после проведения электрофореза, большие молекулы будут находиться ближе к старту, чем меньшие. Выделение индивидуальных белков Метод основан на способности белков прочно связываться с различными молекулами нековалентными связями. Используется для выделения и очистки ферментов, иммуноглобулинов, рецепторных белков. Молекулы веществ (лиманды), с которыми специфически связываются определенные белки, ковалентно соединяют с частицами инертного вещества. Смесь белков вносят в колонку и искомый белок прочно присоединяется к лиганду. Остальные белки свободно выходят из колонки. Задержанный белок затем можно вымыть из колонки с помощью буферного раствора, содержащего в свободном состоянии лиганд. Этот высокочувствительный метод позволяет выделить в чистом виде очень малые количества белка из клеточного экстракта, содержащего сотни других белков. Изоэлектрофокусирование Используется пластина с амфолином —веществом, у которого заранее сформирован градиент pH. Проводят сначала электрофорез в гори зонтальном направлении. Белки разделяются в зависимости от заряда (изоэлектрическая точка). Затем обрабатывают пластину раствором ДДС-Na и проводят электрофорез в вертикальном направлении. Белки разделяются в зависимости от молекулярной массы. Гомологичные белки — белки, которые выполняют одну и ту же функцию, но различаются по первичной структуре (например, локализованы в различных органах или образуются при патологических состояниях). Например, HbA (содержит Glu) Þ HbS (содержит Val) при серповидноклеточной анемии. 1) оба анализируемых белка расщепляют на фрагменты (пептиды); 2) смесь пептидов каждого белка наносят в виде пятна на угол листа хроматографической бумаги; 3) проводят электрофорез в горизонтальном направлении; 4) проводят распределительную хроматографию в вертикальном направлении; 6) различающиеся пептидные пятна выделяют и анализируют. I. Определение N-концевой АК 1. Метод Сэнжера (ФДНБ — фтординитробензол — связывается с N-концевой АК с образованием соединения желтого цвета). 2. Метод Эдмана (используется ФИТЦ — фенилизотиоцианат, который также связывается с N-концевой АК с образованием соединения оранжевого цвета). 3. Взаимодействие N-концевой АК с дансилхлоридом с образованием флуоресцирующего соединения. 4. Ферментативный метод (использование аминопептидаз — это ферменты которые избирательно отщепляют N-концевые АК, например, аланиновая аминопептидаза). II. Определение С-концевой АК 1. Метод Акабори (гидразин разрушает все пептидные связи и реагирует со всеми АК, кроме концевой; концевую АК определяют после обработки смеси ФДНБ). 2. Ферментативный метод (карбоксипептидазы А отщепляют ароматические С-концевые АК, карбоксипептидазы В — основные С-концевые АК). III. Определение АК-последовательности 1. Используют прибор секвенатор, предложенный Эдманом. К раствору белка добавляют реактив Эдмона, содержащий фенилизотиоцианат. Фенилизотиоцианат взаимодействует с альфа-аминогруппой первой (N-концевой) аминокислоты, а затем происходит ее отщепление от полипептидной цепи путем гидролиза: После этого идентифицируют первую аминокислоту. Затем процесс повторяется. В настоящее время процесс автоматизирован. Для проверки предположений о строении высших структур используется еще один метод: 3) Рентгеноструктурный анализ Схема, поясняющая принцип этого метода, представлена на рисунке: В результате облучения на фотопленке фиксируется карта электронной плотности (похожа на географическую карту). Далее производится компьютерный анализ полученного изображения, в результате чего строится пространственная модель белковой молекулы.
Может быть использована для выяснения структуры белковых молекул с большой молекулярной массой – от 500.000 до 1.000.000 Да (дальтон). Дальтон (Да) и килодальтон(кДа)– единицы измерения массы белков. 1кДа=10 3 Да. 1 дальтон равен 1/16 массы атома кислорода (кислородная единица массы). ДЕНАТУРАЦИЯ — это лишение белка его природных, нативных свойств, сопровождающееся разрушением четвертичной (если она была), третичной, а иногда и вторичной структуры белковой молекулы, которое возникает при разрушении дисульфидных и слабых типов связей, участвующих в образовании этих структур. Первичная структура при этом сохраняется, потому что она сформирована прочными ковалентными связями. Разрушение первичной структуры может произойти только в результате гидролиза белковой молекулы длительным кипячением в растворе кислоты или щелочи. 1. Высокие температуры. Для разных белков характерна различная чувствительность к тепловому воздействию. Часть белков подвергается денатурации уже при 40-50 0 С. Такие белки называют термолабильными. Другие белки денатурируют при гораздо более высоких температурах, они являются термостабильными. 2. Ультрафиолетовое облучение 3. Рентгеновское и радиоактивное облучение 5. Механическое воздействие (например, вибрация). 1. Концентрированные кислоты и щелочи. Например, трихлоруксусная кислота (органическая), азотная кислота (неорганическая). 2. Соли тяжелых металлов (например, CuSO4). 3. Органические растворители (этиловый спирт, ацетон) 5. Мочевина в высоких концентрациях
Воздействие факторами денатурации применяют для стерилизации оборудования и инструментов, а также как антисептики. В пробирке (in vitro) чаще всего это – необратимый процесс. Если же денатурированный белок поместить в условия, близкие к нативным, то он может ренатурировать, но очень медленно, и такое явление характерно не для всех белков. In vivo, в организме, возможна быстрая ренатурация. Это связано с выработкой в живом организме специфических белков, которые «узнают» структуру денатурированного белка, присоединяются к нему с помощью слабых типов связи и создают оптимальные условия для ренатурации. Такие специфические белки известны как «белки теплового шока» или «белки стресса». Существует несколько семейств этих белков, они отличаются по молекулярной массе. Например, известен белок hsp 70 – heatshock protein массой 70 kDa. Такие белки есть во всех клетках организма. Они выполняют также функцию траспорта полипептидных цепей через биологические мембраны и участвуют в формировании третичной и четвертичной структур белковых молекул. Перечисленные функции белков стресса называются шаперонными. При различных видах стресса происходит индукция синтеза таких белков: при перегреве организма (40-44 0 С), при вирусных заболеваниях, отравлениях солями тяжелых металлов, этанолом и др. В организме южных народов установлено повышенное содержание белков стресса, по сравнению с северной расой. Молекула белка теплового шока состоит из двух компактных глобул, соединенных свободной цепью: Разные белки теплового шока имеют общий план построения. Все они содержат контактные домены. Разные белки с различными функциями могут содержать одинаковые домены. Например, различные кальций-связывающие белки имеют одинаковый для всех них домен, отвечающий за связывание Ca +2 . Роль доменной структуры заключается в том, что она предоставляет белку большие возможности для выполнения своей функции благодаря перемещениям одного домена по отношению к другому. Участки соединения двух доменов – самое слабое в структурном отношении место в молекуле таких белков. Именно здесь чаще всего происходит гидролиз связей, и белок разрушается. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ. РАСТВОРИМОСТЬ БЕЛКОВ В ВОДЕ. Большинство белков гидрофильны. Однако белковые молекулы имеют очень большие размеры, поэтому белки не могут образовывать истинных растворов, а только коллоидные. Внешнее проявление этого — это эффект Тиндаля (или конус Тиндаля). Эффект Тиндаля вызывается рассеянием тонкого пучка света при прохождении через белковый раствор. Несмотря на большую величину, многие белковые молекулы не осаждаются в водных растворах. Осаждению белковых молекул препятствуют факторы стабилизации белкового раствора.
Чем больше гидрофильных свойств у белковой молекулы, чем больше в ее составе и на ее поверхности аминокислот с полярными (гидрофильными) радикалами, тем сильнее выражена и прочнее удерживается гидратная оболочка и тем больше в ней слоев. Вода гидратной оболочки обладает особыми свойствами: она не является свободной, а связана с белковой молекулой. Это — “связанная” вода. Она принадлежит белку, и поэтому имеет особые свойства. а) Температура кипения выше 100 0 С. б) Температура замерзания ниже 0 О С. в) В воде гидратной оболочки не растворяются различные соли и другие гидрофильные вещества. г) Окружая каждую молекулу белка, гидратная оболочка не дает этим белковым молекулам сблизиться, соединиться и выпасть в осадок. 2) ЗАРЯД БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ. Поверхность большинства белковых молекул заряжена потому, что в каждой молекуле белка есть свободные заряженные СОО — и NH3 + группы. Изоэлектрическая точка (ИЭТ) большинства белков организма находится в слабокислой среде. Это означает, что у таких белков количество кислотных (СООН) групп больше количества основных групп (NH3). рН плазмы крови около 7,36 — это выше ИЭТ большинства белков, поэтому в плазме крови белки имеют отрицательный заряд. 1) Способы осаждения нативного белка 2) Способы осаждения денатурированного белка Чтобы сохранить нативность белковой молекулы, ее заряд можно устранить только одним способом: приблизить рН среды к изоэлектрической точке белка (ИЭТ), а для большинства белков нашего организма ИЭТ находится в слабокислой среде. Другой фактор стабилизации — гидратную оболочку можно устранить разными способами. Наиболее типичным примером осаждения нативного белка является ВЫСАЛИВАНИЕ. При высаливании сохраняется нативность белковых молекул. Если осадить белки с помощью высаливания, а затем уменьшить концентрацию солей, например, методом диализа, то белок опять растворится. Осаждения белков без потери ими нативности можно достичь также с помощью водоотнимающих средств. а) ДЕЙСТВИЕ СОЛЕЙ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ. Образуют соединения с SH-группами белков. Ядовиты для человека и животных. В медицинской практике применяются способы детоксикации при отравлениях тяжелыми металлами. В этих случаях для обезвреживания этих металлов дают внутрь молоко или другие белковые растворы. б) КИПЯЧЕНИЕ (или просто нагревание до высоких температур) — усиливается тепловое движение молекул, ослабляются слабые типы связей, теряется нативность, белковая молекула “разворачивается”, гидрофобные структуры выходят наружу. Это приводит к потере гидратной оболочки, молекулы сближаются и взаимодействуют друг с другом. Это приводит к тому, что белок выпадает в осадок. При охлаждении нативность не восстанавливается. При кипячении белок не всегда выпадает в осадок. Если нагревать белок в любой среде (сильно кислой, сильно щелочной или нейтральной средах), то денатурация белка происходит обязательно, белковые молекулы теряют гидратную оболочку. Но в сильно кислой или в сильно щелочной средах молекулы белка в осадок не выпадают, потому что у них остается один из факторов стабилизации — заряд. Сохранение заряда не позволяет молекулам белка сблизиться друг с другом — агрегация полипептидных цепей не происходит. Даже если раствор белка охладить — осадок все равно не выпадает — это будет коллоидный раствор денатурированного белка. Если приблизить затем рН среды к изоэлектрической точке белка (например, добавлением кислоты или щелочи), то белок выпадет в осадок, потому что будет лишен обоих факторов стабильности в растворе — и заряда, и гидратной оболочки. источник |