Меню Рубрики

Определение белка методом иммуноферментного анализа

5.1 Сущность и классификация ИФА.

ИФА появился в середине 60-х годов и первоначально был разработан как метод для индификации антигена в гистологическом препарате, а также для визуализации линий преципитации в тесте иммунодиффузии и иммуноэлектрофореза, а затем стал использоваться для количественного определения антигенов и антител в биологических жидкостях. В разработке метода принимали участие Е.Энгвалл и Р.Пэлман, а также независимо от них В. Ван Вееман и Р.Шурс.

Рис. 6 Основной принцип ИФА:

для выявления антигенов; 2) для выявления антител

Метод основан на специфическом связывании антитела с антигеном, при этом один из компонентов конъюгирован с ферментом, в результатереакции с соответствующим хромогенным субстратом образовывается окрашенный продукт, количество которого можно определить спектрофотометрически (рис. 6).

Открытие возможности иммобилизации антигена и антитела на различных носителях с сохранением их связывающей активности позволило расширить использование ИФА в различных областях биологии и медицины.

Появление моноклональных антител послужило дальнейшему развитию ИФА, что позволило повысить его чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов.

Теоретически ИФА основывается на данных современной иммунохимии и химической энзимологии, знании физико-химических закономерностей реакции антиген-антитело, а также на главных принципах аналитической химии. Чувствительность ИФА и время его проведения определяется несколькими основными факторами: кинетическими, термодинамическими характеристиками реакции антиген-антитело, соотношением реагентов, активностью фермента и разрешающей способностью методов его детекции. В общем виде реакция антиген-антитело может быть описана простой схемой:

Разнообразие объектов исследования от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, а также необычайно широкий круг задач, связанных с многообразием условий применения ИФА, обусловливают разработку чрезвычайно большого количество вариантов этого метода.

Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии:

1. стадия узнавания тестируемого соединения специфическим к нему антителом, что ведет к образованию иммунного комплекса;

2. стадия формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания;

3. стадия превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал. В основу классификации методов ИФА положено несколько подходов:

1. По типу реагентов, присутствующих на первой стадии ИФА, различают конкурентный и неконкурентный методы.

А) В конкурентном ИФА на первой стадии в системе присутствуют одновременно анализируемое соединение и его аналог, меченный ферментном и конкурирующий за центры специфического связывания с ним.

Б) Для неконкурентных методов характерно присутствие в системе на первой стадии только анализируемого соединения и специфичных к нему центров связывания.

2. Все методы ИФА делются на гомогенные и гетерогенные.

Если все три стадии ИФА проходят в растворе и между основными стадиями нет дополнительных этапов разделения образовавшихся иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов, метод относится к группе гомогенных.

В основе гомогенного ИФА, применяемого, как правило, для определения низкомолекулярных субстанций, лежит ингибирования активности фермента при его соединении с антигеном или антителом. Активность фермента восстанавливается в результате реакции антиген-антитело.

При связывании антитела с антигеном, содержащим ферментную метку, происходит ингибирование активности фермента на 95% по отношению к высокомолекулярному субстрату, что обусловлено стерическим исключением субстрата из активного центра фермента. По мере увеличения концентрации антигена связывается все больше антител и сохраняется все больше свободных конъюгатов антиген-фермент, способных гидролизовать высокомолекулярный субстрат. Анализ проводят очень быстро, для одного определения требуется 1 минута. Чувствительность метода достаточно высока. С его помощью можно определить вещество на уровне пикомолей.

Для гетерогенных методом характерно проведение анализа в двухфазной системе с участием твердой фазы – носителя, и обязательная стадия разделения иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов (отмывка), которые находятся в разных фазах (образовавшиеся иммунные комплексы находятся на твердой фазе, а непрореагировавшие комплексы – в растворе). Гетерогенные методы, в которых формирование иммунных комплексов на первой стадии протекает на твердой фазе, называют твердофазными методами.

Методы относятся к гомогенно- гетерогенным, если 1 стадия – образование специфических комплексов происходит в растворе, а затем для разделения компонентов используют твердую фазу с иммобилизированным реагентом.

3. По принципу определения тестируемого вещества:

А) Прямое определение концентрации вещества (антигена или антитела) по числу провзаимодействующих с ним центров связывания. В этом случае ферментная метка будет находиться в образовавшемся специфическом комплексе АГ-АТ. Концентрация определяемого вещества будет прямо пропорциональна регистрируемому сигналу.

Б) Определение концентрации вещества по разности общего числа мест связывания и оставшихся свободными центров связывания. Концентрация определяемого вещества при этом будет возрастать, а регистрируемый сигнал снижаться, следовательно, в данном случае прослеживается обратная зависимость от величины регистрируемого сигнала.

5.2 Характеристика компонентов, используемых в ИФА.

Ферментные метки обладают чрезвычайно мощьным каталитическим действием, одна молекула фермента может реагировать с большим количеством молекул субстрата. Таким образом, фермент, присутствующий в ничтожных количествах, можно выявить и количественно определить по образованию продуктов, катализируемой им реакции. Другое преимущество применения ферментов в качестве меток обусловлено наличием в молекуле многочисленных функциональных групп (сульфгидрильных, карбоксильных, остатков тиразина и др.), через которые можно ковалентно присоединить молекулы лиганда.

Ферментные маркеры, используемые в ИФА, должны обладать следующими свойствами:

– высокая активность и стабильность фермента в условиях анализа, при модификации и в конъюгате с антителами или другими белками;

– наличие чувствительных субстратов и простота метода определения продуктов или субстратов ферментативной реакции;

– возможность адаптации субстратных систем к дальнейшему усилению;

– отсутствие фермента и его ингибиторов в исследуемой биологической жидкости.

В ИФА может использоваться не менее 15 различных ферментов. Наибольшее применение, в соответствии с вышеназванными требованиями, нашли пероксидаза хрена (ПХ), щелочная фосфотаза (ЩФ) и β-D-галактозидаза. Все три стабильны и катализируют высокочувствительные реакции. Кроме того, продукты, получаемые в результате реакций, катализируемых этими ферментами, в зависимости от используемого субстрата, могут выявляться не только колориметрическими методами, но также флуоресцентными методами. Другие ферменты используются значительно реже. Это объясняется их более низкой в сравнении с ПХ и ЩФ удельной активностью.

Выбор субстрата в первую очередь определяется используемым в качестве метки ферментом, так как реакция фермент-субстрат высоко специфична.

Основные требования к субстрату:

– обеспечение высокой чувствительности метода при выявлении фермента в конъюгате;

– образование хорошо учитываемых (например, окрашенных) продуктов реакции фермент-субстрат;

– субстрат должен быть безопасным, дешевым, доступным и удобным для применения.

Чаще используют хромогенные субстраты, которые, разрушаясь, образуют окрашенное вещество. Перспективным является использование высокоэнергетических субстратов – флуоресцентных, хемипюминесцентных. Применение таких субстратов позволяет теоретически повысить чувствительность ИФА на два порядка.

Конъюгат – это антиген или антитело, меченные ферментной меткой. Образование коньюгата – один из важных этапов проведения ИФА.

При формировании конъюгата подбирают такой оптимальный метод введения ферментной метки, чтобы оба компонента конъюгата сохраняли свою биологическую активность: фермент — способность взаимодействовать с субстратом, а антиген или антитело — антигенность и антигенсвязывающую активность, соответственно. Наличие меченого, высокоочищенного антигена позволяет использовать конкурентные методы. В этом случае на конечном этапе можно измерять активность конъюгата, не связанного с иммобилизованными антителами, что позволяет избежать процедуры отмывки и делает анализ более удобным. Однако антигены разнообразны по своим физико-химическим свойствам и строению, а значит невозможно разработать универсальные методики для получения конъюгата с антигеном. В этом случае получение конъюгата антигена с ферментом представляет собой отдельную сложную задачу. Приготовление меченых антител для ИФА методически более доступно.

Конъюгирование фермента с иммунохимически активными белками производится различными методами: химическая сшивка, ковалентное связывание молекулы фермента с АГ или AT и образование соединений через нековалентные связи, например, когда связь между ферментом и АГ или AT осуществляется иммунологически, через взаимодействие антиген-антитело.

Наиболее широкое распространение получили ковалентные способы приготовления конъюгатов. Выбор реакции связывания определяется типом доступных функциональных групп в данных белковых молекулах. В качестве реагентов, используемых для введения фермента в молекулы антигенов и антител, используют глутаровый альдегид, периодат натрия и др.

Существует одноэтапный и двухэтапный методы получения конъюгатов с помощью глутарового альдегида. Могут образовываться конъюгаты различных размеров с редуцированной ферментативной активностью (15 — 60 % от свободного фермента). Образовавшийся конъюгат больших размеров может стерически затруднять определение тестируемого вещества. Конъюгаты с относительно низкой молекулярной массой состоят из Fab-фрагмента и одной молекулы фермента.

В результате двухэтапного синтеза, который заключается в поэтапном получении сначала модифицированного с помощью сшивающего агента фермента, его выделении, а затем последующем взаимодействии его с антигеном (антителом), образуются молекулы однородного состава, содержащие 1-2 молекулы фермента на молекулу иммуноглобулина и сохраняющие высокую ферментативную и иммунологическую активность. Однако количество таких образовавшихся конъюгатов невелико (для пероксидазы хрена составляет 5 — 10 %).

Наибольшее практическое применение нашел метод получения иммунопероксидазных конъюгатов, основанный на окислении углеводного компонента фермента периодатом натрия (связывание пероксидазы в конъюгат достигает 70-90 % от начального количества фермента).

Надежный конъюгат должен обладать следующими свойствами:

— высоким антительным тигром и высокой афинностью к антигену, чтобы его можно было использовать в большом разведении, и таким образом, уменьшить неспецифическое связывание;

— достаточной специфичностью в рабочем разведении;

— преобладанием мономерных форм над полимерными, т.к. полимерные формы имеют тенденцию к неспецифической адгезии на пластике, что приводит к высокому фоновому уровню реакции;

— оптимальным молярным соотношением между ферментом и антителами (оптимальное соотношение составляет около 1:1);

— достаточной ферментативной активностью конъюгата. Это свойство определяется главным образом условиями конъюгации и соотношением молекул фермента и антител в конъюгате.

5.3 Гетерогенные методы ИФА.

Гетерогенные ИФА (или твердофазные ИФА) включают методы, в которых анализируемое соединение находится в двух фазах. Для разделения компонентов иммунохимической реакции используют твердую фазу (нерастворимый носитель, как правило, пластик) с иммобилизованными на ней антителами или антигеном, которую отмывают на каждой стадии с целью удаления промежуточных продукто непрореагировавших компонентов.

Иммобилизацию можно проводить путем ковалентного связывания антител (антигенов) с активированным носителем, используя химические подходы, а также путем физической адсорбции антител (антигенов) на поверхности твердых полимеров (например, полистирольных пластин). В зарубежной литературе это направление получило название ELISA-тест или энзимсвязанный иммуносорбентный метод (от англ. enzyme-linked immunosorbent assay).

Неконкурентный ИФА определения антигенов на примере использования меченых ферментом специфических антител и иммобилизованных антител.

К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген. В процессе инкубации образуется специфический комплекс антиген-антитело. Затем носитель отмывают от несвязавшихся антигенов и добавляют меченые антитела – конъюгат. При этом количество связавшегося конъюгата прямо пропорционально количеству антигена в исследуемом образце. После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата добавляют хромогенный субстрат для используемого фермента, который изменяет цвет под действием фермента, т. е. происходит ферментативная реакция с окрашиванием раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна количеству меченых ферментом специфических антител, фермента и, соответственно, исследуемого антигена. Измерения оптической плотности раствора в лунках при определенной волне (в зависимости от используемого субстрата) проводят с помощью специальных спектрофотометров, адаптированных для микропланшетов – ридеров. Количественную оценку концентрации антигена в пробе определяют, сравнивая результаты с калибровочной кривой зависимости оптической плотности раствора от концентрации стандартного раствора антигена.

Поскольку на стадии выявления специфического иммунокомплекса антиген оказывается связанным с молекулами иммобилизованных и меченых антител, в литературе этот метод часто называют «сэндвич»-метод (от англ. sandvich) или двухцентровый метод ИФА (от англ. two-site assay).

Этот метод может быть использован для анализа только тех антигенов, на поверхности которых имеется, по крайней мере, две антигенные детерминанты. Для анализа большого количества моновалентных антигенов (лекарственных соединений, пестицидов и др.) он неприемлем.

Основное достоинство данного метода – высокая чувствительность. Предел обнаружения соединений данным методом в настоящее время достигает величины порядка 10-21 моль, что соответствует обнаружению в образце всего 600 молекул анализируемого вещества. Максимальная чувствительность достигается при проведении каждой иммунологической реакции в равновесном режиме, что сказывается на длительности проведения анализа, которая в среднем составляет 4 – 6 часов. Неконкурентный ИФА определения антител на примере использования меченых ферментом вторичных антител и иммобилизованных антигенов.

К иммобилизованному антигену добавляют исследуемую сыворотку. После инкубации и отмывания от несвязавшихся антител добавляют меченые вторичные антитела, которые специфичны к анализируемым антителам. После вторичной инкубации и удаления избытка меченых вторичных антител содержание ферментной метки на носителе пропорционально концентрации специфических антител в сыворотки.

Данная схема является одной из наиболее распространенных ИФА определения антител, поскольку позволяет выявлять антитела к разным антигенам.

Гетерогенный конкурентный ИФА определения антигена на примере использования меченого антигена и иммобилизованных антител.

К иммобилизованным на носителе антителам добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген и фиксированную концентрацию конъюгата антигена с ферментом. После проведения инкубации носитель отмывают от несвязавшихся свободного и меченого антигена и регистрируют ферментативную активность на носителе, которая обратно пропорциональна концентрации определяемого антигена.

Гомогенный иммуноферментный анализ (ГИФА) — наиболее простой в методическом отношении вид ИФА. При его постановке один из участников иммунной реакции (обычно это низкомолекулярный антиген) метится ферментом и за ходом формирования комплекса антиген-антитело следят, регистрируя изменение активности фермента.

Такое нарушение ферментативной активности может возникать либо за счет пространственного разобщения фермента и субстрата, либо за счет конформационных изменений в молекуле фермента, сопровождающих формирование иммунного комплекса. ГИФА имеет ряд существенных преимуществ перед другими иммунохимическими методами. Во-первых, высокая экспрессия (весь анализ с помощью ГИФА , занимает минуты и даже доли минут).

Рис.8 Варианты гомогенного иммуноферментного анализа(А- эффект разобщения фермента (Ф) и субстрата (С) за счет стерических препятствий при взаимодействии антигена (Аг) и антитела (Ат); Б- эффект изменения конформации фермента при формировании комплекса антиген- антитело).

Во-вторых, метод имеет одну стадию и не требует трудоемких и требующих времени этапов промывки. И наконец, в-третьих, метод требует минимальных объемов (8-50 мкл) и количеств биологического или клинического образца. Однако у метода ГИФА имеется один крайне существенный недостаток — на его основе можно создавать диагностические тест-системы только для низкомолекулярных антигенов. Только, в этом случае антитело, взаимодействуя с антигеном, может эффективно экранировать или модифицировать связанную с этим антигеном молекулу фермента. Именно в связи с этим, ( несмотря на кажущуюся простоту и очевидные преимущества перед другими методами, на основе ГИФА были созданы диагностикумы для выявления только гормонов, пептидов, лекарственных и наркотических веществ и некоторых низкомолекулярных белков.

Читайте также:  Анализы на непереносимость молочного белка

5.5 «Сэндвич» — вариант ИФА для выявления антигенов.

Антигены, определяемые с помощью данного варианта ИФА, должны иметь несколько эпитопов, способных связывать антитела, или обладать повторяющимися, пространственно разделенными эпитопами одинаковой специфичности.

При проведении этого варианта ИФА высокоспецифичные поли- или моноклональные антитела, адсорбированные на твердой фазе, инкубируют с исследуемым образцом. После процедуры отмывания в лунки вносят меченные ферментом антитела (конъюгат) к тому же антигену и далее проводят все остальные этапы реакции. Эффективность образования специфического комплекса на каждой стадии анализа зависит от константы связывания реакции антиген-антитело.

источник

Метод иммуноферментного анализа (ИФА)

Метод иммуноферментного анализа является современным методом лабораторного исследования крови на присутствие в ней антител к вирусам и антигенов к возбудителям болезни. Этот метод способен не только выявить этиологию, но еще и определить стадию заболевания. Результаты анализа имеют качественный и количественный показатель.

Для чего проводиться иммуноферментный анализ:

  • обследования крови( общий анализ крови) на присутствие в ней аутоиммунных болезней;
  • обследование больного на онкомаркеры;
  • возможность исследовать гормональный состав крови;
  • поиск антигенов к инфекционным и венерологическим болезням;
  • поиск антител к вирусным инфекциям.

Преимущества иммуноферментного анализа состоят в том, что он гарантирует высокий уровень специфичности результатов и имеет высокую чувствительность (больше 90 %) к возбудителям инфекций. ИФА является доступным методом диагностики, который выполняют в каждом медицинском центре. Также, с помощью такого метода можно определить не только заболевание, но и следить за процессом его развития, сравнивая количество выработанного в крови белка, в разные промежутки время.

Единственным недостатком ИФА, пожалуй, является то, что с его помощью нельзя определить возбудителя инфекции, а можно только выявить иммунный ответ на этот возбудитель.

Основные термины иммуноферментного анализа (ИФА)

Сначала разберемся с некоторыми понятиями, чтобы разобраться в принципе проведения лабораторного исследования.

Иммунный комплекс – это комплекс антител и антигенов, присутствующих в крови, и участвующих в иммунном процессе.

Антигены – это вещества, которые имеют органическое происхождение и образовываются в результате той или иной болезни в клетках организма. Причиной этому может стать аутоиммунное или онкологическое заболевание. Также, антигенами могут быть вещества различных возбудителей инфекционных заболеваний.

Авидность антител — это показатель прочности связи между антигеном и антителом, а также количество антигена, которое вступило в связь с антителами (иммуноглобулинами).
Это очень важный показатель, поскольку с его помощью можно определить дату инфицирования человека, что очень важно при заражении на протяжении срока беременности.
Тест на авидность проводится в лабораторных условиях путем обработки комплекса антитело-антиген мочевиною, что разрушает белок. При этом, соединения с низкой авидностью разрушаются, а соединения, имеющие высокую авидность остаются неповрежденными. Результаты теста на авидность выражаются в процентном соотношении.

Антитела (иммуноглобулины) – это специальный белок, который вырабатывают лимфоциты, то есть иммунные клетки, при попадании в организм человека бактерий, вирусов или грибов (инфекционного патогена).
Существуют иммуноглобулины пяти видов: A, E, M, G, D. Они отличаются друг от друга массой, формой, участием в инфекционном процессе, периодом полураспада, сроками образования с момента заражения.
Самый большой молекулярный вес имеет иммуноглобулин IgM (пентамер), он весит 950000 дальтон, в то время как остальные имеют вес в пределах 150 – 200 000 дальтон. Из-за своих размеров IgM не проходят через плацентарный барьер. В сыворотке из крови основную массу занимают иммуноглобулины IgG, их процентное соотношение занимает приблизительно 80 %. А самую малую часть в сыворотке занимают антитела IgE – 0,003%. В инфекционном процессе участвуют иммуноглобулины IgG, IgМ, IgА. В то время, как IgE являются результатом аллергических реакций. Такие белки как IgD принимают участие в формировании местного иммунитета и образовываются в лимфоузлах и миндалинах.

Основы метода иммуноферментного анализа

Существует несколько видов ИФА, среди них прямой, непрямой, конкурентный и метод блокирования. Хотя на практике, лаборанты чаще всего используют твердофазный гетерогенный иммунный анализ, который называется ELISA (enzyme linked immunosorbent assay).

Принцип проведения иммуноферментного анализа проявляется в реакции антитела и антигена, при которой образовывается иммунный комплекс – антиген-антитело. Такая реакция приводит к тому, что ферментная активность меток на поверхности антител изменяется.

Чтобы разобраться в этом, рассмотрим этот процесс поэтапно.

Первый этап. На этом этапе лаборант, проводящий исследование, размещает на поверхность лунок планшета очищенный антиген инфекционного возбудителя. Затем, к возбудителю добавляют сыворотку крови больного, что провоцирует специфическую реакцию между антителом в крови и антигеном. Это полученное соединение и участвует в следующем этапе эксперимента.

Второй этап. На втором этапе исследования происходит образование иммунных комплексов, которые являются реакцией между антигеном, полученным на первом этапе, и конъюгатом, то есть иммуноглобулином, помеченным ферментом пероксидазы. При этом добавляется специфический хромоген. В результате реакции получается окрашенное соединение в лунке. Интенсивность цвета при этом зависит от количества иммуноглобулинов, содержащихся в крови пациента.

Третий этап. На третьем этапе лаборанты обычно занимаются оценкой результатов исследования. Для этого проводится фотометрирование с использованием спектрофотометра, сравнение плотности биологического материала с плотностью проб, также, проводится математический подсчет результатов. Уровень иммуноглобулинов в крови зависит от плотности лунки планшета.
В практике чаще всего применяют 96 луночные планшеты.

Когда происходит измерение оптической плотности (сокращенно ИП) крови, то проводят подсчет антител в одной единице объема. После чего полученный результат сравнивают с контрольным материалом.
Важно помнить о том, что для каждого метода исследования устанавливаются свои показатели, с помощью которых учитываются референтные значения теста. Это показатели патологий и норм. Поэтому, нужно помнить об этом в каждом конкретном случае. Нельзя проводить интерпретацию результатов одного исследования в иное. Также, нельзя и сравнить результаты отдельно взятых лабораторий.

С помощью иммуноферментного анализа, можно выявить наличие в организме таких заболеваний:

  • вирус иммунодефицита человека,
  • вирусные гепатиты А, В, С, D, E и другие,
  • цитомегаловирусные инфекции,
  • инфекции герпеса первого и второго типа,
  • токсоплазмоз;
  • инфекцию краснухи,
  • мононклеоз, инфекция Эпштейн-Барра,
  • инфекцию кори,
  • бруцеллез,
  • псевдотуберкулез,
  • салмонеллез,
  • дизентерия или шигеллез,
  • аспергиллез,
  • энцефалит,
  • паразитозы, например, лямбиоз, трихинеллез, токсокароз, описторхоз и некоторые другие,
  • инфекции, передающиеся половым путем: сифилис, хламидиоз, уреаплазмоз, микоплазмоз,
  • хеликобактерная инфекция.

2) Показатели состояния человеческого иммунитета и маркеры аутоиммунных болезней.
3) Онкологические заболевания (хронический гонадотропин, простатспецифический антиген, альвеомуцин, фактор некроза опухоли, раково-эмбриональный антиген и другие).
4) Эндокринные заболевания.
5) Нарушения работы репродуктивной системы.

В список включены не все заболевания, которые могут быть диагностированы с помощью ИФА, этот перечень можно продолжать.

Забор материала для исследования методом иммуноферментного анализа.

Для исследований методом ИФА у пациентов могут быть взяты спинномозговое вещество, жидкость стекловидного тела, околоплодные воды, слизь, выделенная из цервикального канала или уретры, а также мазки. Но самым распространенным образцом для исследований является все же кровь пациента.

Забор образцов крови проводится утором, натощак. При этом, нельзя принимать пищу или какие-либо медицинские препараты. Что же касается разного рода терапий, которые включают антибактериальное лечение, лечение от вирусов, паразитов и другие, то их необходимо прекратить не менее, чем за две недели до сдачи анализа.

Результаты иммуноферментного анализа обычно изготавливаются в течение суток. Задержек происходить не должно, хотя при больших скоплениях сывороток, лаборанты могут просто не успеть сделать анализ вовремя.

Оценивая результаты проведенных исследований на выявление каких-либо инфекций, особое значение имеет количество иммуноглобулинов, обнаруженных в крови, а также, их вид. От этих показателей зависит присутствие в организме инфекции или же ее отсутствие. Также, сравнив количественные и качественные показатели, лаборант может определить предполагаемую стадию развития болезни, а также отличить острую форму заболевания от хронической формы. Оценивают также и наличие в организме человека активного вируса, что проявляется при обостренной хронической или острой форме заболевания.
Приблизительное время, через которое происходит появление в крови иммуноглобулинов Ig.

Дело в том, что IgМ являются самыми быстро появляющимися антителами. Обнаружение их происходит уже через 1 – 3 недели после процесса инфицирования организма, это является признаком острой фазы заражения вирусом человека.

Также, подобные антитела можно обнаружить в крови пациента при обострении протекания хронической болезни. Количество антител IgМ сохраняется около 3 месяцев с момента их образования, потом они постепенно начинают исчезать. Хотя случаются и исключения. Например, некоторые пациенты после окончательного выздоровления сохраняют количество антител в своей крови. Так, циркуляция иммуноглобулинов проходит через несколько лет после заражения.

У таких пациентов необходимо проверять положительные показатели на присутствие IgМ антител, поскольку возможны ситуации, когда система тестирования допускает ошибку и выдает ложно положительный результат. Такие ситуации очень часто случаются с беременными женщинами.

Что же касается появления антител IgA, то они способны образоваться через 2 или 4 недели после того, как организм подвергся действию инфекции. Но обнаружить антитела можно только через месяц. Именно тогда количество их достигает оптимального для выявления числа.

Антитела IgA вырабатываются клетками лимфоузлов, селезенки, а также слизистых оболочек. Подобные иммуноглобулины способны концентрироваться на поверхностях слизистых оболочек органов, где и выполняют свою защитную функцию, участвуя в местном иммунитете человека.

Появление антител IgG прослеживается тестирующими системами уже на 4 неделе прогрессирования инфекционного процесса в организме. Титр таких иммуноглобулинов постепенно может увеличиваться в течение 2 месяцев. После выздоровления небольшой их титр сохраняется в организме и поддерживает иммунитет. Такие болезни как хламидиоз, трихомониаз и микоплазмоз характеризируются невысоким уровнем антител IgG в крови, что объясняется отсутствием стойкого иммунитета к таким инфекциям.

Варианты выявления в крови человека иммуноглобулинов разных классов.

  • Выявление антител IgM, которое проводится изолированно, свидетельствует о первичном инфицировании человека.
  • Обнаружение в сыворотке крови одновременно антител класса IgM и IgG происходит также при первичном инфицировании, произошедшем в последние 2-3 месяца. Или же такое сочетание может быть признаком обострения хронического заболевания.
  • Таким образом, такие результаты при беременности не всегда говорят о первичном заражении.
  • Обнаружение изолированно антител класса IgG может быть признаком иммунитета к данной инфекции, хотя также это может указывать и на хроническую болезнь. При наличии хронической формы заболевания большую роль играет количество антител и их динамика. Такие исследования проводят с интервалом примерно в 2 недели.
  • Когда в крови присутствуют сразу антитела IgA и IgM, то это может говорить о первичном инфицировании. Обнаружение IgA изолированно тоже является последствием первичного поражение инфекцией организма.

При обнаружении антител IgA вместе с антителами IgG означает активацию хронической формы инфекции. Иммуноглобулины появляются в крови через 2 недели после обострения болезни.
Авидность антител является показателем прочности связи между антигеном и антителом, а также количество антигена, которое вступило в связь с антителами (иммуноглобулинами). Это дополнительный этап в диагностике методом ИФА.

Это очень важный показатель, поскольку с его помощью можно определить дату инфицирования человека, что очень важно при заражении на протяжении срока беременности. А также, можно оценить все риски внутриутробного инфицирования ребенка.

Тест на авидность проводится в лабораторных условиях путем обработки комплекса антитело-антиген мочевиною, что разрушает белок. При этом, соединения с низкой авидностью разрушаются, а соединения, имеющие высокую авидность остаются неповрежденными. Результаты теста на авидность выражаются в процентном соотношении. Высокая авидность антител свидетельствует о хронической форме болезни, либо же является признаком стойкого иммунитета.

Особенности появления антител в крови грудных детей

Если у детей в возрасте до года или до 1,5 лет в крови обнаружены материнские IgG, то это значит, что антитела проникли в организм ребенка через плаценту во время вынашивания плода. Этот признак не может свидетельствовать об инфицировании малыша, а является передавшемся от матери иммунитетом к инфекции.

Но, если в маленьком организме обнаружено иммуноглобулины класса IgM, которые из-за своего веса не могут проникнуть через плаценту к малышу, то это является признаком инфицирования. Заражение могло произойти уже после рождения или же в период внутриутробного развития.

Результат диагностики заболеваний методом ИФА представлен в определенных единицах измерения:

  1. ОП – оптическая плотность образца – это уровень концентрации антител в одной единице объема. Чем выше этот показатель, тем больше находится иммуноглобулинов в крови.
  2. Некоторые результаты ИФА подразумевают наличие такой единицы как коэффициент позитивности – КП. Это тоже обозначение плотности образца.
  3. Единицы концентрации иммуноглобулинов выражены в нанограммах, миллилитрах или же в нг/мл.
  4. Титры сывороток крови выражены так: 1:20, 1:40, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1200 и тому подобное.
  5. Титры, при которых происходит диагностирование заболевания для разных инфекций разные.
  6. В результатах исследования присутствуют такие символы : «-», «+»,«?» (+, ++, +++, ++++).
  7. Качественная же оценка подразумевает наличие только одного пункта из двух: положительно либо отрицательно.

Правильность интерпретации результатов данного исследования зависит от квалификации врача, поскольку кроме специалиста никто не имеет права назначать лечение.

Специалисты оценивают количество антител в крови, их вид и концентрацию.

Также, необходимо помнить о том, что нельзя сравнивать результаты разных методов исследования, либо же результаты тестов, полученные в разных лабораториях. Поскольку для любого метода диагностики существуют свои показатели и единицы измерения.

Сравнивание результатов допустимое только в пределах одной и той же лаборатории.

Видео метода иммуноферментного анализа ИФА

источник

Для проведения комплексной оценки состояния организма применяется ИФА-метод проведения диагностики. Иммуноферментный анализ крови предназначен для диагностирования инфекционных, гематологических, первичных и вторичных иммунодефицитов.

Читайте также:  Анализы у беременных содержание белка

Многие пациенты интересуются методом ИФА: что это, для чего проводится исследование. Иммуноферментный анализ начал использоваться сравнительно недавно. Изначально с его помощью изучались антигенные структуры, и он проводился только в научных целях. Затем ученые пришли к выводу, что при помощи ферментов можно выявить специфические антитела, возникающие в ответ на протекающее заболевание.

На сегодняшний день этот метод имеет широкую сферу применения. Современные лаборатории используют его для диагностирования:

  • опухолей;
  • гормональных нарушений;
  • инфекций;
  • хронических или перенесенных ранее инфекционных процессов;
  • гельминтов.

Если в организме протекает инфекционный процесс, то этот вид диагностики считается наиболее оптимальным для определения типа заболевания.

Метод ИФА — что это, какова суть этого вида исследования? Этот и многие другие вопросы интересуют пациентов. Основой этого способа диагностики считается связывание иммунных клеток организма с антигенами возбудителей инфекции. Получившийся комплекс определяют при помощи специального фермента.

Реакцию на наличие таких иммунных комплексов проводят в лабораторных условиях, применяя уже готовые соединения, чтобы определить, есть ли в крови подобные им.

Суть метода ИФА достаточно простая, однако из-за того, что анализ крови проводится для выявления многих инфекций и болезней, существует несколько его разновидностей. Каждый отличается схемой проведения и областью применения. Может быть прямой или непрямой ИФА. Прямой метод подразумевает под собой то, что применяются обездвиженные антитела, реагирующие с антигенами. Основным плюсом такого метода является то, что все процессы можно автоматизировать, а значит, диагностика занимает немного времени.

Непрямой метод подразумевает, что применяются антитела вторичного характера. А на твердой фазе обездвиживается антиген. Анализ позволяет определить антитела к различным антигенам. Это помогает достигнуть более точного результата, однако метод отличается сложностью.

Лабораторные исследования методом ИФА имеют множество преимуществ в сравнении с другими способами диагностики. К основным можно отнести такие:

  • высокая чувствительность;
  • стабильность при хранении ингредиентов;
  • скорость проведения диагностики;
  • можно применять небольшое количество исследуемого материала;
  • есть возможность автоматизации всех процессов;
  • можно выявить инфекцию на самых ранних стадиях.

Проведение исследования при помощи метода ИФА могут назначить при подозрении на множество болезней:

  • острые и хронические инфекции, венерические болезни;
  • наличие паразитов;
  • аутоиммунные патологии;
  • онкологические заболевания;
  • для определения уровня гормонов.

На наличие антител исследуется венозная кровь. Перед проведением анализа из нее выделяют элементы, которые могут осложнять исследование. Может проводиться забор и других биологических жидкостей.

Использование метода ИФА помогает определить наличие многих инфекций в организме, в частности и сифилиса. Для проведения исследования берется кровь из вены натощак. Затем осуществляется исследование, помогающее определить не только наличие болезни в организме, но и точные сроки ее начала, так как в течение болезни одни антитела заменяются другими в строго определенном порядке.

При острой фазе, свидетельствующей о продолжительном течении болезни, или при обострении хронической инфекции в крови будут обнаружены иммуноглобулины типа M. Наличие иммуноглобулинов типа A свидетельствует о том, что инфекция обитает в организме более 4 недель. Иммуноглобулины группы G говорят о разгаре болезни или о ранее проведенной терапии.

ИФА-метод применяется и для проведения анализа на ВИЧ-инфекции. Диагностика в таком случае имеет определенные особенности, которые связаны с протеканием и прогрессированием болезни. Этот метод исследования считается наиболее приемлемым для определения, однако проводить его нужно не ранее чем через месяц после воздействия факторов риска. Это связано с наличием инкубационного периода, протекающего от 45 дней и до 6 месяцев. Именно поэтому анализ нужно повторить через полгода.

Положительным результат считается, если при первичном исследовании были обнаружены антитела. В таком случае анализ повторяется через полгода, если снова результат положительный, то исследование проводится с применением высокоспецифичных тестовых систем.

Достаточно часто доктора назначают проведение иммуноферментного анализа для определения наличия паразитов в организме. При помощи такого метода исследования можно определить:

Несмотря на все преимущества, существуют также недостатки метода ИФА. Основным недостатком считается то, что при проведении исследования доктор должен заранее иметь предположение о заболевании.

При диагностике инфекционных болезней нет возможности случайно найти возбудителя и определить его иммуноферментные свойства. Тест только указывает на наличие антител в крови больного. Кроме того, это достаточно дорогостоящий анализ.

Результатом качественного ИФА будет либо наличие антител, либо их отсутствие в крови. Если проводится количественный анализ, то концентрация антител может выражаться или в цифровом значении, или в определенным количеством знаков +.

Кроме того, анализируются такие показатели, как:

Показатель IgM указывает на протекание острого инфекционного процесса в организме. Полное его отсутствие может говорить об отсутствии возбудителя болезни или переходе ее в хроническую стадию.

Сейчас существуют специальные тесты ИФА, которые можно провести самостоятельно.

источник

Иммунохимические методы анализа, основанные на специфическом связывании определяемого соединения соответствующими антителами, широко вошли в аналитическую практику и используются в различных областях медицины, сельского хозяйства, микробиологической и пищевой промышленности, для целей охраны окружающей среды. Индикация образующегося комплекса антиген-антитело может быть осуществлена, если в один из исходных компонентов реакционной системы ввести метку, которая легко детектируется соответствующим высокочувствительным физико-химическим методом. Весьма удобными для этой цели оказались изотопные, ферментные, флуоресцентные, парамагнитные и др. метки, использование которых дало возможность увеличить чувствительность классических иммунохимических методов анализа в миллионы раз, а время анлиза уменьшить до нескольких минут.

Исторически первым среди них был радиоиммунологический анализ (РИА), предложенный в конце 50-х годов прошлого века. Благодаря возможности определять метку, которой являлся изотоп 125 I , в очень малых концентрациях, удалось достигнуть высокой чувствительности анализа (на уровне пкг/мл). В середине 60-х годов для идентификации и локализации антигенов в гистохимических препаратах и выявления полос преципитации в иммунодиффузных и иммуноэлектрофоретических методах в качестве высокочувствительной метки было предложено использовать молекулы ферментов. Являясь по своей природе мощными химическими катализаторами, ферменты способны эффективно осуществлять наработку легко детектируемого продукта, что делает возможным определение ферментной метки в весьма малых концентрациях (до 10 -12 М и ниже). На протяжении последних трех десятилетий иммуноферментные методы анализа интенсивно развивались как в теоретическом, так и практическом плане и к настоящему времени они сформировались в самостоятельное научное направление, имеющее важное прикладное значение. Наибольшее распространение получили гетерогенные методы иммуноферментного анализа, основанные на использовании полистирольных планшетов для иммобилизации антител или антигенов, специфическом связывании определяемого вещества на стенках лунок планшета и последующем выявлении образовавшихся иммунокомплексов с помощью меченных ферментами компонентов.

Структура и свойства антигенов и антител. Генетически чужеродные вещества, попадая в организм высших животных и человека, способны вызывать в них ряд специфических процессов, направленных на их удаление из организма. Система организма, выполняющая эту функцию, называется иммунной системой, а сами процессы – иммунологическими. К важнейшим из них следует отнести образование специфических белков крови – антител (иммуноглобулинов). Вещества, способные вызывать специфические иммунологические реакции в организме, получили название антигенов. Способность антигенов вызывать иммунный ответ называется иммуногенностью, а способность образовывать комплексы с антителами – антигенностью. К антигенам относятся белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты как в очищенном виде, так и в виде компонентов различных биологических структур (клеток, тканей, вирусов и т.д.).

На поверхности молекулы сложного антигена можно выявить функциональные группы или остатки, обуславливающие антигенную специфичность, называемые антигенными детерминантами или эпитопами. Число эпитопов на поверхности сложной молекулы определяет валентность антигена. Понятие антигенная детерминанта включает в себя последовательность образующих ее химических функциональных групп и их пространственное расположение. В молекулах белков антигенная детерминанта образуется совокупностью аминокислотных остатков ( может варьировать от 5 до 20). Антигенные детериминанты белков бывают двух типов – секвенциальные, т.е. представляющие собой последовательность аминокислотных остатков в полипептидной цепи, и конформационные, образованные аминокислотными остатками из различных частей белковой глобулы. Во многих случаях единичная замена аминокислоты в структуре антигенной детерминанты или изменение конформации белковой глобулы являются достаточными для изменений антигенной специфичности макромолекулы. Если два антигена имеют только часть одинаковых антигенных детерминант, их называют перекрестно реагирующими антигенами.

Низкомолекулярные вещества, не способные сами вызывать образование антител, но приобретающие иммуногенные свойства после конъюгирования с высокомолекулярными носителями, например, бычьим сывороточным альбумином, называются гаптенами. К гаптенам относится широкий круг природных соединений: пептидные и стероидные гормоны, различные лекарственные препараты, антибиотики, витамины, олигосахариды и т.д.

Биологическая функция антител заключается в защите организма от проникновения чужеродных веществ путем образования прочных специфических иммунных комплексов с соответствующими антигенами и последующего удаления их из организма. Способность антител образовывать высокоспецифичные прочные иммунокомплексы с различными веществами и возможность получения антител в необходимых количествах являются основой иммунохимических методов анализа.

В организме антитела вырабатываются специфическими клетками крови — В-лимфоцитами, каждый из которых имеет на своей поверхности до 100 000 рецепторов одинаковой специфичности, способных узнавать любой чужеродный антиген. Антиген, встречаясь в кровотоке с комплементарным ему рецептором, проводит отбор (селекцию) соответствующего В-лимфоцита, который затем, трансформируясь в плазматическую клетку и многократно делясь, образует клон клеток. Каждый клон плазматических клеток секретирует гомогенные по своей структуре антитела. Однако так как антиген активирует в крови сразу большое количество типов В-лимфоцитов, которые содержат рецепторы различной степени специфичности по отношению к исходному антигену, такой иммунный ответ и антитела называются поликлональными. Сыворотку животного, содержащую специфические к данному антигену антитела, называют антисывороткой, при этом обычно указывают против какого антигена и каким животным она выработана (например, антисыворотка кролика против эритроцитов человека). Принципиально важным является то, что поликлональные антитела даже против одной-единственной антигенной детерминанты гетерогенны как по структуре активного центра, так и по физико-химическим свойствам. В том случае, если антиген поливалентен, например, белок, то в сыворотке крови образуются антитела, направленные против каждой индивидуальной антигенной детерминанты, что еще более усложняет состав антител.

В середине 70-х годов был разработан принципиально новый путь получения антител, основанный на слиянии (гибридизации) лимфоцитов иммунизированного животного с миеломными клетками с образованием новых клеток – гибридом. Особенностью таких клеток является их способность размножаться и продуцировать антитела в искусственных условиях вне организма. С помощью специальных методов клонирования можно выделить одну гибридную клетку, которая, размножаясь, будет секретировать в неограниченных количествах антитела только одного вида – моноклональные антитела, которые являются гомогенными как по специфичности, так и по физико-химическим свойствам.

Структура антител. Иммуноглобулины по своей химической структуре относятся к большому классу природных соединений – гликопротеидам, т.е. белкам, содержащим в своей структуре олигосахариды. Несмотря на огромное разнообразие антител и их гетерогенность, все они обладают некоторыми общими структурными элементами, обеспечивающими выполнение их основных функций.

По своим антигенным, эффекторным сфвойствам и структурным особенностям иммуноглобулины подразделяются на пять основных классов: IgA , IgD , IgE , IgG и IgM ( Ig обозначает иммуноглобулин).

Общей структурной единицей всех иммуноглобулинов является комплекс из четырех полипептидных цепей – двух идентичных между собой легких цепей с молекулярной массой 23 кД каждая ( L -цепи, от английского слова light — легкий) и тяжелых с молекулярной массой по 53000 (Н-цепи, от английского heavy — тяжелый). Каждая из легких цепей прочно соединена с NH 2-концевыми участками тяжелых цепей благодаря наличию межцепочечных дисульфидных связей и множеству слабых гидрофобных, электростатических и других межатомных взаимодействий. Аналогичные связи существуют и между свободными участками тяжелых цепей. В целом структура такого комплекса напоминает латинскую букву Y (или Т) и характерна для иммуноглобулинов классов IgG , IgD , и IgE (рис.1).

Рис.1. Пространственная структура молекулы IgG

При действии протеолитического фермента папаина молекула IgG распадается на три фрагмента, два из которых идентичны и сохраняют способность связывать антигены (так называемые Fab -фрагменты) и третий, способный к кристаллизации ( Fc -фрагмент), отвечающий за эффекторную функцию антител (Рис.2). Другой протеолитический фермент пепсин разрывает пептидную связь, расположенную ближе к СООН-концу цепи от S — S связи между Н-цепями в Fc -фрагменте. В результате образуются так называемый р Fc ’-фрагмент, представляющий остатки тяжелых цепей и соединенные дисульфидными связями два Fab -фрагмента, обозначаемые как F ( ab ’)2-фрагмент.

Рис.2. Схематическое изображение структуры молекулы IgG .

Антигенсвязывающий центр расположен в NH 2-концевых частях Н- и L -цепей. Таким образом каждая молекула IgG , а также F ( ab ’)2-фрагменты содержат по два одинаковых антигенсвязывающих центра, а Fab -фрагмент – один.

Молекулы антител имеют большое число S — S –связей, которые можно разделить на 3 категории – межцепочечные, внутрицепочечные и связи между Н-цепями отдельных четырехцепочечных комплексов, обусловливающих образование полимерных молекул – IgM и Ig А. Структура иммуноглобулинов различных классов обусловлена числом и расположение S — S связей в молекулах, а также количеством четырехцепочечных элементов. Ig М присутствует в сыворотке в виде пентамера четырехцепочечных комплексов, соединенных S — S связями между Н-цепями. Некоторое количество Ig А сыворотки также присутствует в виде димерной и тетрамерной формы (Рис. 3).

Рис.3. Схематическое изображение структуры молекул иммуноглобулинов различных классов

Легкие цепи иммуноглобулинов бывают только двух типов — l или c , и являются общими для всех пяти классов, в то время как тяжелые цепи обладают структурными, иммунологическими и химическими особенностями, характерными для каждого класса иммуноглобулинов. При исследовании аминокислотной последовательности было обнаружено, что все легкие и тяжелые цепи имеют одну принципиальную структурную особенность: они состоят из двух частей – вариабельной ( V ) и константной (С) (Рис.4).

Рис.4. Схематическое изображение расположения константых и вариабельных участков в молекуле IgG .

Постоянная или константная часть легких цепей (С L ) включает 107 аминокислотных остатков СООН-концевого участка, константная часть тяжелой цепи приблизительно в три раза (или в четыре в случае IgM и IgA ) длиннее вариабельной. Оставшиеся последовательности аминокислотных остатков в NH 2-концевой половине легких и тяжелых цепей образует так называемые вариабельные области ( VC и VH ). В каждой из легких цепей молекул антител существуют две внутрицепочечные дисульфидные связи, число такх связей в тяжелых цепях различно (4-6). Каждый из внутрицепочченых дисульфидных мостиков образует петлю из 55-70 аминокислотных остатков.

Читайте также:  Анализы на белки жиры углеводы

По данным рентгеноструктурного анализа, участки пептидных цепей вблизи петли образуют глобулярную структуру, в которую включается около 110 аминокислотных остатков (Рис.5). Такие глобулы в структуре молекул антител получили название доменов. NH 2— концевой домен тяжелой цепи обозначают как VH , а три последующих в константной области тяжелой цепи – как С H 1, С H 2 и С H 3 (для легкой цепи, соответственно VL и CL ).

Рис.5. Схематическое изображение локализации доменных участков в легкой и тяжелых цепях иммуноглобулинов.

Связывание антигена происходит в доступной растворителю щели активного центра, образованной вариабельными доменами в NH 2-концевой части легкой и тяжелой цепей. Способность связывать антигены с той же эффективностью, что и нативные молекулы антител, обладают Fab и F ( ab ’)2-фрагменты иммуноглобулинов. Основным принципом организации антигенсвязывающих центров иммуноглобулинов является полицентровая структура. Малые антигенные детерминанты связываются на ограниченном участке активного центра, комплементарном данной детерминанте. Большие детерминанты могут занимать практически всю область связывания.

Физико-химические закономерности взаимодействия антиген-антитело. Антитела, образуемые в ответ на введение в организм антигенов, специфически взаимодействуют с этими антигенами. В основе первичного взаимодействия лежат общие принципы любой бимолекулярной реакции. Так как в данном случае продуктом реакции является комплекс антиген-антитело, иммунная реакция является обратимой и описывается теми же кинетическими и термодинамическими параметрами, что и любой процесс комплексообразования.

Степень соответствия между антигенной детерминантой и антигенсвязывающей областью активного центра антитела (иммунологическая специфичность) определяется химической и пространственной комплементарностью, которая обусловлена, с одной стороны, взаимодействием электронных облаков реагирующих химических групп, с другой – стерическими силами отталкивания. С количественной стороны специфичность взаимодействия антиген-антитело характеризуется через аффинность антител или равновесную константу образования иммунокомплексаа, размерность л/моль) или его распада (Кд = 1/ Ka , размерность моль/л).

k -1

Обычный диапазон изменения аффинности антител (Ка) составляет 10 5 – 10 11 М -1 . максимальные значения констант связывания характерны для антигенов, обладающих ярко выраженными гидрофобными свойствами или же взаимодействующих с активным центром антитела достаточно большой областью молекулы. Так как молекула антитела имеет два и более антигенсвязывающих центров, и кроме того, способна взаимодействовать с несколькими антигенными детерминантами молекулы антигена, реально существующий процесс взаимодействия поливалентного антитела с поливалентным антигеном является более сложным и характеризуется функциональной аффинностью или авидностью. С количественной точки зрения бивалентные взаимодействия являются почти на три порядка более прочными, чем моновалентные.

Трудность определения аффинности (или константы связывания антител) обусловлены следующими причинами: гетерогенностью антител по физико-химическим свойствам, в том числе, сродству к антигену, сложностью определения общего количества специфических антител, возможностью образования комплексов сложного состава в случае поливалентных антигенов. Однако для практических целей, в частности для целей использования в иммуноферментном анализе, достаточно знать эффективные значения, характеризующие суммарные свойства используемых антител. Для моноклональных антител определяемые значения констант аффинности носят истинные значения.

Все методы, позволяющие определять концентрации свободного и связанного антигена, можно условно разбить на две большие группы. К первой относятся методы, в которых стадия разделения свободного и связанного антигена осуществляется путем избирательного осаждения, аффинного связывания (иммобилизации) или гель-фильтрации. Для низкомолекулярных антигенов (гаптенов) используется равновесный диализ. Вторая группа включает методы, базирующиеся на изменении физико-химических свойств антигенов (или меток, связанных с антигеном) при комплексообразовании с антителами: тушении или усилении флуоресценции, изменении степени флуоресценции, ингибировании ферментативной активности.

Для количественного способа расчета констант комплексообразования реакции антиген-антитело наиболее распространенными являются способы, основанные на измерении равновесных концентраций комплекса при постоянной концентрации одного из реагентов и варьировании концентрации второго. В координатах Скэтчарда [АгАт]/[Аг] от [АгАт] (или B / F от B , В – bound , F – free ) получаем прямую линию, тангенс угла наклона которой равен величине –Ка, а отрезок, отсекаемый на оси абсцисс- постоянную концентрацию одного из реагентов.

Образование комплекса антиген-антитело является обратимым процессом, т.е. равновесная константа связывания (аффинности) данного комплекса определяется отношением константы скорости ассоциации k 1 к константе скорости диссоциации комплекса k -1. Значения константы скорости реакции ассоциации для большинства антигенов велики и приближаются к диффузионно контролируемому пределу до (10 8 М -1 с -1 ). В случае белковых антигенов их значения приблизительно на два порядка меньше и варьируют от 10 5 до 5 . 10 6 М -1 с -1 . Наблюдаемые различия в аффинности антител обусловлены в основном, различиями в значениях константы скорости диссоциации (10 -3 – 10 -7 с -1 ).

Для экспериментального определения константы скорости ассоциации можно воспользоваться одним из следующих подходов: изучение начальных скоростей реакции при известных начальных концентрациях каждого из реагентов, изучение зависимости скорости образования продукта (комплекса) при избытке одного из реагентов и варьировании концентрации второго. Определение константы скорости диссоциации комплекса продят путем прямого измерения скорости процесса диссоциации комплекса в условиях его необратимости. Для этого используют один из следующих подходов.

1. После установления равновесия в системе проводят разбавление большим избытком буфера. При этих условиях ( V дисс >> V асс) процесс диссоциации комплекса будет описываться экспоненциальной кривой, спрямление которой позволяет определить численное значение k -1.

2. В систему вводят вещества, способные быстро и полностью связывать или удалять свободный лиганд. Если скорость удаления свободного лиганда существенно больше скорости диссоциации комплекса, то наблюдаемая скорость распада комплекса описывается реакцией первого порядка и характеризуется константой k -1.

3. После установления равновесия в системе антитела-меченый антиген в нее водят избыток свободного немеченного антигена. В этих условиях процесс изменения концентрации комплекса меченый антиген-антитело описывается кинетикой первого порядка, константа скорости которого соответствует k -1.

Ферменты как метки в иммуноанализе. Принципиальная возможность применения ферментов в качестве меток в иммуноферментном анализе обусловлена чрезвычайно высокой чувствительностью регистрации ферментов в растворе. Известны усилительные системы, позволяющие регистрировать наличие всего нескольких сотен молекул ферментов в 1 мл раствора. Основными требованиями к молекулам ферментов для возможности их использования в качестве меток являются следующие: высокая удельная каталитическая активность, доступность, возможность получения фермента в высоко очищенном состоянии, сохранение каталитической активности после химической модификации при получении конъюгатов фермент-антитело (антиген), стабильность, простота и чувствительность метода определения концентрации (активности) фермента.

Наибольшее распространение в настоящее время среди ферментов получили пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза. Для фотометрической регистрации активности пероксидазы предпочтительным в настоящее время является использование субстрата тетраметилбензидина. После остановки ферментативной реакции серной кислотой измеряют оптическую плотность раствора при длине волны 450 нм.

Методы иммуноферментного анализа. Первичным процессом в иммуноферментном (или иммунохимическом) анализе является стадия «узнавания» анализируемого соединения специфическим к нему антителом. Так как процесс образования иммунохимических комплексов происходит в строго количественном соотношении, обусловленном аффинностью, концентрациями компонентов и условиями реакции, то достаточным для определения исходной концентрации анализируемого соединения является количественная оценка образовавшихся иммунных комплексов. Для такой оценки возможно либо прямое определение концентрации образующихся иммунокомплексов (тип 1), либо количественная оценка оставшихся свободными мест специфического связывания (тип 2). Второй общей стадией любого метода иммуноферментного анализа является формирование связи меченного ферментом соединения со специфическим комплексом или свободными центрами связывания. И наконец, заключительным обязательным процессом в иммуноферментном анализе является трансформация ферментной метки в соответствующий сигнал, измеряемый каким-либо физико-химическим методом (спектрофотометрическим, флуориметрическим, люминесцентным и т.д.), что достигается путем измерения скорости превращения субстрата или количества продукта, образующегося за фиксированный промежуток времени.

Принимая во внимание вышеописанные подходы для определения специфических комплексов, дальнейшую классификацию методов иммуноферментного анализа, можно осуществить по типу реагентов, используемых на первой стадии анализа. Если на первой стадии в системе присутствуют только анализируемоле соединение и соответствующие ему центры связывания (антиген и специфические анатитела), то метод является неконкурентным. Для неконкурентного анализа типа 1 оптимальным является соотношение компонентов, при котором концентрация центров связывания значительно превышает концентрацию определяемого соединения. Необходимым условием для неконкурентного анализа типа 2 является соблюдение соотношения избытка или сравнимой концентрации определяемого соединения (антигена) и мест специфического связывания, так как в этом случае определяется разность общего числа мест связывания и числа образовавшихся иммунных комплексов. Если на первой стадии анализа в системе одновременно присутствуют анализируемое соединение и его аналог (меченное ферментом анализируемое соединение или анализируемое соединение, иммобилизованное на твердой фазе), конкурирующие за имеющиеся в относительном недостатке центры специфического связывания, то метод является конкурентным. Необходимым условием конкурентного метода является недостаток центров специфического связывания по отношению к суммарной концентрации анализируемого соединения и его аналога.

Следующим принципом классификации методов иммуноферментного анализа является их разделение по типу проводимых на каждой из иммунохимических стадий реакций. В соответствии с этим все методы можно разделить на две группы – гомогенные и гетерогенные.

Гетерогенные методы иммуноферментного анализа. Гетерогенный иммуноферментный анализ объединяет методы, в которых анализ проводится в двухфазной системе, при этом разделение на фазы может происходить на любой стадии определения. В целях удобства классификации целесообразно проводить разделение гетерогенных методов по характеру проведения первой стадии «узнавания», которая является определяющей для всего анализа. Если на первой стадии антиген или антитело используют в иммобилизованном состоянии и формирование специфического иммунокомплекса проходит на твердой фазе, то метод относится к твердофазным (англ. solid phase assay ). Если же на первой стадии анализа образование специфических иммунных комплексов происходит в растворе, а лишь затем для целей разделения используют твердую фазу с иммобилизованным реагентом, то такие методы целесообразно классифицировать как гомогенно-гетерогенные.

Многообразие методов гетерогенного иммуноферментного анализа, относящихся к типам 1 и 2, обусловлено возможностью введения ферментной метки как в молекулу антигена, так и молекулу антитела. Кроме того, для конкретной схемы анализа определяющим является, какой из реагентов – антитело или антиген, использован в иммобилизованном виде для разделения иммунохимических комплексов от несвязавшихся компонентов.

В качестве примера гетерогенного неконкурентного метода проведения иммуноферментного анализа приведем одну из самых распространенных схем иммуноферментного анализа белков (поливалентных антиегенов), основанную на использовании пары антител различной антигенной специфичности, одно из которых иммобилизовано на поверхности твердого носителя, а второе конъюгировано с ферментной меткой (например, пероксидазой хрена). Анализ проводят следующим образом. В лунки полистирольного планшета с сорбированными антителами вносят анализируемый образец, инкубируют в течение 1 часа, при этом анализируемый антиген образует вступает в реакцию с антителами и образует иммунокомплекс на поверхности лунок. Планшет отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют меченные ферментом антитела. После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата антител с ферментом определяют ферментативную активность носителя, которая пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена. На стадии выявления специфического иммунокомплекса антиген оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизованных и меченых антител, что послужило поводом для широкого распространения в литературе названия «сэндвич»-метод (англ. sandwich ). Часто в литературе встречается и другое название двухцентровой метод (англ. two — site assay ). Схема может быть использована для анализа только тех антигенов, на поверхности которых существуют, по крайней мере две расположенные далеко друг от друга антигенные детерминанты, а для определения большого числа моновалентных антигенов (например, низкомолекулярные гормоны, лекарственные соединения, пестициды) метод неприемлем.

Конкурентный твердофазный анализ низкомолекулярных антигенов может быть реализован по следующей схеме. К иммобилизованным на носителе антителам добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген и фиксированную концентрацию конъюгата антигена с ферментом. После проведения инкубации носитель отмывают от несвязавшихся свободного и меченого антигена и регистрируют ферментативную активность на носителе, которая обратно пропорциональна концентрации определяемого антигена.

Конкурентные твенрдофазные методы обладают меньшей чувствительностью по сравнению с неконкурентными. Предел обнаружения различных соединений для них ограничен как чувствительностью регистрации ферментной метки, так и аффинностью антител, в то время, как для неконкурентных методов, при отсутствии неспецифических взаимодействий, — только чувствительностью определения фермента. Поэтому для достижения высокой чувствительности анализа конкурентным методом необходимо использовать высокоаффинные антитела.

Гомогенные методы иммуноферментного анализа. К гомогенным относятся методы, осуществляемые в однофазной системе, и не требующие стадии механического разделения образовавшихся комплексов. Во всех схемах проведения гомогенного иммуноферментного анализа регистрируется концентрация не образующегося специфического комплекса антитело-антиген, а оставшихся свободными центров специфического связывания. Однако, в противоположность гетерогенным схемам, наблюдаемая ферментативная активность, соответствующая концентрации незанятых мест специфического связывания, может как уменьшаться, так и увеличиваться, что обусловлено различной природой воздействия связывания лигандов на ферментнативную активность. Введение метки в молекулу антигена является одним из наиболее распространенных подходов в гомогенных методах иммуноферментного анализа. Все гомогенные методы относятся к конкурентным и основаны на одновременном взаимодействии с антителами анализируемого и меченого антигенов. После образования в растворе соответствующего иммунохимического комплекса проводят измерение ферментативной активности, которая пропорциональна концентрации свободного или связанного меченого лиганда.

Одним из распространенных методов является EMIT -анализ ( enzyme multiplied immunoassay technique ), основанный на изменении активности ферментной метки в конъюгате фермент-антиген при образовании комплекса с антителами, происходящем в результате конформационных перестроек в молекуле фермента или стерическом исключении доступности молекулы субстрата к активному центру фермента при комплексообразовании конъюгата с антителами. Достоинствами гомогенных методов является значительное сокращение времени проведения анализа (несколько минут), недостатками – меньшая чувствительность и возможность влияния состава анализируемого образца на результаты анализа.

Перспективными направлениями дальнейшего развития иммуноферментного анализа является создание экспресс-методов, основанных на использованием мембранных и иммунохроматографических систем, проточно-инжекционных методов, кинетического анализа, иммунобиосенсорных устройств, позволяющих проводить экспресс-анализ, в том числе одновременное определение нескольких антигенов в одном образце, в реальном времени.

1. А.М.Егоров, А.П.Осипов и др. Теория и практика иммуноферментного анализа, М., Высш.шк., 1991

источник