Определение первичной структуры белка гидролиз аминокислотный анализ

Можно выделить следующие этапы выяснения первичной структуры белков и пептидов:

1. Выделение белка в чистом виде и определение его молекулярной массы

2. Определение аминокислотного состава

3. Определение N-концевой аминокислоты

4. Определение С-концевой аминокислоты

5. Определение аминокислотной последовательности

Выделение белка в чистом виде. Как правило, исходный материал содержит много различных белков. В связи с этим возникает проблема выделения из этой смеси интересующего белка в чистом виде. При очистке белков используются методы, которые основаны на разнице:

1.Поверхностного заряда белков

2.Молекулярного размера белков (зависящего от их молекулярной массы)

3.Биологической активности вследствие связывания с субстратами или ингибиторами

Разделение белков по разнице величины поверхностного заряда. Суммарный поверхностный электрический заряд белка при данном значении рН может быть отрицательным, нейтральным или положительным. Для разделения белков с различным зарядом, подобно тому, как это было в случае аминокислот, может быть использован метод ионообменной хроматографии (см. выше). Концентрацию белка в пробирках с элюатом определяют с помощью спектрофотометра по интенсивности поглощения ультрафиолетового света и строят графическую зависимость её от объема вытекшей из хроматографической колонки жидкости.

Разделение белков по молекулярной массе. Если представить молекулы белков в виде шариков различной величины, размер которых зависит от их молекулярной массы, то окажется, что у больших шариков будет большей молекулярная масса или размер молекул. Это означает, что белки можно разделить подобно частичкам в сите — молекулярном сите, образованном гелем. Такой способ часто называют гель-фильтрацией или хроматографией исключения размером. Ниже приводится иллюстрация того, как с помощью гель-фильтрации удается разделить смесь белков различного размера (рис.1.12).

Хроматографическую колонку заполняют набухшим гелем. Частицы геля приготовлены из связанного поперечными сшивками полисахаридного материала и содержат большое количество микропор. Размер микропор подбирают таким образом, чтобы в них проникали меньшие из разделяемых молекул, в то время как большие этого сделать не могли. Смесь разделяемых белков наносят на верхнюю часть колонки и элюируют буферным раствором. Увлекаемые током нисходящей жидкости большие молекулы, не имея возможности проникнуть в поры гелевых частиц, будут двигаться быстрее. Меньшие молекулы проникают в поры и задерживаются там. Если собирать вытекающий из колонки раствор равными порциями в пробирки, то окажется, что в более ранних порциях вытекающей жидкости будут содержаться белки больших размеров, а в более поздних — меньших размеров. Путем подбора размера пор можно добиться разделения самых разных смесей белков.

Рис.1.12. Схематическое изображение разделения белков методом гель-фильтрации

Если учесть, что размер молекулы зависит от молекулярной массы, то оказывается, что разделяя белки методом гель-фильтрации, одновременно можно установить его молекулярную массу.

Рис.1.13. График зависимости молекулярной массы белков от объема выхода их из хроматографической колонки в ходе гель-фильтрации

Объем вытекающего из колонки элюата обратнопропорционален логарифму молекулярной массы белка. Таким образом, достаточно знать объем жидкости, в котором вышел из колонки интересующий белок, чтобы, пользуясь подобным графиком, можно было установить его молекулярную массу (рис.1.13).

Ещё одним методом, который позволяет разделить белки в зависимости от их молекулярной массы, является гель-электрофорез (см. выше).

Ультрацентрифугирование. Если встряхнуть сосуд, заполненный песком с водой, а затем поставить его на ровную поверхность, то песок быстро осядет на дно благодаря силе земного притяжения. С высокомолекулярными веществами, находящимися в растворе, этого не произойдет, так как тепловое (броуновское) движение сохраняет их равномерное распределение в растворе. Оседание макромолекул, подобно песчинкам, произойдет, только если их подвергнуть значительному ускорению.

В 1923 году шведский биохимик Т. Сведберг впервые использовал ультрацентрифугирование. При скорости вращения ротора 80000 об/мин ему удалось показать, что многие белки состоят из субъединиц. Позже ультрацентрифугирование стало незаменимым методом для разделения белков, нуклеиновых кислот и субклеточных частиц.

Рис.1.14. Схематическое изображение зонального ультрацентрифугирования.

Образец наслаивают на градиент сахарозы (слева). После центрифугирования (середина) каждая частица осаждается на уровне, зависящем от его массы. После остановки ротора центрифужную пробирку прокалывают и разделенные частицы (зоны) собирают в пробирки (справа).

Осаждение проводят в растворе химически инертного вещества (сахарозы или CsCl), концентрация которого и, следовательно, плотность увеличивается в направлении от поверхности до дна центрифужной пробирки. Использование таких градиентов плотности значительно усиливает разрешающую способность ультрацентрифуги. Различают зональное препаративное ультрацентрифугирование (рис.1.14) и ультрацентрифугирование в равновесном градиенте плотности (изократное ультрацентрифугирование) (рис.1.15).

Разделение белков по разнице биологической активности вследствие связывания с лигандами. Характерной особенностью белков является их способность прочно связываться с различными молекулами, но нековалентными связями. На этом основан метод разделения белков аффинной хроматографией (рис.1.16).

Рис.1.16. Схематическое изображение принципа иммуноаффинной хроматографии

Антиген — лиганд для выделяемого белка. Антитело — выделяемый белок.

Молекулы веществ, с которыми специфически связываются определенные белки, ковалентно соединяют с частицами инертного матрикса. Тогда они выполняют роль своеобразных «рыболовных крючков», задерживающих необходимый белок. Все остальные белки транзитом проходят через колонку. Задержанный белок затем можно вымыть из колонки с помощью буферного раствора, содержащего в свободном состоянии такие же молекулы, которые выполняли роль «рыболовных крючков», или с помощью какого-нибудь другого реактива, способного нарушить это взаимодействие. Одним из вариантов этого метода является иммуноаффинная хроматография. Тогда антитела к определенному белку присоединяют к частицам сорбента. Они обеспечивают с очень высокой специфичностью задержку в колонке этого белка (рис.1.16).

Определение аминокислотного состава белка.До определения аминокислотной последовательности выделенного белка желательно иметь представление о его аминокислотном составе, то есть знать, какие аминокислоты и в каком количестве входят в состав его молекулы. Для этого проводят полный гидролиз белка с последующим количественным анализом высвободившихся аминокислот. Чаще используют кислотный гидролиз. Полипептид растворяют в 6N НCl в отсутствие кислорода, чтобы предотвратить окисление серусодержащих аминокислот. Смесь нагревают до 100-120 0 С и выдерживают при этой температуре в течение 10-100ч. К сожалению при этом способе гидролиза некоторые аминокислоты (Сер, Три, Тир, Глн, Асн) разрушаются.

Аминокислотный состав полипептидного гидролизата определяют с помощью автоматического аминокислотного анализатора. Прибор разделяет аминокислоты посредством ионообменной хроматографии (см. выше). Их идентифицируют по элюционному объему и количественно учитывают по интенсивности флюоресценции после проведения реакции с дансилхлоридом. Современные аминокислотные анализаторы проводят анализ гидролизата белка в течение 1ч с чувствительностью, которая позволяет определить до 1 пикомоля аминокислоты.

Определение N-концевой аминокислоты.Имеется несколько эффективных подходов, с помощью которых можно идентифицировать N-концевую аминокислоту. 1-Диметиламинонафталин-5-сульфонилхлорид (дансил хлорид) взаимодействует с первичными аминами с образованием дансилированного полипептида. Последующее проведение кислотного гидролиза позволяет высвободить из полипептидной цепи N-концевую аминокислоту в виде дансил-аминокислоты, обладающей интенсивной желтой флюоресценцией (рис.1.17).

Рис.1.17. Этапы определения N-концевой аминокислоты методом дансилирования

Благодаря этому дансил-производное аминокислоты можно идентифицировать хроматографически.

Ещё более популярным методом идентификации N-концевой аминокислоты является разрушение по Эдману (Pehr Edman — автор метода). Фенилизотиоцианат (ФИТЦ, реактив Эдмана) взаимодействует с N-концевой аминогруппой белков в слабо щелочной среде (рис.1.18). В результате образуется фенилтиокарбамильный продукт. Его обрабатывают безводной сильной кислотой, такой как трифторуксусная кислота. При этом тиазолиновое производное N-концевой аминокислоты отщепляется, в то время как остальные пептидные связи не подвергаются гидролизу. Тем самым разрушение по Эдману заключается в отщеплении остатка только N-концевой аминокислоты и сохранении оставшейся части полипептидной цепи.

Тиазолиновое производное аминокислоты избирательно экстрагируют органическим растворителем и превращают в более стабильное фенилтиогидантоиновое производное. Последнее можно идентифицировать сравнением с известными стандартами при проведении тонкослойной хроматографии, электрофореза, высокоэффективной жидкостной хроматографии или газо-жидкостной хроматографии.Наиболее важным преимуществом расщепления по Эдману по сравнению с другими методами определения N-концевой аминокислоты является то, что, проводя повторно с одним и тем же пептидом эту процедуру, каждый раз можно идентифицировать новую N-концевую фенилгидантоин-аминокислоту, выясняя таким образом аминокислотную последовательность.

Идентификация С-концевой аминокислоты. Один из подходов заключается в использовании ферментов — карбоксипептидаз (катализирует отщепление от пептида С-концевой аминокислоты). Карбоксипептидазы, подобно другим ферментам, обладают субстратной специфичностью, то есть они катализируют отщепление определенных аминокислот. Вместе с тем, наличие рядом с С-концевой аминокислотой остатка Про делает невозможной её отщепление под влиянием карбоксипептидазы. В этом случае наиболее надежным считается метод гидразинолиза. Полипептид обрабатывают безводным гидразином при температуре 90 0 С в течение 20-100ч в присутствии ионообменного сорбента (в качестве катализатора). При этом разрушаются все пептидные связи, а из высвобождающихся аминокислот образуются гидразиды. Но С-концевая аминокислота высвобождается как свободная и поэтому её можно идентифицировать хроматографически.

Определение аминокислотной последовательности. Установление концевых аминокислот в исследуемом пептиде позволяет в дальнейшем определить всю его аминокислотную последовательность. Для этого обычно проводят повторное разрушение по Эдману (см. выше) в автоматическом приборе — секвенаторе, который был предложен П. Эдманом и Г. Бэгом. Современный такой прибор определяет 1 аминокислотный остаток в час. Таким способом можно установить последовательность расположения 40-60 остатков аминокислот. Затем накапливаются незавершенные реакции, продукты побочных реакций. Наряду с потерей самого пептида они делают малоинформативной и ненадежной дальнейшую идентификацию аминокислот. Чтобы установить последовательность их расположения в больших полипептидных молекулах, их подвергают расщеплению ферментативным или химическим путем на фрагменты с размерами, достаточными для проведения секвенирования (рис.1.19).

Рис.1.19. Аминокислотную последовательность полипептидной цепи определяют, совмещая перекрывающиеся последовательности фрагментов пептида. В данном случае после расщепления исследуемого пептида трипсином (катализирует разрыв пептидных связей, в образовании которых участвует карбоксильные группы Арг и Лиз), а в другом случае — бромцианом (CNBr) (катализирует разрыв пептидных связей, в образовании которых участвует Мет) были получены два набора пептидных фрагментов. Порядок связывания первых двух фрагментов, образовавшихся в результате действия трипсина, устанавливается на основании того наблюдения, что фрагмент Гли-Ала-Лиз-Лей-Про-Мет (результат расщепления CNBr) имеет последовательность аминокислот на N и С — концах, включающую N и С — концы двух трипсиновых фрагментов. Иными словами, обнаружение накладывающихся участков позволяет установить последовательность расположения пептидных фрагментов, то есть аминокислотную последовательность всего исследуемого пептида.

Исследование последовательности нуклеотидов ДНК — рутинная операция в молекулярной биологии.Этот метод в последнее время вытеснил другие методы исследования первичной структуры белков. Зная последовательность нуклеотидов, можно легко установить последовательность аминокислот (более подробное описание этого метода см. в главе 13).

Метод пептидных карт.Процесс определения аминокислотной последовательности в белке — процедура достаточно длительная. Её можно существенно ускорить в случае выяснения аминокислотной последовательности гомологичного белка[2], если у сравниваемого белка она уже известна. Метод носит название «метод пептидных карт» или «метод отпечатков пальцев». Он включает в себя сочетание хроматографии и электрофореза на бумаге продуктов неполного гидролиза сравниваемых белков. При этом пептидные фрагменты, отличающиеся аминокислотной последовательностью, будут обладать разной подвижностью по сравнению с таковыми у исходного белка (рис.1.21).

Рис.1.21. Сравнение «отпечатков пальцев» (окраска нингидрином) продуктов расщепления трипсином (а) гемоглобина А и (б) гемоглобина S. Пептиды, отличающиеся по подвижности, обведены квадратом. Они включают в себя 98 аминокислот, расположенных на N-конце b-субъединицы гемоглобина. Различие заключается в замене 6-ой аминокислоты (Глю) в составе Hb A на Вал в составе Hb S.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник

ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ

Все белки различаются по своей первичной структуре. Установление первичной структуры белка служит основой для определения вторичной и третичной структур, выяснения расположения функциональных групп в его активном центре и открывает путь к познанию механизма его функционирования.

Первичную структуру белков можно определять путем непосредственного анализа аминокислотной последовательности или путем расшифровки нуклеотидной последовательности соответствующих генов с помощью генетического кода.

При записи последовательности аминокислот в полипептидных цепях используется однобуквенное или трехбуквенное сокращение и предполагается, что a -аминогруппа находится слева, а a -карбоксильная группа — справа от символа, т. е. полипептидная цепь начинается с остатка, имеющего свободную a -аминогруппу, и заканчивается остатком, имеющим свободную карбоксильную группу. Аминокислотные остатки—называются соответственно N-концевым и С-концевым остатком.

В качестве примера использования сокращенной символики и для демонстрации ее преимуществ приведены структуры гормона вазопрессина, который производится гипофизом и регулирует кровяное давление, сужая капилляры и усиливая ресорбцию воды в почках.

Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH₂ или C YFQNCPR G-NH₂

Рис. 1. Молекула вазопрессина:

а)—записанная с помощью трехбуквенной символики; б)— записанная с помощью однобуквенной символики. Линия, соединяющая символы остатков цистеина в формуле, означает наличие между ними дисульфидного мостика; С-концевая карбоксильная группа аминокислоты амидирована

Исследование первичной структуры белка начинается с определения его молекулярной массы, аминокислотного состава, N — и С-концевых аминокислотных остатков. Поскольку пока не существует метода, позволяющего установить полную первичную структуру белка на целой молекуле, полипептидную цепь подвергают специфичному расщеплению химическими реагентами или протеолитическими ферментами. Смесь образовавшихся пептидных фрагментов разделяют, и для каждого из них определяют аминокислотный состав и аминокислотную последовательность. После того как структура всех фрагментов установлена, необходимо выяснить порядок их расположения в исходной полипептидной цепи. Для этого белок подвергают расщеплению при помощи другого агента и получают второй, отличный от первого набор пептидных фрагментов, которые разделяют и анализируют аналогичным образом.

Предположим, что исследуемый модельный полипептид имеет последовательность представленную на рис.2. При действии на него трипсином гидролизуются связи: Lys — Val и Arg — Ser , а при обработке бромцианом ( BrCN ) расщепляются связи: Met — Tyr и Met — Ala .

Полная аминокислотная последовательность модельного полипептида

Сопоставление аминокислотных последовательностей бромциановых и триптических пептидов позволяет однозначно выяснить их расположение вдоль полипептидной цепи белка. Обычно для определения полной структуры белка двух гидролизатов оказывается недостаточно, причем чем длиннее полипептидная цепь белковой молекулы, тем большее число различных типов расщеплений белка приходится использовать.

На завершающей стадии исследования первичной структуры белка проводится определение положения дисульфидных мостиков, если таковые имеются. Образование дисульфидных мостиков происходит при окислении двух остатков цистеина в составе уже сформированных пептидных цепей. В результате из двух остатков цистеина образуется остаток диаминодикарбоновой кислоты цистина:

При этом возникает сшивка либо внутри одной полипептидной цепи, либо между двумя различными цепями. В качестве примера небольшого белка, имеющего две полипептидные цепи (А- и В-цепь), скрепленные дисульфидными мостиками, а также сшивки внутри отдельных цепей, можно привести молекулу инсулина (рис. 3) — гормона, вырабатываемого поджелудочной железой и ответственного за усвоение углеводов, в первую очередь глюкозы. Нарушения в синтезе инсулина вызывают тяжелое и, к сожалению, весьма распространенное заболевание—сахарный диабет, при развитых формах которого необходимо ежедневно вводить в организм этот гормон.

FYNQHLC GSHLVEALY L V C GERGFFYTPKA ( В — цепь )

Рис. 3. Схема строения молекулы инсулина человека в однобуквенной символике.

Скобкой обозначен внутрицепочечный, а вертикальными линиями — межцепочечные дисульфидные связи

Развитие методов анализа последовательности ДНК сделало возможным на основе генетического кода выводить соответствующие аминокислотные последовательности, исходя из установленных нуклеотидных. При реализации такого подхода следует, однако, иметь в виду целый ряд ограничений и возможные источники ошибок. Во-первых, выведенная из нуклеотидной аминокислотная последовательность может не соответствовать реальной, вследствие процессинга, который часто происходит как на уровне информационной РНК, так и при превращении белка-предшественника в конечный белок. Во-вторых, лишь одна ошибка в определении последовательности ДНК (пропуск или вставка) приводит к выведению совершенно неправильной аминокислотной последовательности белка. Таким образом, установление первичной структуры ДНК не всегда может заменить непосредственное исследование аминокислотной последовательности кодируемого ею белка. В то же время параллельное изучение первичных структур белка и ДНК чрезвычайно эффективно. Установление нуклеотидной последовательности дает возможность расположить изученные пептидные фрагменты в непрерывную полипептидную цепь, позволяя решать, таким образом, наиболее сложную задачу структурного анализа белка. С другой стороны, данные по аминокислотной последовательности пептидов упрощают и уточняют анализ нуклеотидной последовательности.

В последние годы анализ первичной структуры белков на основе исследования нуклеотидной последовательности соответствующих генов принимает все большие масштабы. Первоначально такие исследования касались белков прокариотических организмов, в основном E . coli , генетика которых хорошо изучена, и получение структурных генов не представляло большого труда. По мере развития методов генетической инженерии появилась возможность выделять также структурные гены белков эукариот.

Во многих ведущих лабораториях мира созданы так называемые «банки» или «библиотеки» генов многих высших животных и человека. В этих банках гены разнообразных белков хранятся в составе специальных векторов — плазмид или фагов. Для выделения соответствующего гена из банка используются гибридизационные зонда — небольшие нуклеотидные фрагменты, синтезированные на основе установленной аминокислотной последовательности пептидов исследуемого белка. Из-за «вырожденности» генетического кода могут использоваться не любые последовательности.. Подходящими являются пептиды, содержащие в своем составе аминокислоты, представленные одним или двумя кодонами, поскольку в этом случае минимально число различных вариантов олигонуклеотидов, способных кодировать данный пептид. Оптимальными являются пептиды, содержащие остатки метионина и триптофана, кодируемые уникальными кодонами. Поэтому особое значение приобретают исследования по выделению и изучению таких пептидов. Имеются и другие методические подходы для выделения структурных генов белков, связанные, в частности, с их способностью в определенных условиях экспрессироваться.. Синтезируемый в результате экспрессии белок может быть идентифицирован, например, с помощью иммунохимических методов.

Определение аминокислотного состава.

Анализ аминокислотного состава включает полный кислотный гидролиз исследуемого белка или пептида с помощью 5,7н соляной кислоты и количественное определение всех аминокислот в гидролизате. Гидролиз образца проводится в запаянных ампулах в вакууме при 110 0 в течение 24 часов. При этом полностью разрушается триптофан и частично серии, треонин, цистин и цистеин, а глутамин и аспарагин превращаются в глутаминовую и аспарагиновую кислоты соответственно. В то же время пептидные связи, образованные аминокислотными остатками с разветвленной боковой цепью (Val, Ile, Leu), из-за стерических препятствий гидролизуются частично. Особенно стабильны связи Val-Val, Ile-Ile, Val-Ile, Ile-Val и т . п .

С целью более надежного определения аминокислотного состава белка проводится параллельный гидролиз в течение 24, 48 и 96 часов, и все пробы далее количественно анализируются. Для валина, лейцина и изолейцина берутся максимальные значения, а для серина и треонина полученные значения экстраполируются к нулевому времени. При анализе содержания в белке триптофана вместо соляной кислоты для гидролиза используется 4н метансульфоновая кислота (СН₃-SО₃). Триптофан можно идентифицировать спектрофотометрически или с помощью цветных реакций.

Обычно при определении аминокислотного состава белка ограничиваются анализом суммарного содержания глутамина и глутаминовой кислоты, аспарагина и аспарагиновой кислоты, а их дифференциация проводится в процессе установления первичной структуры. Цистеин и цистин анализируются в виде цистеиновой кислоты или карбоксиметилцистеина.

Количественное определение аминокислот в гидролизате белка или пептида проводится с помощью аминокислотного анализатора — прибора, разработанного в 1958 году С.Муром и У.Стенном. Смесь аминокислот разделяется методом ионообменной хроматографии на колонке, заполненной сульфированной полистирольной смолой. Колонка промывается буферными растворами с последовательным повышением их рН и молярности. Время удерживания каждой аминокислоты строго определенно и зависит от степени ее ионизации.

Постколоночная модификация. Выходящий с колонки элюат смешивается с раствором нингидрина и в специальной ячейке нагревается до 100°С. Интенсивность образущейся окраски измеряется сначала в одном калориметре при 570 нм. а затем в другом, где при 440 нм определяется концентрация пролина и оксипролина. В 1972 г. в качестве селективного флуорогенного реагента на первичные амины был предложен флуорескамин, а несколько позже он стал использоваться для модификации аминокислот после их выхода с колонки аминокнслотного анализатора. Получаемая при этом чувтвительность определения в 10-100 раз превышает возможности нингидринового метода. Широкому распространению флуорескамина помешали его нестабильность в водной среде и высокая стоимость. Этих недостатков лишен введенный в практику почти одновременно с флуорескамином о-фталевый альдегид (ОФА), но с его помощью нельзя определить пролин и вторичные амины.

Предколоночная модификация. Реакция фенилизотиоцианата (ФИТЦ) с аминокислотами изучена детально, поскольку она лежит в основе метода Эдмана (рис.5). Первая стадия этой реакции — образование фенилтиокарбамильных (ФТК) производных — используется для количественного определения аминокислот в гидролизате белка в PICO — TAG -анализаторе ( Waters ). ФТК-аминокислоты стабильны, легко синтезируются и успешно идентифицируются методом ВЭЖХ на обращенной фазе. В этих же целях можно использовать реакции аминокислот с ОФА и дансилхлоридом (рис.4). Однако, воспроизводимость результатов уступает достигаемой в постколоночном методе.

Определение чистоты препарата белка с помощью N-концевого анализа

Анализ концевых остатков играет важную роль в процессе определения аминокислотной последовательности белка. На первом этапе исследования он дает возможность судить о числе полипептидных цепей, составляющих молекулу белка, и о чистоте исследуемого препарата. На последующих этапах с помощью анализа N-концевых аминокислотных остатков осуществляется контроль за процессом разделения пептидных фрагментов.

Один из первых методов определения N-концевых аминокислотных остатков был предложен Ф. Сэнгером в 1945 году — динитрофенильный метод — заключающийся в реакции a -аминогруппы белка или пептида с 2,4-динитрофторбензолом. При этом образуется динитрофенильное производное (ДНФ) окрашенное в желтый цвет. Последующий кислотный гидролиз 5,7н соляной кислотой (НС l ) приводит к разрыву пептидных связей и образованию ДНФ-производного N-концевой аминокислоты, которое экстрагируется эфиром и идентифицируется методом тонкослойной хроматографии в присутствии стандартов.

В настоящее время наибольшее применение находит метод дансилирования, разработанный в 1962 году В. Греем и Б. Хартли. Метод основан на введении в a -аминогруппу белка «флуоресцентной метки», устойчивой в условиях полного расщепления белка до аминокислот при кислотном гидролизе.

Первая стадия: 1-диметиламинонафталин-5-сульфохлорид (дансилхлорид, ДНС-С1) реагирует с непротонированной
a -аминогруппой пептида (и с боковыми группами цистеина, тирозина, лизина и гистидина) с образованием дансильного производного пептида (ДНС-пептида). Эта реакция проводится в щелочной среде в смешанном водно-органическом растворителе (органический компонент для растворения ДНС-С1). В этих условиях конкурируют два процесса: дансилирование и гидролиз дансилхлорида до кислоты (ДНС-ОН), а степень модификации пептида определяется соотношением скоростей протекания этих процессов (рис.4). Присутствие следовых количеств солей аммония привносимых с соответствующими буферами приводит к образованию, в процессе реакции, дансиламида (ДНС- NH ₂).

Вторая стадия: кислотный гидролиз модифицированного ДНС-пептида приводит к разрыву пептидных связей и образованию ДНС-производного N-концевой аминокислоты. Гидролиз проводится в 5,7н соляной (НС1) кислоте в течение 4-16 час при 110 0 С или смесью 5.7 н НС l и концентрированной трифторуксусной (ТФУ) кислот в соотношении 1:2 — 50мин при 166 0 С. Из производных, образующихся по боковым группам после гидролиза сохраняются e -ДНС-лизин и о-ДНС-тирозин.

Производные ДНС-аминокислот обладают интенсивной флуоресценцией в ультрафиолетовой области спектра ( l 366 нм) и обычно для их идентификации используют как высокоэффективную двумерную тонкослойную хроматографию (ВЭТСХ) на силикагеле или полиамиде, так и ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой, при этом достаточно иметь 0,05-0,5 нмоль вещества. В условиях жесткого кислотного гидролиза полностью разрушаются ДНС-триптофан и происходит дезаминирование остатков дикарбоновых кислот, которые превращаются соответственно в ДНС-апарагиновую и ДНС-глутаминовую аминокислоту. Степень разрушения ДНС-пролина, ДНС-серина и ДНС-треонина возрастает по мере увеличения времени гидролиза.

В то же время связи, образованные остатками валина, лейцина и изолейцина обладают повышенной устойчивостью к гидролизу. Образующиеся при этом дансилдипептиды (ДНС- Ile — Ile , ДНС- Ile — Val , ДНС- Val — Leu и т.п.) на хроматограмме могут быть ошибочно приняты за дансиламинокислоты. Правильность идентификации может быть проверена с помощью более продолжительного гидролиза (24час).

Определение аминокислотной последовательности белков с помощью метода Эдмана

Основным методом определения аминокислотной последовательности является метод деградации полипептидной цепи белка с помощью фенилизотиоцианата (ФИТЦ), разработанный П. Эдманом в 1950-1956г.г. Метод Эдмана позволяет последовательно отщеплять N -концевые аминокислотные остатки в виде фенилтиогидантоинов аминокислот (ФТГ).

Каждый цикл деградации включает три стадии: (рис.6)

I стадия — конденсация , образование фенилтиокарбамил пептида (ФТК-пептид);

II стадия — циклизация, отщепление N -концевого остатка аминокислоты и его циклизация в 2-анилино-5-тиазолинон;

III стадия — изомеризация , 2-анилино-5-тиазолинон N -концевого остатка аминокислоты изомеризуется в фенилтиогидантоин, который в дальнейшем идентифицируется.

Первая стадия . На первой стадии реакции происходит присоединение фенилизотиоцианата (ФИТЦ) к a -аминогруппе пептида с образованием фенилтиокарбамильного производного пептида (ФТК-пептида). Реакция проводится в летучих буферных системах при рН 9,0-9,5, в качестве оснований используются тритичные и ароматические амины (триэтиламин, триметиламин, N -метилпипиридин, пиридин). Выход на этой стадии может существенно снижаться вследствие побочных реакций. Такими реакциями являются окислительное десульфирование ФТК-группы пептида под действием кислорода воздуха, блокирование a -аминогруппы пептида за счет образования оснований Шиффа со следовыми количествами альдегидов, присутствующих в реагентах и растворителях. Поэтому все стадии деградации пептидов проводятся в атмосфере инертного газа, а используемые реагенты предварительно тщательно очищаются. В щелочных условиях ФИТЦ гидролизуется с образованием моно- и дифенилтиомочевины и анилина. Избыток реагентов и побочных

продуктов удаляется экстракцией органическими растворителями (этилацетатом и хлорбунаном).

Вторая стадия . На второй стадии деградации в присутствии безводной сильной трифторуксусной кислоты отщепляется N-концевой остаток в виде 2-анилино-5-тиазолинона и образуется укороченный на одну аминокислоту пептид со свободной a -аминогруппой следующего остатка. Условия реакции обычно не вызывают неспецифического расщепления полипептидной цепи белка. Однако остаток глутамина, когда он становится N-концевым в пептиде, может превращаться в остаток пироглутаминовой кислоты, блокирующий дальнейшую деградацию. В случае последовательности Asn — Gly возможна перегруппировка, при которой образуется циклический имид ангидрида аспартилглицила (рис.6). Возможна также 0—N-ацильная миграция у остатков ацилсерина и ацилтреонина, которая приводит к блокированию процесса расщепления.

Третья стадия . Изомеризация — состоит из быстрого гидролиза тиазолинона в производное фенилтиокарбамил аминокислоты (ФТК-аминокислота), а затем циклизация последнего в фенилтиогидантоин N -концевого остатка аминокислоты (ФТГ-аминокислота).

Способ обнаружения ФТГ-производных аминокислот основан на их сильной абсорбции в УФ-области спектра с максимумом поглащения 265-270 нм (среднее значение молярного коэффициента экстинкции равно 16000).

Повторное, цикл за циклом, проведение реакции Эдмана с одновременной идентификацией ФТГ-производного отщепляемой аминокислоты («прямой» Эдман) позволяет устанавливать аминокислотную последовательность исходного белка или пептида.

В 1972 г. В.Греем было предложено использовать метод Эдмана в сочетании с реакцией дансилирования (ДНС-Эдман). С этой целью после каждого цикла отщепления по Эдману отбирается небольшая проба образца (аликвота) и анализируется N-концевой остаток укороченного пептида с помощью реакции дансилирования. Этот подход выгодно отличается от «прямого» Эдмана, так как при этом отсутствует стадия промывки (экстракции), удаляющая избыток реагентов и побочных продуктов, образовавшихся в процессе реакции конденсации, что позволяет исключить возможные потери пептидов (особенно неполярных) за счет их растворения в органическом расворителе. Постепенное уменьшение количества анализируемого материала (в результате отбора аликвот) компенсируется более высокой чувствительностью определения флуоресцирующих производных аминокислот.

Определения С-концевой последовательности белков с помощью карбоксипептидаз

Ферментативный метод основан на использовании карбоксипептидаз (экзопептидазы класса гидролаз), которые атакуют в молекуле белка связи, расположенные по соседству со свободными a -карбоксильными группами, и отщепляют последовательно по одному остатку аминокислоты с С-конца полипептидной цепи. Изучая кинетику отщепления аминокислот карбоксипептидазами, можно получить информацию о последовательности расположения их на С-концевом участке молекулы белка или пептида. При исследовании структуры белков используется несколько типов карбоксипептидаз (А, В, С, Р, Y ), которые различаются по скорости отщепления индивидуальных аминокислот. Карбоксипептидаза А (из поджелудочной железы крупного рогатого скота) отщепляет с наибольшей скоростью аминокислоты с ароматической и длинной алифатической боковой цепью: Phe , Tyr , Trp , Leu , Ile , Met , Val . С меньшими скоростями отщепляются Thr, Gln, His, Ala, HSer, Asn, Ser, Lys. Очень медленно высвобождаются Gly , Glu , Asp , Cys — SO ₃ H , KM — Cys и совсем не гидролизуются связи образованные С-концевыми Pro и Arg . Карбоксипептидаза В (из поджелудочной железы свиньи) быстрее всех других отщепляет основные аминокислоты — лизин, аргинин, орнитин и не отщепляет С-концевой Pro . Пептидная связь, образованная остатком аргинина, гидролизуется быстрее, чем связь, образованная остатком лизина. Оптимальным значением рН для карбоксипептидаз А и В являются рН 7,5-8,5. Оно меняется в зависимости от субстрата. Так при снижении рН до 5,0 возрастает скорость отщепления С-концевых дикарбоновых аминокислот, тогда как при рН более 9,0 возрастает скорость отщепления лизина и гистидина. Карбоксипептидаза С ( выделена из ряда растительных источников, включая цитрусовые ) Этот фермент соединяет в себе специфичность карбоксипептидаз А и В и в то же время может отщеплять С-концевой Pro . Скорости высвобождения приблизительно одинаковы для всех аминокислот, за исключением Gly, который выщепляется очень медленно . Карбоксипептидаза Р ( получена из Aspergillus и Penicillum ) Она активна при рН 2,5 и имеет специфичность, сходную с таковой для карбоксипептидазы С. Карбоксипептидаза Y (из пекарских дрожжей) отщепляет, практически все аминокислоты, включая Pro . Гидролиз проходит наиболее эффективно при рН 5,5 — 6 , 5. Оптимальное значение рН для отцепления лизина и аргинина = 7,0.

При работе с карбоксипептидазами следует учитывать следующие основные проблемы: 1) многие препараты панкреатических ферментов А и В содержат эндонуклеазы (трипсин, химотрипсин), которые следует инактивировать добавлением диизопропилфторфосфата( DIPF ); 2) следует учитывать различие в скоростях отщепления отдельных аминокислот, зависящее как от природы боковой цепи у отщепляемого остатка, так и от природы аминокислоты расположенной в соседнем положении. Отщепление С-концевой аминокислоты значительно ускоряется, если перед ней находится остаток с ароматической или алифатической боковой цепью. Напротив, если в соседнем положении находится глицин, пролин, глутаминовая кислота, то скорость гидролиза снижается; 3) возникают осложнения и в случае, когда в С-концевой последовательности стоят подряд несколько остатков одной и той же аминокислоты. Поэтому при использовании карбоксипептидаз, надежно, удается вывести последовательность не более чем трех-пяти аминокислотных остатков, расположенных в белке в С-концевом положении.

Количество анализируемого материала зависит от чувствительности используемого метода идентификации. Освобождающиеся аминокислоты определяют или методом дансилирования с последующей ВЭТСХ, или количественно на аминокислотном анализаторе. Результаты представляют в виде графика зависимости количества отщепившейся аминокислоты (моль/моль белка) от времени (рис.7). Скорость появления освобождающихся аминокислот во времени позволяет сделать вывод о С-концевой последовательности белка.

(рис. 7) Отщепление аминокислот альдолазы

мышцы кролика карбоксипсптидазой А

Перед проведением количесвенного анализа следует убедиться, что отщепление действительно происходит, подобрать оптимальное соотношение фермента и субстрата, подобрать продолжительность расщепления. Для белков обычно необходимы предварительная денатурация и перевод в растворенное состояние. Для плохо растворимых белков расщепление можно проводить в 6М мочевине или в 0,05М додецилсульфате натрия ( SDS ). В обычном эксперименте образец белка инкубируют с карбоксипептидазами в подходящем буферном растворе (0,2М N-этилморфолинацетатном, 0,1М Na -бикарбонатном, аммоний-бикарбонатном, 0,05М пиридин-ацетатном и т.п.). Если в ходе предварительного эксперимента обнаруживается высвобождение многих аминокислот, то следует использовать соотношение фермент:субстрат 1:100 или 1:200 (по весу) и/или проводить отщепление при комнатной температуре. Если аминокислоты высвобождаются медленно, то следует увеличить соотношение фермент:субстрат 1:20 или 1:10 (по весу) и температуру до 37 0 С.

Структура a -аминокислот, наиболее часто встречающихся в белках

источник

Первичная структура белков. Гидролиз белков, определение аминокислотного состава. Анализ N- и С-концевых аминокислот.

Синтез белка происходит на рибосомах в виде первичной структуры, т.е. расположенных в определенном количестве и определенной последовательности аминокислот, соединенных пептидными связями, образованными карбоксильной и α-аминогруппами соседних аминокислотных остатков Пептидная связь — жесткая, ковалентная, генетически детерминированная.В структурных формулах изображается в виде одинарной связи: ,однако на самом деле эта связь между углеродом и азотом носит характер частично двойной связи:

Вокруг нее вращение невозможно и все четыре атома лежат в одной плоскости, т.е. компланарны. Вращение же других связей вокруг полипептидного остова достаточно свободно.

Первичная структура открыта в 1898 году профессором казанского университета Данилевским. В 1913 году Эмилем Фишером были синтезированы первые пептиды.

Такая последовательность аминокислот является уникальной для каждого белка и закреплена генетически. При нарушении процесса синтеза первичной структуры белка на рибосоме могут развиваться различные гететические заболевания. Например, при нарушении двух аминокислот в гемоглобине развивается серповидноклеточная анемия.

Для изучения аминокислотного состава белков пользуются сочетанием (или одним из них) кислотного (НСl), щелочного (Ва(ОН)2) и реже ферментативного гидролиза. Установлено, что при гидролизе чистого белка, не содержащею примесей, освобождается 20 различных а-аминокислот. Все другие открытые в тканях животных, растений и микроорганизмов аминокислоты (более 300) существуют в природе в свободном состоянии или в виде коротких пептидов или комплексов с другими органическими веществами.

α-аминокислоты представляют собой производные карбоновых кислот, у которых один водородный атом, у α -углерода, замещен на аминогруппу (-NH2), например: следует подчеркнуть, что все аминокислоты, входящие в состав природных белков являются а-аминокислотами, хотя аминогруппа в свободных аминикарбоновых кислотах может находиться, как увидим ниже, в β, γ, δ, ε -положениях.

9. Вторичная структура белков — α-спирали и β-структуры. Строение и функциональная роль доменов.

Вторичная структура — это пространственное расположение полипептидной цепочки в виде α-спирали или β-складчатости безотносительно к типам боковых радикалов и их конформации. Она стабилизирована водородными связями, которые замыкаются между пептидными, амидными (-N-H) и карбонидными (-C=O) группами, т.е. входят в пептидную единицу, и дисульфидными мостиками между остатками цистеина

Полинг и Кори предложили модель вторичной структуры белка в виде левозакрученной α-спирали, в которой водородные связи замыкаются между каждой первой и четвертой аминокислотой, что позволяет сохранять нативную структуру белка, осуществление им простейших функций, защищать от разрушения. На один виток спирали приходится 3,6 аминокислотных остатка, шаг спирали составляет 0,54 нм. В образовании водородных связей принимают участие все пептидные группы, что обеспечивает максимальную стабильность, снижает гидрофильность и увеличивает гидрофобность белковой молекулы. Альфа-спираль образуется самопроизвольно и является наиболее устойчивой конформацией, отвечающей минимуму свободной энергии

Полинг и Кори предложили и другую упорядоченную структуру — складчатый β-слой. В отличие от конденсированной α-спирали β- слои почти полностью вытянуты и могут располагаться как параллельно , так и антипараллельно

В стабилизации данных структур также принимают участие дисульфидные мостики и водородные связи.

Супервторичная структура — это более высокий уровень организации белковой молекулы, представленный ансамблем взаимодействующих между собой вторичных структур: α-спираль — два антипараллельных участка, взаимодействуют гидрофобными комплементарными поверхностями (по принципу впадина-выступ) αсα, сверхспирализация α-спирали, (βхβ)-элементы в глобулярных белках, представленные двумя параллельными β-цепями, связанные сегментом х, βαβαβ-элементы, представленные двумя сегментами α-спирали, вставленными между тремя параллельными β-цепями.

источник

Существуют 4 основных уровня структурной организации белковых молекул.

Первичная структура белка – последовательность расположения остатков аминокислот в полипептидной цепи. Отдельные аминокислоты в белковой молекуле связаны друг с другом пептидными связями, образующимися при взаимодействии a-карбоксильных и a-аминогрупп аминокислот:

.

В настоящее временя расшифрована первичная структура десятков тысяч различных белков. Первым этапом определения первичной структуры белка является установление аминокислотного состава методами гидролиза. Затем определяют химическую природу концевых аминокислот. Следующий этап — определение последовательности аминокислот в полипептидной цепи, для чего применяют частичный избирательный (ферментативный либо химический) гидролиз.

Методы определения N-концевой аминокислоты

Метод Сэнджера, основанный на реакции с 2,4-динитрофторбензолом (ДНФБ). Образуется окрашенное в желтый цвет 2,4-динитрофенильное производное N-концевой аминокислоты, которую идентифицируют хроматографически.

Фенилтиогидантоиновый метод Эдмана. Фенилизотиоцианат реагирует со свободной a-аминогруппой N-концевой аминокислоты полипептида. Природу фенилтиогидантоина N-концевой аминокислоты устанавливают хроматографическим методом, а укороченный на одну аминокислоту полипептид анализируют далее. Метод Эдмана осуществляют в специальном приборе — секвенаторе (от англ. sequence – последовательность).

Методы определения С-концевой аминокислоты

Ферментативные методы. Обработка белка карбоксипептидазой приводит к отщеплению С-концевой аминокислоты, которую определяют методом хроматографии.

Химический метод Акабори. Гидразин расщепляет пептидные связи и реагирует со всеми аминокислотами, за исключением С-концевой.

Следующим этапом является определение последовательности аминокислот в полипептидной цепи. Проводят частичный гидролиз полипептидной цепи; в результате образуются короткие пептиды. Избирательно гидролизующие вещества: цианогенбромид CNBr (по остаткам мет), гидроксиламин (по связям между остатками асп и гли), N-бромсукцинамид (по остаткам три). Пепсин ускоряет гидролиз пептидных связей, образованных фен, тир и глу, трипсин — арг и лиз, химотрипсин — три, тир и фен.

Используют также рентгеноструктурный анализ, а также данные о нуклеотидной последовательности ДНК (ДНК кодирует последовательность аминокислот в белке).

Вторичная структура белка – конфигурация полипептидной цепи, т.е. способ укладки полипептидной цепи в определенную конформацию
(рис. 1). Процесс этот протекает не беспорядочно, а в соответствии с первичной структурой белка.

Вторичная структура поддерживается в основном водородными связями, хотя для некоторых белков определенный вклад вносят пептидные и дисульфидные ковалентные связи.

Наиболее вероятным типом вторичной структуры глобулярных белков является a-спираль. Закручивание полипептидной цепи в спираль происходит по часовой стрелке. Для каждого белка характерна определенная степень спирализации. Так, полипептидные цепи гемоглобина спирализованы на 75%, а молекула пепсина — на 30%.

Тип конфигурации полипептидных цепей, когда сегменты пептидной цепи располагаются в один слой, образуя структуру, подобную листу, сложенному в гармошку, называется b-структурой. Такой тип вторичной структуры обнаружен в белках мышц, волос, шелка. b-Слой может быть внутримолекулярным, а также образованным двумя или более полипептидными цепями.

Способность к образованию водородных связей, являющихся движущей силой при возникновении α- и β-структур в белковой молекуле, выражена у разных аминокислот в неодинаковой степени. Выделяют группу спиралеобразующих аминокислот: ала, глн, глу, лей, мет, лиз, гис. Вал, иле, тир, тре, фен способствуют образованию b-структур полипептидной цепи. Наличие сер, гли, про, асн, асп приводит к преимущественному образованию неупорядоченных фрагментов в белковой молекуле.

В природе существуют белки, строение которых не соответствует ни
β-, ни a-структуре (коллаген).

Третичная структура белка – пространственная ориентация полипептидной спирали или способ укладки полипептидной цепи в определенном объеме. Первый белок, Третичная структура белка (миоглобин кашалота) впервые была установлена методом рентгеноструктурного анализа (рис. 2).

В стабилизации пространственной структуры белков, помимо ковалентных связей, основная роль принадлежит нековалентным связям (межмолекулярные ван-дер-ваальсовы силы, водородные связи, электростатические взаимодействия ионизированных групп, гидрофобные взаимодействия и т.д.).

Методом рентгеноструктурного анализа установлено существование специфических уровней структурной организации белковой молекулы, промежуточных между вторичной и третичной структурами. Домен — это компактная глобулярная структурная единица внутри полипептидной цепи (рис. 3). Открыты белки (в частности, иммуноглобулины), в которых существуют различные по структуре и функциям домены.

Согласно современным представлениям, белка после окончания синтеза белка его третичная структура формируется самопроизвольно. Процесс формирования нативной пространственной структуры полипептидной цепи — фолдинг. Основной движущей силой фолдинга является взаимодействие радикалов аминокислот с молекулами воды. При этом гидрофобные радикалы аминокислот ориентируются внутрь белковой молекулы, а гидрофильные радикалы повернуты в сторону воды.

В клетках существуют белки, названные шаперонами. Их основная функция — участие в фолдинге (рис. 4). Описан ряд заболеваний человека, имеющих наследственную природу, возникновение которых связывают с нарушением процесса фолдинга вследствие мутаций (пигментозы, фиброзы и др.).

Рис. 4. Участие шаперонов в фолдинге белков

Все биологические свойства белков связаны с образованием и сохранностью третичной структуры, называемой нативной. Белковая глобула не является абсолютно жесткой структурой: возможны обратимые перемещения фрагментов полипептидной цепи. Эти изменения не приводят к нарушению общей конформации молекулы. Факторы, влияющие на конформацию белковой молекулы — ионная сила раствора, рН среды, взаимодействие с компонентами раствора. Любые воздействия, приводящие к нарушению нативной структуры молекулы, приводят к частичной или полной утрате белком его биологических свойств.

Четвертичная структура белка — укладка отдельных полипептидных цепей, обладающих специфической первичной, вторичной или третичной структурой, в пространстве, и формирование единого макромолекулярного образования.

Белок, состоящий из нескольких полипептидных цепей, называют олигомером, а каждую входящую в него полипептидную цепь — протомером. Олигомерные белки, как правило, состоят из четного числа псубъединиц, например, молекула гемоглобина построена из двух a- и двух b-полипептидных цепей (рис. 5).

Четвертичную структуру имеют около 5% белков, такие как ферритин, иммуноглобулины. Субъединичное строение свойственно многим ферментам, в первую очередь тем, которые выполняют сложные функции. Почти все ДНК- и РНК-полимеразы имеют четвертичную структуру. Полипептидные цепи, входящие в состав белка с четвертичной структурой, образуются на рибосомах по отдельности. Только после завершения синтеза происходит их объединение в надмолекулярную структуру. Биологическую активность белок приобретает на уровне четвертичной структуры. Стабилизация четвертичной структуры происходит при участии тех же связей, что и при формировании третичной структуры, за исключением ковалентных связей.

Ряд исследователей признают наличие пятого уровня структурной организации белков. Полифункциональные макромолекулярные комплексы разных ферментов, катализирующие весь путь превращений субстрата, получили назвение метаболонов (пируватдегидрогеназный комплекс, синтетазы ВЖК, дыхательная цепь).

Белок, выполняющий специфическую функцию в метаболизме клетки, может быть представлен несколькими формами — изофункциональными белками, или изобелками. В эритроцитах крови человека обнаружено несколько форм гемоглобина: У взрослого человека преобладающей формой является НbА. Ч Для эмбриональной стадии развития человека характерен фетальный гемоглобин HbF. Все формы гемоглобинов выполняют функцию переноса кислорода из легких в ткани, однако свойства разных гемоглобинов отличаются.

Последнее изменение этой страницы: 2016-07-14; Нарушение авторского права страницы

источник

Определение аминокислотного состава белков может быть осуществлено различными методами: химическим, хроматографическим, микробиологическим и изотопным. Чаще используются хроматографические методы.

Бумажная хроматография. Бумажная хроматография используется для идентификации компонентов смеси аминокислот с ди- и три-пептидами, получаемой при частичном гидролизе белков и полипептидов.

Гидролиз может быть осуществлен кислотным, щелочным или ферментативным методом. Кислотный метод используется чаще (6 н. HCl, 8 н. H₂SO₄). Гидролиз проводят при нагревании, иногда при повышенном давлении. Показателями окончания гидролиза могут служить: прекращение нарастания карбоксильных или аминных групп в гидролизате, либо отрицательная биуретовая реакция. Избыток гидролизующего реагента удаляют: серную кислоту осаждают Ca(OH)₂, соляную кислоту отгоняют в вакууме, а остаток кислоты осаждают нитратом серебра.

Компоненты гидролизата распределяются между водой, адсорбированной на целлюлозе и являющейся неподвижной фазой, и органическим растворителем, подвижной фазой, которая движется вдоль листа вверх или вниз. В качестве подвижной фазы используется смесь бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:5). Более липофильные аминокислоты сильнее увлекаются органическим растворителем, более гидрофильные – проявляют большую тенденцию связываться с неподвижной фазой. Гомологические соединения, отличающиеся даже на одно метиленовое звено, движутся с различной скоростью и легко могут быть разделены. По окончании хроматографии бумагу высушивают и обрабатывают проявителем (0,5% раствор нингидрина в смеси ацетон-ледяная уксусная кислота-вода) и нагревают в течение нескольких минут. Аминокислоты проявляются в виде окрашенных пятен. Подвижность – постоянная величина, характерная для каждого соединения возрастает с увеличением молекулярной массы. Для аминокислот с неразветвленной цепью величина подвижности несколько больше, чем для соответствующих изомеров. Введение в молекулу полярных групп снижает подвижность соединения. Аминокислоты с объемными неполярными боковыми цепями (лейцин, изолейцин, фенилаланин, триптофан и др.) перемещаются быстрее, чем аминокислоты с более короткими неполярными боковыми цепями (пролин, аланин, глицин) или с полярными боковыми цепями (треонин, аргини, цистеин, гистидин, лизин). Это обусловлено большей растворимостью полярных молекул в гидрофильной стационарной фазе и неполярных – в органических растворителях.

Бумажная хроматография может быть использована для количественной оценки содержания аминокислот. Каждое пятно вырезают и элюируют подходящим растворителем; затем проводят количественный колориметрический (нингидриновый) анализ. В другом варианте бумагу опрыскивают нингидрином и измеряют с помощью фотометра интенсивность окрашивания пятна в отраженном или проходящем свете. При полуколичественной оценке содержание аминокислот оценивают по площади пятен на хроматограмме, которые пропорциональны концентрациям аминокислот в разделяемой смеси.

Тонкослойная хроматография. Для разделения и определения аминокислот может быть также использована тонкослойная хроматография. ТСХ, как известно, существует в двух вариантах. Распределительная ТСХ сходна с распределительной на бумаге и адсорбционная ТСХ, основана совершенно на других принципах.

При проведении РТСХ на порошке целлюлозы или других относительно инертных носителях можно использовать такие же системы растворителей и такие же проявляющие реагенты, как и при хроматографии на бумаге.

Разделение с помощью АТСХ определяется способностью растворителя (этот растворитель не обязательно является бинарной или более сложной смесью) элюировать компоненты образца с места его адсорбции на активированном сорбенте. Например, на нагретом силикагеле. АТСХ применима для разделения таких неполярных соединений, как липиды, но не для разделения аминокислот и большинства пептидов. Для разделения аминокислот используют РТСХ, которая позволяет достаточно быстро разделять и определять 22 аминокислоты белковых гидролизатов.

Аминокислоты в белковом гидролизате могут быть определены также методом газовой хроматографии, но перед хроматографическим анализом аминокислоты как правило переводят в летучие соединения.

-Взаимодействие с нингидрином. Образуются соответствующие альдегиды.

Таким образом, получают смесь альдегидов и анализируют ее. Это простейший случай, пригоден лишь для некоторых аминокислот.

-Переводят аминоксилоты в летучие эфиры (алкильные эфиры, метильные эфиры оксикислот, метиловые эфиры хлорзамещенных кислот и др.).

Выбор производных зависит от исследуемой смеси аминокислот.

Ионообменная хроматография. В настоящее время аминокислотный состав пищевых продуктов определяется исключительно с помощью автоматической ионообменной хроматографии.

В методе Мура и Штейна используют короткую и длинную колонки, заполненные смолой из сульфонированного полистирола в Na + – форме. Когда кислотный гидролизат при рН = 2 наносят на колонку, аминокислоты связываются в результате катионного обмена с ионами натрия. Далее колонку элюируют раствором цитрата натрия при заранее запрограммированных значениях рН и температуры. Короткую колонку элюируют одним буфером, длинную – двумя. Элюат обрабатывают нингидрином, измеряя интенсивность окраски с помощью проточного колориметра. Данные автоматически регистрируются на ленте самописца и могут передаваться в компьютер для вычисления площади под пиком.

Высоковольтный электрофорез на инертных носителях. В биохимии широкое применение нашло разделение аминокислот, полипептидов и других амфолитов (молекул, суммарный заряд которых зависит от рН среды) под действием наложенного постоянного электрического поля. Это метод высоковольтного электрофореза на инертных носителях. При разделении аминокислот в качестве инертных носителей чаще всего используют полоски бумаги или тонкие слои целлюлозного порошка. Разделение проводят в течение 0,5–2 ч при напряжении 2000–5000 В в зависимости от суммарных зарядов амфолитов и их молекулярных масс. Среди молекул, несущих одинаковый заряд, более легкие мигрируют быстрее. Но более важным параметром при разделении является суммарный заряд. Метод применяется для разделения аминокислот, низкомолекулярных пептидов, некоторых белков, нуклеотидов. Образец помещают на носитель, смачивают буфером при соответствующем рН и соединяют с буферным резервуаром полоской фильтровальной бумаги. Бумагу прикрывают стеклянной пластинкой или погружают в углеводородный растворитель для охлаждения. В электрическом поле молекулы, несущие при данном рН отрицательный заряд, мигрируют к аноду, а те, которые несут положительный заряд, – к катоду. Далее высушенную электрофореграмму «проявляют» нингидрином (при работе с аминокислотами, пептидами) или измеряют поглощение в УФ-свете (при работе с нуклеотидами).

Выбор рН определяется значениями рК диссоциирующих групп, входящих в состав молекул смеси. При рН 6,4 глутамат и аспарат несут заряд –1 и движутся к аноду; разделение их осуществляется благодаря различию в молекулярной массе. Лизин, аргинин и гистидин движутся в противоположном направлении, а все другие аминокислоты, входящие в состав белка, остаются вблизи места нанесения. При разделении пептидов, образовавшихся в результате ферментативного расщепления, уменьшение рН до 3,5 приводит к увеличению заряда катионных групп и обеспечивает лучшее разделение.

Методы бумажной, тонкослойной хроматографии, микробиологические, газохроматографические и ряд других, в настоящее время практически не используются вследствие худшей воспроизводимости и большой длительности. Современные хроматографы позволяют определять аминокислотный состав смеси, содержащей лишь 10 –7 –10 –9 моль каждого компонента с воспроизводимостью до 5% за 2–4 часа.

Анализ аминокислотного состава включает полный гидролиз исследуемого белка или пептида и количественное определение всех аминокислот в гидролизате. Поскольку при нейтральных рН пептидные связи стабильны, применяют кислотный или щелочной катализ. Ферментативный катализ для полного гидролиза менее пригоден. Полный гидролиз белка на составляющие аминокислоты неизбежно сопровождается частичной потерей некоторых аминокислотных остатков. Для гидролиза обычно используется 6 н. водный раствор соляной кислоты (110ºС), в вакуумированной ампуле. Количественное определение аминокислот в гидролизате проводят с помощью аминокислотного анализатора. В большинстве таких анализаторов смесь аминокислот разделяют на сульфокатионитах, а детектирование осуществляют спектрофотометрически по реакции с нингидрином или флуориметрически с о-фталевым диальдегидом.

Однако данные по аминокислотному составу однотипных продуктов, полученные в разных лабораториях по отдельным аминокислотам, иногда различаются до 50%.

Эти различия обусловлены не только сортовыми, видовыми или технологическими различиями, а главным образом условием проведения гидролиза пищевого продукта. При стандартном кислотном гидролизе (6 н. HСl, 110–120ºС, 22–24 часа) происходит частичное разрушение некоторых аминокислот, в том числе треонина, серина (на 10–15% и тем больше, чем дольше проводится гидролиз) и особенно метионина (30–60%) и цистина 56–60%, а также практически полное разрушение триптофана и цистеина. Этот процесс усиливается в присутствии больших количеств углеводов в продукте. Для количественного определения метионина и цистина рекомендуется проводить предварительное их окисление надмуравьиной кислотой. При этом цистин превращается в цистеиновую кислоту, а метионин в метионин-сульфон, которые весьма устойчивы при последующем кислотном гидролизе.

Цистин Цистеиновая кислота

Трудной задачей в аминокислотном анализе является определение триптофана. Как уже говорилось, при кислотном гидролизе происходит почти полное его разрушение (до 90%). Поэтому для определения триптофана проводят один из вариантов щелочного гидролиза 2 н. NaOH, 100ºС, 16–18 часов в присутствии 5% хлорида олова или 2 н. гидроокиси бария, при которых он разрушается незначительно (до 10%). Минимальное разрушение происходит в присутствии тиогликолевой кислоты и предварительно гидролизованного крахмала. (При щелочном гидролизе происходит разрушение серина, треонина, аргинина и цистеина). Гидролизат после нейтрализации смесью лимонной и соляной кислот немедленно (во избежание студнеобразования) анализируют на аминокислотном анализаторе. Что касается многочисленных химических методов определения триптофана, то они, как правило, в пищевых продуктах плохо воспроизводимы и поэтому их использовать не рекомендуется.

Для мясных продуктов дополнительной необходимой аминокислотой является оксипролин, который характеризует количество соединительных тканных белков в мясе. Его можно определять ионообменной хроматографией с помощью автоматических анализаторов или химическим колориметрическим методом. Метод основан на нейтрализации кислотного гидролизата до рН 6,0, последующем окислении оксипролина с помощью 1,4% раствора хлорамина Т (или хлорамина Б) в смеси пропилового спирта и буфера, колориметрическом определении при 533 нм продуктов окисления оксипролина после реакции с 10%-ным раствором пара-диметиламинобензальдегида в смеси хлорной кислоты и пропилового спирта (1:2).

В связи с тем, что тирозин, фенилаланин и пролин в присутствии кислорода могут частично окисляться, стандартный кислотный гидролиз рекомендуется проводить в атмосфере азота. Ряд аминокислот, в том числе лейцин, изолейцин и валин, требуют для своего полного выделения из белков более длительного кислотного гидролиза – до 72 ч. В биохимии при анализе белков гидролизуют параллельные пробы в течение 24, 48, 72 и 96 ч.

Для точного количественного определения всех аминокислот требуется проводить 5 различных гидролизов, что весьма удлиняет определение. Обычно же проводят 1–2 гидролиза (стандартный с соляной кислотой и с предварительным оксилением надмуравьиной кислотой).

Во избежание потерь аминокислот удаление избытка кислоты при кислотном гидролизе следует проводить немедленно многократным выпариванием в вакуум-эксикаторе с добавлением дистиллированной воды.

При правильной работе анализатора ионообменные колонки работают без замены смолы довольно долго. Однако, если образцы содержат заметные количества красящих веществ и липидов, то колонка быстро забивается и для восстановления ее разделительных способностей требуется многократная регенерация, иногда с перенабивкой колонки. Поэтому, для продуктов, содержащих более 5% жира, рекомендуется предварительно удалять липиды экстракцией. В таблице 2.3 приведены условия пробоподготовки основных пищевых продуктов при анализе аминокислотного состава.

Таблица 2.3. – Условия подготовки проб пищевых продуктов к анализу

Контрольные вопросы:

1. Дайте определение понятию «белки».

2. На какие группы делят белки по их функциям в организме?

3. Какова роль белков в питании человека?

4. Каковы рекомендуемые нормы белка в питании?

5. Каково рекомендуемое соотношение белков растительного и животного происхождения и как белки различного происхождения отличаются по своему аминокислотному составу?

6. Какие незаменимые аминокислоты вы знаете и какие аминокислоты могут стать незаменимыми?

7. Как определяют содержание общего азота в продуктах питания?

8. Как определяют аминокислотный состав белков?

9. Какие методы определения аминокислот вы знаете?

§ 2.4. Углеводы

Углеводы широко представлены в растениях и животных, где они выполняют как структурные, так и метаболические функции. В растениях в процессе фотосинтеза из углекислого газа и воды синтезируется глюкоза, которая далее запасается в виде крахмала или превращается в целлюлозу – структурную основу растений. Животные способны синтезировать ряд углеводов из жиров и белков, но большая часть углеводов поступает с пищей растительного происхождения.

Дата добавления: 2015-05-29 ; Просмотров: 2823 ; Нарушение авторских прав? ;

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

источник