Меню Рубрики

Методы качественного и количественного анализа белков

Количественное определение белков. Количество белка можно определять:

  • 1) по содержанию в них азота (для этого белковый препарат сначала подвергают минерализации, а затем определяют содержание азоту по реакции Несслера);
  • 2) биуретовый метод — основан на образовании окрашенных в сине-фиолетовый цвет комплексов между ионами меди и пептидными связями белков;
  • 3) метод Лоури, который основан на способности медных комплексов белков, восстанавливать реактив Фолина;
  • 4) метод Бредфорда, который основан на способности белков связывать красители — бромфеноловый синий, кумасси голубой;
  • 5) на кафедре разработан метод определения белков по их взаимодействию с коллоидным раствором высокодисперсного кремнезема.

Качественное определение белков — используются осадочные пробы с органическими кислотами (трихлоруксусная, сульфосалициловая кислоты), цветные реакции на определенные аминокислоты в составе белка (реакция Фоля, ксантопротеиновая реакции и др).

Минеральные вещества относятся к жизненно необходимым компонентам питания, обеспечивающим развитие и нормальное функциональное

состояние организма. По содержанию в пищевых продуктах их принято условно разделять на две группы: в первую включаются так называемые макроэлементы, содержащиеся в сравнительно больших количествах (кальций, фосфор, магний, калий, сера, хлор и др.), во вторую входят микроэлементы, находящиеся в продуктах в малых количествах (железо, кобальт, марганец, йод, фтор, цинк, стронций и др.). Некоторые исследователи выделяют еще группу ультрамикроэлементов, концентрация которых соответствует гамма-процентам (золото, свинец, ртуть, радий и др.).

Можно считать установленным участие минеральных веществ наряду с другими компонентами пищи во всех биохимических процессах, протекающих в организме. Доказанным также является факт, что данные вещества обладают выраженной активностью и могут считаться истинными биоэлементами. При этом, находясь в плазме крови и других жидкостях организма, они имеют большое значение в регуляции основных жизненно важных функций. Это прежде всего связано с их влиянием на состояние коллоидов тканей, определяющих степень дисперсности, гидратации и растворимости внутриклеточных и внеклеточных белков. Вместе с тем достаточно высокое и стабильное содержание некоторых макроэлементов способствует поддержанию на неизменном уровне солевого состава крови и осмотического давления, от чего в значительной мере зависит количество воды, удерживаемой в тканях. Так, ионы натрия усиливают способность тканевых белков связывать воду, а ионы калия и кальция уменьшают. В результате избыток поваренной соли будет в конечном итоге затруднять деятельность сердца и почек и отрицательно сказываться на состоянии соответствующих категорий больных. Весьма важную роль играют минеральные вещества для формирования буферных систем организма и поддержания на должном уровне его кислотно-щелочного состояния. При этом преобладание в пищевых продуктах калия, натрия, магния и кальция обусловливает их щелочную ориентацию, а серы, фосфора и хлора — кислотную. При обычном смешанном питании пищевые рационы нередко отличаются большим содержанием кислых веществ, что может приводить к возникновению ацидоза. Установленным является значение микроэлементов для эндокринного аппарата, активности гормонов и ферментативных процессов. Об этом свидетельствует участие йода в деятельности щитовидной железы, влияние меди и кобальта, действие адреналина, цинка и кадмия — инсулина и т. д. Большую физиологическую роль играют минеральные вещества в пластических процессах, в построении и формировании тканей организма, особенно скелета. В этом отношении общеизвестно значение кальция, фосфора, магния, стронция и фтора, причем недостаточное их поступление, вместе с пищей неизбежно приводит к нарушению роста и обызвествления костей.

О биологической активности минеральных компонентов питания свидетельствует существование биогеохимических провинций, т. е. районов, где количество некоторых микроэлементов в почве резко увеличено или понижено, что отражается на составе произрастающих на ней растений, составе воды, молока и мяса животных. Если люди длительное время проживают в таких районах, то это может повлечь за собой развитие своеобразных патологических состояний, например эндемического зоба или флюороза.

При характеристике отдельных микроэлементов необходимо, прежде всего остановиться на физиологической роли кальция, соединения которого существенно влияют на обмен веществ, рост и деятельность клеток, возбудимость нервной системы я сократимость мышц. Особенно важное значение он имеет в формировании костей скелета в качестве одного из основных структурных компонентов. При этом только при определенном соотношении в крови фосфора и кальция отложение последнего в костной ткани протекает нормально. Если же количество данных элементов не сбалансировано, то наблюдается нарушение процессов окостенения, выражающееся в возникновении рахита у детей, остеопороза и других костных изменений у взрослых. Установлено, что оптимальное их соотношение 1:1,5 — 1:2. Ввиду того что в пищевом рационе это соотношение обычно далеко от оптимального, то для нормализации соответствующих процессов необходима регулирующая роль витамина О, способствующего усвоению кальция и задержке его в организме. Необходимо также отметить, что он является весьма трудно усвояемым макроэлементом из-за чрезвычайно малой растворимости в воде. Только воздействие желчных кислот, сопровождаемое образованием комплексных соединений, позволяет перевести кальций в усвояемое состояние. Весьма большое значение для организма имеет содержание в пище фосфатов, так как органические соединения фосфора представляют подлинные аккумуляторы энергии (аденозинтрифосфат, фосфорилкреатинин). Именно эти соединения используются организмом при сокращении мышц и биохимических процессах, протекающих в мозге, печени, почках и других органах. Вместе с тем фосфорная кислота участвует в построении молекул многочисленных ферментов катализаторов распада пищевых веществ, создающих условия для использования потенциальной их энергии. Наконец, фосфор широко представлен в пластических процессах, особенно протекающих в костной системе животного организма.

При характеристике физиологической роли магния следует указать, что он имеет важное значение для нормализации возбудимости нервной системы, обладает антиспазматическими и сосудорасширяющими свойствами и оказывает влияние на снижение уровня холестерина в крови. Отмечено также, что при его недостатке увеличивается содержание кальция в мышцах и стенках артерий. Имеются данные о том, что соли магния угнетают рост злокачественных новообразований и, таким образом, обладают антибластомогенным действием. Наконец, известно, что он участвует в процессах углеводного, фосфорного и кальциевого обмена, причем его избыток отрицательно сказывается на усвоении последнего. Говоря о макроэлементах, входящих в состав пищевых продуктов, необходимо отметить значение калия, натрия, хлора и серы. Первый из них играет важную роль во внутриклеточном обмене, некоторых ферментативных процессах, образовании ацетилхолина и способствует выведению жидкости из организма. Ионы натрия являются в известной мере физиологическими антагонистами калия, и его соединения (бикарбонаты и фосфаты) принимают непосредственное участие в образовании буферных систем, обеспечивающих кислотно-щелочное состояние и постоянство осмотического давления. Что касается хлора, то он в составе хлорида натрия служит одним из регуляторов водного обмена и используется для синтеза соляной кислоты железами желудка. Наконец, сера представляет важный структурный компонент некоторых аминокислот, витаминов и ферментов, а также входит в состав инсулина. Переходя к краткой биологической характеристике микроэлементов, необходимо подчеркнуть, что их содержание в пищевых продуктах растительного и животного происхождения подвержено большим колебаниям, поскольку оно зависит от геохимических особенностей местности. Одним из наиболее ярких примеров в этом отношении является изменение концентрации в почве йода и фтора, служащее причиной возникновения своеобразных эндемических заболеваний. Интересно отметить, что в настоящее время из элементов, входящих в таблицу Менделеева, более 60 уже обнаружены в составе живых организмов. Однако иногда еще очень трудно сказать, какие из этих элементов представляются жизненно необходимыми, а какие случайно попадают из окружающей внешней среды. Тем не менее то, что мы знаем, позволяет прийти к заключению об огромной роли их в нашем организме, о чем впервые высказал предположение выдающийся русский биохимик Т. А. Бунге. К числу наиболее изученных микроэлементов относится железо, основное значение которого заключается в его участии в процессе кроветворения. Кроме того, оно является составной частью протоплазмы и клеточных ядер, входит в состав окислительных ферментов и т. д. Вместе с железом в синтезе гемоглобина и других жедезопорфиринов принимают участие медь и кобальт, последний к тому же воздействует на образование ретикулоцитов и превращение их в зрелые эритроциты.

Что касается марганца, то он, очевидно, является активатором процессов окисления, обладает выраженным липотропным влиянием, а также служит одним из факторов оссификации, определяющих состояние костной ткани. Вместе с тем он обладает стимулирующим влиянием на процессы роста и деятельности эндокринного аппарата. Из других микроэлементов обращает на себя внимание цинк, причем, по мнению ряда исследователей, его роль в организме не менее важна, чем железа. В частности, имеются данные об участии этого элемента в кроветворении, деятельности гипофиза, поджелудочной и половых желез, а также значение его как фактора роста. Наконец, цинк оказывает влияние на содержание витаминов в пищевых продуктах, причем обогащение им почв способствует синтезу растениями аскорбиновой кислоты и тиамина. Все сказанное о роли макро- и микроэлементов делает необходимым нормирование их в питании населения. В этом отношении более или менее точно определена средняя потребность взрослого человека в целом ряде минеральных веществ (табл. 1).

Однако принятые в настоящее время официальные рекомендации включают пока соответствующие нормативы только для трех наиболее важных микроэлементов. При этом относительно подробная дифференциация этих нормативов имеется для детей, подростков, беременных и кормящих женщин, взрослых (табл. 2).

К числу минеральных жизненно важных веществ необходимо отнести и воду, недостаток и избыток которой в нашем рационе является вредным для организма. При этом водное голодание наиболее тяжело переносится человеком и оно значительно опаснее, чем пищевое, приводя к летальному исходу уже через несколько суток. Вместе с тем излишнее ее потребление способствует большой нагрузке на сердце, повышает процессы белкового распада и увеличивает жирообразование. Установлено, что суточная потребность в воде определяется условиями внешней среды, характером работы и количеством принятой пищи. Так, водный баланс взрослого человека в среднем определяется следующими величинами: супы 500-600 г, вода питьевая 800-1000 г, содержащаяся в твердых продуктах 700 г и образующаяся в самом организме 300-400 г.

источник

Присутствие белков в пищевых объектах устанавливается с помощью качественных реакций, которые условно разделяют на две группы: а) цветные реакции; б) реакции осаждения.

Среди первой группы различают универсальные реакции (биуретовая на пептидные связи и нингидриновая на α-аминокислоты) и специфические, обусловленные присутствием в белках остатков определенных аминокислот. Так, ксантопротеиновая реакция свидетельствует о наличии в белках остатков ароматических аминокислот, реакция Паули – гистидина и тирозина, Адамкевича и Вуазене – триптофана, нитропруссидная – цистеина, а реакция Сакагучи – аргинина. По результатам специфических реакций ориентировочно можно судить о пищевой ценности белков.

Во второй группе реакций белки осаждают действием солей, органических растворителей, концентрированных кислот, щелочей, ионов тяжелых металлов, температуры и в изоэлектрической точке. Белки в растворенном состоянии крайне неустойчивы, поэтому при добавлении органических растворителей (спирт, ацетон), концентрированных растворов нейтральных солей щелочных металлов и воздействии физических факторов (нагревание, облучение, ультразвук) гидратная оболочка разрушается и они выпадают в осадок.

Так как белковые вещества сырья (муки, крупы, молока, мяса), включая ферменты, часто являются определяющими в обеспечении качества пищевых изделий, то для изучения физико-химических, биохимических и физиологических свойств этих соединений обязательным условием является получение белков в индивидуальном и, по возможности, неденатурированном состоянии. Белки обычно теряют природные (нативные) свойства (растворимость, гидратацию, ферментативную активность и т.д.), подвергаясь денатурации под влиянием различных факторов.. Длительный контакт со спиртом также приводит к необратимой денатурации белка. Денатурирующее действие различных факторов на белки можно смягчить, если проводить операции выделения их при температуре не выше +4°С.

Методы выделения и очистки белков. Общая схема операций по выделению белков сводится к измельчению биологического материала (гомогенизации), экстрагированию и собственно выделению, то есть очистке и получению белка в индивидуальном состоянии.Разрушение клеточной структуры осуществляется тщательным измельчением материала в гомогенизаторах, мельницах, попеременным замораживанием и оттаиванием, применением ультразвуковых высокочастотных колебаний, пресс-методов с использованием высоких давлений и метода «азотной бомбы». В последнем случае клетки насыщаются азотом под давлением, которое затем сбрасывается и клетки разрушаются. Эффективность гомогенизации зависит не только от способа разрушения клеточных структур, но и от вида анализируемого материала. Животные клетки разрушаются относительно легко, особенно в отсутствие сосудистой и соединительной ткани, тогда как растительные и микробные – из-за присутствия клеточных стенок – трудно. В таком случае применяют методы растирания материала с твердыми веществами (песок, абразивный порошок) или обработку клеточных стенок лизоцимом или ферментными препаратами, содержащими целлюлазу, хитиназу и липазу. Гомогенизацию рекомендуется проводить в холодных комнатах или с использованием льда.

Экстракция белков может быть совмещена с гомогенизацией клеток и тканей либо проведена отдельно, если продукт заранее измельчен.

При изучении физико-химических свойств белков и их превращений в пищевых системах широко используют методы фракционирования и очистки от небелковых соединений. Они основаны на различиях таких свойств белков, как размер молекул, растворимость, заряд и сродство к специфическим химическим группам.

Осаждение белков из раствора под действием солей щелочных и щелочноземельных металлов называют высаливанием. Для высаливания чаще применяется сульфат аммония, под влиянием которого белки, как правило, сохраняют растворимость и ферментативную активность. Главную роль при высаливании играет не природа солей, а валентность ионов, действие которых оценивается по ионной силе (μ):

где С – концентрация каждого вида иона; V – валентность ионов.

В практике выделения и очистки белков используются различные типы хроматографии: адсорбционная, распределительная, ионообменная и хроматография по сродству. Адсорбционнаяхроматография основана на различиях в полярности белков. В колонке вместе с буферным раствором упаковывают адсорбент, на который в небольшом объеме растворителя наносят исследуемый образец. Компоненты разделяемой смеси адсорбируются, затем элюируются с помощью буферного раствора с увеличивающейся концентрацией или полярностью. Фракции белка собирают с помощью автоматического коллектора фракций.

Читайте также:  Анализы на непереносимость молочного белка

В распределительной хроматографии, в отличие от адсорбционной, в качестве неподвижной фазы выступает водный слой, удерживаемый твердой фазой (силикагель, бумага). Разделяемые вещества многократно распределяются между водным слоем и движущейся фазой растворителя и с разной скоростью перемещаются подлине колонки или бумаге. Распределительную хроматографию на бумаге часто используют для анализа пептидов и аминокислот. Адсорбентом служат нити целлюлозы, а растворителем – смесь органических растворителей, например: бутиловый спирт–уксусная кислота–вода. Хроматограмму проявляют, высушивают и анализируют местонахождение разделяемых компонентов тем или иным способом.

Методом ионообменной хроматографии белки или аминокислоты разделяют на основе различий в общем заряде молекул. Если белок в нейтральной среде (рН 7) имеет положительный заряд, то он связывается на колонке с ионообменником, содержащим фенольные, сульфо- и карбоксильные группы (катионообменник), если отрицательный, то – на колонке с ионообменником, представленным аминами или органическими основаниями (анионообменник). Чаще всего для фракционирования белков используют производные полистирола и целлюлозы:

Хроматография по сродству (аффинная хроматография,) основана на принципе избирательного связывания белков со специфическими веществами (лигандами), прикрепленными к носителю. Лиганд (глюкозу) ковалентно присоединяют к носителю (проводят иммобилизацию) и наносят на колонку исследуемую белковую смесь. Несвязавшиеся белки удаляют соответствующим буфером, а нужный белок элюируют раствором, содержащим лиганд в очень высокой концентрации. При этом присоединенные к колонке остатки глюкозы в молекуле белка замещаются на глюкозу, находящуюся в растворе (рис. 2.20).

Гель-фильтрация, или метод молекулярных сит заключается в пропускании белков через колонку с гелем сефадекса или других типов (агарозных, полистирольных). Применяются также пористые стеклянные шарики и пористый кварц (порасил). Наибольшее распространение получили декстрановые гели (сефадекс), являющиеся продуктом поперечного сшивания полисахаридных цепочек декстрана. Зерна сефадексов разных номеров содержат поры разных размеров, в которые могут проникать белки с определенной молекулярной массой. Низкомолекулярные белки распределяются в растворенном виде как внутри частиц полимера, так и между ними, а высокомолекулярные – только между частицами, поэтому вторые быстрее проходят через колонку и первыми вытекают из нее (рис. 2.21). В итоге белки распределяются по молекулярной массе и могут быть собраны в виде отдельных хроматографических

Принцип методов электрофоретического разделения заключается в способности молекул пептидов и аминокислот, находясь в заряженной форме в виде катионов (+) или анионов (–), передвигаться в электрическом поле с определенной скоростью. Кроме того, молекулы с близкими зарядами, но разными размерами, отличаются отношением заряда к массе. Все эти различия и обуславливают высокую разрешающую способность электрофоретических методов. Скорость миграции белков в электрическом поле (V) зависит от напряжения электрического поля(ε), заряда белков (z) и сопротивления трения (О-Сопротивление трения определяется размерами, формой белка, значениями рН и концентрацией буфера. Указанные величины связаны между собой соотношением: V = ε · z / f.

Впервые метод электрофореза был разработан Тизелиусом с применением бумаги в качестве носителя и специальных оптических устройств, регистрирующих передвижение границы раздела раствора белка и растворителя по показателям преломления (фронтальный электрофорез). В настоящее время распространены методы зонального электрофореза, предусматривающие использование крахмальных и полиакриламидных гелей (ПААГ). Наиболее распространенным методом фракционирования белков является диск-электрофорез (от англ, discontinuous – прерывистый) в ПААГ, при котором используется пара буферных растворов с различными значениями рН в присутствии ДДС-Na и гели различной пористости (концентрирующие и разделяющие) (Laemmli, 1970). Для обнаружения белков гели обрабатывают красителями: амидовым черным 10В, кумасси синим R-250. Интенсивность окраски, а по ней количественное содержание белковых фракций, определяют сканированием на денситометре.

Для электрофоретического разделения белков и пептидов успешно применяется двумерный электрофорез в ПААГ. В соответствии с этим методом смесь компонентов разделяют сначала в столбиках геля электрофорезом в горизонтальном направлении, затем в гелевых пластинах – в вертикальном (рис. 2.23). При разделении белков, например гороха, этим методом удалось получить более 150 различных компонентов.

Очень высокую разрешающую способность имеет метод изоэлектрического фокусирования белков, в основе которого лежит фронтальный электрофорез, проводимый на колонке одновременно в градиенте рН и напряжения. Колонку предварительно заполняют носителями с синтетическими смесями полиаминополикарбоновых кислот (амфолитами), затем сверху в нее подают раствор сильной кислоты, снизу – сильнощелочной раствор для того, чтобы установить градиент рН с крайними значениями, соответствующими рН кислого и щелочного растворов. Амфолиты прекращают движение по колонке, когда их суммарный заряд становится равным нулю, и тем самым стабилизируют исходный градиент рН. В подготовленную колонку вносят образец исследуемой смеси, компоненты которой распределяются по зонам со значениями рН, характерными их изоэлектрическим точкам.

В химии пищевого белка применяют и другие разновидности ектрофоретическогоразделения(иммуноэлектрофорез, изотахофорез), а также метод пептидных карт и ультрацентрифугирование. Метод пептидных карт (отпечатков пальцев) относится к методам двумерного разделения и наиболее часто используется для анализа пептидов. Пептиды получают избирательным гидролизом белков, затем на бумаге их разделяют в горизонтальном направлении электрофорезом, в вертикальном – распределительной хроматографией. Пептиды окрашивают нингидрином, элюируют и определяют аминокислотный состав.

В методе ультрафильтрации белки в градиенте плотности распределяются на разных уровнях центрифужной пробирки в процессе седиментации (осаждения) в виде отдельных зон. Для создания градиента используют соли тяжелых металлов и растворы сахарозы. Метод широко применяется для определения молекулярных масс белков по константе седиментации (S), которая зависит от массы и формы белковых частиц:

где v – скорость перемещения границы растворитель–белок, см/с; w– угловая скорость ротора, рад/с; г – расстояние от центра ротора до середины ячейки с раствором белка.

Величина S, равная 1 · 10 -13 с, принята за единицу и названа сведбергом (S) в честь Т. Сведберга, впервые сконструировавшего ультрацентрифугу.

Очистка белков от низкомолекулярных соединений (солей, сахаров, аминокислот) осуществляется методами диализа, гель-фильтрации на сефадексе G-25, кристаллизации, ультрафильтрации и с помощью полых волокон. При диализе используют полупроницаемые мембраны (целлофан, коллодийная пленка), через которые белки не диффундируют и остаются внутри диализного мешочка. Более мелкие молекулы проходят через поры диализной мембраны и выходят в диализат. В методе ультрафильтрации, который применяется, например, в производстве сывороточных белков молока, соевых белковых изолятов, по обе стороны мембраны создается разность давлений за счет продавливания фильтруемого белкового раствора. В качестве мембран используются целлюлозные пленки и нецеллюлозные полиэлектролитные комплексы. Аналогично мембранам по принципу молекулярного сита действуют и полые волокна. Белковый раствор помещается с внешней стороны волокон, и создается разность давления за счет повышения его в растворе или понижения внутри их.

Гомогенность белка определяется на последнем этапе выделения и очистки с применением по меньшей мере двух методов, оценивающих то или иное физико-химическое свойство. Наиболее достоверными являются ультрацентрифугирование в градиенте плотности, диск-электрофорез в ПААГ, иммунохимические методы и растворимость. Если белок при электрофорезе представлен только одной полосой и обладает при этом максимальной биологической активностью, то он считается гомогенным. Для гомогенного белка на кривой растворимости (зависимости растворенного белка от общего его количества в постоянном объеме растворителя) имеется только один перегиб, тогда как для гетерогенного – столько, сколько в нем индивидуальных компонентов.

Содержание белка в пищевых объектах обычно определяют по количеству азота с использованием метода Кьельдаля. С целью упрощения и сокращения длительности анализа этот метод с момента его разработки (1983) неоднократно модифицировался с применением различных катализаторов и условий минерализации. На основе модифицированных методов созданы высокопроизводительные автоматические анализаторы типа «Кьельфос», стоимость определения содержания белка на которых и сегодня остается высокой. Существует и некоторая условность в методе Кьельдаля при расчете количества белка, заключающаяся в использовании переводного коэффициента. Однако, несмотря на недостатки, метод Кьельдаля является унифицированным, он включен в ГОСТы на многие пищевые продукты.

Для перевода количества азота в содержание белка используют коэффициент 6,25. Принят он потому, что большинство белков содержит 16% азота (100/6,25 = 16). Однако более правильным является использование коэффициентов, соответствующих фактическому содержанию сырого белка в каждом его виде. Так, для пшеницы получен коэффициент 5,7, так как ее белки содержат 17,5% азота. Для других белковых ресурсов коэффициенты перевода приняты следующими: 5,7 – рожь, ячмень, овес, семена подсолнечника; 5,8 – соя; 6,25 – кукуруза, мясо; 6,38 – молоко.

Имеются и другие методы определения азота, такие как метод Дюма, нейтронно-активационный и с фенолятгипохлоритом на приборе «Техникон». Принцип метода Дюма заключается в разложении органического соединения в атмосфере оксида углерода до газообразного состояния с последующим измерением объема азота (N2). В нейтронно-активационном методе атомы азота образца бомбардируются нейтронами в ядерном реакторе с получением изотопа 13 N. Содержание белка рассчитывают по количеству гамма-лучей. Определение азота на приборе «Техникон» осуществляется колориметрическим способом, в котором измеряется интенсивность сине-голубой окраски, образующейся по реакции взаимодействия сульфата аммония, выделяющегося в процессе минерализации образца, с щелочным раствором фенола и гипохлорита. Все описанные здесь методы по точности анализа не уступают методу Кьельдаля, однако они являются достаточно дорогими.

Широкое распространение получил метод инфракрасной спектроскопии, в основе которого лежит поглощение белками света с определенной длиной волны и измерение интенсивности его отражения в приборах-анализаторах. Приборы калибруют по образцам зерна (эталонам) с известным содержанием белка, определяемым по методу Кьельдаля.

Известны методы количественного определения белка, основанные на различной степени помутнения (нефелометрический метод), способности белков адсорбировать красители (кумасси синий R-250, амидочерный и др.) и преломлять лучи света (по показателю преломления). Они характеризуются высокой точностью и простотой определения, хотя имеют ряд ограничений. Наиболее удобными являются методы с кумасси синим, биуретовый и Лоури. В основе биуретового метода лежит биуретовая реакция, в основе метода Лоури – восстановление фосфомолибденовой кислоты тирозином и триптофаном с одновременным протеканием биуретовой реакции. По оптической плотности с использованием калибровочных графиков находят концентрацию белка в растворах.

Дата добавления: 2016-04-11 ; просмотров: 1908 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ

источник

Нормальные показатели: белок в норме в моче содержится в минимальных количествах, которые не обнаруживаются обычными качественными реакциями. Верхняя граница нормы белка в моче – 0,033 г/л. Если содержание белка выше этого значения, то качественные пробы на белок становятся положительными.

Клиническое значение определения:

Появление белка в моче называется протеинурия. Протеинурии могут быть ложными и почечными. Экстраренальные протеинурии могут быть при наличии примесей белкового происхождения из половых органов (вагинитах, уретритах и др.), количество белка при этом незначительно – до 0,01 г/л. Почечные протеинурии могут быть функциональными (при переохлаждении, физических нагрузках, лихорадке) и органическими — при гломерулонефрите, пиелонефрите, нефрите, нефрозах, почечной недостаточности. При почечных протеинуриях содержание белка может быть от 0,033 до 10 – 15 г/л, иногда выше.

Принцип метода: основан на том, что белок под действием неорганических кислот коагулирует (становится видимым). Степень помутнения зависит от количества белка.

Обнаружение белка в моче с 20% сульфосалициловой кислотой.

Реактивы: 20% р-р сульфосалициловой кислоты. Оборудование: темный фон.

1. Требования к моче: моча должна быть кислой (или слабокислой) рН, должна быть прозрачной, для этого мочу центрифугируют. Щелочную мочу подкисляют до слабокислой реакции среды, используя для контроля индикаторную бумагу.

2. В 2 пробирки одинакового диаметра наливают по 2 мл подготовленной мочи. 1 пробирка – контроль, 2 – опыт. В опытную пробирку добавляют 4 капли 20% сульфосалициловой кислоты.

3. Результат отмечают на темном фоне.

4. При наличии белка, моча в опытной пробирке мутнеет.

Качественное определение белка в моче тест – полосками.

Для выявления протеинурий используют различные монотест – полоски: Альбуфан, Альбустикс, Биофан Е и политесты: Трискан, Нонафан и др.

Обнаружение белка в моче по методу Робертса – Стольникова.

Принцип метода: основан на том, что белок под действием неорганических кислот коагулирует (становится видимым). Степень помутнения зависит от количества белка (т.е. кольцевая проба Геллера). При концентрации белка в моче 0,033 г/л к концу 3 минуты после наслаивания мочи появляется тонкое нитевидное белое кольцо.

Реактивы: 50% р-р азотной кислоты или реактив Робертса (98 частей насыщенного раствора поваренной соли и 2 части концентрированной соляной кислоты) или реактив Ларионовой (98 частей насыщенного р-ра поваренной соли и 2 части концентрированной азотной кислоты).

1. Требования к моче: моча должна быть кислой (или слабокислой) рН, должна быть прозрачной, для этого мочу центрифугируют. Щелочную мочу подкисляют до слабокислой реакции среды, используя для контроля индикаторную бумагу.

2. В пробирку наливают 2 мл 50% р-ра азотной кислоты или один из реактивов, затем осторожно по стенке пробирки с помощью пипетки наслаивают такой же объем подготовленной мочи

3. Пробу оставляют на 3 минуты

4. Через 3 минуты отчитывают результат. Результат отмечают на темном фоне в проходящем свете. Если кольцо широкое, компактное, то мочу разводят дистиллированной водой и вновь наслаивают на реактив.

5. Мочу разводят до тех пор, пока через 3 минуты не образуется тонкое нитевидное кольцо.

6. Расчет содержания белка в моче производят по формуле:

С = 0,033г/л х степень разведения.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: При сдаче лабораторной работы, студент делает вид, что все знает; преподаватель делает вид, что верит ему. 8930 — | 7146 — или читать все.

193.124.117.139 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.

Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)

очень нужно

источник

Выбор метода определения белка как интегральной части любого исследования, связанного с выделением, очисткой, характеристикой и анализом белка. Основные требования, предъявляемые к методу количественного определения белка. Подготовка белкового образца.

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Читайте также:  Белки в анализе на биохимию

Размещено на http://www.allbest.ru/

Количественное определение содержания белка

    Аннотация
  • Введение
  • Выбор метода определения белка
  • Калибровочный график (кривая)
  • Метод LOWRY
  • Метод BRADFORD
  • Определение белка с BCA реагентом
  • УФ-метод
  • Подготовка белкового образца
  • Список литературы
  • Приложение

Любой метод, используемый для определения белка в бесклеточных экстрактах, показывает лишь общее содержание белка в образце. Чтобы получить представление о составе белков и их индивидуальных свойствах и функциях, необходимо фракционирование сложных белковых смесей путем их хроматографического или электрофоретического разделения с целью последующего анализа индивидуальных белков. Понятно, что при всех перечисленных ситуациях необходимо определять содержание белка.


Едва ли не основным требованием, предъявляемым к методу количественного определения белка, является возможность использовать выбранный метод в присутствии разнообразных внутриклеточных компонентов и нечувствительность к компонентам буферных смесей, использованных для экстракции белков из клеток. Таким образом, «золотой стандарт» — это метод, характеризующийся специфичностью, чувствительностью, воспроизводимостью, быстротой и простотой проведения, а также отсутствием влияния небелковых компонентов. Сразу оговоримся, что пока не существует какого-то одного метода определения белка, который удовлетворяет всем перечисленным требованиям. У каждого метода есть свои преимущества и недостатки.


В связи с этим наша основная цель состоит в том, чтобы помочь в выборе наиболее приемлемого метода определения белка для конкретного исследования. Очевидно, что знание точной концентрации белка абсолютно необходимо для расчета, например, ферментативной активности. Ошибки в измерении концентрации белка приводят к накоплению общих ошибок в этих расчетах. Более того, в настоящее время все чаще исследователи используют коммерческие наборы для определения содержания белков (киты), что вполне оправдано, поскольку позволяет до определенной степени стандартизировать процедуру. Но пользователи коммерческих китов, к сожалению, не всегда представляют себе лежащие в их основе химические реакции, об этом также целесообразно рассказать.


Будут рассмотрены наиболее часто и широко используемые методы определения белка: метод Lowry с соавт. [1], метод Bradford [2], метод BCA (бицинхониновая кислота, от bicinchoninic ac >определение белок количественный метод


Осаждение ацетоном является самым простым и совместимым с описанными выше методами определения белка. К раствору белка добавляют холодный (-20°С) 100% ацетон до конечной концентрации 80%. После инкубации не менее 1 ч при — 20°С белок осаждают центрифугированием (20 мин, 15 000 g, 4°С). Как правило, этих условий достаточно для осаждения белка, но если содержание белка в исходном растворе низкое, то могут потребоваться более высокие скорости центрифугирования. Затем следует осторожно отобрать надосадочную жидкость. После этого необходимо высушить осадок при комнатной температуре или при — 20°С. Очень важно не пересушить осадок белка, в противном случае могут появиться сложности с растворением осадка в буфере/растворе, совместимом с выбранным методом определения белка. Хотя способ осаждения белка ацетоном прост, могут потребоваться большие объемы ацетона, вследствие чего нужно проводить несколько повторных центрифугирований, что удлиняет процедуру. В этом случае можно осаждать белок трихлоруксусной кислотой (ТХУ).


При осаждении белка ТХУ нужно знать, кислота какой концентрации необходима для осаждения белков, присутствующих в исследуемом образце. Другой очень важный момент, возникающий при использовании ТХУ, — убрать избыток кислоты перед растворением белкового осадка. К белковой пробе добавляют ТХУ до выбранной конечной концентрации, тщательно перемешивают и инкубируют не менее 30 мин во льду. Затем белок осаждают центрифугированием, как описано выше. После удаления надосадочной жидкости осадок белка промывают холодным (-20°С) 80% ацетоном. Для удаления ТХУ потребуется, по крайней мере, 3-4 отмывки. Отмытый от ТХУ осадок белка высушивают при комнатной температуре или при — 20°С, не пересушивая. Затем растворяют осадок в буфере/растворе, совместимом с выбранным методом определения белка.


Кроме ацетона и ТХУ, белок можно осадить смесью хлороформа с метанолом, которые берут в разных соотношениях в зависимости от природы белков, находящихся в исследуемом препарате. При этом образуются две фазы, разделенные белком. После тщательного удаления фаз осадок белка промывают метанолом, затем высушивают и растворяют в выбранном буфере.


Чтобы снизить концентрацию веществ, мешающих использованию выбранного метода определения белка, белковый препарат можно разбавить, но этот прием подходит только для образцов с высокой концентрацией белка.


Также можно избавиться или существенно снизить концентрацию несовместимых веществ путем перевода белков в другой буфер при помощи гель-фильтрация в миниколонках, например, PD-10 или NAC-5 и NAC-10 (GE Health Care) в соответствии с прилагаемыми инструкциям. Гель-фильтрация приведет к разбавлению белкового раствора, который можно концентрировать при помощи специальных концентрирующих фильтров.


Сейчас для определения содержания белка используют коммерческие наборы реактивов. Фирмы «Sigma», «Bio-Rad», «Pierce» и многие другие продают киты, которые давно и успешно применяются. Для тех читателей, которые хотят самостоятельно готовить реагенты, используемые в описанных выше методах, в Приложении приведем их «рецепты», а также соответствующие протоколы (микроформат) для каждого из рассмотренных выше методов определения содержания белка.


Авторы выражают благодарность Российскому фонду фундаментальных исследований за финансовую поддержку (гранты №№ 11-04-01006 и 11-04-01509).

1. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P.265-275.

2. Bradford M.M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding // Anal. Biochem. 1976. V.72. P.248-254.

3. Smith P.K., Krohn R.I., Hermanson G.T., Mallia A.K., Gartner F.H., Provenzano M.D., Fujimoto E.K., Goeke N.M., Olson B.J., Klenk D.C. Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid // Anal. Biochem. 1985. V.150. P.76-85.

4. Gornall A.G., Bardawill C.S., David M.M. Determination of Serum Proteins by Means of the Biuret Method // J. Biol. Chem. 1949. V.177. P.751-766.

5. Wiechelman K.J., Braun R.D., Fitzpatrick J.D. Investigation of the Bicinchoninic Acid Protein Assay: Identification of the Groups Responsible for Color Formation // Anal. Biochem. 1988. V.175. P.231-237.

6. Layne E. Spectrophotometric and Turbidimetric Methods for Measuring Proteins // Methods Enzymol. 1957. V.3. P.447-455.

7. Fasman G.D. Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. Boca Raton: CRC, 1989.601 p.

8. Stoscheck C.M. Quantitation of Protein // Methods Enzymol. 1990. V.182. P.50-68.

Реактив Folin-Ciocalteu.100 г вольфрамата натрия, 25 мг молибдата натрия, 700 мл воды, 50 мл 85% фосфорной кислоты и 100 мл соляной кислоты кипятить 10 ч с обратным холодильником. Добавить 150 г сульфата лития, 50 мл воды и 3-4 капли бромной воды, кипятить в течение 15 мин. После охлаждения разбавить водой до 1 л, профильтровать. Как видно, готовить реактив самим очень трудоемко. Дешевле и надежней купить готовый реактиву фирмы «Sigma» (номер по каталогу F9252).


Реактив Lowry.2% Na2CO3 (раствор 1), 2% K-Na тартрат (или 2% Na цитрат) (раствор 2), 1% CuSO4 (раствор 3). Все эти растворы можно хранить при комнатной температуре. Непосредственно перед определением приготовить рабочий раствор, для чего смешать 98 мл раствора 1, 1 мл раствора 2 и 1 мл раствора 3.


Протокол (время проведения 1.5-2.0 ч). К 100 мкл раствора белка в 0.5 M NaOH добавить 500 мкл свежеприготовленного реактива Lowry, инкубировать 10 мин, затем добавить 100 мкл разбавленного реактива Folin-Ciocalteu (разбавить исходный реактив дистиллированной водой в соотношении 1:


Поскольку при этом реакция никак не останавливается, то следует помнить, что каждые 10 мин оптическая плотность будет увеличиваться. Поэтому необходимо контролировать время, прошедшее до спектрофотометрии.


Реагент: 0.5 мг/мл Кумасси (Coomassie Blue Brilliant) G-250, 25% метанол (этанол) и 42.5% H3PO4. Реагент стабилен в темноте при 4°C. Для приготовления рабочего раствора реагент разбавить в пять раз. Разбавленный рабочий раствор стабилен в течение недели в темноте при 4°C.


Хотя приготовить рабочий раствор не составляет большого труда, но его можно купить у фирмы «Sigma» (номер по каталогу B6916).


Протокол. К 50 мкл раствора белка добавить 450 мкл рабочего раствора, перемешать, инкубировать при комнатной температуре 5 мин, измерить оптическую плотность полученного раствора при 595 нм.


Протокол (время проведения 35-45 мин при инкубации 37°С). К 25 мкл раствора белка добавить 500 мкл рабочего раствора и инкубировать 30 мин при 37°С (или 2 ч при комнатной температуре). Охладить до комнатной температуры и измерить оптическую плотность полученного раствора при 562 нм.

Типовые нарушения белкового обмена. Несоответствие поступления белка потреблению. Нарушение расщепления белка в ЖКТ и содержания белка в плазме крови. Расстройство конечных этапов катаболизма белка и метаболизма аминокислот. Нарушения липидного обмена.

презентация [201,8 K], добавлен 21.10.2014

История открытия и изучения белков. Строение молекулы белка, ее пространственная организация и свойства, роль в строении и жизнеобеспечении клетки. Совокупность реакций биологического синтеза. Всасывание аминокислот. Влияние кортизола на обмен белка.

контрольная работа [471,6 K], добавлен 28.04.2014

Классификация рода «белка». Описание внешнего вида. Хвойно-широколиственные леса как место обитания белок. Фото Аризонской и Японской белки. Численность, размножение, потомство. Ухаживание самца за самкой. Развитие и питание новорожденных бельчат.

презентация [1,4 M], добавлен 14.05.2014

Структура молекулы тайтина. Структура и функции молекул С-белка, Х-белка и Н-белка. Белки семейства тайтина в норме, при адаптации и патологии. Амилоидозы. Современные представления о строении, формировании амилоидных фибрилл. Патологические проявления.

дипломная работа [975,8 K], добавлен 15.12.2008

Определение понятия и описание общих особенностей трансляции как процесса синтеза белка по матрице РНК, осуществляемого в рибосомах. Схематическое представление синтеза рибосом у эукариот. Определение сопряженности транскрипции и трансляции у прокариот.

презентация [2,8 M], добавлен 14.04.2014

Характеристика биосинтеза как процесса образования органических веществ, происходящего в клетках с помощью ферментов и внутриклеточных структур. Участники биосинтеза белка. Синтез РНК с использованием ДНК в качестве матрицы. Роль и значение рибосом.

презентация [2,3 M], добавлен 21.12.2013

Изучение кодирования аминокислотной последовательности белков и описание процесса синтеза белка в рибосомах. Генетический код и синтез рибонуклеиновой кислоты. Построение цепи матричной РНК и синтез протеина. Трансляция, сворачивание и транспорт белков.

реферат [3,5 M], добавлен 11.07.2015

Ген — участок ДНК, в котором содержится информация о первичной структуре одного белка. Последовательность из трех расположенных друг за другом нуклеотидов (триплет). Важные свойства генетического кода. Схема синтеза белка в рибосоме (трансляция).

презентация [354,6 K], добавлен 06.03.2014

Синтез белка Xvent-2 в клетках зародышей с целью дальнейшей дифференцировки стволовых клеток. Выделение клеточных органелл. Реагенты и растворы для изоэлектрического фокусирования. Получение биологического материала. Результаты работы и их обсуждение.

курсовая работа [4,5 M], добавлен 27.06.2015

Белки, или протеины — природные органические соединения, которые обеспечивают жизненные процессы организма. Основатель химии белка. Структура и уровни организации соединения. Физические свойства белка. Денатурация и биуретовая реакция. Функции белков.

презентация [9,4 M], добавлен 27.01.2011

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.

источник

Присутствие белков в пищевых объектах устанавливается с помощью качественных реакций, которые условно разделяют на две группы: а) цветные реакции; б) реакции осаждения.

Среди первой группы различают универсальные реакции (биуретовая на пептидные связи и нингидриновая на α-аминокислоты) и специфические, обусловленные присутствием в белках остатков определенных аминокислот. Так, ксантопротеиновая реакция свидетельствует о наличии в белках остатков ароматических аминокислот, реакция Паули – гистидина и тирозина, Адамкевича и Вуазене – триптофана, нитропруссидная – цистеина, а реакция Сакагучи – аргинина. По результатам специфических реакций ориентировочно можно судить о пищевой ценности белков.

Во второй группе реакций белки осаждают действием солей, органических растворителей, концентрированных кислот, щелочей, ионов тяжелых металлов, температуры и в изоэлектрической точке. Белки в растворенном состоянии крайне неустойчивы, поэтому при добавлении органических растворителей (спирт, ацетон), концентрированных растворов нейтральных солей щелочных металлов и воздействии физических факторов (нагревание, облучение, ультразвук) гидратная оболочка разрушается и они выпадают в осадок.

Так как белковые вещества сырья (муки, крупы, молока, мяса), включая ферменты, часто являются определяющими в обеспечении качества пищевых изделий, то для изучения физико-химических, биохимических и физиологических свойств этих соединений обязательным условием является получение белков в индивидуальном и, по возможности, неденатурированном состоянии. Белки обычно теряют природные (нативные) свойства (растворимость, гидратацию, ферментативную активность и т.д.), подвергаясь денатурации под влиянием различных факторов. Типичным примером необратимой денатурации белков является выпадение их в осадок под действием ТХУ. Длительный контакт со спиртом также приводит к необратимой денатурации белка. Денатурирующее действие различных факторов на белки можно смягчить, если проводить операции выделения их при температуре не выше +4°С.

Методы выделения и очистки белков. Общая схема операций по выделению белков сводится к измельчению биологического материала (гомогенизации), экстрагированию и собственно выделению, то есть очистке и получению белка в индивидуальном состоянии. При изучении метаболических процессов в живых организмах (в созревшем зерне, плодах, овощах) морфологическая и биохимическая целостность клеток и тканей сохраняется в максимальной степени, тогда как при исследовании состава сырья и готовых пищевых продуктов потеря целостности структуры несущественна. Гомогенизацию объектов следует рассматривать как начальную стадию выделения белков, но способ ее определяется постановкой задачи. Например, анализ ферментов из растительных материалов часто затруднен тем, что при гомогенизации экстрагируется большое количество фенолов, которые взаимодействуют с карбонильными группами пептидных групп при помощи водородных связей и вызывают денатурацию белка и потерю ферментами своей активности. Добавление в экстракт поливинилпирролидона, образующего с фенолами нерастворимые комплексы, предотвращает инактивацию ферментов.

Читайте также:  Анализы у беременных содержание белка

Разрушение клеточной структуры осуществляется тщательным измельчением материала в гомогенизаторах, мельницах, попеременным замораживанием и оттаиванием, применением ультразвуковых высокочастотных колебаний, пресс-методов с использованием высоких давлений и метода «азотной бомбы». В последнем случае клетки насыщаются азотом под давлением, которое затем сбрасывается и клетки разрушаются. Эффективность гомогенизации зависит не только от способа разрушения клеточных структур, но и от вида анализируемого материала. Животные клетки разрушаются относительно легко, особенно в отсутствие сосудистой и соединительной ткани, тогда как растительные и микробные – из-за присутствия клеточных стенок – трудно. В таком случае применяют методы растирания материала с твердыми веществами (песок, абразивный порошок) или обработку клеточных стенок лизоцимом или ферментными препаратами, содержащими целлюлазу, хитиназу и липазу. Гомогенизацию рекомендуется проводить в холодных комнатах или с использованием льда.

Экстракция белков может быть совмещена с гомогенизацией клеток и тканей либо проведена отдельно, если продукт заранее измельчен. Для определения ферментативной активности белка достаточно одноразовой экстракции, тогда как для количественного определения белковых фракций зерна – трех- или пятикратной. Условия экстрагирования белков (время, гидромодуль, температура и т.д.) подбираются эмпирически, основываясь на методиках ведущих научных школ.

Большинство белков животных тканей хорошо растворимы в 5–10% растворах солей, тогда как для перевода в раствор белков зерновых культур применяют более широкий набор растворителей. Для этого используются буферные системы со значениями рН от кислых до слабощелочных (фосфатные, боратные, цитратные, трис-HCl), органические растворители и неионные детергенты, разрывающие белок-липидные или белок-белковые связи:

Растворители подбираются с учетом разрыва в белках определенных типов связей. Так, уксусная кислота ослабляет ионные связи, сообщая молекулам одноименные положительные заряды, мочевина – водородные и гидрофобные, салицилат натрия и ДДС-Na – гидрофобные и ионные, а водные растворы спиртов – водородные и гидрофобные взаимодействия. Органические растворители разрывают белок-липидные связи.

При изучении физико-химических свойств белков и их превращений в пищевых системах широко используют методы фракционирования и очистки от небелковых соединений. Они основаны на различиях таких свойств белков, как размер молекул, растворимость, заряд и сродство к специфическим химическим группам.

Осаждение белков из раствора под действием солей щелочных и щелочноземельных металлов называют высаливанием. Для высаливания чаще применяется сульфат аммония, под влиянием которого белки, как правило, сохраняют растворимость и ферментативную активность. Главную роль при высаливании играет не природа солей, а валентность ионов, действие которых оценивается по ионной силе (μ):

где С – концентрация каждого вида иона; V – валентность ионов.

Глобулины выпадают в осадок при 50% насыщении, альбумины – при 100% насыщении растворов солей, а при ступенчатом фракционировании (20–100% насыщения) выпадают белки и других классов (проламины, глютелины).

В практике выделения и очистки белков используются различные типы хроматографии: адсорбционная, распределительная, ионообменная и хроматография по сродству. Адсорбционная хроматография основана на различиях в полярности белков. В колонке вместе с буферным раствором упаковывают адсорбент, на который в небольшом объеме растворителя наносят исследуемый образец. Компоненты разделяемой смеси адсорбируются, затем элюируются с помощью буферного раствора с увеличивающейся концентрацией или полярностью. Фракции белка собирают с помощью автоматического коллектора фракций.

В распределительной хроматографии, в отличие от адсорбционной, в качестве неподвижной фазы выступает водный слой, удерживаемый твердой фазой (силикагель, бумага). Разделяемые вещества многократно распределяются между водным слоем и движущейся фазой растворителя и с разной скоростью перемещаются подлине колонки или бумаге. Распределительную хроматографию на бумаге часто используют для анализа пептидов и аминокислот. Адсорбентом служат нити целлюлозы, а растворителем – смесь органических растворителей, например: бутиловый спирт–уксусная кислота–вода. Хроматограмму проявляют, высушивают и анализируют местонахождение разделяемых компонентов тем или иным способом.

Методом ионообменной хроматографии белки или аминокислоты разделяют на основе различий в общем заряде молекул. Если белок в нейтральной среде (рН 7) имеет положительный заряд, то он связывается на колонке с ионообменником, содержащим фенольные, сульфо- и карбоксильные группы (катионообменник), если отрицательный, то – на колонке с ионообменником, представленным аминами или органическими основаниями (анионообменник). Чаще всего для фракционирования белков используют производные полистирола и целлюлозы:

Положительно заряженный белок снимается с колонки с помощью раствора хлористого натрия или изменением рН элюирующего буфера. При этом ионы натрия конкурируют с положительно заряженными группами белков. Белки с меньшим положительным зарядом вымываются с колонки первыми, с большим зарядом – последними.

Хроматография по сродству (аффинная хроматография,) основана на принципе избирательного связывания белков со специфическими веществами (лигандами), прикрепленными к носителю. Лиганд (глюкозу) ковалентно присоединяют к носителю (проводят иммобилизацию) и наносят на колонку исследуемую белковую смесь. Несвязавшиеся белки удаляют соответствующим буфером, а нужный белок элюируют раствором, содержащим лиганд в очень высокой концентрации. При этом присоединенные к колонке остатки глюкозы в молекуле белка замещаются на глюкозу, находящуюся в растворе (рис. 2.20).

ис. 2.20. Хроматография по сродству (афинная хроматография)

Рис. 2.21. Распределение молекул белка среди гранул сефадекса

Гель-фильтрация, или метод молекулярных сит заключается в пропускании белков через колонку с гелем сефадекса или других типов (агарозных, полистирольных). Применяются также пористые стеклянные шарики и пористый кварц (порасил). Наибольшее распространение получили декстрановые гели (сефадекс), являющиеся продуктом поперечного сшивания полисахаридных цепочек декстрана. Зерна сефадексов разных номеров содержат поры разных размеров, в которые могут проникать белки с определенной молекулярной массой. Низкомолекулярные белки распределяются в растворенном виде как внутри частиц полимера, так и между ними, а высокомолекулярные – только между частицами, поэтому вторые быстрее проходят через колонку и первыми вытекают из нее (рис. 2.21). В итоге белки распределяются по молекулярной массе и могут быть собраны в виде отдельных хроматографических фракций (рис. 2.22).

Рис. 2.22. Картина распределения смеси веществ, различающихся по молекулярным массам, при методе гель-фильтрации

Принцип методов электрофоретического разделения заключается в способности молекул пептидов и аминокислот, находясь в заряженной форме в виде катионов (+) или анионов (–), передвигаться в электрическом поле с определенной скоростью. Кроме того, молекулы с близкими зарядами, но разными размерами, отличаются отношением заряда к массе. Все эти различия и обуславливают высокую разрешающую способность электрофоретических методов. Скорость миграции белков в электрическом поле (V) зависит от напряжения электрического поля(ε), заряда белков (z) и сопротивления трения (О-Сопротивление трения определяется размерами, формой белка, значениями рН и концентрацией буфера. Указанные величины связаны между собой соотношением: V = ε · z / f.

Впервые метод электрофореза был разработан Тизелиусом с применением бумаги в качестве носителя и специальных оптических устройств, регистрирующих передвижение границы раздела раствора белка и растворителя по показателям преломления (фронтальный электрофорез). В настоящее время распространены методы зонального электрофореза, предусматривающие использование крахмальных и полиакриламидных гелей (ПААГ). Наиболее распространенным методом фракционирования белков является диск-электрофорез (от англ, discontinuous – прерывистый) в ПААГ, при котором используется пара буферных растворов с различными значениями рН в присутствии ДДС-Na и гели различной пористости (концентрирующие и разделяющие) (Laemmli, 1970). Для обнаружения белков гели обрабатывают красителями: амидовым черным 10В, кумасси синим R-250. Интенсивность окраски, а по ней количественное содержание белковых фракций, определяют сканированием на денситометре.

Для электрофоретического разделения белков и пептидов успешно применяется двумерный электрофорез в ПААГ. В соответствии с этим методом смесь компонентов разделяют сначала в столбиках геля электрофорезом в горизонтальном направлении, затем в гелевых пластинах – в вертикальном (рис. 2.23). При разделении белков, например гороха, этим методом удалось получить более 150 различных компонентов.

Очень высокую разрешающую способность имеет метод изоэлектрического фокусирования белков, в основе которого лежит фронтальный электрофорез, проводимый на колонке одновременно в градиенте рН и напряжения. Колонку предварительно заполняют носителями с синтетическими смесями полиаминополикарбоновых кислот (амфолитами), затем сверху в нее подают раствор сильной кислоты, снизу – сильнощелочной раствор для того, чтобы установить градиент рН с крайними значениями, соответствующими рН кислого и щелочного растворов. Амфолиты прекращают движение по колонке, когда их суммарный заряд становится равным нулю, и тем самым стабилизируют исходный градиент рН. В подготовленную колонку вносят образец исследуемой смеси, компоненты которой распределяются по зонам со значениями рН, характерными их изоэлектрическим точкам.

В химии пищевого белка применяют и другие разновидности электрофоретическогоразделения(иммуноэлектрофорез, изотахофорез), а также метод пептидных карт и ультрацентрифугирование. Метод пептидных карт (отпечатков пальцев) относится к методам двумерного разделения и наиболее часто используется для анализа пептидов. Пептиды получают избирательным гидролизом белков, затем на бумаге их разделяют в горизонтальном направлении электрофорезом, в вертикальном – распределительной хроматографией. Пептиды окрашивают нингидрином, элюируют и определяют аминокислотный состав.

В методе ультрафильтрации белки в градиенте плотности распределяются на разных уровнях центрифужной пробирки в процессе седиментации (осаждения) в виде отдельных зон. Для создания градиента используют соли тяжелых металлов и растворы сахарозы. Метод широко применяется для определения молекулярных масс белков по константе седиментации (S), которая зависит от массы и формы белковых частиц:

где v – скорость перемещения границы растворитель–белок, см/с; w– угловая скорость ротора, рад/с; г – расстояние от центра ротора до середины ячейки с раствором белка.

Величина S, равная 1 · 10 -13 с, принята за единицу и названа сведбергом (S) в честь Т. Сведберга, впервые сконструировавшего ультрацентрифугу. Очистка белков от низкомолекулярных соединений (солей, сахаров, аминокислот) осуществляется методами диализа, гель-фильтрации на сефадексе G-25, кристаллизации, ультрафильтрации и с помощью полых волокон. При диализе используют полупроницаемые мембраны (целлофан, коллодийная пленка), через которые белки не диффундируют и остаются внутри диализного мешочка. Более мелкие молекулы проходят через поры диализной мембраны и выходят в диализат. В методе ультрафильтрации, который применяется, например, в производстве сывороточных белков молока, соевых белковых изолятов, по обе стороны мембраны создается разность давлений за счет продавливания фильтруемого белкового раствора. В качестве мембран используются целлюлозные пленки и нецеллюлозные полиэлектролитные комплексы. Аналогично мембранам по принципу молекулярного сита действуют и полые волокна. Белковый раствор помещается с внешней стороны волокон, и создается разность давления за счет повышения его в растворе или понижения внутри их.

Гомогенность белка определяется на последнем этапе выделения и очистки с применением по меньшей мере двух методов, оценивающих то или иное физико-химическое свойство. Наиболее достоверными являются ультрацентрифугирование в градиенте плотности, диск-электрофорез в ПААГ, иммунохимические методы и растворимость. Если белок при электрофорезе представлен только одной полосой и обладает при этом максимальной биологической активностью, то он считается гомогенным. Для гомогенного белка на кривой растворимости (зависимости растворенного белка от общего его количества в постоянном объеме растворителя) имеется только один перегиб, тогда как для гетерогенного – столько, сколько в нем индивидуальных компонентов.

Содержание белка в пищевых объектах обычно определяют по количеству азота с использованием метода Кьельдаля. С целью упрощения и сокращения длительности анализа этот метод с момента его разработки (1983) неоднократно модифицировался с применением различных катализаторов и условий минерализации. На основе модифицированных методов созданы высокопроизводительные автоматические анализаторы типа «Кьельфос», стоимость определения содержания белка на которых и сегодня остается высокой. Существует и некоторая условность в методе Кьельдаля при расчете количества белка, заключающаяся в использовании переводного коэффициента. Однако, несмотря на недостатки, метод Кьельдаля является унифицированным, он включен в ГОСТы на многие пищевые продукты.

Для перевода количества азота в содержание белка используют коэффициент 6,25. Принят он потому, что большинство белков содержит 16% азота (100/6,25 = 16). Однако более правильным является использование коэффициентов, соответствующих фактическому содержанию сырого белка в каждом его виде. Так, для пшеницы получен коэффициент 5,7, так как ее белки содержат 17,5% азота. Для других белковых ресурсов коэффициенты перевода приняты следующими: 5,7 – рожь, ячмень, овес, семена подсолнечника; 5,8 – соя; 6,25 – кукуруза, мясо; 6,38 – молоко.

Имеются и другие методы определения азота, такие как метод Дюма, нейтронно-активационный и с фенолятгипохлоритом на приборе «Техникон». Принцип метода Дюма заключается в разложении органического соединения в атмосфере оксида углерода до газообразного состояния с последующим измерением объема азота (N2). В нейтронно-активационном методе атомы азота образца бомбардируются нейтронами в ядерном реакторе с получением изотопа 13 N. Содержание белка рассчитывают по количеству гамма-лучей. Определение азота на приборе «Техникон» осуществляется колориметрическим способом, в котором измеряется интенсивность сине-голубой окраски, образующейся по реакции взаимодействия сульфата аммония, выделяющегося в процессе минерализации образца, с щелочным раствором фенола и гипохлорита. Все описанные здесь методы по точности анализа не уступают методу Кьельдаля, однако они являются достаточно дорогими.

Широкое распространение получил метод инфракрасной спектроскопии, в основе которого лежит поглощение белками света с определенной длиной волны и измерение интенсивности его отражения в приборах-анализаторах. Приборы калибруют по образцам зерна (эталонам) с известным содержанием белка, определяемым по методу Кьельдаля.

Известны методы количественного определения белка, основанные на различной степени помутнения (нефелометрический метод), способности белков адсорбировать красители (кумасси синий R-250, амидочерный и др.) и преломлять лучи света (по показателю преломления). Они характеризуются высокой точностью и простотой определения, хотя имеют ряд ограничений. Наиболее удобными являются методы с кумасси синим, биуретовый и Лоури. В основе биуретового метода лежит биуретовая реакция, в основе метода Лоури – восстановление фосфомолибденовой кислоты тирозином и триптофаном с одновременным протеканием биуретовой реакции. По оптической плотности с использованием калибровочных графиков находят концентрацию белка в растворах.

источник