Рефрактометрический метод анализа белка в молоке

Молоко — один из самых ценных продуктов питания человека. Роль молока как полноценного пищевого продукта в поддержании процессов жизнедеятельности организма хорошо известна. Особую ценность представляют белки молока — наиболее важные в биологическом отношении органические вещества. Образующиеся в результате расщепления белков аминокислоты идут на построение клеток организма, ферментов, защитных тел, гормонов и прочее. Некоторые аминокислоты легко образуются в организме из других кислот, но есть и такие, которые должны поступать с пищей. Эти аминокислоты (лизин, триптофан, метионин, фенилаланин, лейцин, изолейцин, треонин, валин) называют незаменимыми. Количество многих незаменимых аминокислот в сывороточных белках молока значительно выше не только по сравнению с белками растительных продуктов, но и с некоторыми белками мяса и рыбы.

Кроме того, казеин и сывороточные белки молока обладают рядом важных функциональных свойств (водосвязывающая, эмульгирующая, пенообразующая способность), позволяющих использовать их концентраты в качестве стабилизаторов, эмульгаторов разнообразных продуктов (мороженое, кремы, пудинги и прочее).

Обычно в молоке контролируют массовую долю белков (общий белок), включающих казеин и сывороточные белки. Реже в молоке определяют только содержание казеина.

Для контроля массовой доли белка в молоке имеется несколько методов. Арбитражным считается сложный химический метод Кьельдаля ГОСТ23327-98 «Молоко. Методы определения общего белка».

Метод Кьельдаля

Метод основан на сжигании органических компонентов пробы молока в колбе Кьельдаля в присутствии серной кислоты; освобождающийся при этом азот определяют титрованием и по его количеству вычисляют содержание белка.

Для проведения измерения в колбу Кьельдаля последовательно помещают несколько стеклянных бусинок или кусочков фарфора, около 10 г сульфата калия, 0,04 г сульфата меди. В бюксу с крышкой отмеривают 5 см³ молока, крышку закрывают и взвешивают. Молоко из бюксы переливают в колбу. Пустую бюксу вновь взвешивают и по разнице между массой бюксы с молоком и массой пустой бюксы вычисляют массу взятого молока. В колбу добавляют 20 см³ серной кислоты, осторожно вливая ее по стенкам колбы, смывая с них капли молока. Колбу закрывают грушеобразной стеклянной пробкой и осторожно круговыми движениями перемешивают содержимое колбы.

Колбу ставят на нагревательный прибор в наклонном положении под углом 45º и осторожно нагревают до тех пор, пока не прекратится пенообразование и содержимое колбы не станет жидким. Затем сжигание продолжают при более интенсивном нагревании. Степень нагревания считают достаточной, когда кипящая кислота конденсируется в середине горловины колбы Кьельдаля.

Время от времени содержимое колбы перемешивают, смывая обуглившиеся частицы со стенок колбы. Нагревание продолжают до тех пор, пока жидкость не станет совершенно прозрачной и практически бесцветной (при применении в качестве катализатора окиси ртути) или слегка голубоватой (при применении в качестве катализатора сульфата меди). После осветления раствора нагревание продолжают в течение 1,5 час., после чего колбе дают остыть до комнатной температуры. Добавляют 150 см³ дистиллированной воды и несколько кусочков свежепрокаленной пемзы, перемешивают и снова охлаждают.

В коническую колбу отмеривают 50 см³ раствора борной кислоты , добавляют 4 капли индикатора и перемешивают.

Коническую колбу соединяют с холодильником с помощью аллонжа и резиновой трубки так, чтобы конец аллонжа был погружен в раствор борной кислоты в конической колбе. Колбу Кьельдаля соединяют с холодильником при помощи каплеуловителя, проходящего через одну пробку с делительной воронкой. Градуированным цилиндром отмеряют 80 см³ раствора гидроксида натрия (реактив 3) (при применении в качестве катализатора красного оксида ртути используют раствор гидроксида натрия, содержащий сульфид натрия) и через делительную (капельную) воронку вносят его в колбу Кьельдаля. Сразу же после выливания раствора кран делительной воронки закрывают для избежания потери образующегося аммиака.

Содержимое колбы Кьельдаля осторожно смешивают круговыми движениями и нагревают до кипения. При этом необходимо избегать пенообразования.

Перегонку продолжают до тех пор, пока жидкость не начнет булькать. При этом регулируют степень нагрева так, чтобы время дистилляции было не менее 20 минут. Убедиться в полноте перегонки аммиака можно путем дополнительной перегонки в новую порцию борной кислоты (20 см³) в течение 5 минут. Окраска раствора борной кислоты должна оставаться без изменений. При перегонке не допускают нагревания раствора борной кислоты в конической колбе. Слишком сильное охлаждение

(ниже 10ºС) также нежелательно, так как оно может вызвать переброс жидкости из конической колбы в колбу Кьельдаля.

Перед окончанием перегонки коническую колбу опускают так, чтобы конец аллонжа был над поверхностью раствора борной кислоты, и продолжают перегонку в течение 1-2 минут.

После прекращения нагревания отсоединяют аллонж. Внешнюю и внутреннюю поверхности аллонжа ополаскивают небольшим количеством дистиллированной воды, сливая ее в коническую колбу.

Дистиллят титруют раствором соляной кислоты до перехода зеленого цвета в серый. При избытке титранта раствор приобретает фиолетовый цвет.

Параллельно так же, как и основной проводят контрольный опыт, применяя 5 см³ дистиллированной воды место молока. Количество повторностей контрольного опыта должно быть не менее 5.

По объему аммиака, определяемого титрованием кислотой, устанавливают количество общего азота при умножении последнего на принятый коэффициент 6,38 и таким образом находят содержание общего белка в молоке.

Три следующих метода описаны в ГОСТе 25179-90 «Молоко. Методы определения белка».

Рефрактометрический метод

Метод основан на установлении разности показателей преломления луча света после прохождения его через молоко и полученной из него безбелковой сыворотки (для осаждения белков используют раствор хлорида кальция и нагревание пробы).

Массовую долю белков в молоке данным методом определяют на рефрактометре ИРФ-464.

Для измерения в 3 флакона наливают по 5 см³ молока, добавляют по 6 капель раствора хлорида кальция. Флаконы закрывают пробками и перемешивают путем переворачивания флаконов.

Далее флаконы помещают в водяную баню, наливая воду таким образом, чтобы ее максимальный уровень достигал половины высоты флаконов. Баню закрывают, помещают на электроплитку, воду в бане доводят до кипения и кипятят не менее 10 минут. Не открывая бани, горячую воду сливают через отверстие в крышке, наливают в баню холодную воду и выдерживают в ней не менее 2 минут.

Открывают баню, извлекают флаконы и разрушают белковый сгусток путем энергичного встряхивания флаконов.

Флаконы помещают в центрифугу и центрифугируют не менее 10 минут. Образовавшуюся прозрачную сыворотку отбирают пипеткой и наносят на измерительную призму рефрактометра 1-2 капли. Измерительную призму закрывают осветительной.

Наблюдая в окуляр рефрактометра, специальным корректором убирают окрашенность границы света и тени. Для улучшения резкости границы измерение проводят через одну минуту после нанесения сыворотки на призму, так как за это время из пробы удаляется воздух и поверхность осветительной призмы лучше смачивается.

По шкале «Белок» проводят не менее трех наблюдений. Затем сыворотку с призмы рефрактометра удаляют, промывают ее водой и вытирают фильтровальной бумагой.

На измерительную призму помещают две капли исследуемого молока и по шкале «Белок» проводят не менее пяти наблюдений, так как резкость границы света и тени у молока хуже, чем у сыворотки.

Массовую долю белка в молоке Х₁ (%) вычисляют по формуле:

где Х₂ — среднее арифметическое значение результатов наблюдения по шкале «Белок» для молока (%);

Х₃ — среднее арифметическое значение результатов наблюдения по шкале «Белок» для сыворотки (%).

Колориметрический метод

Колориметрический метод основан на способности белков молока при рН ниже изоэлектрической точки связывать кислый краситель, образуя с ним нерастворимый осадок, после удаления которого измеряют оптическую плотность исходного раствора красителя относительно полученного раствора, которая уменьшается пропорционально массовой доле белка.

Методика определения массовой доли белков в молоке сводится к следующему. В пробирку отмеряют 1 см³ молока, приливают 20 см³ рабочего раствора сине-черного красителя (готовится путем смешивания водного раствора красителя и кислого буферного раствора с добавлением поверхностно-активного вещества) и смесь интенсивно перемешивают. Выпавший осадок центрифугируют или отфильтровывают. Полученный фильтрат разводят в 100 раз и колориметрируют на фотоколориметре КФК-3 при длине волны 500-600 нм в кювете с рабочей длиной 10 мм.

Массовую долю белков в молоке устанавливают в процентах, пользуясь градуировочным графиком. Для построения графика в нескольких пробах молока (с массовой долей белков 2,5-3,5%) определяют содержание белков методом Кьельдаля и оптическую плотность фильтрата, полученного указанным способом.

Метод формольного титрования

Метод применяют при условии согласия с поставщиком.

Метод формольного титрования основан на нейтрализации карбоксильных групп моноаминодикарбоновых кислот белков раствором гидроксида натрия, количество которого, затраченное на нейтрализацию, пропорционально массовой доле белка в молоке. Для проведения подготавливают, согласно инструкции, рН-метр-термометр «Нитрон». Бюретку, вместимостью не менее 5 см 3 с ценой деления не более 0,05 см 3 заполняют раствором гидроксида натрия с молярной концентрацией 0,1 моль/дм 3 . Для определения поправки к результатам измерения массовой доли белка методом формольного титрования проводят одновременное измерение массовой доли белка в одном и том же образце молока методом формольного титрования и по ГОСТ 23327.

В стакан помещают 20 см 3 молока и стержень магнитной мешалки. Стакан устанавливают на магнитную мешалку, включают двигатель мешалки и погружают электроды потенциометрического анализатора в молоко. Титруют раствор гидроксида натрия в стакан с молоком до точки эквивалентности равной 9 единицам рН, подавая раствор по каплям начиная с рН 4 и делают 30-секундную выдержку после достижения точки эквивалентности. Определяют количество раствора щелочи, затраченной на нейтрализацию молока, до внесения формальдегида, и вносят в стакан 5 см 3 формальдегида.

По истечении 2-2,5 минут вновь титруют раствор гидроксида натрия в стакан с молоком до точки эквивалентности равной 9 единицам рН, подавая раствор по каплям начиная с рН равное 4 и деляют 30-секундную выдержку после достижения точки эквивалентности.

Параллельно проводят контрольный опыт по нейтрализации смеси 20 см 3 воды и 5 см 3 раствора формальдегида.

Массовую долю белка Х₇ (%) вычисляют по формуле:

где V₂ — общее количество раствора, израсходованное на нейтрализацию, см 3 ;

V₁ — количество раствора, израсходованное на нейтрализацию до внесения формальдегида (см 3 );

V — количество раствора, израсходованное на контрольный опыт (см 3 );

0,96 — эмпирический коэффициент (%/ см 3 );

Х₄ — поправка к результату измерения массовой доли белка (%).

_ГДЕ Х₅ — среднее арифметическое значение массовой доли белка, полученное по ГОСТ23327 (%);

Х₄ — среднее арифметическое значение массовой доли белка, полученное формольным титрованием (%).

Все вышеперечисленные методики определения белка имеют существенные недостатки: длительность определения, использование дорогостоящих реактивов, повышенная опасность для обслуживающего персонала.

Разработанный в последние годы электронный ультразвуковой анализатор молока «Клевер-2» лишен этих недостатков. Без применения химических реактивов прибор измеряет одновременно содержание массовой доли жира, сухого обезжиренного молочного остатка (СОМО), плотность, белок, количество добавленной воды и температуру пробы.

Принцип действия прибора основан на измерении скорости распространения ультразвуковых колебаний в зависимости от температуры и состава молока.

Анализатор молока «Клевер-2» работает следующим образом. В режиме измерения дегазированную пробу молока заливают в пробозаборник прибора, где ее последовательно нагревают до двух заданных температур, при каждой из которой определяют скорость ультразвука. На основе полученных данных микропроцессор автоматических вычисляет массовые доли белка, жира, плотности, СОМО, количество добавленной воды и температуру пробы молока. Полученные значения отображаются на цифровом индикаторе прибора. Процесс измерения полностью автоматизирован.

Прибор прост в обслуживании и портативен. Температура пробы молока может быть от 10º до 30ºС. Время измерения три минуты.

Использование анализатора молока «Клевер-2» позволяет значительно сократить трудовые ресурсы на проведение анализа, исключить приготовление реактивов, характерных для традиционных методов, сократить площади лабораторий.

Анализаторы на основе ультразвукового метода компактны, просты в эксплуатации, имеют умеренную цену и перспективны как на мини-заводах, заводах средней мощности, так и на животноводческих фермах и в фермерских хозяйствах.

источник

Метод основан на том, что нейтральный водный раствор аминокислот в присутствии нейтрального формалина способен повышать кислотность с образованием соединений, в которых оба водорода аминогруппы замещаются метильной группой.

Колбы вместимостью 50-100 см 3 ; бюретка; пипетки вместимостью 10 см 3 ; спиртовой раствор фенолфталеина 1%; 0,1 н раствор щелочи; нейтральный формалин.

В колбу на 50-100 см 3 отмеривают пипеткой 10 см 3 молока, добавляют 10 капель 1%-ного спиртового раствора фенолфталеина, все размешивают и оттитровывают 0,1 н раствором щелочи до слабо-розового окрашивания, не исчезающего при взбалтывании. В колбу добавляют 2 см 3 нейтрального формалина, размешивают. Слабо-розовое окрашивание исчезает.

В бюретке отмечают уровень щелочи, содержимое колбы вновь оттитровывают до такого же слабо-розового окрашивания, как и в первый раз, как и в первый раз, не исчезающего при помешивании.

Делают отсчет по бюретке, показывающий количество 0,1 н раствора щелочи, пошедшей на титровании смеси в колбе, и рассчитывают содержание общего белка и казеина в молоке. Для установления содержания общего белка количество 0,1 н раствора щелочи, пошедшее на титрование, после добавления формалина умножают на коэффициент 1,92, а для определения содержания казеина – на коэффициент 1,51.

Рефрактометрический метод основан на измерении показателей преломления молока и безбелковой молочной сыворотки, полученной из того же образца молока, разность между которыми, прямо пропорциональна массовой доле белка в молоке.

Аппаратура, материалы и реактивы

Рефрактометр со шкалой массовой доли белка в диапазоне 0 — 15 %, ценой деления 0,1 %; водяная баня закрытого типа для флаконов; центрифуга для измерения массовой доли жира в молоке; электроплитка; колбы, вместимостью 1000 см 3 ; пипетки, вместимостью 1и 5 см 3 ; флаконы из стеклянной трубки для лекарственных средств, вместимостью 10 см 3 ; пробки резиновые по нормативно-технической документации; кальций хлористый 2-водный; вода дистиллированная.

Навеску 40,0 г хлористого кальция помещают в колбу, вместимостью 1000 см 3 , приливают к ней 500 см 3 воды и перемешивают до полного растворения соли. Содержимое колбы нагревают до температуры 20±2 о С и доводят водой до метки.

Наливают в 3 флакона по 5 см 3 молока, добавляют по 6 капель раствора 4%-ного раствора хлористого кальция. Флаконы закрывают пробками, и содержимое их перемешивают путем переворачивания флаконов. Помещают флаконы в водяную баню, наливая в баню воду так, чтобы ее уровню достигал половины высоты флаконов. Баню закрывают, помещают на электроплитку, доводят воду в бане до кипения и кипятят не менее 10 мин. Не открывая бани, сливают горячую воду через отверстия на крышке, наливают в баню холодную воду и выдерживают в ней не менее 2 мин.

Открывают баню, извлекают флаконы и разрушают белковый сгусток путем энергичного встряхивания флаконов. Флаконы помещают в центрифугу и центрифугируют не менее 10 мин. Образовавшуюся прозрачную сыворотку отбирают пипеткой и наносят на измерительную призму рефрактометра 1-2 капли. Закрывают измерительную призму осветительной. Наблюдая в окуляр рефрактометра, специальным корректором убирают окрашенность границы света и тени. Для улучшения резкости границы измерение проводят через 1 мин после нанесения сыворотки на призму, так как за это время из пробы удаляется воздухи и лучше смачивается поверхность осветительной призмы. Проводят по шкале «Белок» не менее 3 наблюдений. Удаляют сыворотку с призмы рефрактометра, промывают ее водой и вытирают фильтровальной бумагой.

Помещают на измерительную призму 2 капли исследуемого молока и проводят по шкале «Белок» не менее 5 наблюдений, так как резкость границы света и тени у молока хуже, чем у сыворотки. Вычисляют средние арифметические результатов наблюдений для сыворотки и молока.

Массовую долю белка в молоке (X₁) в процентах вычисляют по формуле:

где Х₂ — среднее арифметическое значение результатов наблюдений по шкале «Белок» для молока, %;

Х_З — среднее арифметическое значение результатов наблюдений по шкале «Белок» для сыворотки, %.

Предел допустимой погрешности результата измерений составляет ±0,1 % массовой доли белка при доверительной вероятности 0,90 и расхождении между двумя параллельными определениями не более 0,1 % массовой доли белка.

За окончательный результат измерения принимают среднее арифметическое, значение результатов двух параллельных вычислений массовой доли белка, округляя результат до второго десятичного знака.

В сыром коровьем молоке согласно ФЗ «Технический регламент на молоко и молочную продукцию» массовая доля белка должна быть в пределах 2,8-3,6%, но не менее 2,8%. Базисная норма массовой доли белка составляет 3,0%.

источник

78-87%) от всех белков. Основными компонентами казеина являются α s1- , β-, χ-, γ-казеин. Казеины α и β-наиболее чувствительные к ионам Ca, γ-казеин ионами Ca не осаждается, однако γ-казеин содержит чувствительную к сычужному ферменту пептидную связь, образованную остатками фенилаланина и метионина. Казеин, как и любой другой белок, распадается при термической обработке, однако он гораздо более термоустойчив. Для его разрушения необходимо температурное воздействие в 130 градусов Цельсия. Также, казеин образован из большого числа различных аминокислот, объединенных друг с другом в полипептидной цепи, но содержит также множество фосфатных групп, которые и связывают кальций (казеинат кальция, соль кальция)

В молоке казеин находится не в свободном виде, а в виде казеинаткальцийфосфатного комплекса – ККФК. Казеинаткальцийфосфатный комплекс образует мицеллы сферической формы, состоящие из субмицелл. Нативные мицеллы казеина имеют на поверхности общий отрицательный заряд и прочную гидратную оболочку, что в заметной степени обусловливает их устойчивость в молоке. Такой вид казеина иногда именуется как казеиноген.

При прокисании молоко сворачивается, и казеин осаждается в форме творожного сгустка. Свёртывание казеина в молоке протекает под влиянием протеолитических ферментов сычужного сока, кислот, вырабатываемых молочнокислыми бактериями, либо при прямой добавке кислот (технический казеин).

Казеин получают разными способами. Важный фактор, определяющий промышленное получение казеина, является его растворимость в различных растворах. Казеин растворим в разбавленных растворах щелочей и в сильных кислотах, однако нерастворим в разбавленных кислотах, где он выпадает в осадок. Для производства казеина применяется свежее обезжиренное молоко. Удаление жира в молоке происходит с помощью центрифугирования, после чего в него добавляют слабощелочной раствор. Для отделения малейших следов жира снова центрифугируют и приливают разбавленный раствор кислоты, чтобы добиться максимально полного выпадения казеина в осадок. Образовавшийся творожный сгусток промывают для удаления кислоты и высушивают при низкой температуре, поскольку казеин чувствителен к нагреванию.

Существуют четыре основных метода определения массовой доли белка в молоке и молочных продуктах:

– Метод формольного титрования

ГОСТ 25179-2014 устанавливает методы определения массовой доли белка в колориметрическом методе и в методе формольного титрования. ГОСТ 53951-2010, а так же ГОСТ 23327-98 регулируют измерение массовой доли белка по Кьельдалю.

Метод Кьельдаля

Данный метод основывается на сжигании органических компонентов молочной пробы в колбе Кьельдаля с добавлением серной кислоты в присутствии катализатора сульфата меди. Определяют массовую долю азота, который в ходе реакции освобождается. Массовую долю белка находят, умножая полученный результат на соответствующий коэффициент.

Массовую долю азота определяют следующими способами:

Электрохимический.Кулонометрическое титрование аммиака происходит автоматически в минерализованной пробе.

Химический. Раствор подщелачивается, аммиак с водяным паром дистиллируется, с поглощением его раствором борной кислоты и титрованием последнего раствором соляной кислоты. Индикация точки эквивалентности происходит по изменению окраски индикатора или с помощью потенциометрического анализатора.

Измерения проводится с добавлением, в колбу Кьельдаля, нескольких кусочков фарфора, примерно 10 г. сульфата калия, 0,04 г. сульфата меди. Молочную пробу отмеривают в бюксу с крышкой в количестве 5 см³, крышку закрывают и взвешивают. Перелив молоко из бюксы в колбу, пустую бюксу взвешивают и по разнице определяют массу взятого молока. В колбу с молоком осторожно по стеночкам, тем самым смывая молоко со стенок колбы, добавляют 20 см³ серной кислоты. Колбу закрывают, содержимое с осторожностью перемешивают.

Колбу устанавливают на нагревательный прибор под углом в 45º и осторожно, нагревают до тех пор, пока не прекратится бурное вспенивание и содержимое колбы не станет жидким. Далее процесс продолжают при более интенсивном нагревании. Кипящая кислота должна конденсироваться в середине горловины колбы Кьельдаля. Степень нагревания считается достаточной, когда жидкость становится прозрачной, бесцветной (при применении в качестве катализатора окиси ртути) или слегка голубоватой (при применении в качестве катализатора сульфата меди).

Как только раствор обесцветится, нагревание следует продолжать в течение 1,5 часа. После чего колбе необходимо дать остыть до комнатной температуры. Как только температура достигнет комнатной, доливают 150 см³ дистиллированной воды и вносят несколько кусочков свежепрокаленной пемзы, перемешивают, и снова остужают.

В коническую колбу отмеривают 50 см³ раствора борной кислоты, добавляют 4 капли индикатора и перемешивают.

Коническую колбу с борной кислотой устанавливают под холодильником, и соединяют при помощи аллонжа и резиновой трубки, при условии ,что конец аллонжа должен быть погружен в кислоту. Колбу Кьельдаля соединяют с холодильником при помощи каплеуловителя, проходящего через одну пробку с делительной воронкой. Отмеряют 80 см³ раствора гидроксида натрия и приливают его через делительную воронку в колбу Кьельдаля. Кран делительной воронки закрывают незамедлительно для избегания потери образующегося аммиака. Содержимое колбы Кьельдаля круговыми движениями осторожно смешивают и доводят до кипения. Пенообразования следует избегать.

В холодильнике происходит конденсация паров раствора аммиака, которые попадают в колбу с раствором борной кислоты. Перегонка продолжается пока жидкость не начнет бурлить. Степень нагрева регулируется так, чтобы время дистилляции было не менее 20 минут. Борная кислота в процессе принимает зеленую окраску. Полнота перегонки аммиака проверяется путем дополнительной перегонки в новую порцию борной кислоты (20 см³) в течение 5 минут. Окраска раствора борной кислоты не должна меняться. При перегонке не допускается нагревания раствора борной кислоты. Слишком сильное охлаждение (как правило, ниже 10ºС) недопустимо, оно может вызвать переход жидкости из конической колбы в колбу Кьельдаля. По окончании перегонки аллонж вынимают из раствора борной кислоты, и продолжают перегонку в течение 1-2 минут. После прекращения нагревания отсоединяют аллонж. Поверхности аллонжа промываются небольшим количеством дистиллированной воды, сливая ее в коническую колбу. Дистиллят титруют раствором соляной кислоты до перехода зеленого цвета в серый. При избытке титранта раствор приобретает фиолетовый цвет.

Параллельно основному проводят контрольный опыт, применяя 5 см³ дистиллированной воды вместо молочной пробы. Контрольный опыт необходимо повторить не менее 5 раз. По объему аммиака, определяемого титрованием, устанавливают количество общего азота. При умножении количества азота на принятый коэффициент 6,38 для молока; 6,25 для молокосодержащих продуктов; 6,28 для сыворотки, таким образом, находят содержание общего белка в молоке.

Колориметрический метод.

Метод основывается на способности белков молока связывать кислый краситель (при рН ниже изоэлектрической точки), образуя с ним нерастворимый осадок, удаляя который измеряют оптическую плотность исходного раствора красителя относительно полученного раствора.

В пробирку отмеряют 1 см³ молока, приливают 20 см³ рабочего раствора сине-черного красителя, который готовится путем смешивания водного раствора красителя и кислого буферного раствора с добавлением поверхностно-активного вещества (ПАВ). Пробирку закрывают и получившуюся смесь интенсивно перемешивают. Встряхивание не допускается во избежание появления трудноразрушаемой пены. Выпавший осадок центрифугируют 10 минут при 1500 об./мин (20 минут при меньшей частоте вращения в 1000 об./мин.) Далее необходимо отобрать 1 см³ надосадочной жидкости и перенести в мерную колбу №1. Дистиллированной водой доливают до метки 50 см³ и перемешивают. В мерную колбу №2 помещают 1 см³ красителя и так же доливают дистиллированной водой до метки 50 см³. Используя колориметр или спектрофотометр, измеряют оптическую плотность разбавленного раствора красителя (колба №2) по отношению к анализируемой пробе (колба №1). После каждых 24х измерений кювету промывают, специально приготовленным по ГОСТу, буферным раствором.

Массовую долю белка Х4, %, вычисляют по формуле:

где 7,78 — эмпирический коэффициент, %/ед. оптической плотности;

D — измеренная оптическая плотность, ед. оптической плотности;

1,34 — эмпирический коэффициент, %.

Окончательный результат есть среднеарифметическое значение результатов измерений, выполненных в условиях повторяемости, округленное до второго десятичного знака.

Метод формольного титрования.

Этот метод основывается на нейтрализации карбоксильных групп моноаминодикарбоновых кислот белков раствором гидроксида натрия. Количество гидроксида натрия, затраченного на нейтрализацию, пропорционально массовой доле белка в молоке.

В стакан помещают стержень магнитной мешалки и вносят 20 см 3 молочной пробы. Далее стакан устанавливается на магнитной мешалке, двигатель мешалки запускают и в молочную пробу погружают электроды потенциометрического анализатора. Постепенно приливают раствор гидроокиси натрия. При достижении точки эквивалентности (pH = 9, подавая раствор по каплям начиная с рН = 4) и окончании времени выдержки, которая длится 30 сек., определяют количество раствора гидроокиси натрия, израсходованное на нейтрализацию молочной пробы до внесения формальдегида. После в стакан вносят 5 см 3 формальдегида и засекают время. Через 2 — 2,5 мин. продолжают титрование (снова до точки эквивалентности, где рН=9) и по окончании процесса определяют общее количество раствора, использованного для нейтрализации.

Параллельно основному проводится контрольный опыт по нейтрализации смеси 20 см 3 воды и 5 см 3 раствора формальдегида.

Массовую долю белка Х₃, %, вычисляют по формуле:

V₂– общее количество раствора, израсходованное на нейтрализацию;

V₁– количество раствора, израсходованное на нейтрализацию до внесения формальдегида;

V – количество раствора, израсходованное на контрольный опыт;

0,96 – эмпирический коэффициент;

K – поправка к результату измерения массовой доли белка, %.

Рефрактометрический метод

Метод основывается на измерении разности показателей преломления луча света, после прохождения его через молоко и безбелковую молочную сыворотку, полученную из той же молочной пробы. Разность между ними прямо пропорциональна массовой доле белка в молоке.

Навеску 40,0 г хлористого кальция вносят в колбу вместимостью 1000 см 3 , сюда же добавляют 500 см 3 воды и перемешивают до полного растворения осадка. Содержимое колбы нагревают до температуры 20 о С и доводят дистиллированной водой до метки.

Наливают в 3 флакона по 5 см 3 молока, вносят по 6 капель 4%-ного раствора хлористого кальция. Закрывают флаконы пробками, и их содержимое перемешивают, переворачивая флаконы. Далее флаконы помещают в водяную баню, при этом уровень воды в бане должен достигать половины высоты флаконов. Баню закрывают, ставят на электроплитку, доводят содержимое бани до кипения и продолжают кипятить как минимум 10 мин. Сливают горячую воду через отверстия на крышке, не открывая бани, добавляют в баню холодную воду и держат в ней как минимум 2 мин.

Через время баню открывают, достают флаконы и разрушают белковый сгусток, энергично встряхивая флаконы. Флаконы устанавливают в центрифугу и центрифугируют как минимум 10 мин. Получившуюся прозрачную сыворотку отбирают пипеткой и капают на измерительную призму рефрактометра 1-2 капли. Закрывают измерительную призму осветительной. Наблюдая в окуляр рефрактометра, специальным корректором убирают окрашенность границы света и тени. Для того чтобы улучшить резкость границы, измерение проводят через 1 мин после нанесения сыворотки на призму, так как за это время из пробы удаляется воздух и происходит лучшее смачивание поверхности осветительной призмы. Осуществляют по шкале «Белок» как минимум 3 наблюдения. Удаляют сыворотку с поверхности призмы рефрактометра, промывают ее водой и протирают фильтровальной бумагой.

Вносят на измерительную призму 2 капли исследуемого молока и проводят по шкале «Белок» как минимум 5 наблюдений, так как резкость границы света и тени у молока хуже, чем у сыворотки. Вычисляют средние арифметические результаты наблюдений для сыворотки и молока.

Массовую долю белка в молоке X1, %, в процентах вычисляют по формуле:

Х2 — среднее арифметическое значение результатов измерений по шкале «Белок» для молока, %;

ХЗ — среднее арифметическое значение результатов измерений по шкале «Белок» для сыворотки, %.

Сумм Б. Д. Основы коллоидной химии: учебник для студентов хим. и нехим. спец. — М.: Высшая школа, 2010 — 410 с.

Боровская Л.В. Электронный учебно-методический комплекс дисциплины «Физическая и коллоидная химия: учебно-методический комплекс дисциплины» Учебное пособие. ФГУП НТЦ «ИНФОРМРЕГИСТР» Депозитарий электронных изданий. Москва 2010 .

Феноменологическая модель термокислотной коагуляции белков обезжиренного молока / Л.А. Остроумов, А.М. Осинцев, И.А. Смирнова и др. // Техника и технология пищевых производств. – 2011. – № 1. – С. 133–139.

Транспортировка и хранение скоропортящихся пищевых продуктов. Данилин В.Н., Петрашев В.А., Боровская Л.В.// Известия высших учебных заведений. Пищевая технология. 1996. № 1-2. С. 7

Осинцев, А.М. Роль ионов кальция в коллоидной стабильности мицелл казеина / А.М. Осинцев, В.И. Брагинский О.Ю. Лапшакова А.Л. Чеботарев // Техника и технология пищевых производств. – 2009. – № 1. – С. 63–67

Исследование термодинамических свойств белково-полисахаридной системы методом дифференциальной сканирующей калориметрии /Бугаец Н.А., Тамова М.Ю., Боровская Л.В., Миронова О.П. //Известия высших учебных заведений. Пищевая технология Издательство: Кубанский государственный технологический университет .Краснодар, № 5-6,с.112.

источник

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3 ИЗУЧЕНИЕ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАССОВОЙ ДОЛИ БЕЛКА В МОЛОКЕ И МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТАХ

Цель работы: Ознакомиться с различными методами определения белка в молоке.

1. Изучить различные методы определения белка в молоке.
2. Дать сравнительный анализ полученных результатов, указать причины расхождений значений массовой доли белка при определении различными методами.
3. Сделать вывод о целесообразности использования исследованных методов в лабораторных и промышленных масштабах.

Краткие теоретические сведения

Определение белковых веществ в молоке методом формольного титрования. Метод основан на связывании свободных аминогрупп белков альдегидными группами формалина, в результате чего кислотность молока изменяется. Наблюдается сдвиг (на кривой титрования) в область более низких значений рН. Метод применим для определения суммы белковых веществ в молоке (кислотностью не выше 22 0 Т).

Определение процентного содержания белка в молоке рефрактометрическим методом. Показатель преломления П_д молока состоит из суммы П_д воды и П_д растворенных в ней белков, молочного сахара, небелковых азотистых веществ и солей. Небелковые азотистые вещества, молочный сахар и соли находятся в молоке в виде истинного раствора, белки — в виде коллоидного. Жир в молоке находится в виде эмульсии и на суммарный показатель преломления молока не влияет. Содержание белков (сумму казеина, альбумина, глобулина) в молоке определяют по разности показаний по шкале “Белок” молока и безбелковой сыворотки при одинаковых условиях производимых измерений.

Колориметрический метод определения белка в молоке. Метод предназначен для исследовательских целей. В основу его положена способность белков связывать кислые красители. Колориметрическим методом, как и стандартным методом Къельдаля, определяют массовую долю общего белка, включая фракцию небелкового азота.

Экспрессное измерение содержания белка в молоке на приборах белкомер БМЦ-1 или БМ-003. Принцип действия прибора основан на фотоколориметрическом методе измерения оптической плотности отфильтрованной смеси дозы молока и дозы раствора красителя органического кислотного сине-черного.

Метод основан на способности белков молока при рН ниже изоэлектрической точки связывать кислые красители, образуя с ними нерастворимый комплекс, при этом оптическая плотность раствора красителя уменьшается пропорционально количеству белка. После удаления нерастворимого комплекса вновь измеряют оптическую плотность раствора, содержащего остаточно несвязанный краситель, которая пропорциональна массовой доле белка в молоке. Конструктивно прибор состоит из двух блоков: измерительного и блока приготовления пробы.

Определение общего белка в молоке методом Къельдаля. Метод определения азотистых веществ в пищевых продуктах был предложен Къельдалем в 1883 г. и до сих пор, с небольшими изменениями, является основным методом определения белковых веществ в молоке и молочных продуктах. Къельдаль разработал метод определения количества белков по азоту, основываясь на том, что органические вещества при нагревании с концентрированной серной кислотой окисляются до H₂O и CO₂, а азот аминогрупп — NH₂ переходит в сернокислый аммоний.

Серная кислота при нагревании разлагается на сернистый ангидрид, атомарный кислород и воду:

Выделяющийся атомарный кислород окисляет аминнокислоты. После окончания окисления аминный азот белковых веществ будет находиться в форме аммонийной соли. Переводя азот белковых соединений в форму сернокислого аммония, определяют количество азота в форме аммиака, для этого раствор разбавляют водой, серную кислоту нейтрализуют раствором едкого натра и избытком его создают щелочную реакцию, благодаря чему аммонийные соли выделяют аммиак:

Образующийся аммиак перегоняют в приемную колбу с борной кислотой, в результате получается борат аммония, который в водной среде сильно гидролизован и имеет щелочную среду, Для нейтрализации его используют соляную кислоту. По количеству мл 0,1 н раствора HCl, пошедших на титрование бората, находят количество азота. Для определения количества белков количество азота умножают на коэффициент 6,38. Коэффициент установлен из расчета, что количество азота в молочных белках равно 15,65 %.

Оборудование, приборы и технические средства:

Рефрактометр, термостат водяной циркуляционный, весы, пипетки на 1мл, 5 мл, 10 мл, 20 мл, прибор для отмеривания формальдегида вместимостью 1 мл, пробирки емкостью 10 мл, колбы мерные на 100 мл, фильтровальная бумага, колба Къельдаля, бюкса с крышкой, уксусной кислоты 10%-й раствор, хлорид кальция 4%-й раствор, фенолфталеин 2%-й раствор, гидроокись натрия 0,1 н раствор, формалин 36-40%-й раствор, сульфат кобальта 25%-й раствор, молоко разного состава; сернокислый калий, окись ртути, сернокислая медь, серная кислота, индикатор Таширо, борная кислота.

Порядок выполнения работы

Определение белковых веществ в молоке методом формольного титрования. В стакан вместимостью 150-200 мл вносят пипеткой 20 мл молока, 0,25 мл 2%-го раствора фенолфталеина и титруют 0,1 н. раствором гидроксида натрия до появления слабо-розовой окраски, соответствующей контрольному эталону. Затем вносят 4 мл нейтрализованного 36-40%-го формальдегида и вторично титруют до такой окраски, как и при первом титровании.

Для приготовления контрольного эталона окраски в такой же стакан отмеривают 30 мл молока и 1 мл 0,25 %-го раствора сульфата кобальта. Эталон пригоден для работы в течение одной смены. Во избежание отстоя сливок эталон рекомендуется периодически переливать. Долю общего белка в молоке можно определить также по таблице 3.1

Количество 0,1 н раствора NaOH, см 3

Массовая доля белков в молоке, %

Количество 0,1 н раствора NaOH, см 3

Массовая доля белков в молоке, %

2,45
2,50
2,55
2,60
2,65
2,70
2,75
2,80
2,85
2,90
2,95
3,00
3,05
3,10
3,15
3,20
3,25

2,35
2,40
2,44
2,49
2,54
2,59
2,64
2,69
2,73
2,78
2,83
2,88
2,93
2,98
3,03
3,07
3,12

3,30
3,35
3,40
3,45
3,50
3,55
3,60
3,65
3,70
3,75
3,80
3,85
3,90
3,95
4,00
4,05
4,10

3,16
3,21
3,25
3,31
3,35
3,40
3,45
3,50
3,55
3,60
3,65
3,69
3,74
3,79
3,84
3,89
3,94

Параллельно проводят контрольный опыт по нейтрализации смеси 20 мл воды и 5 мл раствора формальдегида.

Массовую долю белка (Х₂) в процентах вычисляют по формуле:

где: V₂ — общее количество раствора, израсходованное на нейтрализацию, мл; V₁ — количество раствора, израсходованное на нейтрализацию до внесения формальдегида, мл;

V — количество раствора, израсходованное на контрольный опыт, мл;

0,96 — эмпирический коэффициент, % / мл;

Х₁ — поправка к результату измерения массовой доли белка, %.

Определение процентного содержания белка в молоке рефрактометрическим методом. Для получения безбелковой сыворотки отмеряют во флакон 5 мл исследуемого молока и добавляют в него 5-6 капель 4%-го раствора хлористого кальция (40 г СаСI₂ в одном литре дистиллированной воды).

Флакон закрывают пробкой и слегка взбалтывают содержимое. Одновременно готовят 2-3 параллельных пробы (флаконы должны быть пронумерованы). Флаконы помещают в бачок термостата, наливают в него воду до половины высоты флаконов, закрывают крышкой. Воду в бачке кипятят в течение десяти минут. Затем горячую воду заменяют холодной. Флаконы охлаждают в течение двух минут. Флаконы вынимают из бачка, встряхивают так, чтобы сгусток разрушился и выделившаяся сыворотка смешалась с конденсатом.

Отфильтрованную сыворотку наносят на измерительную призму рефрактометра и плавно закрывают ее осветительной призмой. Наблюдая в окуляр, убирают окрашенность границы светотени. Для улучшения резкости границы измерение необходимо проводить через 0,5 — 1 мин., т.к. за это время из пробы удаляется воздух и лучше смачивается поверхность осветительной призмы.

По шкале «Белок» снимают показание для сыворотки. Измерения повторяют 3-4 раза и подсчитывают среднеарифметическое значение Б_с. Удалив сыворотку с обеих призм, их тщательно промывают водой и вытирают чистой мягкой салфеткой или ватой. Затем 1-2 капли исследуемого молока помещают на измерительную призму.

Проводят измерения по шкале «Белок» в том же порядке, как на сыворотке. Так как резкость границы у молока несколько хуже, чем у сыворотки и воды, измерения повторяют 4-5 раз и подсчитывают среднеарифметическое значение Б_м. Содержание белков в молоке определяют по формуле:

Общий белок (белки и небелковые азотистые вещества) определяют по формуле:

По шкале «Белок» также можно определить содержание казеина, сывороточных белков (альбумина и глобулина) в молоке. Содержание казеина в молоке определяют по формуле:

где Б_к.с. — показание по шкале «Белок» для бесказеиновой сыворотки.

Для получения бесказеиновой сыворотки во флакон с молоком (5 мл) вносят 10 капель 10%-го раствора уксусной кислоты. Содержание сывороточных белков определяют по формуле:

Определение общего белка в молоке методом Къельдаля. В колбу Къельдаля помещают последовательно несколько стеклянных бусинок или кусочков фарфора, около 10 г сернокислого калия, 0,5 г окиси ртути или 0,04 г сернокислой меди. В бюксу с крышкой отмеривают 5 мл молока, крышку закрывают и взвешивают с точностью до 1 мг. Пустую бюксу вновь взвешивают и по разнице между массой бюксы с молоком и массой пустой бюксы устанавливают массу взятого молока. В колбу добавляют 20 мл серной кислоты, вливая осторожно по стенкам колбы, смывая с них капли молока. Колбу закрывают грушеобразной стеклянной пробкой и осторожно круговыми движениями перемешивают содержимое колбы.

Колбу ставят на нагревательный прибор в наклонном положении под углом 45 0 и осторожно нагревают. Продолжают нагревание колбы до тех пор, пока не прекратится пенообразование и содержимое колбы не станет жидким. Затем сжигание продолжают при более интенсивном нагревании. Степень нагревания считают достаточной, когда кипящая кислота конденсируется в середине горловины колбы Къельдаля.

После осветления раствора нагревание продолжают в течение 1,5 ч, после чего колбе дают остыть до комнатной температуры. Добавляют 150 мл дистиллированной воды и несколько кусочков свежепрокаленной пемзы, перемешивают и снова охлаждают.

В коническую колбу отмеривают 50 мл раствора борной кислоты, добавляют 4 капли индикатора Таширо и перемешивают. Коническую колбу соединяют с холодильником с помощью аллонжа и резиновой пробки так, чтобы конец аллонжа был ниже поверхности раствора борной кислоты в конической колбе. Колбу Къельдаля соединяют с холодильником при помощи каплеуловителя, проходящего через одну пробку с делительной воронкой. Градуированным цилиндром отмеривают 80 мл раствора гидроокиси натрия (при применении в качестве катализатора красной окиси ртути используют раствор гидроокиси натрия, содержащий сульфид натрия) и через делительную (или капельную) воронку вносят его в колбу Къельдаля. Сразу же после выливания раствора закрывают кран делительной воронки для избежания потери образующегося аммиака. Содержимое колбы Къельдаля осторожно смешивают круговыми движениями и нагревают до кипения. При этом необходимо избегать пенообразования.

Продолжают перегонку до тех пор, пока жидкость не начнет вскипать толчками. При этом регулируют степень нагрева так, чтобы время дистилляции было не более 20 мин. Убедиться в полноте перегонки аммиака можно путем дополнительной перегонки в новую партию борной кислоты (20 мл) в течение 5 мин. Окраска раствора борной кислоты должна остаться без изменения. При перегонке не допускают нагревания раствора борной кислоты в конической колбе. Слишком сильное охлаждение (ниже +10 0 С) также нежелательно, так как оно может вызвать переброс жидкости из конической колбы в колбу Къельдаля.

Перед окончанием перегонки опускают коническую колбу так, чтобы конец аллонжа оказался над поверхностью раствора борной кислоты, и продолжают перегонку в течение 1-2 мин. Прекращают нагревание и отсоединяют аллонж. В коническую колбу смывают внешнюю и внутреннюю поверхности аллонжа небольшим количеством дистиллированной воды. Титруют дистиллят 0,1 н раствором соляной кислоты до перехода зеленого цвета в фиолетовый.

Параллельно проводят контрольный анализ так же, как и основной, применяя 5 мл дистиллированной воды вместо молока. Контрольный анализ проводят в каждой серии определения количества белка и при каждой замене реактивов.

Массовую долю общего белка (Б) в процентах вычисляют с точностью до третьего десятичного знака по формуле:

где 1,4 — количество азота, эквивалентное 1 мл 0,1 н раствора соляной кислоты, мг;

0,1 — нормальность раствора соляной кислоты;

V₁ — объем 0,1 н соляной кислоты, израсходованной на титрование дистиллята в основном анализе, мл;

V — объем 0,1 н соляной кислоты, израсходованной на титрование дистиллята в контрольном анализе, мл;

6,38 — коэффициент для перевода массовой доли общего азота на массовую долю общего белка;

m — масса молока, взятого на анализ, г.

Отчёт о выполнении задания

Результаты работы представить по форме, приведённой в табл.3.2

Метод формального титрования

1. Белки молока, их классификация.
2. Методы формольного титрования и Къельдаля, их химическая сущность.
3. Рефрактометрический метод, на каких свойствах казеина и сывороточных белков он основан?

источник

Название	Молока и молочных продуктов
страница	21/28
Дата публикации	29.07.2013
Размер	3.34 Mb.
Тип	Документы

userdocs.ru > Химия > Документы

Метод основан на установлении разности показателей преломления луча света после прохождения через молоко и полученной из него безбелковой сыворотки (для осаждения белков используют раствор хлорида кальция и нагревание пробы).

Массовую долю белков в молоке данным методом определяют на рефрактометрах АМ-2 (рис. 68) и ИРФ-464. На приборах можно также определить массовую долю СОМО, измеряя разность между показателями преломления молока и дистиллированной воды.

Метод стандартизован. На его основе созданы отечественные и импортные белкоме-ры молока.

Колориметрический метод основан на способности белков молока связывать кислые красители (сине-черный, амидо-черный) с образованием нерастворимых комплексов.

1 — основание; 2 — шкала компенсатора; 3 — компенсатор; 4 — камера с призмами; 5—осветитель; 6— окуляр; 7— стрелка-указатель; 8— подвижная шкала; 9— рукоятка

Количество связанного красителя пропорционально массовой даже боков в молоке. Концентрацию не связанного белком красителя определи ют фотометрически, контролируя оптическую плотность фильтрата после удаления нерастворимых комплексов.

Методика определения массовой доли белков в молоке сводится ж следующему. В пробирку отмеривают 1 см 3 молока, приливают 20 см рабочего раствора сине-черного красителя (готовится путем cmcl ния водного раствора красителя и кислого буферного раствора с. лением поверхностно-активного вещества) и смесь интенсивно перемешивают. Выпавший осадок центрифугируют или отфильтровывай: Полученный фильтрат разводят в 100 раз и колориметрируют на фст:-колориметре (ФЭК-56М, ФЭК-Н-57 и др.) при длине волны 5Х-600 нм в кювете с рабочей длиной 10 мм. Массовую долю белков в ть-локе в процентах устанавливают, пользуясь градуировочным графиком. Для построения графика в нескольких пробах молока (с массовой лей белков 2,5—3,5%) определяют содержание белков методом даля и оптическую плотность фильтрата, полученного указанным способом.

^ МЕТОДЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФОТОКОЛОРИМЕТРИЧЕСКИХ И ДРУГИХ ПРИБОРОВ

Фотоколориметрические полуавтоматические и автоматические приборы — отечественные цифровые белкомеры БМЦ-1 и БМЦ-2, датские белкомеры «Про-Милк МК2», «Про-Милк-Автоматик» — разработаны на основе колориметрического метода. На рис. 69 показан датский прибор «Про-Милк МК2».

Прибор состоит из дозатора и емкости для красителя, распределительной трубки, держателя со смесительной трубкой, фотоколориметрической ячейки и измерительного прибора. Массовую долю белков в молоке измеряют следующим образом. С помощью шприца отбирают пробу молока (1 см 3 ) и выдавливают в смесительную трубку, в которую поступает краситель (20 см 3 ). Смесь перемешивают и фильтруют под давлением подаваемого в смесительную трубку воздуха. Далее фильтрат поступает в кювету фотоколориметрической ячейки. Световой поток, прошедший через кювету с фильтратом, преобразуется в ток и фиксируется индикаторным цифровым устройством.

Прибор «Про-Милк МК2» компактен, надежен в работе, легко обслуживается, на измерение одной пробы расходуется не более 1 мин (производительность прибора составляет до 600 образцов молока в час).

Отечественные белкомеры БМЦ-1 и БМЦ-2 работают аналогичным образом. Пробы молока для анализа подаются вручную (БМЦ-2) или автоматически (БМЦ-1). В отличие от датского прибора «Про-Милк МК2»

Рис. 69. Прибор «Про-Милк МК2»:

/ — измерительный прибор; ^ 2 — фотоколориметрическая ячейка; 3 — держатель; 4 — смесительная трубка; 5 — распределительная трубка; 6 — емкость для красителя; 7 —

дозатор красителя; 8 — резиновая груша

нерастворимые комплексы белков с красителем отделяют центрифугированием.

Кроме сложных и громоздких фотоколориметрических приборов для контроля массовой доли белков в молоке используют многокомпонентные инфракрасные анализаторы («Милко-Скан», «Аналикон») и ультразвуковой анализатор «Лактан» (модели 150, 200, 500 и 550).

^ ОПРЕДЕЛЕНИЕ В МОЛОКЕ МАССОВОЙ ДОЛИ ЛАКТОЗЫ

Массовую долю лактозы в молоке (а также сахарозы, внесенной в некоторые молочные продукты) определяют физическими (рефрактометрический, спектрофотометрический, поляриметрический) и химическими (иодометрический, метод Бертрана и др.) методами.

Рефрактометрический метод доступен, относительно прост и достаточно точен. Им определяют массовую долю лактозы в свежем молоке кислотностью не выше 20°Т.

^ Принцип метода. Метод основан на способности сыворотки (полученной из молока осаждением белков) преломлять проходящий через нее свет в зависимости от концентрации лактозы. Показатель преломления молочной сыворотки устанавливают по углу отклонения светового луча слоем сыворотки, заключенной между призмами рефрактометра.

Приборы. Толстостенная пробирка с пробкой; пипетка вместимостью 5 см 3 ; водяная баня; термометр; стеклянная трубка; вата; рефрактометр типа РЛ (рис. 70) или РПЛ.

^ Материал для исследования и реактив. Молоко свежее; 4%-ный раствор хлорида кальция.

Последовательность определения. В толстостенную пробирку отмеривают 5 см 3 исследуемого молока и добавляют 5 капель 4%-ного раствора хлорида кальция. Пробирку плотно закрывают корковой или резиновой пробкой и для полного осаждения белков ставят ее в кипящую водяную баню. Через 10 мин пробирку вынимают из бани и охлаждают до 18—20°С, опуская в холодную воду. Затем берут стеклянную трубку или пипетку с ватным тампоном в нижней части и набирают сыворотку (жидкость слегка мутноватая), фильтруя ее через вату.

Содержание лактозы в сыворотке определяют при помощи рефрактомет-

ра. В течение 10—15 мин через призмы рефрактометра пропускают воду с температурой 17,5°С. Далее откидывают верхнюю призму, на поверхность нижней призмы быстро наносят несколько капель молочной сыворотки и верхнюю призму опускают. Наблюдая в окуляр, движением специальной рукоятки вверх и вниз совмещают границу между темной и светлой частями поля зрения с пунктирной линией (указателем). Если граница между темным и светлым полем неотчетливая (радужная), вращением винта компенсатора достигают резкости (монохроматичности). Показатель преломления молочной сыворотки отсчитывают по левой шкале (деление шкалы должно совпадать с пунктирной линией, совмещенной с границей темного и светлого полей) с точностью до 0,0001. Массовую долю лактозы в молоке находят, пользуясь табл. 45.

Ошибки анализа и их предупреждение. Недостаточно точные результаты анализа могут быть вызваны следующими причинами.

Неточные показания рефрактометра. ^ Его следует проверить по дис
тиллированной воде.
Для исследования берут пробу молока кислотностью выше 20Т. При
данном методе анализа повышение кислотности молока способствует
завышению результатов. Необходимо исследовать только свежее молоко.
Не полностью осаждены белки при получении сыворотки. Следует
повторно их осадить на водяной бане.
Не выполняется правило отсчета показателя преломления молоч
ной сыворотки при температуре 17,5°С и четком установлении границы

между темным и светлым полями. ^ Тщательно контролировать температуру воды, пропускаемой через призмы рефрактометра, и добиваться четкой границы.

5. Завышение результатов вследствие испарения влаги. ^ Показания реф рактометра рекомендуется снимать быстро.

Наиболее точным (арбитражным) считается иодометрический метод контроля содержания лактозы и других Сахаров в молоке и молочных продуктах. Мы с ним познакомимся в разделе анализа молочных консервов. Наряду с ним, при определении Сахаров в молочных продуктах широко применяют поляриметрический метод.

Метод контроля массовой доли лактозы в молоке ^использованием автоматических приборов мы уже рассматривали, разбирая принцип работы ИК-анализаторов («Милко-Скан» и др.).

^ ОПРЕДЕЛЕНИЕ В МОЛОКЕ МАССОВОЙ ДОЛИ КАЛЬЦИЯ

Концентрацию металлов (кальция) в растворах можно установить химическими и физическими методами. Наиболее быстрым и простым является комплексометрический или трилонометрический метод (по А. Я. Дуденкову).

Данным методом можно контролировать не только массовую долю общего кальция в молоке, но и содержание в нем условно растворимого кальция, который остается в сыворотке после осаждения белков молока трихлоруксусной кислотой или сычужным ферментом.

^ Принцип метода. Определение массовой доли кальция основано на образовании устойчивого комплекса трилона Б (динатриевой соли эти-лендиаминтетрауксусной кислоты) с двухвалентным кальцием:

Комплексное соединение трилона Б настолько прочно связывает катионы кальция, что при его добавлении к молоку растворяются плохо растворимые соединения кальция с фосфором и белками.

Если в молоко внести индикатор, образующий с ионами кальция окрашенные соединения, то при добавлении трилона Б в точке эквивалентности окраска индикатора изменится. В качестве металлоиндикатоpa в методе А. Я. Дуденкова применяют мурексид, который в щелочной среде при отсутствии ионов кальция окрашивается в сине-фиолетовый цвет, а при их наличии — в розовый. В методике используется способ обратного титрования: в молоко вносят избыток трилона Б, связываемый затем раствором хлорида кальция.

Приборы. Коническая колба вместимостью 250—300 см 3 ; пипетки вместимостью 5 см 3 ; мерный цилиндр на 100 см 3 ; бюретки на 20 см 3 .

^ Материал для исследования и реактивы. Молоко; 2 н. (или 8%-ный ) раствор гидроксида натрия; 0,1 н. раствор трилона Б (приложение 6); смесь индикатора мурексида с хлоридом натрия (соотношение 1:50); 0,1 н. раствор хлорида кальция (приложение 7); вода дистиллированная.

^ Последовательность определения. В коническую колбу вместимостью 250—300 см 3 отмеривают 5 см 3 молока, приливают 90—95 см 3 дистиллированной воды, 5 см 3 2 н. раствора гидроксида натрия, 4 см 3 0,1 н. раствора трилона Б, перемешивают и оставляют на 2 мин, Вносят на кончике шпателя 0,04—0,05 г мурексида, раствор тщательно перемешивают (он окрашивается в сиреневый цвет) и титруют 0,1 н, раствором хлорида кальция до устойчивого розового окрашивания. Далее вновь добавляют по каплям 0,1 н. раствор трилона Б до появления сиреневой окраски (заметного синеватого оттенка). Массовую долю кальция х (мг%) рассчитывают по формуле

где Vj — общий объем 0,1 н. раствора трилона Б, добавленного к молоку (4 см 3 плюс количество, израсходованное на второе титрование), см 3 ; V— объем 0,1 н. раствора хлорида кальция, израсходованного на обратное титрование трилона Б, см 3 ; V— объем исследуемого молока, см 3 ; 2 — количество кальция, соответствующее 1 см 3 0,1 н. раствора трилона Б, мг; 0,97 — коэффициент для перерасчета количества молока из кубических сантиметров в граммы.

При исследовании 5 см 3 молока формула приобретает следующий вид:

Следовательно, для подсчета массовой доли кальция в молоке необходимо объем трилона Б, связавшегося с кальцием, умножить на 38,83 или воспользоваться данными табл. 46.

При титровании в присутствии мурексида наблюдается недостаточно четкий переход окраски индикатора. Для достижения более резкого перехода окраски рекомендуют смешивать мурексид с другим индикатором или применять более чувствительный индикатор флуорексон, образующий с кальцием соединение, флуоресцирующее зеленым светом, а при его отсутствии — имеющий красную или желтую окраску.

Из других методов следует отметить химический метод (принятый Международной молочной федерацией в качестве стандартного) — осаждение кальция оксалатом аммония, и физический метод пламенной фотометрии — измерение яркости излучения кальция в пламени фотометра. Оба метода весьма трудоемки: первый предусматривает анализ получаемой из молока сыворотки, второй — предварительное озоление пробы молока.

Содержание ионов кальция в молоке можно определить ионометри-ческим методом с использованием кальцийселективного электрода.

^ ОПРЕДЕЛЕНИЕ В МОЛОКЕ МАССОВОЙ ДОЛИ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ

Как мы уже отмечали, витамин С в молоке содержится главным образом в виде аскорбиновой кислоты, и лишь его небольшая часть — в виде дегидроаскорбиновой кислоты.

Аскорбиновая кислота способна легко окисляться, восстанавливая многие соединения, в том числе специальные окислительно-восстановительные индикаторы, меняющие при этом свою окраску, — метилено-вый голубой, 2,6-дихлорфенолиндофенол и др. На данном свойстве витамина и основаны методы количественного определения аскорбиновой кислоты в пищевых продуктах (молоке).

Для определения дегидроаскорбиновой кислоты необходимо предварительно ее восстановить в аскорбиновую кислоту с помощью сероводорода, глутатиона и др.

^ Принцип метода. В основе метода лежит способность аскорбиновой кислоты обесцвечивать окрашенный раствор индикатора 2,6-дихлор-

В результате реакции аскорбиновая кислота переходит в дегидроас-корбиновую, а окрашенный в синий цвет индикатор (краска) восстанавливается до бесцветной формы. В эквивалентной точке избыток краски в кислой среде дает розовое окрашивание. По количеству индикатора 2,6-дихлорфенолиндофенола, израсходованного на окисление аскорбиновой кислоты, рассчитывают содержание последней в молоке.

Обычно титрование аскорбиновой кислоты индикатором ведут в прозрачном растворе (фильтрате), поэтому для анализа молока необходимо удалить из него белки. В рассматриваемом ниже ускоренном методе вместо осаждения белков предусматривается разбавление молока водой.

Приборы. Колбы конической формы вместимостью 50 см 3 ; пипетки вместимостью 1; 5 и 10 см 3 ; микробюретка (или градуированная пипетка вместимостью 1 или 2 см 3 ).

^ Материал для исследования и реактивы. Молоко; 2%-ный раствор соляной кислоты; 0,001 н. раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола (приложение 8); вода дистиллированная.

^ Последовательность определения. В коническую колбу вместимостью 50 см 3 отмеривают пипеткой 5 см 3 молока, приливают 10 см 3 дистиллированной воды и перемешивают смесь. В другую колбу вносят 5 см 3 разведенного в три раза молока, 1 см 3 2%-ного раствора соляной кислоты и 10 см 3 дистиллированной воды. Содержимое колбы тщательно перемешивают и титруют из микробюретки 0,001 н. раствором 2,6-дихлорфе-нолиндофенола, прибавляя его по каплям до слабо-розового окрашивания, сохраняющегося в течение 30—60 с.

Массовую долю аскорбиновой кислоты в молоке (мг%) вычисляют

где Vj — объем раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, пошедшего на титрование, см 3 ; К — поправочный коэффициент к титру краски; 3 — разведение молока; 0,088 — количество аскорбиновой кислоты, соответствующее 1 см 3 0,001 н. раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, мг; V— объем исследуемого раствора (разведенного молока), взятого для титрования, см 3 .

источник