Меню Рубрики

Диагноз гепатит с а анализ

Коварство вирусных заболеваний, таких как гепатиты, заключается в том, что заражение происходит вмиг, но больной долгое время может даже не догадываться о том, что он инфицирован. Точно диагностировать болезнь и подобрать необходимую терапию помогают вовремя сделанные анализы. Давайте поговорим о них более подробно.

Под гепатитом понимают воспалительное заболевание печени. Оно может иметь как острую, так и хроническую форму. Чаще всего встречаются болезни вирусного характера. На сегодняшний день известно семь основных разновидностей вирусов гепатитов – это группы A, B, C, D, E, F и G. Однако, независимо от типа вируса, на начальном этапе болезнь протекает схоже: неприятные ощущения в правом подреберье, температура, слабость, тошнота, ломота во всем теле, потемнение мочи, желтуха. Все эти симптомы являются поводом для сдачи анализа на гепатит.

Следует знать, что заболевание может передаваться разными способами: через зараженную воду и пищу, через кровь, слюну, половым путем, при использовании чужих средств гигиены, в том числе бритвы, полотенца, маникюрных ножниц. Поэтому если симптомы не проявляются (а инкубационный период может длиться до двух месяцев и даже более), но у вас имеются предположения, что вы можете быть заражены, то тест на гепатит нужно сделать как можно скорее.

Кроме того, регулярно сдавать подобные анализы необходимо медицинским работникам, сотрудникам служб безопасности, специалистам по маникюру и педикюру, стоматологам, словом – всем, чья повседневная работа связана с соприкосновением с биологическими материалами других людей. Также тест показан специалистам, чья профессиональная деятельность сопряжена с поездками в экзотические страны.

Вызывается РНК-вирусом семейства Picornaviridae. Вирус передается через бытовые предметы и продукты питания, поэтому заболевание также называют «болезнь грязных рук». Симптоматика типичная для любого вида гепатита: тошнота, температура, боль в суставах, слабость. Затем проявляется желтуха. Инкубационный период длится в среднем 15–30 дней. Различают острую (желтушную), подострую (безжелтушную) и субклиническую (бессимптомную) формы болезни.

Выявить гепатит А позволяет анализ Anti-HAV-IgG (антитела класса IgG к вирусу гепатита А). Также данный тест помогает определить наличие иммунитета к вирусу гепатита А после вакцинации, это исследование особенно необходимо во время эпидемий. При клинических признаках гепатита А, контактах с больным, холестазе (нарушение оттока желчи) назначают Anti-HAV-IgM (антитела класса IgM к вирусу гепатита А). При этих же показаниях делают тест на определение РНК-вируса в сыворотке крови методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в плазме крови.

Вызывается вирусом HBV из семейства гепаднавирусов. Возбудитель очень устойчив к высоким и низким температурам. Гепатит В представляет серьезную опасность: около 2 миллиардов людей в мире инфицированы этим вирусом, а более 350 миллионов – больны им.

Заболевание передается через колюще-режущие предметы, кровь, биологические жидкости, при половых контактах. Инкубационный период может длиться от 2 до 6 месяцев, если в этот период не выявить и не начать лечить заболевание, то оно из острой может перейти в хроническую стадию. Течение болезни проходит со всеми симптомами, характерными для гепатита. В отличии от гепатита А при гепатите В нарушение функций печени носит более выраженный характер. Чаще развиваются холестатический синдром, обострения, возможны затяжное течение, а также рецидивы болезни и развитие печеночной комы. Нарушение правил гигиены и незащищенные случайные половые контакты являются поводом для проведения теста.

Для выявления этого заболевания назначают количественный и качественный тесты на определение HBsAg (Hepatitis B surface antigen, HBs-антиген, поверхностный антиген вируса гепатита B, австралийский антиген). Интерпретация показаний количественного анализа такова: и = 0,05 МЕ/мл – положительно.

Вирусное заболевание(ранее назывался «гепатит ни А, ни В»), передающееся через зараженную кровь. Вирус гепатита С (ВГC) относится к флавивирусам. Он весьма устойчив во внешней среде. Три структурных белка вируса имеют сходные антигенные свойства и обусловливают выработку антител anti-HCV-core. Инкубационный период заболевания может длиться от двух недель до полугода. Болезнь очень распространена: в мире около 150 миллионов человек инфицированы вирусом гепатита С и подвергаются риску развития цирроза или рака печени. Ежегодно более 350 тысяч человек умирают от связанных с гепатитом С болезней печени.

Гепатит С коварен тем, что может скрываться под видами других болезней. Желтуха при данном виде гепатита проявляется редко, повышение температуры тоже наблюдается не всегда. Отмечались многочисленные случаи, когда единственными проявлениями болезни были хроническая усталость и психические расстройства. Известны также случаи, когда люди, являясь носителями и переносчиками вируса гепатита С, годами не испытывали никаких проявлений болезни.

Диагностировать заболевание можно с помощью качественного анализа Anti-HCV-total (антитела к антигенам вируса гепатита C). Количественное определение РНК-вируса делается методом ПЦР. Результат интерпретируется следующим образом:

  • не обнаружено: РНК гепатита С не выявлена или значение ниже предела чувствительности метода (60 МЕ/мл);
  • 108 МЕ/мл: результат положительный с концентрацией РНК гепатита С более 108 МЕ/мл.

В группу риска возникновения рака печени относят больных гепатитом В и С. До 80% случаев первичного рака печени во всем мире фиксируется у хронических носителей этих форм заболевания.

Развивается только при наличии вируса гепатита B. Способы заражения аналогичны гепатиту В. Инкубационный период может длиться от полутора месяцев до полугода. Заболевание часто сопровождается отеками и асцитом (брюшной водянкой).

Болезнь диагностируется с помощью анализа на определение РНК-вируса гепатита D в сыворотке крови методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией в режиме реального времени, а также анализом на антитела класса IgM (Hepatitis delta virus, IgM antibodies, anti-HDV IgM ). Положительный результат теста означает наличие острой инфекции. Отрицательный результат теста фиксирует ее отсутствие либо ранний инкубационный период заболевания или позднюю стадию. Тест показан пациентам, у которых выявлен гепатит В, а также колющимся наркоманам.

Вакцинация против гепатита В защищает от заражения гепатитом D.

Инфекция часто передается через продукты и воду. Вирус нередко обнаруживается у жителей жарких стран. Симптомы схожи с гепатитом А. В 70% случаев болезнь сопровождается болевым синдромом в правом подреберье. У больных расстраивается пищеварение, ухудшается общее самочувствие, затем начинается желтуха. При гепатите Е тяжелое течение болезни, приводящее к смерти, встречается чаще, чем при гепатитах А, В и С. Исследование рекомендуется делать после посещения стран, где распространен этот вирус (центральная Азия, Африка).

Заболевание выявляется при проведении теста Anti-HEV-IgG (антитела класса IgG к вирусу гепатита Е). Положительный результат означает наличие острой формы заболевания либо свидетельствует о недавно проведенной вакцинации. Отрицательный – об отсутствии гепатита Е или о выздоровлении.

Этот тип заболевания на данный момент мало изучен, а сведения, собранные о нем, противоречивы. Возбудителей болезни два, один можно обнаружить в крови, другой – в фекалиях человека, которому было сделано переливание зараженной крови. Клиническая картина – такая же, как и при заболевании другими типами гепатита. Лечение, которое было бы направлено непосредственно на сам вирус гепатита F, пока не разработано. Поэтому проводится симптоматическая терапия.

Помимо анализа крови, для выявления этой болезни исследуют мочу и кал.

Развивается только при наличие других вирусов этой болезни – В, С и D. Он встречается у 85% наркоманов, вводящих психотропные вещества непродезинфецированной иглой. Также возможно заражение при нанесении татуировок, прокалывании ушей, иглоукалывании. Передается заболевание и половым путем. Долгое время оно может протекать без выраженной симптоматики. Течение болезни во многом напоминает гепатит С. Исходами острой формы заболевания могут быть: выздоровление, формирование хронического гепатита или длительное носительство вируса. Сочетание с гепатитом С может привести к циррозу.

Выявить болезнь можно с помощью анализа на определение РНК (HGV-RNA) в сыворотке крови. Показанием для проведения теста являются зафиксированные ранее гепатиты С, В и D. Также тест необходимо пройти наркоманам и тем, кто с ними контактирует.

Для анализов на все виды гепатита берут кровь из вены. Забор крови производится утром натощак. Специальной подготовки процедура не требует, однако накануне следует воздержаться от физических и эмоциональных перегрузок, отказаться от курения и употребления алкоголя. Обычно результаты тестов бывают готовы через сутки после забора крови.

Анализы на выявление гепатитов могут быть качественными (они указывают на наличие или отсутствие вируса в крови) или количественными (устанавливают форму заболевания, помогают контролировать течение болезни и эффективность терапии). Интерпретировать анализ и ставить диагноз на основании теста может только врач-инфекционист. Однако давайте в общих чертах рассмотрим, какими бывают результаты тестов.

Подобный результат говорит о том, что вируса гепатита в крови не обнаружено – качественный анализ показал, что тестируемый здоров. Ошибки быть не может, так как антиген проявляется в крови уже во время инкубационного периода.

Говорить о хорошем результате количественного анализа можно в том случае, если количество антител в крови ниже пороговой величины.

В случае положительного результата через некоторое время (по усмотрению врача) проводится повторный анализ. Дело в том, что повышенное содержание антител может быть вызвано, например, тем, что пациент недавно перенес острую форму гепатита, и антитела в крови все еще присутствуют. В иных случаях положительный результат свидетельствует об инкубационном периоде, наличии острого или вирусного гепатита или подтверждает то, что пациент является носителем вируса.

Согласно российскому законодательству, информация о положительных результатах серологических исследований на маркёры парентеральных вирусных гепатитов передается в отделы учета и регистрации инфекционных заболеваний соответствующих центров Госсанэпиднадзора.

В случае если тест был проведен анонимно, его результаты не могут быть приняты для оказания медицинской помощи. При положительном результате теста следует обратиться к врачу-инфекционисту для назначения дальнейшего обследования и проведения необходимой терапии.

Гепатит не приговор, в большинстве случаев острая форма заболевания полностью излечивается, хронический гепатит, при соблюдении определенных правил, кардинально не меняет качества жизни. Главное – вовремя обнаружить вирус и начать борьбу с ним.

В частных клиниках Москвы можно сдать анализы на выявление и конкретизацию вируса гепатита. Так, качественный анализ на гепатит А стоит в среднем 700 рублей, столько же на гепатит В; а вот количественный тест на поверхностный антиген вируса гепатита B обойдется примерно в 1300 рублей. Определение вируса гепатита G – в 700 рублей. А вот более сложный анализ, количественное определение РНК вируса гепатита С методом ПЦР, стоит около 2900 рублей.

В настоящее время не существует затруднений в проведении диагностики гепатитов, тем более в центральных областях развитых стран. А вот чтобы избежать подобных болезней, не стоит пренебрегать правилами личной гигиены. Также следует помнить о том, что случайные сексуальные контакты могут стать причиной болезни. Лучшей защитой от возможных заболеваний станет вакцинация – против большинства вирусов гепатита она давно и успешно практикуется.

Исследование на гепатит можно пройти в государственных, ведомственных и частных клиниках. Преимущество последних заключается в том, что там не требуется направление лечащего врача, а результаты готовятся оперативнее. Рекомендуем обратить внимание на лаборатории «ИНВИТРО». Эта сеть медицинских клиник специализируется на диагностике и анализах, обладает собственными лабораториями. Она предлагает пройти исследование на наличие всех типов гепатитов по следующим ценам: Anti-HAV-IgG – 695 рублей; HBsAg, качественный тест – 365 рублей; HBsAg, количественный тест – 1290 рублей; Anti-HBs – 680 рублей; Anti-HCV-total – 525 рублей; количественное определение РНК вируса гепатита С методом ПЦР – 2850 рублей; HDV-RNA – 720 рублей; HGV-RNA – 720 рублей; Anti-HEV-IgM и Anti-HEV-IgG – по 799 рублей за каждый. Ответственность перед пациентами и высокий уровень профессионализма сотрудников – визитная карточка «ИНВИТРО».

источник

Рассказывает Анна Киселева,

гастроэнтеролог

Вирус гепатита С (HCV) — единственный вирус рода Hepadnovirus в семействе Flaviviridae, который имеет в своем составе цепочку рибонуклеиновой кислоты (РНК).

Диагноз HCV инфекции можно заподозрить при повышенной активности печеночных ферментов в сочетании с факторами риска. Но, несмотря на это, особенностью заболевания является скрытая форма течения: на протяжении длительного периода у заболевшего могут не проявляться симптомы, указывающие на наличие вируса.

Для подтверждения диагноза необходимо сделать ряд тестов, в том числе и анализ крови РНК вируса гепатита С. Однако у некоторых пациентов возможны отрицательные результаты исследований, поэтому следует провести повторное исследование как минимум через 6 месяцев.

Лабораторная диагностика основана на выявлении специфических маркеров инфицирования вирусом (РНК вируса гепатита С, антител).

Этапность лабораторной диагностики:

  • при превышении двух норм показателей биохимического спектра сыворотки крови: АСТ, АЛТ, ЩФ и общего билирубина — проводят иммунно-ферментный анализ крови на анти-HCV;
  • при выявлении антител к вирусному гепатиту С проводится следующий этап диагностики — определение РНК вируса гепатита С в сыворотке крови методом ПЦР;
  • при повышенных показателях печеночных проб, положительном результате иммунно-ферментного анализа и полимеразно-цепной реакции проводят клиническую диагностику, подбор противовирусной терапии и осуществляют контроль за эффективностью лечения гепатита С;
  • при превышении нормы показателей печеночных проб и отрицательного результата иммунно-ферментного анализа и в случае превышения нормы в показателях печеночных проб, отрицательного результата полимеразно-цепной реакции и положительного результата иммунно-ферментного анализа проводят динамическое наблюдение за пациентом один раз в 6 месяцев на протяжении 2 лет.

Диагноз острого гепатита С ставится на основании клинических (увеличение печеночных проявлений – телеактоэктазии, печеночные ладони, увеличение размеров печени и селезёнки), вирусологических (наличие в крови РНК вируса и/или антител), биохимических (повышенный уровень активности аминотрансфераз-АСТ и АЛТ, билирубина) данных, имеющих четкую связь с парентеральными манипуляциями за первые месяцы до его развития: хирургическими операциями, переливанием крови, инъекцией наркотических средств и т.п.

К сожалению, у большинства больных отсутствуют признаки острого гепатита, и обнаружение РНК вируса не позволяет отличить острый гепатит от хронического гепатита. В данном случае диагностика при гепатите С должна основываться на наличии соответствующих данных эпидемического анамнеза за 1-6 месяцев до впервые выявленных признаков гепатита С, которыми являются антитела к вирусу гепатита С и повышением АСТ и АЛТ.

Биохимический анализ крови

  • исследование уровня фракций билирубина в крови;
  • исследование мочевины в крови;
  • исследование уровня креатинина в крови;
  • исследование уровня аминотрансферазы в крови (АСТ);
  • исследование уровня аминотрансферазы в крови (АЛТ);
  • исследование уровня гамма-глютамилтранспептидозы (ГГТП);
  • исследование уровня щелочной фосфатазы в крови.

Общеклинический анализ крови

  • ПЦР РНК HCV количественный
  • Генотипирование расширенное вируса гепатита С
  • определение HВsAg;
  • определение количественных антител к HBsAg-
  • определение суммарных антител к HВсAg;

УЗИ органов брюшной полости с эластометрией печени

Фибросканирование печени с функцией САР

Обследование может быть расширено при наличии у пациента тяжелых форм заболевания печени.

На основании данных проведенного обследования пациенту осуществляется подбор схемы противовирусной теарпии.

Врачи ЕМС назначают только современные, зарегистрированные в РФ противовирусные препараты. Все схемы лечения не содержат интерферонов, рибавирина, а значит не имеют побочных эффектов. Эффективность безинтерфероновых схем лечения около 100%, срок лечения от 8 до 16 недель.

источник

Гепатит С — это тяжелое инфекционное заболевание, которое вызывает вирус, содержащий молекулы рибонуклеиновой кислоты (РНК). Именно этот вирус является причиной запуска разнообразных болезней печени. В крови у зараженного происходят характерные изменения: растет показатель билирубина, увеличиваются печеночные пробы, вырабатываются специфические маркеры, характерные для этого типа вируса. Все эти изменения можно отследить, только сделав ряд лабораторных анализов.

Гепатит С развивается очень стремительно, и, как правило, хронический тип болезни всегда приводит к циррозу печени. Однако в 20% случаев человек, зараженный гепатитом С, может самоизлечиться. Постепенно симптомы начинают принимать обратную форму: в крови вырабатываются антитела, и вирус погибает, печень продолжает работать в нормальном режиме.

Еще в 20% случаев человек, даже не подозревая о наличии вируса в организме, становится его носителем и может заражать людей. В этом случае организм никак не проявляет внешних признаков наличия гепатита, единственное, если провести тест на маркеры, можно вычислить вирус.

В большинстве случаев люди узнают о том, что заражены, выступая донорами, так как в лабораториях всю донорскую кровь проверяют на гепатит С. Даже при такой скрытой форме рано или поздно вирус начнет атаковать печень, и чтобы начать лечение, важно поставить человеку правильный диагноз.

Диагностика гепатита С подразумевает под собой использование нескольких методов, которые внедряются поэтапно:

  • Серологический метод. Подразумевает проведение иммуноферментного анализа (ИФА). Этот метод определяет, есть ли в организме антитела к вирусу гепатита С. Они вырабатываются только как ответная реакция на наличие маркеров вируса. При этом антитела, выработавшись однажды, могут находиться в организме человека очень долгое время, даже всю жизнь. Процесс вырабатывания антител начинается через 2-5 месяцев после заражения. Важно отметить: если результат серологического теста на гепатит С — положительный, это еще не дает 100% гарантии, что вы в данный момент заражены вирусом. Наличие в организме анти-HCV может говорить о том, что инфекция была перенесена раньше, и антитела — это показатель борьбы иммунитета. Этот метод чаще всего используют как первичный, после которого необходимо провести более детальную и углубленную диагностику, если человек страдает от болезни печени.
  • Тест на иммуноглобулины. Это антитела класса М, которые вырабатываются в крови через месяц после заражения. Очень большой выброс этих антител происходит на острой стадии заболевания. Постепенно их количество может уменьшиться. Новый этап увеличения наблюдается, когда болезнь примет хроническую стадию. Поэтому специалисты расшифровывают наличие иммуноглобулинов как острую стадию при хронической форме гепатита С. А вот, если антител класса М в организме нет, но иммуноферментный анализ показал положительный результат — человек является носителем вируса.
  • Метод полимеразной цепной реакции. Это один из самых эффективных методов диагностики гепатита С — вычисляет, есть ли в организме РНК вирус. Это молекулярная диагностика, позволяющая обнаружить вирус и вычислить, насколько он агрессивен. Суть метода состоит в том, что берется несколько пар оснований ДНК в определенном порядке и в них выявляется наличие того или иного вируса или инфекции. Медики называют этот метод качественным, поскольку он считается прямым методом и высоко специфическим. Только на его основе можно приступать к количественным методом диагностики.
  • Биопсия. Этот метод позволяет выяснить, насколько вирус активно атакует клетки печени, увидеть реальное состояние органа и принять адекватное решение по назначению лечения. Безусловно, эту процедуру нельзя назвать безболезненной. Под местным наркозом большой иглой у человека для анализа берут микрочастицу печени. Затем ее изучают и на основании исследований назначают лечение или делают окончательное заключение по диагнозу.
  • Эластометрия. Это современный метод, дающий высокий результат и позволяющий провести качественную диагностику хронического гепатита С. При этой болезни вырабатываются определенные вещества и сильно меняется структура печени. Фиброскан — прибор, которым проводится диагностика, вычисляет эти изменения на клеточном уровне. Известны случаи, когда эластометрия показывала более развернутую картину, чем биопсия.
  • УЗИ печени. Этот метод, конечно, далеко не такой высокоэффективный, как эластометрия, но часто врачу бывает необходимо посмотреть только поверхностные изменения органа, чтобы поставить точный диагноз. Ультразвуковое исследование позволяет узнать, стала ли печень больше, изменились ли ее края, возможно, есть отдельные участки на органе, пораженные вирусом.
  • Эксперсс-тест на гепатит С. Сегодня предлагают множество разнообразных тестов, которые быстро определяют антитела к HCV в любых условиях. Чувствительность подобных тестов — 96%. Определяется результат специальной кассетой, куда нужно поместить образец крови. Этот метод считается предварительной диагностикой и не может использоваться как единственный.

Для уточнения диагноза и степени заражения органа человеку назначают ряд специфических анализов на гепатит С. Они предназначены для того, чтобы определить количественную составляющую вируса в организме, а также для разработки схемы лечения и ее длительности.

К необходимым уточняющим анализам относятся:

  1. Анализ крови на генотип. Гепатит С — очень изменчивый вирус, он может мутировать и изменять свою форму. По этой причине начинать его лечение без определения генотипа бессмысленно. Существует несколько генотипов, и каждый имеет разную устойчивость к медицинским препаратам, поэтому перед назначением лечения так важно провести этот анализ. Всего медицина изучила 11 генотипов вирусного гепатита, но в странах СНГ широко распространены три типа — 1,2 и 3. Анализ позволяет провести точную диагностику вирусного гепатита С и назначить эффективную схему лечения для его уничтожения.
  2. Анализ крови на свертываемость — коагуллограмма. Если свертываемость снижена и увеличено время свертываемости — это признак наличия в крови вируса. При гепатите выработка белка протромбина снижается, а он отвечает за остановку крови при кровотечении и синтезируется в печени. Если этот белок плохо вырабатывается, это говорит о проблемах с печенью.
  3. Общий анализ крови. Здесь показательным является уровень тромбоцитов и лейкоцитов. Если тромбоцитов вырабатывается меньше, а лейкоцитов больше — это сигнализирует о том, что в печени уже начался воспалительный процесс. В этом случае врач может сделать вывод, что больному нужно назначать, кроме противовирусной терапии, еще и противовоспалительные препараты.
Читайте также:  Анализ на аутоиммунный гепатит инвитро

Печень быстро отзывается на малейшие изменения в своей структуре или целостности. Когда гепатит С проникает в орган, печень перестает справляться с нагрузкой, и природные процессы сбиваются. Вычислить это можно по ферментному составу в крови.

Какие ферменты и вещества изменяются, если человек заражен вирусом:

  • Изменяется содержание в крови аланинаминотрансфераза (АЛТ) — фермента, входящего в состав гепатоцитов. Даже в небольшом количестве этот фермент указывает на то, что в печени происходят аномальные процессы. Часто биохимический анализ проводят именно для выяснения наличия этого фермента, потому что он, благодаря своей чувствительности, позволяет определить острый гепатит С на ранних стадиях.
  • Нарушается количество печеночного фермента — аспартатаминотрансфераза (АСТ). Если в результате теста выявлено два фермента, это сигнал о том, что клетки печени начали погибать. Если уровень фермента АСТ выше, чем АЛТ, в печени идет процесс разрастания соединительной ткани. Так может начинаться фиброз, или это указывает на поражение органа токсинами — лекарствами или спиртным. В любом случае, лучше, если расшифровкой анализов на гепатит С займется врач-гепатолог, который обладает необходимыми знаниями и опытом.
  • Уровень билирубина увеличивается. Это вещество, входящее в состав желчи. Он отвечает за желтизну кожи человека при гепатитах. Так, если повышен уровень прямого или общего билирубина, это говорит о том, что в клетки печени уже проник вирус и начался процесс разрушения.
  • Меняется уровень печеночного фермента гамма-глутамилтранспептидаза (ГГТ). Если он повышен, значит, работа печени нарушена. Чаще всего этот фермент увеличивается, если у человека диагностируют цирроз, который развивается на фоне чрезмерного приема спиртных напитков.
  • Происходит аномальный процесс: в крови появляется фермент, содержащейся в желчных протоках — это щелочная фосфатаза (ЩФ). Этот феряент у здорового человека не должен выделяться в кровь. Если это происходит, значит, в организме проблемы с оттоком желчи.
  • Уровень ряда белков меняется. Эти белки выделяются в кровь, если в печени начались аномальные процессы. Так, если их обнаружили, это сигнал о том, что печень в опасности, началось поражение органа.

Чтобы получить точные результаты и не пересдавать анализы, важно приходить в лабораторию для забора крови утром и на голодный желудок. Пренебрегать этими анализами нельзя: только полная картина позволит вычесть качественные и количественные показатели вируса и начать лечение. Обследования при гепатите С лучше начинать после консультации с врачом, ведь только профессионал сможет расшифровать анализы и назначить терапию.

  • Читайте обзор препарата Ледипасвир при гепатите C

Женщинам в положении назначается обязательный скрининг на присутствие в организме различных инфекций, в том числе гепатита С. Пренебрегать им нельзя. Диагностировать заболевание важно, чтобы уменьшить риск развития у будущего ребенка патологий и ухудшения общего самочувствия женщины, которой предстоит колоссальная нагрузка — роды.

Сдавать анализ крови на гепатит С нужно два раза: при первом посещении лаборатории на первом триместре и на третьем триместре вместе с анализом на сифилис и другими исследованиями крови.

Если стандартного скрининга, который подразумевает проведение биохимического анализа крови, недостаточно, женщине могут назначить качественный метод диагностики — полимеразную цепную реакцию.

Эти методы дают такую информацию:

  1. Наличие антител к вирусу гепатита. Когда антитела обнаружили, а РНК вирус — нет, значит, женщина может вздохнуть спокойно — малыш не будет заражен. Антитела, которые перейдут ребенку от матери, будут жить в маленьком организме до двух лет. После этого малыш будет здоров.
  2. Если обнаружили и антитела к вирусу гепатита, и РНК вирус, в 40% случаев возможно заражение ребенка во время родов. Также определить точно, заражен ли малыш, можно будет после двух лет, когда из организма уйдут антитела матери.
  3. Об уровне билирубина и печеночных ферментов — АЛТ, АСТ, ГГТП. Все они будут повышены, но не намного. Доказано, что беременность нивелирует любые изменения в крови, практически сводит на нет желтушный период. Однако после родов болезнь начинает свирепствовать, и в организме молодой мамы резко происходит скачек вируса.

Если женщине до беременности поставили диагноз гепатит С, она должна обратиться за консультацией к врачу-инфекционисту, который назначит противовирусную терапию. Только через полгода после окончания лечения можно заниматься планированием детей. Так женщина убережет малыша от возможности заразиться вирусом. Однако если зараженная женщина забеременела, вирус не является рекомендацией к аборту.

Вместе со своим врачом женщина сможет подготовиться к родам и настроиться на позитив. Доказано, что при родах вероятность заражения возникает, только если роженица и младенец получили травмы, а это небольшой процент. Конечно, малыш может заразиться во время прохода по родовым путям, но этого можно избежать, если сделать кесарево сечение. Эта операция существенно снижает риск передачи вируса.

  • Читайте отзывы о Hepcinat LP

Смотрите видео о гепатите С:

Гепатит С называют «ласковым убийцей» не просто так. Вирус проникает в клетки печени быстро и практически бессимптомно приводит к серьезным последствиям — раку и циррозу. Чтобы избежать такой участи, человеку важно внимательно следить за общим самочувствием и при необходимости сдать как минимум общий анализ крови.

  • Статья по теме: Диета при хроническом гепатите С

TutKnow.ru

источник

РНК-содержащий вирус при инфицировании повреждает ткани печени и вызывает заболевание – гепатит С. Недуг протекает в острой и хронической форме. Для него характерно воспаление органа без явно выраженных признаков. Бессимптомное течение объясняется способностью патогена к образованию видов, которые приспосабливаются к организму хозяина. Они мутируют и, благодаря различным видам, ускользают от надзора иммунной системы.

Много лет вирус находится внутри организма. Ранняя диагностика не дает желаемого результата. Антитела появляются через четыре – восемь недель от начала инфицирования и титры антител низкие. Внедряясь в клетки печени, со временем разрушают их. Анализ на гепатит С нужен, чтобы выявить инфекцию сразу после инфицирования и начать лечение печени.

Для сдачи анализа крови на гепатит С нужны предпосылки:

  • половая связь с инфицированным лицом;
  • цирроз органа;
  • диагностика эффективности лечения другого инфекционного заболевания;
  • плановое обследование работников медучреждений, садов, школ;
  • обследование перед операцией;
  • проведение вакцинации против вируса гепатита В.

Если у пациента ярко выражены признаки воспаления органа:

  • желтизна кожи и белков;
  • боль в боку с правой стороны;
  • утомляемость;
  • увеличение размеров органа;
  • тошнота.

Чтобы диагностировать гепатит С, проводят анализы на прямое выявление вируса и на второстепенные признаки его присутствия: наличие антител к вирусу HCV.

При попадании в человеческий организм патогена иммунная система начинает вырабатывать антитела. Это компоненты иммунной системы, направленные на уничтожение чужеродного белкового соединения. Их называют маркеры. Маркеры гепатита С – это суммарные антитела к вирусу HCV. Обозначают IgM и IgG. Каждый вид антител появляется в определенный период.

Вначале обнаруживаются антитела IgM (через 1-1,5 месяца). Это характеризует острую фазу поражения. По мере развития инфекции, количество антител возрастает. Больше всего появляется на 3-6 месяц развития болезни, а затем количество снижается.

Антитела IgG появляются через 1,5-2 месяца с момента поражения. Через полгода концентрация достигает максимального уровня. Это характеризует хроническое протекание болезни. Они остаются в кровотоке многие годы.

Определение суммарных антител при анализе позволяет определить природу заболевания на третьей неделе инфицирования и понять, в какой форме оно протекает. Исследование по отдельности не является информативным. Для правильной диагностики важно знать суммарное значение.

Антитела к HCV определяются методом иммуноферментного анализа. Берется венозная кровь пациента, и определяются значения иммуноглобулинов IgM и IgG. Это ультрачувствительный тест. Он определяет даже один патоген в клетке крови.

Метод полимеразной цепной реакции применяется для выявления РНК патогена. Это основной способ установления диагноза гепатита С. С его помощью проводится качественное и колтчественное определение РНК вируса.

Уровень антител HCVcor IgG NS3-NS5 необходимо определить, чтобы подтвердить или опровергнуть поставленный диагноз при отрицательном значении на ПРЦ. Этот метод – самый точный. Он укажет присутствие инфекции на пятый день после заражения. Если ИФА не в состоянии это сделать, ПЦР поможет определить генотип вируса и начать лечение. Она определяет скорость развития заболевания.

Принято обозначать его HCV. Качественный и количественный анализ на гепатит С в расшифровке пишется как вирус гепатита «С»-HCV-РНК. Антитела к гепатиту С обозначают Anti-HCV.

Анализ крови при гепатите С и расшифровка делается от одного до пяти дней. Срок исполнения зависит от загруженности лаборатории. При получении положительного результата, проводят дополнительное исследование. Его называют иммуноблоттинг.

Для подтверждения HCV применяют ПЦР, чтобы выявить РНК вируса. Присутствие в крови антител свидетельствует о хроническом протекании заболевания.

Ложноположительные анализы бывают у беременных женщин и у людей, болеющих инфекционными болезнями.

Результат обследования готов на следующий день, но пациент может получить его с расшифровкой по ряду причин через 5-7 дней. Сколько стоит анализ на гепатит С? Качественный – от 700 рублей. Количественный стоит дороже – от 1300 рублей.

Кроме общего анализа крови, ПЦР и ИФА делают биохимический анализ, исследуется функциональные возможности печени, делаются тесты на присутствие других видов гепатита. Врач назначает исследование на вирус иммунодефицита, на аутоиммунные болезни. Оценивается стадия и активность процесса. Берется биопсия печеночных тканей. Исследуют щитовидную железу. Какие делать анализы, определяет врач. Возможна диагностика внутренних органов и печени с помощью УЗИ.

Общий развернутый клинический анализ позволяет оценить содержание гемоглобина в крови и количество:

ОАК выявит отклонения нормативных показателей. При развитии болезни у больного понижается свертываемость крови и повышается кровоточивость. Показатель СОЭ будет повыше.

Позволяет оценить работу не только печени, но и общего состояния других органов. Биохимический анализ крови определяет, как происходит метаболизм и выясняет потребность в микроэлементах. Биохимия определяет АЛТ, АСТ, ГГТП, билирубин, щелочную фосфатазу, общий белок, амилазу крови.

Все анализы сдаются на голодный желудок. Перед приемом продуктов питания должно пройти 7-8 часов. В последние двое суток из рациона исключают жареную и жирную пищу, не употребляют алкогольные напитки и не курят. Нельзя выполнять тяжелую физическую работу, заниматься спортом. Эти предосторожности исключают получение ложноположительного или ложноотрицательного результата исследования.

Не отчаивайтесь, если данные обследования на вирус оказались положительными. В 20% случаев происходит самоизлечение. Антитела не означают, что вы болеете гепатитом С. Случается ошибка в лабораторных исследованиях. Вакцинация влияет на получение верного результата.

При беременности возможен ложноположительный результат. Опухоли, инфекционные заболевания смазывают картину результатов лабораторного исследования. Чтобы убедиться в правильности поставленного диагноза, назначается ПЦР для определения РНК вируса гепатита С. Результат будет точным и покажет, болеете вы или нет.

Даже, если результат после окончательного обследования положительный, ранняя диагностика поможет назначить правильное лечение. Современные препараты вылечивают хроническую форму болезни через 3-6 месяцев.

Заболевание опасно тем, что оно возникает повторно. Раз в 6 месяцев проверяют антитела в кровотоке. Как только антитела перестанут определяться в 2-ух последних лабораторных исследований на ПЦР, болезнь побеждена.

Биохимический анализ крови покажет результат лечения и состояние внутренних органов. Из-за изменчивости патогена нет вакцины, предупреждающей заболевание вирусом гепатита С.

Помните, что болезнь заразна. С окружающими и близкими людьми будьте осторожны. Недуг передается через кровь. Поэтому нужно предупреждать врачей, стоматологов о своем заболевании. Попросите лечащего врача назначить прогрессивные препараты для подавления вируса гепатита С. Интерфероновые препараты менее эффективны. Они подавляют размножение инфекции, но не уничтожают. Возможно возвращение болезни через какой-то срок.

источник

Как проводится диагностика вирусного гепатита С, какие симптомы болезни и какое может быть назначено лечение

Вирусные гепатиты — группа инфекционных заболеваний, которые вызываются различными гепатотропными вирусами, отличаются по механизму передачи, течению и прогнозу.

Существует множество форм вирусных гепатитов: от легких, субклинических, до тяжелых, быстропрогрессирующих; от острых до хронических поражений с развитием цирроза и рака печени.

Хронический вирусный гепатит — хроническое заболевание печени, вызванное вирусами гепатитов В, С, Д, развивающееся через 6 мес. после перенесенного острого гепатита.

Классификация хронических вирусных гепатитов

МКБ-10
В 18 — хронический вирусный гепатит
В 18.0 — хронический вирусный гепатит В с дельта-агентом
В 18.1 — хронический вирусный гепатит В без дельта-агента
В 18.2 — хронический вирусный гепатит С
В 19 — неопределенный вирусный гепатит

Гепатит С (ГС) — инфекционное заболевание, вызванное вирусом гепатита С (HCV). HCV принадлежит к семейству флавивирусов, рода Hepacivirus. В клинической практике различают 6 основных генотипов HCV: 1а, 1b, 2a, 2b, 3, 4.

Гепатит С — это вирусная инфекция печени. Её возбудителем является вирус гепатита С. Этот вирус размножается в печени, и из клеток печени он проникает в кровь. Примерно у 60-80 % пациентов их собственная защитная иммунная система не в состоянии успешно справиться с этим вирусом. В таких случаях заболевание гепатитом С принимает хроническую форму. Другая часть пациентов, составляющая 20-40 %, выздоравливает от гепатита С на протяжении полугода без какого-либо лечения.

Симптомы гепатита С почти незаметны, большинство пациентов вообще не замечают, что они заражены. Некоторые пациенты ощущают повышенную усталость,чувствуют себя разбитыми и замечают снижение своей работоспособности или у них возникают жалобы на неприятные ощущения с правой стороны надчревной области. Желтуха развивается обычно реже.

Наличие вируса гепатита С в крови может быть подтверждено либо прямым путем — на основании его наследственной информации (РНК) или же косвенно — на основании наличия в крови антител, выработанных белыми кровяными тельцами пациента. Положительное подтверждение РНК свидетельствует об остром заболевании, а наличие антител против вируса гепатита С (анти-HCV) не может отличить излеченную инфекцию гепатита С от сохраняющейся хронической инфекции. Поэтому также и у пациентов, излеченных от гепатита С, еще на протяжении дли- тельного периода времени можно обнаружить антитела, но не РНК вируса гепатита С.

Основой диагностики гепатита С является подтверждение наличия антител к вирусу гепатита С (анти-HCV). Если такой тест окажется положительным (т.е. в крови пациента имеются антитела к вирусу гепатита С), то в данном случае необходимо провести прямое исследование на наличие вируса, например, так называемым методом PCR (полимеразная цепная реакция, ПЦР). Это — особенно чувствительный тест, предназначенный для подтверждения наличия вирусов гепатита С в крови.

Во всех тех случаях, когда возникает мысль о проведении антивирусной терапии, имеет смысл провести дополнительное исследование для определения количества вирусов в крови (вирусная нагрузка) а также генотипа вируса гепатита С.

С некоторыми ограничениями показатели печени АЛТ и АСТ, также именуемые «трансаминазами») дают информацию о воспалительной активности гепатита. Однако нормальные показатели печени не означают того, что можно исключить хроническое заболевание гепатитом С. Для контроля показатели печени будут определяться также и во время процесса лечения.

Поскольку у пациентов с хронической формой гепатита С риск получения рака печени повышен, то у них через регулярные промежутки времени (от шести до двенадцати месяцев) необходимо определять наличие в крови онкомаркера рака печени — альфа-фетопротеина. С такими же интервалами времени следует проводить и ультразвуковое исследование печени.

Биопсия печени (пункция печени)

Для того чтобы получить возможность оценить долю волокон соединительной ткани в печени, активность воспалительного процесса и степень ожирения, может возникнуть необходимость в пункции печени. При пункции печени под местным наркозом изымается небольшой кусочек ткани, гистологию которого затем исследуют под микроскопом. При проведении полного гистологического исследования будут раздельно определены показатели воспалительной активности (оценка степени активности) и стадии фиброза.

«Здоровые» носители вируса гепатита С (в крови выявлены вирусы, но показатели печени нормальны и пробы ткани печени тоже нормальны) встречаются чрезвычайно редко. У большинства пациентов даже при нормальных показателях печени можно подтвердить признаки хронического гепатита в тканях печени.

Механизм развития болезни

При хронической инфекции вирусы гепатита постоянно заражают новые клетки печени. Признаком воспалительного процесса является проникновение белых кровяных телец в ткани печени. Эти белые кровяные тельца заботятся о том, чтобы инфицированные и погибшие клетки печени были уничтожены и удалены. Однако сам вирус они, как правило, победить не в состоянии. Отмершие клетки печени позже могут быть замещены клетками соединительной ткани (= рубцовая ткань). Если на печени произошли изменения соединительной ткани, то в таких случаях на ранней стадии врачи говорят о фиброзе печени, а позже — о циррозе печени. Организм уже не в состоянии преобразовать цирротическую рубцовую ткань в ткани печени.

Заражение вирусом гепатита С происходит в основном через прямой или непрямой контакт с кровью (парентеральное заражение).

До 1990 г. далеко не редким явлением было заражение вирусом гепатита С через препараты, изготовленные из крови, а также через препараты для улучшения свертываемости крови. В настоящее время при помощи современных методов тестирования можно выявлять доноров крови, являющихся носителями гепатита С. На сегодняшний день остаточный риск заражения инфекцией гепатита С при переливании крови является минимальным.

Вирус может передаваться от одного человека к другому также через зараженные шприцы, например, при употреблении наркотиков. Другими факторами риска для заражения вирусом гепатита С являются нанесение татуировок или вживление пирсинга. Возможно также и заражение через открытые раны, бритвенные лезвия или зубные щетки. Возможна передача вируса и сексуальным путем. Однако риск для сексуального партнера зараженного пациента оценивается как весьма незначительный. Риск заражения зависит от сексуального поведения.

Случаи заражения вирусом через неповрежденную кожу или через слюну до сих пор в научной литературе не описаны. Таким образом, если на посуде, на стаканах или на столовых приборах нет загрязнений кровью, то опасаться заражения не приходится.

Отдаленные осложнения гепатита С

На основе хронического гепатита (воспаление печени, при котором в тканях печени имеются отчетливые признаки воспалительного процесса) в последующие годы примерно у 30 % пациентов развивается цирроз печени. Риск развития цирроза печени зависит, в том числе, от возраста пациента на момент заражения и от продолжительности заболевания. Это означает, что при заражении в более зрелом возрасте (старше 40 лет) болезнь часто развивается быстрее. К факторам, которые могли бы ускорить развитие цирроза печени, относятся дополнительные хронические заболевания печени, к примеру, заражение другими печеночными вирусами (например, дополнительная инфекция вирусом гепатита В) или вещества, наносящие вред печени иным образом. К ним относится, в первую очередь, алкоголь. Врачи говорят о циррозе печени в тех случаях, когда большая часть ткани печени оказывается замещенной соединительной тканью. Вследствие этого нормальная структура ткани печени разрушается. В результате возникают изменения кровоснабжения, что может привести к повышению кровяного давления в воротной вене (вене, проходящей между кишечником и печенью). В результате застоя крови в пищеводе и в желудке могут образоваться расширенные вены (варикозные узлы). Если такие сосуды лопнут, то могут открыться тяжелые кровотечения в области кишечника и желудка. Опасность открытия кровотечения возрастает также еще и потому, что из-за ослабленного синтеза белка в печени и из-за уменьшения количества кровяных пластинок (тромбоцитов) сворачиваемость крови ограничена. В том числе из-за повышенного кровяного давления перед печенью в брюшной полости могут также скапливаться физиологические жидкости (асцит). При наличии цирроза печени токсичные вещества, попадающие в кровь из желудочно-кишечного тракта, уже не могут перерабатываться печенью и, таким образом, они попадают в большой круг кровообращения. Это может привести к усилению утомляемости и снижению концентрационной способности (гепатическая энцефалопатия, «Encephalon» = головной мозг).

Из-за пониженной выработки белка в печени с цирротическими изменениями наряду с нарушениями процессов очистки крови также снижается выработка веществ, необходимых для защитных механизмов организма. Результатом является повышенная предрасположенность к инфекциям. Из-за застоя желчи при тяжелых заболеваниях печени глаза и кожа часто приобретают желтую окраску (желтуха). Это часто сопряжено также с зудом. Одновременно моча может приобрести темную окраску. Если пациент страдает хроническим гепатитом С на протяжении длительного времени, то у него также повышается и риск развития рака печени (гепатоцеллюлярная карцинома). У большинства пациентов гепатоцеллюлярная карцинома развивается на базе цирроза печени, однако, у небольшого числа пациентов с хроническим гепатитом С были также описаны случаи карциномы печени, несмотря на то, что у них еще не было цирроза печени. Поэтому имеет смысл проводить регулярные ультразвуковые обследования, а также исследования крови.

В некоторых случаях гепатит С развивается в настолько тяжелой форме, что может понадобиться пересадка печени. Активность воспалительного процесса, а также степень ожирения печени и изменений в соединительных тканях можно установить только путем взятия гистологических проб. Для этого из печени необходимо взять ткань на пробу (биопсия печени). Степень развития фиброза печени можно также хорошо оценить при помощи таких неинвазивных методов, как например, эластография.

Читайте также:  Анализ на антитела на гепатит

Хронический гепатит С на протяжении нескольких десятков лет может привести к циррозу печени и к раку печени. Терапия и здоровый образ жизни могут остановить или замедлить этот процесс.

Наличие вируса гепатита С в крови может быть подтверждено либо прямым путем — на основании его наследственной информации (РНК) или же косвенно — на основании наличия в крови антител, выработанных белыми кровяными тельцами пациента. Положительное подтверждение РНК свидетельствует об остром заболевании, а наличие антител против вируса гепатита С (анти-HCV) не может отличить излеченную инфекцию гепатита С от сохраняющейся хронической инфекции. Поэтому также и у пациентов, излеченных от гепатита С, еще на протяжении дли- тельного периода времени можно обнаружить антитела, но не РНК вируса гепатита С.

Основой диагностики гепатита С является подтверждение наличия антител к вирусу гепатита С (анти-HCV). Если такой тест окажется положительным (т.е. в крови пациента имеются антитела к вирусу гепатита С), то в данном случае необходимо провести прямое исследование на наличие вируса, например, так называемым методом PCR (полимеразная цепная реакция, ПЦР). Это — особенно чувствительный тест, предназначенный для подтверждения наличия вирусов гепатита С в крови.

Во всех тех случаях, когда возникает мысль о проведении антивирусной терапии, имеет смысл провести дополнительное исследование для определения количества вирусов в крови (вирусная нагрузка) а также генотипа вируса гепатита С.

С некоторыми ограничениями показатели печени АЛТ и АСТ, также именуемые «трансаминазами») дают информацию о воспалительной активности гепатита. Однако нормальные показатели печени не означают того, что можно исключить хроническое заболевание гепатитом С. Для контроля показатели печени будут определяться также и во время процесса лечения.

Поскольку у пациентов с хронической формой гепатита С риск получения рака печени повышен, то у них через регулярные промежутки времени (от шести до двенадцати месяцев) необходимо определять наличие в крови онкомаркера рака печени — альфа-фетопротеина. С такими же интервалами времени следует проводить и ультразвуковое исследование печени.

Биопсия печени (пункция печени)

Для того чтобы получить возможность оценить долю волокон соединительной ткани в печени, активность воспалительного процесса и степень ожирения, может возникнуть необходимость в пункции печени. При пункции печени под местным наркозом изымается небольшой кусочек ткани, гистологию которого затем исследуют под микроскопом. При проведении полного гистологического исследования будут раздельно определены показатели воспалительной активности (оценка степени активности) и стадии фиброза.

«Здоровые» носители вируса гепатита С (в крови выявлены вирусы, но показатели печени нормальны и пробы ткани печени тоже нормальны) встречаются чрезвычайно редко. У большинства пациентов даже при нормальных показателях печени можно подтвердить признаки хронического гепатита в тканях печени.

источник

М.И.Михайлов, Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН, Москва

При постановке диагноза «гепатит С» необходимо учитывать следующие наиболее важные факторы:

  • показатели активности «печеночных» ферментов;
  • наличие или отсутствие маркеров инфицирования вирусом гепатита С (ВГС) и другими гепатотропными вирусами;
  • данные эпидемиологического анамнеза;
  • результаты клинического осмотра пациента. Только комплексный учет данных факторов позволяет с высокой степенью надежности диагностировать это заболевание. Лабораторный работник должен предоставить объективную информацию о выявленном спектре вирусных антигенов и антител, а также РНК ВГС, позволяющую клиницисту, сотруднику службы переливания крови и врачу-эпидемиологу решать стоящие перед ними задачи. Чаще всего это:
  • выявление лиц с наличием ВГС для снижения уровня посттрансфузионного гепатита С;
  • постановка диагноза и разграничение острого и хронического гепатита С;
  • прогноз заболевания;
  • назначение, оценка и прогноз эффективности проводимой терапии;
  • изучение широты распространения ВГС в популяции и различных группах населения.
    При этом основными направлениями работ, выполняемых лабораторными сотрудниками, являются:
  • разработка и выбор наиболее информативных методов выявления маркеров инфицирования ВГС;
  • определение критериев объективной оценки полученных результатов;
  • разработка оптимальных алгоритмов проведения лабораторных исследований;
  • внедрение системы повышения качества выявления маркеров инфицирования ВГС.

    Основой лабораторной диагностики гепатита С служат знания о ВГС, его репликации, информация о динамике появления и исчезновения маркеров инфицирования, а также современные иммунохимические и молекулярно-биологические методы детекции антигенов, антител и нуклеиновых кислот.

    ВИРУС ГЕПАТИТА С. ВГС впервые был идентифицирован в 1988 году, когда группа исследователей во главе с М. Houghton и Choo Q.L, применив новые молекулярнобиологические методы исследования, клонировала и секвинировала геном вируса [I]. Частица вируса гепатита С имеет сферическую форму со средним диаметром около 50 нм [2,3]. Попытки визуального обнаружения и изучения строения вируса гепатита С предпринимались с момента открытия вируса, однако до сих пор отсутствуют хорошо документированные результаты этих исследований, что, возможно, связано с трудностями накопления вирусных частиц в необходимых количествах.

    ВГСединственный член рода Hepacivirus в семействе Flaviviridae, в которое входят такие вирусы, как вирус диареи быков и лихорадки свиней (род Pestivirus) и вирус желтой лихорадки, вирус дэнге и GB-вирусы: GBV-A, GBV-B и GBV-C/HGV (род Flavivi-rus). Схема строения вируса гепатита С может быть представлена следующим образом (схема № 1). Нуклеокапсид содержит РНК вируса гепатита С. Сверху нуклеокапсид покрыт липидной оболочкой с утопленными в ней оболочечными белками, кодированными РНК ВГС. Геном вируса представлен однонитевой линейной молекулой РНК положительной полярности, протяженностью около 9600 нуклеотидов. Организация генома ВГС подобна другим флавивирусам. В нем выделяют две зоны, кодирующие структурные и неструктурные (функциональные) белки. Гены, кодирующие структурные белки, расположены у 5′ области генома вируса, а неструктурные у 3′ области. Ген ВГС имеет одну открытую рамку считывания (ОРС), единый полипептид (приблизительно в 3000 аминокислот), который под действием вирусных и клеточных протеаз нарезается на структурные и неструктурные белки.

    Рис. 1. Структурные элементы HCV

    К структурным белкам относят белки, кодированные Core, El и Е2 зонами РНК ВГС. Выявлено три формы С-белка ВГС: полноразмерная (р21) с молекулярной массой — 21 kD, усеченная (р19) и форма (р16), обнаруженная в ядрышках инфицированных гепатоцитов. На своей поверхности С-белок несет различные высококонсервативные В-клеточные эпитопы, существование которых чрезвычайно важно для выявления антител к ВГС в процессе лабораторной диагностики гепатита С.

    Зоны РНК ВГС — Е1 и Е2 кодируют белки с молекулярной массой 31 и 70 kD . Эти белки имеют несколько участков N-гликозилирования; в Е1 белке определено до 6 таких участков, а в Е2 — 11. В участке Е2 заключена информация о небольшом белке — р7, который в структуре вируса не обнаружен.

    Обозначение регионов, расположенных ближе к 3′- концу РНК ВГС — как зон, несущих информацию о неструктурных белках вируса, указывает на то, что эти белки не являются структурными компонентами вирусной частицы. В неструктурной зоне РНК ВГС выделяют участки, обозначенные как: NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A и NS5B. Большинство из белков, кодированных неструктурными зонами РНК ВГС, необходимы для репликации вируса.

    Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей РНК изолятов ВГС, полученных в различных регионах мира и даже в процессе заболевания от одного и того же пациента, выявил основную особенность этого вируса — высокую гетерогенность РНК. Положение о значительной генетической вариабельности РНК ВГС легло в основу теорий, объясняющих: длительное (иногда пожизненное) носительство вируса, частое развитие хронического заболевания, трудности в терапии и создании эффективных вакцинных препаратов. Наиболее значительные отличия последовательностей РНК ВГС сосредоточены в N-концевой части региона Е2, которую обозначают — «гипервариабельный регион» (HVR) [4].

    В настоящее время определено 6 основных генотипов и свыше 100 субтипов ВГС. Генотипы 1а, 1в, 2а, 2в, 2с и За составляют более 90% HCV-изолятов, полученных в Северной и Южной Америке, Европе, России, Китае, Японии и Австралии/Новой Зеландии [5]. Генотипы 4, 5а и 6 соответственно регистрируются в Центральной и Южной Африке, Юго-Восточной Азии. В России и странах СНГ зарегистрировано преобладание генотипа 16 (не менее 68,9%) [6,7]. Считается, что пациенты, инфицированные генотипом 1 (особенно 1в), отвечают хуже на лечение по сравнению с пациентами, инфицированными другими генотипами вируса.

    У больного ВГС циркулирует как популяция частиц вируса, у которых геномы отличаются друг от друга на 1-2% (квазиспецифичности) в результате мутаций, накапливающихся во время инфекции и/или попавших в организм пациента при заражении. Эти мутантные формы могут способствовать более активной репликации или могут помогать вирусу уклоняться от иммунного ответа организма и потенциально влиять на исход острой инфекции, различия в течении заболевания и ответе на интерферонотерапию [8].

    ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИ-ВГС. После открытия вируса ВГС и определения его роли в развитии посттрансфузионного гепатита — «ни А, ни В» перед исследователями стояла задача разработать методы, способные выявлять лиц с ВГС и пригодные для диагностики острого и хронического гепатита С. Было установлено, что антигены ВГС циркулируют в чрезвычайно низких концентрациях, и очевидно, что методический уровень конца 80-х годов XX века, применяемый для детекции вирусных антигенов, был явно недостаточен.

    В 1989 году группа исследователей фирмы «Chiron Corporation» под руководством Q-L.Choo осуществила клонирование РНК ВГС и получила иммунореактивные олигопептиды, вступающие в реакцию с антителами, циркулирующими в крови больных хроническим гепатитом «ни А, ни В». Эти олигопептиды стали основой диагностических препаратов для выявления антител к ВГС. Это определило быстрый прогресс в разработке и промышленном выпуске диагностических препаратов. Основным методом, применяемым для детекции анти-ВГС, стал твердофазный иммуноферментный анализ, как метод, отвечающий требованиям практического здравоохранения -т.е. обладающий высокой чувствительностью, специфичностью и простотой проведения.

    Учитывая, что ВГС персистирует в крови больных острым и хроническим гепатитом С одновременно с анти-ВГС, внимание разработчиков диагностических препаратов концентрировалось на создании тест-систем для детекции антител, обеспечивающих максимально полное выявление носителей вируса и максимально ранние сроки диагностики острой инфекции. Многообразие антигенов и антигенных детерминант, кодированных структурной и неструктурной зоной РНК ВГС, определило направление в конструировании диагностических препаратов выбором и аранжировкой олигопептидов, применяемых для их создания. За время, прошедшее с момента открытия ВГС, созданы диагностические системы трех поколений ( таблица 1).

    Таблица 1
    Диагностические препараты для выявления анти-ВГС [9]

    Применяемые пептиды,
    зоны РНК ВГС, в которых
    они кодированы

    Время первого
    выявления
    анти-ВГС от
    начала желтухи

    С22-3 Core
    С200 NS3 и NS4
    СЗЗс NS3
    С 100-3 NS4

    С22-3 Core
    С200 NS3 и NS4
    СЗЗс NS3
    Пептид NS5

    Введение дополнительных пептидов, прежде всего с22-3 (Core), в диагностические препараты 2-го и 3-го поколения позволило решить главную задачу, то есть увеличить чувствительность, специфичность и, самое главное, выявляемость анти-ВГС . Благодаря диагностикумам 3-го поколения удается выявлять до 97% носителей ВГС. Вместе с тем, определенную дискуссию вызвало решение о введении в диагностикум пептида, кодированного NS5 регионом РНК ВГС. По мнению некоторых исследователей, присутствие этого пептида не имеет принципиального значения для улучшения качества диагностического препарата. [10,11]. Однако антитела к NS5 могут быть выявлены в более ранние сроки инфекции, что улучшает качество лабораторной диагностики острого гепатита С. [12].

    В настоящее время во всем мире, в том числе и в России, применяются диагностические препараты 3-го поколения. Пептиды, применяемые в диагностических препаратах, получены при помощи рекомбинантной технологии (например, диагностикумы фирм: «Диагностические препараты», г. Нижний Новгород; «Вектор» г. Новосибирск; «Roche»; «Abbott» и др.), или синтетической (000 МЦ «Авиценна» г. Санкт-Петербург; «Organon» и др.). Диагностикумы, в которых одновременно использованы оба вида пептидов, получили обозначения, как препараты 4-го поколения. По своим характеристикам эти препараты не обладают значимыми различиями. Сравнительные испытания, регулярно проводимые МЗ России, продемонстрировали сопоставимую чувствительность диагностических препаратов отечественных и зарубежных производителей.

    Установлено, что применение диагностикумов 3-го поколения для выявления анти-ВГС среди иммунокомпетентного населения (например, доноров крови) оценивается в 98,8-100%. В то же время среди иммунокомпрометированных лиц, например, таких как пациенты после трансплантации почки, костного мозга или лица, инфицированные ВИЧ, этот показатель значительно ниже — 50 — 95% [12]. S.George с соавт. [13] продемонстрировали, что у 8,4% больных ВИЧ-инфекцией регистрируются ложно-негативные результаты выявления анти-ВГС. Причем у таких пациентов в процессе наблюдения может регистрироваться серореверсионный эффект, т.е. регистрация позитивного результата после серонегативного анти-ВГС периода [14].

    Одна из наиболее важных проблем при проведении исследований на наличие анти-ВГС — ложнопозитивные результаты. Их появление может быть связано с неспецифическим взаимодействием компонентов реакции, возможными перекрестными реакциями с другими вирусными антигенами и многими другими факторами. Уровень ложно-позитивных результатов при выявлении анти-ВГС с различными диагностическими препаратами может достигать 10-20% [15,16]. Повышенный уровень таких результатов отмечен среди больных онкологическими и аутоиммунными заболеваниями, лиц с иммунодефицитными состояниями и больных сифилисом [16,17]. Существование ложнопозитивных результатов ставит перед лабораторным работником задачу их разграничения с истинным выявлением анти-ВГС. Для решения этой задачи служит обнаружение в образце сыворотки крови РНК ВГС. Однако отрицательный результат обнаружения РНК ВГС не позволяет говорить о наличии ложнопозитивного выявления анти-ВГС. Необходимо учитывать, что анти-ВГС могут изолированно циркулировать в крови пациента, который выздоровел после острого гепатита С (10-15%) или у которого произошла элиминация РНК ВГС в результате проводимой терапии.

    КОНФИРМАЦИОННЫЕ (SUPPLEMENTAL) ТЕСТЫ. Для разграничения ложнопозитивных образцов и образцов, действительно содержащих антитела к ВГС, разработаны дополнительные (Supplemental) тесты. Наиболее часто в этих тестах используется принцип иммуноблота [например — тест RIBA («Ortho-Clinical Diagnostics»); «LiaTek HCV» (Organon Teknika)], когда на нитроцеллюлозной мембране адсорбируются в виде отдельных полос антигены, кодированные различными зонами РНК ВГС. Анти-ВГС взаимодействуют с адсорбированными антигенами с помощью меченных ферментом антител против Ig G человека с последующей их детекцией при помощи субстратного комплекса. Помимо иммуноблота в качестве дополнительных тестов также используют диагностические препараты для выявления анти-ВГС против конкретных антигенов, кодированных различными зонами РНК ВГС [«Спектр 4» («Имбио», г. Нижний Новгород; РекомбиБест АНТИ-ВГС-СПЕКТР» — ЗАО «Вектор Бест», г. Новосибирск; ИФА- Анти-НСУ-Спектр, НПО «Диагностические системы», г. Нижний Новгород].

    Разработка и внедрение этих тестов идет параллельно с внедрением скрининговых тестов для выявления анти-ВГС, повторяя принцип расширяющегося спектра использованных пептидов в каждом последующем поколении диагностических препаратов. Так, диагностикум RIBA-III отличается от предыдущего поколения добавлением пептида, кодированного зоной NS5. Принципы, позволяющие подтвердить позитивный результат выявления анти-ВГС, прежде всего включают: возможность (в некоторых случаях) получения более четких результатов ферментативной реакции при взаимодействии с отдельными пептидами, а также применение в диагностикуме расширенного спектра пептидов, которые не используются в скрининговых тестах. Только введение новых пептидов позволяет повысить диагностическую ценность подтверждающих тестов.

    Трактовка полученных результатов, например в таком тесте, как RIBA-III, включает три возможных ответа : позитивный, негативный и неопределенный результат. Последний из них выдается в случае отсутствия четких показаний (согласно инструкции, прилагаемой к диагностическому набору), позволяющих определенно судить о наличии или отсутствии анти-ВГС в исследуемом образце. Соотношение спектра регистрируемых ответов при проведении подтверждающих тестов колеблется в зависимости от характеристик групп пациентов, у которых первично выявлены анти-ВГС [18]. По данным J.M. Pawlotsky с соавт. [19], в половине случаев результатов, трактуемых как «неопределенные», удается обнаружить РНК ВГС. На наш взгляд, правомочность ответа — «неопределенный результат выявления анти-ВГС», выдаваемого лабораторным работником клиницисту, очевидна не только при проведении подтверждающего теста, но и рутинном исследовании на наличие анти-ВГС. Необходимость такой трактовки полученных результатов является отражением современного состояния лабораторной диагностики гепатита С.

    ОПРЕДЕЛЕНИЕ IgM АНТИ- ВГС. В настоящее время созданы и промышленно выпускаются диагностические наборы для выявления IgM анти-ВГС фирмами: «Вектор Бест»; «Диагностические системы»; «Имбио», «Abbott» и др. На этапе конструирования диагностических наборов были созданы наборы для ИФА, основой которых являлись пептиды, кодированные различными регионами РНК ВГС [20] . Выбор был остановлен на пептиде, кодированном Core регионом РНК ВГС и выявлении антител к нему класса IgM. Так же как и при использовании тестов для выявления анти-ВГС (IgG), при исследовании IgM анти-ВГС могут быть зарегистрированы ложнопозитивные результаты. По данным Stevensona D.L. с соавт. [21], до 70% больных с хроническим гепатитам С с наличием IgM анти-ВГС одновременно имели повышенный уровень ревматоидного фактора, который способствует появлению ложнопозитивных результатов. Вместе с тем, по мнению Pawlotsky J.M., наличие ревматоидного фактора не влияет на качество выявления IgM анти-ВГС [22].

    ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИГЕНОВ ВГС. Возможность определения антигенов ВГС привлекала внимание исследователей сразу же после открытия вируса. Принципиальная возможность их тестирования была продемонстрирована К. Krawczynski с соавторами [23], которые иммуногистохимически обнаружили в печеночной ткани антигены ВГС, доказав специфичность иммунофлюоресцентного свечения. Применение поли- и моноклональных антител к различным антигенам ВГС установило наличие ВГС core Ag, антигенов, кодированных NS3 и NS4 зонами РНК ВГС, в ядре и цитоплазме гепатоцитов, у 60-90% больных хроническим ГС [24].Однако дальнейшие исследования продемонстрировали, что антигены ВГС удается обнаружить менее чем в 5% печеночных клеток.

    Первые диагностические тест-системы («Ortho Antibody to Core Antigen (Murine Monoclonal) EL1SA Test System» и «Imucheck F-HCV Ag Core Kokusai») для выявления антигена ВГС появились на рынке иммунобиологических препаратов в 1999 году. В качестве цели детекции был избран Core антиген ВГС, который определяют при помощи твердофазного варианта ИФА, сконструированного на основе моноклональных антител. Первые исследования по применению этих тестов определили их высокую чувствительность, специфичность, и перспективность применения, прежде всего, в службе переливания крови [25,26]. Установлены:

  • возможность определения Core Ag ВГС в сыворотке или плазме крови;
  • специфичность выявления Core Ag ВГС;
  • наличие лиц с циркулирующим антигеном в крови серонегативных по анти-ВГС;
  • частое (90,3%) обнаружение Core Ag ВГС в сыворотках крови с наличием анти-ВГС и РНК ВГС [25];
  • прямая корреляция между концентрацией РНК ВГС и выявлением Core Ag ВГС [25];
  • сокращения фазы «окна» — от момента инфицирования до первого позитивного результата выявления анти-ВГС . Определено, что Core Ag ВГС удается выявлять в 83% случаев (n=24) на следующий день после первого обнаружения РНК ВГС [26] и задолго (в среднем 26 дней) до появления анти-ВГС [27].

    МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ РНК ВГС. Современный этап лабораторной диагностики гепатита С можно охарактеризовать как этап начала широкого применения молекулярно — биологических методов выявления РНК ВГС. Подавляющее большинство методов выявления нуклеиновых кислот было апробировано для выявления РНК ВГС. Принципам конструирования диагностических препаратов и их применению для детекции вирусных ДНК или РНК посвящено значительное количество литературных обзоров, опубликованных как в отечественных [28], так и зарубежных изданиях [29]. Все эти методы можно разделить на две группы, в основе которых лежит применение принципов гибридизации без амплификации избранного участка нуклеиновой кислоты или с их амплификацией, что позволяет значительно повысить разрешающую способность метода.

    Метод гибридизации основан на соединении меченных гибридизационных зондов (генноинженерные или синтетические молекулярные структуры, содержащие в себе нуклеотидные последовательности, комплементарные избранным участкам РНК). Учет результатов осуществляют по интенсивности сигнала, поступающего от метки в составе образовавшегося комплекса.

    При гепатите С этот метод выявления РНК ВГС прежде всего нашел применение для ее идентификации непосредственно в гепатоцитах, в тестах обозначаемых — in situ hibidization [30]. Возможность непосредственной детекции РНК ВГС в ткани позволила обнаружить ее в мононуклеарных клетках крови, клетках слюнных желез и других тканях организма больного гепатитом С [31,32].

    Метод гибридизации, применяемый для детекции РНК ВГС, позволяет продемонстрировать наличие негативных (репликативных) цепей РНК ВГС, что свидетельствует об активной репликации вируса [33].

    Метод полимеразнной цепной реакции — в настоящее время наиболее широко применяемый методический прием, лежащий в основе практически всех молекулярно-биологических методов детекции РНК ВГС. Причем определение РНК ВГС возможно как в качественном, так и количественном варианте, что особенно важно для назначения, мониторинга и оценки эффективности применяемой терапии.

    В качестве основных вариантов метода можно выделить:

  • полимеразную цепную реакцию (ПЦР);
  • лигазную цепную реакцию;
  • NASBA;
  • ТМА (Реакция транскрипционно опосредованной амплификации, Transcrip-tion-mediated amplification).

    Полимеразная цепная реакция широко применяемый как в России, так и за рубежом метод детекции РНК ВГС. В его основе лежит многоцикловой процесс, напоминающий естественную репликацию нуклеиновой кислоты, причем каждый цикл состоит из последовательных этапов.

    Из исследуемого материала (сыворотка или плазма крови, печеночный биоптат) выделяется РНК ВГС. Учитывая, что нуклеиновая кислота ВГС представлена РНК, а для амплификации необходима молекула кДНК, при помощи фермента — обратной транскриптазы, происходит образование однонитевых молекул кДНК ВГС. На следующем этапе к определенному участку каждой из цепей кДНК ВГС присоединяются т.н. праймеры — короткие олигонуклеотиды, комплементарные известным нуклеотидным последовательностям. Сравнение первичной структуры 5’UTR области генома различных изолятов ВГС выявило их незначительную изменчивость (между генотипами, гомология нуклеотидов — 92-98%, а внутри генотипа 98-99%). Это сделало предпочтительным выбор праймеров из этой зоны РНК ВГС и их применение в диагностических тест-системах, выпускаемых у нас в стране и за рубежом.

    Читайте также:  Анализ на генотип количества гепатит в

    Далее, при помощи фермента ДНК- зависимой ДНК полимеразы происходит синтез новых участков ДНК. В настоящее время в качестве источника этого фермента чаще всего используют бактерии Thermophilus termus (Tth-полимераза) или Thermophilus aquaticus (Taq-полимераза). Обладая термостабильностью в присутствии ионов марганца и магния, этот фермент может быть одновременно использован для синтеза комплементарных одноцепочечных молекул кДНК ВГС и амплификации избранных участков кДНК. На завершающем этапе одного цикла реакции, при помощи ДНК полимеразы происходит синтез новых цепей комплементарных кДНК ВГС. Многократное повторение циклов реакции приводит к накоплению фрагментов кДНК ВГС, которые возможно зарегистрировать при помощи электрофореза в полиакриламидном геле с последующей визуальной детекцией или же с применением гибридизации с олигонуклеотидными зондами, что увеличивает чувствительность и специфичность применяемых диагностических препаратов. Применение праймеров, меченных ферментами, позволяет проводить учет результатов ПЦР при помощи иммуноферментного анализа.

    Постоянная цель, стоящая перед исследователями, конструирующими диагностические системы для выявления РНК ВГС, — повышение чувствительности и специфичности. Этой цели служит вариант ПЦР, обозначенный — «гнездовой ПЦР» (nested PCR) [34]. Отличительной особенностью этого метода от «классического» является одновременное использование двух пар праймеров, одна из которых комплементарно связывается с внутренним участком ампликона, полученного после первого раунда амплификации. Вместе с тем считается, что при этом варианте ПЦР более высок риск контаминации образцов, что может привести к ложноположительным результатам [35] .

    Острая потребность в определении РНК ВГС и сложности, связанные с крупномасштабным производством высокочувствительных и специфичных диагностических наборов для ПЦР диагностики, определили широкое применение препаратов, изготовленных в научных лабораториях. Сравнение этих тест-систем, так называемых — «домашних» тестов («in house tests»), продемонстрировало их высокую вариабельность по чувствительности и специфичности, а также отсутствие воспроизводимости результатов между лабораториями и сериями диагностических препаратов. Так, при проведении первого Европейского цикла «внешнего» контроля качества оценки выявления РНК ВГС (1996 г.) из 136 лабораторий только 22 (16%) смогли абсолютно правильно определить наличие или отсутствие вирусной РНК в предоставленных контрольных образцах [36]. Подобный результат отмечен и в нашей стране, во время проведения аналогичной работы в рамках Федеральной системы внешнего контроля качества (2001 г.), когда из 14 участвующих лабораторий лишь 3 (21,4%) смогли правильно решить поставленную задачу [37].

    Причины появления ложнонегативных и ложнопозитивных результатов выявления РНК ВГС разнообразны. При ложноотрицательных результатах:
    — потеря или разрушение РНК ВГС в ходе подготовки к реакции клинического материала;
    — наличие в образце ингибиторов, влияющих на различные компоненты ПЦР. Эти ингибиторы представлены различными химическими или белковыми субстанциями. Например: наличие в спермальной жидкости ингибиторов обратной транскриптазы не позволяло обнаружить РНК ВГС и говорить о возможности реализации полового пути передачи гепатита С [38]; наличие гепаприна [39]; высокий уровень криоглобулинов в сыворотке крови [40];
    — несоблюдение теплового режима хранения и транспортировки клинического материала. При ложнопозитивных результатах:
    — контаминация между пробами (при обработке образцов и/или работе с реакционной смесью), в том числе и контаминацией позитивным контрольным образцом;
    — контаминация продуктами предшествующий амплификации (ампликонами), которые могут загрязнять исследуемые образцы и растворы через аэрозоли или лабораторное оборудование.

    Массовое внедрение ПЦР диагностики по определению РНК ВГС поставило перед органами практического здравоохранения задачи перехода на новый уровень проведения лабораторных исследований. Выделение изолированных зон для осуществления основных этапов ПЦР (для подготовки проб; проведения амплификации; для учета полученных результатов); отдельный комплект для каждого этапа реакции лабораторной одежды, автоматических пипеток; существование стандартных диагностических наборов и самое главное — наличие высококвалифицированных лабораторных сотрудников позволяет снизить уровень появления ложных результатов.

    Первый стандартизированный набор для определения РНК ВГС («AmplicorTM HCV», «Roche Diagnostic Systems») изготовлен в 1993 году. За прошедшие годы наборы для выявления РНК ВГС прошли эволюцию, основной целью которой стало повышение их чувствительности и специфичности. При конструировании «Amplicor TM HCV» использовано несколько оригинальных методических приемов, позволяющих выявлять 100 и выше копий РНК ВГС в мл., а также бороться с возможными случаями контаминации образцов и растворов, применяемых в наборе. Использование фермента — амперазы и дезиксиуридинтрифосфата (dUTP) позволяет разрушать в первом цикле амплификации предшествующие апликоны, которыми могла произойти контаминация. Разрушение амперазы в конце первого цикла амплификации (при +55 С) не позволяет ферменту разрушать ампликоны, избранные в качестве мишени. Принципиальным новшеством стало введение внутреннего контроля. Смысл этого новшества заключается во введении в каждый исследуемый образец последовательности, подобной амплифицируемому участку РНК ВГС, которая в дальнейшем выявляется с помощью соответствующих праймеров в реакции амплификации в аналогичном режиме. Отсутствие позитивной реакции при выявлении внутреннего контроля свидетельствует о наличии ложнонегативного результата реакции на наличие РНК ВГС в исследуемом образце. Диагностикумом следующего поколения стал препарат, обозначенный — «HCV Amplicor 2,0», при использовании обладающий пределом чувствительностью 50 молекул РНК ВГС.

    Систему выявления РНК ВГС при помощи наборов фирмы «Roche» нельзя рассматривать в отрыве от их приборного обеспечения, определяющего высокое качество тестирования. Разработчики метода стремились к полной автоматизации всех этапов реакции. Воплощением этой идеи стала система «COBASAmpliPrepTM», позволяющая полностью автоматизировать процесс выделения РНК ВГС, амплификации и детекции, тем самым уменьшить риск получения ложнопозитивных и ложнонегативных результатов, сохранив при этом высокую чувствительность и специфичность [41].

    Лигазная цепная реакция выявления РНК BГC.(LCR). Метод основан на способности фермента «ДНК- зависимой ДНК-лигазы» сшивать (лигировать) разрывы фосфодиэфирной связи в ДНК в присутствии АТФ и ионов Mg 2+. Так же как и при проведении «классической» ПЦР для выявления РНК ВГС, первый этап LCR — обратная транскрипция с получением кДНК ВГС. Далее ДНК-лигаза осуществляет связывание двух пар праймеров (комплементарных 5′ некодированной зоне РНК ВГС), которые в дальнейшем амплифицируются. Детекция продуктов амплификации LCR осуществляется при помощи учета реакции антиген-антитело. Каждый из двух прайеров метится различным гаптеном. Первый из них захватывается антителами, адсорбированными на микрочастицах. После процедуры промывания при помощи второй пары антител, меченных флуоресцентной меткой, происходит их избирательное взаимодействие с гаптеном в амплификационном продукте с последующим проведением субстратной реакции и учетом на флюориметре.

    Чувствительность этого метода составляет около 200 копий РНК ВГС в мл, что позволяет его использовать для решения различных клинико-диагностических задач [42]. В настоящее время диагностические наборы выявления РНК ВГС, основанные на LCR, изготовлены фирмой «Abbott».

    Nucleic Acids Seaquencence Amplification — NASBA —метод детекции РНК ВГС основан на одновременном действии трех ферментов: обратной транскриптазы вируса миелобластомы птиц, РНК-азы Н и РНК-полимеразы Т7 [43.]. В отличие от RT PCR на первом этапе не проводится обратная транскрипция РНК ВГС. При помощи использованных ферментов удается получить более 10(9) копий участка кДНК ВГС в течение 90 минут [44]. Возможность проведения реакции при небольших температурах (+41 С) значительно упрощает работу и позволяет отказаться от оборудования, обеспечивающего циклические изменения высоких температур. Учет результатов реакции осуществляется при помощи электрохемилюминесценции. Несмотря на то, что по своей чувствительности NASBA близка к RT PCR, метод широко не используется для выявления РНК ВГС. В настоящее время проводится разработка варианта метода, сочетающего принципы проведения NASBA и «Real-time RT PCR».

    Метод транскрипционно опосредованной амплификации (Transcription-mediated amplification — ТМА) отличается от ПЦР и LCR прежде всего тем, что непосредственно амплифицируются фрагменты РНК ВГС , а не кДНК ВГС. На начальном этапе реакции к РНК ВГС присоединяется праймер (№1) и с помощью фермента (обратной транскриптазы) синтезируется копия молекулы мишени — кДНК. Обратная транскриптаза, обладая также активностью РНКазы-Н, разрушает вирусную РНК в гибриде РНК-кДНК. Далее к молекуле кДНК присоединяется второй праймер с последующей достройкой двухцепочечной ДНК при помощи обратной транскриптазы. При помощи другого фермента -РНК-полимеразы происходит транскрипция РНК с кДНК, что приводит к образованию от 100 до 1000 копий ампликона РНК ВГС в одном цикле реакции. К этим РНК-апликонам присоединяется праймер № 2 с дальнейшим синтезом кДНК-копий и разрушением молекулы РНК. Присоединение праймера №1 на кДНК с последующей достройкой двухцепочечной ДНК запускает следующий цикл амплификации. Учет результатов реакции осуществляют на люменометре, так как образовавшиеся РНК-ампликоны специфически взаимодействуют с ДНК-зондами, меченными хемилюминафорами.

    В качестве преимуществ ТМА-метода при выявление РНК ВГС отмечают:

  • проведение реакции при более низких температурах по сравнению с ПЦР;
  • образование большего числа ампликонов в одном цикле реакции, что уменьшает время, необходимое для получения конечного результата (30-40 минут), и повышает чувствительность реакции (50 копий /мл.) [45].
  • снижение риска контаминации, так как РНК менее устойчива, чем ДНК.

    Сравнительные исследования по детекции РНК ВГС при помощи ТМА и другими методами продемонстрировали высокий уровень совпадений результатов [45].

    Сочетание принципов гибридизации и амплификации лежит в основе метода выявления РНК ВГС, обозначенного как «Метод гибридизации с использованием разветвленных зондов или Branched DNA assay (bDNA) [46]. В отличие от ПЦР в данном тесте осуществляется амплификация не молекул кДНК ВГС, а сигнала. Реакция проводится в 96 луночных планшетах, на которых адсорбированы фрагменты РНК ВГС из 5′ нетранслируемой зоны и core-гена РНК ВГС. За счет последующего связывания с синтетической молекулой разветвленной ДНК и гибридизацией с пробой, меченной щелочной фосфотазой с усилителем и последующей ферментативной реакцией достигается резкое увеличение полученного сигнала. В настоящее время на диагностическом рынке появились диагностикумы третьего поколения (Вауег 3.0 Hepati-tis С Virus RNA Quantitation by bRNА), обладающие чувствительностью, позволяющей выявлять 520 IU/ml (2500 копий РНК ВГС).

    КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ РНК ВГС. Для оценки концентрации РНК ВГС применяют количественный вариант ПЦР. Первоначально концентрацию РНК ВГС пытались охарактеризовать порядковыми величинами, например»+»,»++» и т.д., визуально отражающими интенсивность полос, полученных при электрофорезе продуктов амплификации, или же методом конечных разведений, т.е по наличию позитивного результата в конечной точке титрования. Трудности стандартизации всех этапов ПЦР не позволяют объективно оценить концентрацию РНК ВГС, что приводит к существенным ошибкам трактовки полученных результатов.

    В настоящее время результаты исследования выражают в количественных единицах: количество копий РНК ВГС, содержащихся в 1 мл., в абсолютном или логарифметическом выражении (log 10). Исходя из того, что концентрация обнаруженной РНК ВГС отражает количество вирусных частиц, данный показатель обозначают как «вирусный эквивалент (eq)», с добавлением приставки k (килограмм, тысяча) или М (миллион). Еще одним способом выражения количества вирусных частиц являются их весовые эквиваленты. Например, в граммах или пикограммах (1 pg соответствует приблизительно 1 миллиону eq). Разнообразие применяемых величин создает трудности трактовки результатов, полученных в различных лабораториях. Поэтому комитет экспертов ВОЗ по биологической стандартизации изготовил «международный стандартный образец», содержащий РНК ВГС (лиофильновысушенная сыворотка крови, содержащая РНК ВГС 1-го генотипа), концентрация которой выражена в международных единицах (IU/mL) [47]. Специальные коэффициенты позволяют пересчитывать полученные показатели концентрации в международные единицы.

    Для определения концентрации РНК ВГС применяют практически все варианты ПЦР. При этом к диагностическим препаратам предъявляется ряд специфических требований, важнейшим из которых является строгая линейность результатов, т.е. увеличение сигнала регистрируемой реакции при увеличении концентрации РНК ВГС в исследуемом образце. Применение внутренних стандартов с различным содержанием РНК ВГС позволяет избежать многих методических ошибок, которые могут отразиться на конечном результате реакции [28]. Чувствительность применяемых диагностикумов (Amplicor HCV Monitor v2.0; LCx HCV RNA Quantitative Assay) позволяет выявлять РНК ВГС, начиная с 50 копий в мл [48,49], что особенно важно для прогнозирования эффективности избранной противовирусной терапии.

    ПЦР в реальном времени («Real-time RT PCR») —один из наиболее перспективных вариантов количественного метода выявления РНК ВГС. Метод и его аппаратное обеспечение совместно разработаны специалистами фирм «Roche» и «Percin Elmer». Принцип метода заключается в способности гидролизовать последовательности кДНК в направлении 5′—- 3′. В реакции применяется специальный зонд, меченный двумя флюоресцентными красителями, имеющими близкие максимумы поглощения и флюоресценции. При наличии продуктов амплификации Tag-полимераза расщепляет зонд, что приводит к предотвращению переноса энергии от одной молекулы красителя к другой, и тем самым предотвращает выход кванта света. Специальный прибор осуществляет учет реакции и математическое моделирование кинетики флюоресценции на каждом этапе реакции, что позволяет получить информацию об исходной концентрации РНК ВГС.

    Отличительной особенностью «ПЦР в реальном времени» считают возможность получать информацию о наличии РНК ВГС непосредственно в процессе реакции, что позволяет уменьшить время анализа в сочетании с высокой чувствительностью и линейностью получаемых результатов [50]. По данным Татьяны Яшиной с соавторами, данный метод позволяет выявлять от 200 копий РНК ВГС в мл. [51].

    МЕТОДЫ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ РНК ВГС. Определение принадлежности ВГС к определенному генотипу и субтипу нашло свое применение для решения не только чисто научных, но и практических вопросов. Например: поиск источника инфекции во время вспышек гепатита С или прогнозирование эффективности применяемой терапии.

    «Золотой стандарт» генотипирования ВГС — непосредственное определение первичной структуры РНК ВГС с его последующим филогенетическим анализом [52], что позволяет четко охарактеризовать данный изолят вируса. Получить эту информацию возможно при использовании следующих вариантов секвенирования:

  • прямого;
  • на основе стандартного клонирования;
  • секвенирования продуктов ПЦР реакции (Limited-sequencing).
    Несмотря на точность получаемого результата, метод непосредственного секвенирования не используется в практическом здравоохранении из-за технических сложностей проведения исследования и высокой стоимости работ. Вместе с тем наличие информации о первичной структуре РНК ВГС является референтным методом генотипирования, а наличие приборов для автоматического секвинирования упрощает получение результата.

    В настоящее время в большинстве случаев для генотипирования РНК ВГС применяются методы, основанные на использовании ПЦР с типоспецифическими праймерами. Впервые генотипирование РНК ВГС проведено Н. Okamoto с соавторами в 1992 году при помощи RT-ПЦР [53], включающего два этапа амплификации. Первый из них проводился с универсальными, для всех генотипов ВГС, праймерами, второй со смесью типоспецифических праймеров с получением специфических продуктов амплификации различной длины. О наличии того или иного генотипа судили по размеру амплифицированного продукта. В качестве праймеров используются типоспецифические зонды, информация о которых расположена в 5’UTR, Core или NS5 — областях РНКВГС[54].

    Гибридизация амплифицированных продуктов с адсорбированными геноспецифическими зондами (из 5′-нетранслируемой зоны РНК ВГС), адсорбированными на нитроцеллюлозной мембране, лежит в основе теста — обозначенного «INNO-LiPA HCV, INNO-GENETICS» [55]. Первоначально с помощью этого теста удавалось типировать генотипы: la; lb; 2a; 2b;3a; 3Ь; 4 и 5а. В дальнейшем тест-системы 2-го поколения «INNO-LiPA HCV II , INNOGENETICS» позволяют различать все 6 генотипов и дополнительно 2с; 2d; 2i; 3с; 4a-h; 6а и 10а. [56]

    Методический арсенал определения генотипов ВГС не ограничивается вышеперечисленными способами и включает в себя разнообразные методы:

  • генотипирование на основе анализа профилей рестрикции амплифицированных продуктов (RFLP). Продукты амплификации фрагментов РНК ВГС (5’UTR — область или NS5 область РНК ВГС) расщепляются рестриктазами. Образовавшиеся фрагменты различаются по длине в зависимости от имеющихся внутри них сайтов рестрикции, по которым идет расщепление. Результаты электрофореза и их сравнение позволяют идентифицировать генотип ВГС в исследуемом образце [57]. Сравнение результатов генотипирования методом ПЦР- RFLP с данными секвинирования продемонстрировало высокий уровень совпадения результатов — 95% [58].
  • генотипирование на основе метода SSCP (оценки конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК). В качестве объекта исследования выбран 5′-нетранслируемый регион РНК ВГС, который обладает минимальным набором нуклеотидных вариаций, отличающих генотипы друг от друга. Этот факт определяет возможность применить общие праймеры при генотипировании [59].

    СЕРОТИПИРОВАНИЕ Анти-ВГС стало возможным благодаря исследованиям P.Simmonds с соавторами, установившим наличие антител, направленных к генотипспецифичным эпитопам, информация о которых кодирована NS4 зоной РНК ВГС [60]. При помощи диагностикума для ИФА, сконструированного на основе синтетических пептидов, удалось разграничить случаи гепатита С, вызванные вирусами 1, 2 и 3 генотипа (89% совпадения с результатами генотипирования). Разработка тестсистем с использованием синтетических и рекомбинантных антигенов, кодированных NS4 и Core зонами РНК ВГС, позволила расширить перечень типируемых вариантов вируса, а также судить о наличии подтипов (1а, lb, 2a, 2Ь, За, и 4а) [61,62]. В настоящее время осуществляется коммерческий выпуск диагностических препаратов для проведения серотипирования как в плашечном варианте проведения ИФА — «Мurех НС 1-6 Serotyping Assay, Murex Diagnostics», так и в варианте «иммуноблот» — RIBA HCV Serotyping Assay, Chiron Diagnostics. Сравнительные данные результатов серотипирования и генотипирования РНК ВГС продемонстрировали высокий уровень совпадения результатов, достигая 95% [62].

    Серотипирование анти- ВГС по сравнению с генотипированием РНК ВГС обладает такими преимуществами, как простота проведения реакции и более низкая стоимость. Вместе с тем, этот метод ни в коем случае не может заменить генотипирование. Результаты серотипирования анти-ВГС свидетельствуют о типовой принадлежности анти-ВГС при текущей или ранее перенесенной инфекции. В некоторых случаях (наиболее часто у больных гемофилией) регистрируется одновременное выявление анти-ВГС различных подтипов, что может свидетельствовать о множественном инфицировании различными субтипами и генотипами ВГС [63]. Кроме того, у пациентов с гепатитом С на фоне выраженного иммунодефицитного состояния РНК могут быть единственным маркером, что делает невозможным проведение серотипирования.

    ВЫЯВЛЕНИЕ и ТРАКТОВКА РЕЗУЛЬТАТОВ ТЕСТИРОВАНИЯ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ВГС-ИНФЕКЦИИ. Наличие широкого спектра серологических маркеров текущей или предшествующей ВГС инфекции, а также современная методологическая база позволяют решить многие задачи лабораторной диагностики и профилактики гепатита С. В таблице № 2 представлены серологические маркеры ВГС инфекции и наиболее важные направления их тестирования.

    Таблица 2
    Диагностическая значимость маркеров текущей или предшествующей ВГС инфекции

    Подтвер-
    ждение
    результата
    + анти-ВГС

    Одной из главных задач лабораторной диагностики гепатита С является постановка диагноза и разграничение острого от хронического гепатита С при помощи выявления серологических маркеров инфицирования. Так же как и при других острых вирусных гепатитах, серологические маркеры инфицирования ВГС последовательно появляются и исчезают по ходу инфекции и процесса выздоровления (Рисунок 2).

    РНК ВГС удается обнаружить на 7 — 21-й день после инфицирования ВГС, а анти-ВГС на 20 — 150-й день (в среднем 50-й день) [64]. Спектр анти-ВГС может различаться в зависимости от периода острого гепатита. Считается, что первыми удается определить антитела, кодированные Core и NS5 зоной РНК ВГС. Анти-ВГС к белкам, кодированным NS4 зоной, в острую фазу гепатита С отсутствуют [65]. Сравнительное изучение уровня концентраций анти-ВГС, спектра анти-ВГС и РНК ВГС у больных острым и хроническим гепатитом продемонстрировало некоторые различия [66]. На наш взгляд, эти различия могут быть связаны с индивидуальными особенностями инфекционного процесса, что снижает их диагностическую ценность.

    Рис. 2. Острый гепатит С

    По аналогии с лабораторной диагностикой гепатита А и В ожидали, что определение антител к ВГС класса IgM будут иметь столь же большое диагностическое значение как IgM анти-ВГА и IgM анти-НВс. Однако данные тестирования сывороток крови больных острым и хроническим гепатитом С на наличие IgM анти-ВГС указывают на частое их выявление среди этих больных — 50-93% и 50-70% соответственно [67,68], эти результаты свидетельствуют, что обнаружение IgM анти-ВГС не может быть использовано как маркер острой ВГС инфекции.

    Отсутствие маркера, претендующего на роль «золотого» стандарта острого гепатита С, определяет необходимость комплексной оценки полученных результатов, основанных на динамическом наблюдении за пациентом.

    Не менее важное направление использования высокочувствительных методов тестирования РНК ВГС снижение риска развития посттрансфузионного гепатита С. Необходимость таких работ определяется наличием фазы «окна», т.е. временем между первым обнаружением РНК ВГС и появлением анти-ВГС , а также существованием доноров крови (больных хроническим гепатитом С), у которых имеются РНК ВГС при отсутствии анти-ВГС. Современная система контроля донорской крови на наличие ВГС включает только тестирование анти-ВГС, риск заражения гепатитом С сохраняется. Исходя из этого правомерна постановка вопроса о тестировании крови на наличие РНК ВГС современными методами (методы NAT — «nucleic acid amplification test»). Фактор, ограничивающий эту работу, — высокая цена исследований. Для сокращения затрат рекомендуется тестирование пулов сывороток крови (от 8 до 96 образцов) с последующим поиском позитивного образца в случае выявления РНК ВГС в пуле сывороток. Учитывая фактор разведения искомой РНК ВГС при пулировании сывороток крови, принципиальным становится вопрос о применении наиболее чувствительных методов детекции. Считается, что использование диагностических наборов для NAT — с чувствительностью 50-100 IU/mL позволяет значительно уменьшить риск посттрансфузионного гепатита С.

    Несомненно, перечень вопросов, которые можно решить при тестировании всего спектра маркеров ВГС-инфекции, не исчерпывается этими двумя направлениями. Наличие современных методов тестирования в совокупности со знанием их возможностей открывает широкие перспективы научных и прикладных работ по гепатиту С.

    источник