Меню Рубрики

Постановка иммуноферментного анализа на гепатит

Для диагностики вирусного гепатита в рамках медицинского протокола используется несколько лабораторных и инструментальных методик. Одной из самых достоверных является иммуноферментный анализ (ИФА). Метод помогает определить наличие антигена к тому или иному виду вируса. Для этого выполняется стандартная процедура забора крови из вены пациента. Результаты становятся известны уже через неделю после взятия анализа.

Термин расшифровывается как «иммуноферментный анализ». Он подразумевает определение в крови комплексов антиген-антитело для уточнения этиологии возбудителя. Если это вирус, определяются его виды и подвиды. Антигены — это частички на поверхности клеток возбудителей, связывающиеся с определенными участками антител. Последние являются иммунными молекулами, вырабатываемыми организмом для собственной защиты. Антигены и антитела неповторимы, поэтому определение их структуры с помощью иммуноферментного анализа свидетельствует о наличии конкретной патологии в организме больного. В качестве меток используются ферменты, которые и дали название методике.

ИФА — это высокоточная методика, ее чувствительность достигает 90%. Она помогает проводить скрининг парентеральных гепатитов. Эти заболевания передаются путем инъекции, или через переливание крови. ИФА помогает выявить пациентов, у которых отсутствуют симптомы. Таковыми является большинство хронических больных. Они имеют риск развития цирроза. Его обнаружение на поздних стадиях — это плохой прогноз. Поэтому иммуноферментная методика позволяет своевременно определить заболевание и сэкономить деньги на лечение. ИФА верифицирует этиологию возбудителя и определяет прогноз недуга. Диагностические наборы для нее стоят недорого и длительно хранятся. За быстроту, удобство и точность данных ИФА называют экспресс-методом.

ИФА необходим, когда требуется уточнить этиологию вирусного возбудителя для определения схемы лечения. У пациента идентифицируют наличие хронического гепатита B и C, или перенесенного заболевания вирусом подтипа A. Методику нужно применять у членов семьи больного, которые могут заразиться. В инфекционном стационаре анализ выполняется всем пациентам, у которых присутствуют такие симптомы:

  • Желтуха. Желтушность кожных покровов не сопровождается болями в правом подреберье и изменением цвета стула и мочи.
  • Повышение температуры тела. Она вырастает до субфебрильных цифр, иногда наступает лихорадка.
  • Диспепсия. Присутствуют тошнота и рвота, которая не приносит облегчение.
  • Немотивированная слабость.
  • Мелкоточечные высыпания на теле. Это мелкие кровоизлияния вследствие печеночной недостаточности.
  • Тяжесть в правом подреберье. Симптом возникает вследствие растяжения увеличенной печенью собственной капсулы, содержащей множество нервных окончаний.

Основным показанием к выполнению анализа является наличие определенных анамнестических данных. Если пациент ранее страдал инъекционной наркоманией, ему переливали кровь или пересаживали органы — это повод выполнить ИФА.

Чтобы результаты ИФА были достоверными, требуется предварительно подготовиться. За день до сдачи крови пациенту рекомендуется перестать употреблять жирную и жареную пищу, продукты с высокой концентрацией красителей, стабилизаторов, консервантов, усилителей вкуса и аромата. Нежелательно непосредственно перед выполнением метода заниматься тяжелым физическим трудом и спортивными упражнениями. В день сдачи крови необходимо воздержаться от завтрака. Забор материала натощак позволит получить точный результат. Необходимо исключить из употребления некоторые лекарственные средства. Но самостоятельно это делать не рекомендуется, поскольку есть вероятность вреда для здоровья. Нужна предварительная консультация лечащего доктора.

Метод ИФА состоит из двух этапов. На первом выполняется забор материала, на втором последний исследуется в лаборатории. Начальный этап проходит стандартно. Ему предшествует подготовка пациента к сдаче крови. В стерильном помещении проводится забор биоматериала, отправляемый в герметических контейнерах на лабораторное исследование. Дальнейшее определение комплексов антиген-антитело происходит с помощью ферментов и тест-систем на специализированном оборудовании. Результат становится известен в течение недели и отправляется пациенту на электронную почту.

Интерпретация данных подразделяется на качественную и количественную. При качественном определении результаты анализа считаются позитивными, если обнаружены суммарные антитела к определенному подтипу вируса. Выявление anti-НАV IgМ свидетельствует про острый, а anti-НАV IgG — хронический гепатит А. Позитивный маркер НВsAg — признак инфицирования вирусом подтипа В. Он наблюдается в острой и хронической фазах заболевания. Если же выявлен HBCAg, у человека присутствует хронический гепатит С. А anti-НDV сигнализирует про инфицирование подвидом D. Пациенты, у которых определен положительный маркер к вирусу, нуждаются в дальнейшем обследовании для более точной верификации диагноза.

источник

Чтобы оценить работоспособность защитных функций организма и выявить точные диагностические данные, проводят иммуноферментный анализ. В случаях инфицирования человека обнаруживаются кардинальные изменения в крови и получают результат ИФА на гепатит С положительный.

Метод изучения биологического материала ИФА относят к определению иммунохимических реакций, открывающих взаимосвязи антигенов и антител. В ходе проведения анализа к молекуле антитела химическим способом подсаживают антиген-экзим, служащий маркером, который указывает на компоненты процесса.

К компонентам иммуноферментного анализа относят:

  • антитела:
  • антитела промаркированные;
  • antibodies-attacking-a-virus1-440×264 антиген;
  • субстрат фермента;
  • краситель-индикатор.

Процесс выработки антител и иммуноглобулинов запускается в момент проникания в организм пациента посторонних генов или болезнетворных бактерий.

Задачей иммуноглобулинов считают нейтрализацию антигенов, происходящую при их взаимодействии. В ходе взаимодействия иммуноглобулины формируют комплект антиген-антител, которые имеют количественные и качественные характеристики. Эти значения и изучаются в процессе исследования анализа.

Для регистрации результата в ходе тестирования иммуноферментного анализа у человека забирают биологический материал. Обычно для этих целей используют венозную кровь, но в определенных ситуациях необходим анализ спинномозговой жидкости, стекловидного тела или околоплодных вод беременной женщины. Главной особенностью этого теста является его высокая достоверность, которая составляет порядка 80%.

К плюсам иммуноферментного анализа также относят:

  • метод ИФА превосходит прочие тесты по точности определения важных показателей в десятки раз;
  • для выполнения ИФА не требуется много времени, результаты, подтверждающие или опровергающие наличие вируса в организме, получают довольно быстро;
  • стоимость проведения ИФА доступна большинству категорий населения, в отличие от прочих тестов;
  • проведение ИФА дает возможность обнаружить проблему при начальных проявлениях, что значительно облегчает последующий процесс лечения человека;
  • все стадии проведения этого анализа автоматизированы;
  • высокая степень унификации теста.

К негативным проявлениям данного анализа относят возможность ложноположительных и отрицательных результатов. Сомнительные итоги могут регистрироваться при различных патологических состояниях, беременности и при употреблении медикаментозных средств, которые влияют на выработку организмом антител.

С помощью проведения иммуноферментного анализа подсчитывается количество антител к вирусу гепатита С. В ходе исследования определяется число этих образований по IgM типу, который соответствует острому течению недуга и IgG, обнаруживаемому при хронической форме.

Антитела IgM регистрируют в течение двух недель после инфицирования организма пациента вирусом гриппа С в острой форме, срок существования этих образований от 3 до 5 месяцев.

Антитела IgG вырабатываются спустя несколько месяцев после поражения организма, но их существование подтверждается в течение десяти лет, даже при условии полного выздоровления пациента.

Отрицательный результат тестирования дает возможность утверждать, что антитела обоих типов отсутствуют в организме и на данный момент гепатит С не обнаружен. Следует учитывать, что если человек заразился в течение последних двух недель, определение патологии невозможно.

Положительный результат теста показывает наличие того или иного типа антител в организме пациента. Данный показатель характеризует инфицирование гепатитом С в острой или хронической форме. Следует учитывать, что фиксация этих образований не дает возможность однозначно указывать на заражение человека, вполне допустимо, что он является только носителем. Бывают случаи, когда при расшифровке данных фиксируется ложноположительный результат.

Это происходит в результате фиксирования лабораторными приборами антител, которые производятся защитной системой человека в ответ на следующие патологии:

  • аутоиммунное воспаление;
  • проникновение в организм пациента прочих инфекций;
  • при беременности.

Статистика проведения иммуноферментного исследования показывает, что ложноположительный вывод регистрируется в 15% всех результатов, подтверждающих наличие вируса. Для беременных женщин данный показатель еще выше.

Недостоверный вывод тестирования на гепатит С выявляется при сбоях функционирования внутренних органов и технических сбоев, то есть халатного отношения медицинского персонала к своим обязанностям. Ошибки обнаруживаются не более чем в 15% случаев, но их можно избежать, выполняя следующие правила:

Перед сдачей анализа нельзя курить

  • для сдачи анализа необходимо выбирать только проверенные, сертифицированные лаборатории с обученным медицинским персоналом;
  • накануне проведения анализов следует прекратить употребление любых медикаментозных препаратов, если прием лекарства обусловлен состоянием пациента, он должен предупредить персонал лаборатории об этом факте;
  • процедура обычно проводится утром натощак, но перед этим пациенту не следует проявлять излишнюю физическую активность и курить;
  • непосредственно перед проведением анализа рекомендуется определить температуру тела, она не должна превышать норму.

При сомнении в правильности выводов тестирования, назначается повторный анализ. В идеале требуется проведение трех исследований биологического материала на гепатит С.

Если первый тест показал наличие антител в крови пациента, а последующие два не выявили эти образования, можно утверждать, что инфицирования организма вирусом гепатита С нет. Существует ряд заболеваний, которые влияют на результат тестирования крови на наличие вируса гепатита С.

Некоторые патологии сопровождаются выработкой антител, и в этом случае подтверждение наличия вируса гепатита С в организме пациента производится с помощью других методов исследования, так как многократно повторяющиеся ошибки при ИФА анализе не дают гарантии правильного диагноза.

Комплексное изучение с применением исследования биологического материала человека в лабораторных условиях и с использованием инструментальных методов позволит выявить истинную причину недомогания, и исключить гепатит С.

Чаще всего причиной ложноположительного результата анализа являются следующие патологии:

  • инфекционные заболевания острого или хронического типа;
  • рак или доброкачественные новообразования во внутренних органах;
  • заболевания аутоиммунного типа, при течении которых образуются антитела к собственным клеткам организма пациента;
  • туберкулез;
  • малярия;
  • склеродермия;
  • герпес;
  • рассеянный склероз;
  • артрит.

Все перечисленные заболевания являются причиной возникновения сбоев в иммунной системе человека, в результате чего иммуноглобулины начинают вырабатываться с превышением нормы, что и становится помехой для постановки точного диагноза и подтверждения наличия вируса гепатита С в организме пациента.

После соприкосновения с источником инфекции организм человека может успешно подавить воспаление, но антитела, при проведении ИФА, все еще обнаруживались в крови, что стало причиной ложноположительного результата теста.

Довольно часто такой результат тестирования регистрируется у беременных женщин, поэтому без повторного анализа, подтверждение заболевания у такого пациента, не проводится.

Причиной отклонений от нормы становится изменения в организме женщины, которая ждет ребенка. В этот период у нее происходит перестройка внутренних органов, что выражается в следующих процессах:

  • изменяется гормональный фон;
  • в крови формируются специфические белки, вследствие чего меняется ее состав;
  • уровень цитокинов увеличивается.

Помимо перечисленных факторов, влияющих на итоги иммуноферментного анализа, нужно отметить ошибки медицинского персонала, приводящие к обнаружению ложноположительных выводов тестирования:

  • недостаточная квалификация персонала, проводящего забор биологического материала;
  • сбои в функционировании лабораторного оборудования;
  • подмена проб по халатности;
  • ненадлежащее хранение биологического материала (нарушение температурного режима).

При проведении иммуноферментного анализа следует учитывать, что пациент мог недавно получить прививку против гриппа, гепатита или столбняка. Этот факт нужно обязательно довести до сведения лечащего врача или медицинского персонала в лаборатории, чтобы была назначена другая дата исследования.

Регистрация антител в биологическом материале пациента, указывающая на присутствие вируса гепатита С в организме, не всегда является окончательным диагнозом заболевания. Ложноположительные результаты иммуноферментного анализа нередки, и повторные тесты часто опровергают первоначальные выводы.

При положительных анализах нужно обратиться к гепатологу

Нужно понимать, что ИФА тест дает возможность выявить количественные и качественные изменения в биологическом материале человека и определить характер течения заболевания. Делать окончательное заключение об инфицировании гепатитом С можно только после комплексного изучения состояния пациента с применением других лабораторных и инструментальных исследований.

Если положительный результат выявлен надлежащим образом, человеку следует отправиться к специалистам: инфекционисту и гепатологу. Только профильный врач сможет определить, какие тесты необходимо пройти дополнительно до назначения курса терапии

По данным медицинской статистики, в мире инфицировано гепатитом С почти 4% населения, но этот показатель явно занижен, так как многие носители недуга не подозревают о своей проблеме. Поэтому проведение ИФА теста в качестве профилактической меры поможет выявить заболевание на начальной стадии и быстро справиться с болезнью.

источник

иммуноферментная тест-система для определения поверхностного антигена вируса гепатита в и способ определения поверхностного антигена вирусного гепатита в

Изобретение относится к области иммунологии, медицины и биотехнологии. Использование: выявление или подтверждение поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg). Иммуноферментная тест-система для идентификации HBsAg в сыворотке (плазме) и препаратах крови (альбумине, фибринолизине, иммуноглобулинах и лейкоцитарном интерфероне) содержит: твердую фазу, содержащую иммуносорбент, представляющий собой сорбированные на стрипах планшета моноклональные антитела мыши к HBsAg; конъюгат-1 — биотин с моноклональными антителами к HBsAg и конъюгат-2 — стрептавидин, меченный пероксидазой хрена, представленные в виде жидких концентратов; положительный контрольный образец; отрицательный контрольный образец; промывочный раствор; раствор для разведения конъюгатов; субстратный буферный раствор; тетраметилбензидин в качестве хромогена; серную кислоту в качестве стоп-реагента; нейтрализующий реагент, жидкий или лиофилизированный, представляющий собой иммуноглобулины козы, содержащие антитела к HBsAg; контрольный реагент, жидкий или лиофилизированный, представляющий собой иммуноглобулины козы, не содержащие антител к HBsAg; слабоположительный контрольный образец, представляющий собой сыворотку крови в лиофилизированном виде, содержащую HBsAg в концентрации 0,02-0,06 МЕ/мл. Предложен также способ определения поверхностного антигена вирусного гепатита В (HBsAg) методом иммуноферментного анализа в биологическом образце с помощью данной тест-системы. Изобретение позволяет выявлять искомый антиген с чувствительностью 0,01 МЕ/мл при сохранении высокой специфичности. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 8 табл.

Изобретение относится к области медицины, иммунологии и биотехнологии.

Использование: выявление поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) или подтверждение специфичности результатов выявления.

Сущность: получение иммуноферментной тест-системы для идентификации HBsAg в сыворотке (плазме) и препаратах крови (альбумине, фибринолизине, иммуноглобулинах и лейкоцитарном интерфероне), позволяющей выявлять искомый антиген с чувствительностью не менее 0,01 МЕ/мл.

Для диагностики гепатита В с помощью специфических тестов решающее значение имеет обнаружение в сыворотке крови поверхностного антигена вируса гепатита В — HBsAg, являющегося основным маркером заболевания, который регистрируется задолго до появления клинических признаков болезни. На ранних стадиях инфекционного процесса и перед исчезновением из циркуляции концентрация HBsAg может составлять несколько пг/мл.

Всеобщая вакцинация ускорила накопление мутантных форм вируса гепатита В. Наличие мутаций в вирусном геноме вызывает изменение структуры антигенных эпигонов HBsAg или биологических свойств вируса, например снижение секреции вируса из клеток. Вследствие этого снижается выявляемость HBsAg с помощью сертифицированных диагностических тестов [Weinberger K.M. et al., 2000].

Установлено, что при сочетанном инфицировании вирусами гепатитов В и С или вирусом гепатита В и ВИЧ происходит подавление репликации вируса гепатита В. Это приводит к тому, что количество HBsAg в сыворотке крови ниже предела чувствительности большинства используемых тест-систем, разрешенных к применению [Berger A. et al., 2000; Hofer M. et al., 1998; Schuttler C.G. et al., 2002].

Современные методы выявления HBsAg позволяют обнаруживать его в низких концентрациях. Существуют национальные критерии чувствительности и специфичности отечественных препаратов. Так, с 2003 года для тест-систем на HBsAg регламентируется чувствительность 0,1 МЕ/мл.

Однако выявление случаев возникновения гепатита В после переливания «серонегативной» по HBsAg крови свидетельствует о необходимости дальнейших работ по созданию и внедрению в практическое здравоохранение тест-систем, обладающих высокой чувствительностью с сохранением высокой специфичности. Поэтому создание иммуноферментной тест-системы для определения HBsAg в сыворотке крови в концентрации 0,01 МЕ/мл позволит уменьшить риск посттрансфузионного заражения вирусным гепатитом В, повысит качество скрининга донорской крови.

Одним из путей повышения чувствительности детекции HBsAg в иммуноферментном анализе может быть использование иммунохимического комплекса биотин-стрептавидин. При синтезе конъюгата антитело-биотин с одной молекулой антитела может быть связано до 90 молекул биотина. Молекула стрептавидина имеет 4 центра связывания биотина, поэтому каждый специфический иммунохимический комплекс на конечной стадии будет содержать не одну молекулу фермента, а несколько десятков. Использование для биотинилирования длинного спейсера значительно снижает стерические препятствия при взаимодействии меченных биотином антител со стрептавидином.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) к заявленному изобретению по совокупности признаков является диагностический набор «Enzygnost HBsAg 5.0» (Dade Behring, Германия), основанный на двухстадийной постановке, в составе которого имеются биотиновый и стрептавидиновый конъюгаты (Medicines and Healthcare Products Regulatory Agency, 06/2003, Evaluation Report MHRA num-ber 03044). На первом этапе HBsAg, содержащийся в тестируемом образце, одновременно связывается с овечьими поликлональными антителами к HBsAg, сорбированными в лунки планшета, и с конъюгатом-1, являющимся мышиными моноклональными антителами к HBsAg, связанными с биотином. На втором этапе после отмывки не связавшихся реагентов конъюгат-2 (стрептавидин, меченный пероксидазой хрена) взаимодействует с конъюгатом-1. После отмывки не прореагировавших реагентов ферментативная активность связавшегося конъюгата-2 детектируется окрашенным продуктом взаимодействия фермента со смесью субстрата и хромогена. Интенсивность окрашивания пропорциональна концентрации HBsAg в исследуемом образце. Общее время реакции составляет 120 мин. Недостатком данного набора является то, что его чувствительность не превышает 0,1 МЕ/мл, что и является причиной, препятствующей достижению требуемого технического результата.

Задачей настоящего изобретения является получение тест-системы, с помощью которой достигается возможность выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) в сыворотке (плазме) крови человека с чувствительностью 0,01 МЕ/мл при сохранении высокой специфичности.

Сущность предлагаемого технического решения состоит в том, что выявление HBsAg с чувствительностью 0,01 МЕ/мл проводят с помощью диагностической иммуноферментной тест-системы, построенной на основе использования пары конъюгатов, один из которых — моноклональные антитела к HBsAg, связанные с биотином, второй — стрептавидин, меченный пероксидазой хрена, причем в ходе постановки иммуноферментного анализа присутствует стадия совместного выдерживания в лунке исследуемого образца одновременно с двумя конъюгатами.

Тест-система для определения поверхностного антигена вирусного гепатита В (HBsAg) методом иммуноферментного анализа в биологическом образце содержит:

— в качестве твердой фазы иммуносорбент, представляющий собой сорбированные на стрипах полистиролового планшета моноклональные антитела мыши к HBsAg,

— первый конъюгат — (11-кратный концентрат), прозрачная или слегка опалесцирующая, фиолетового цвета жидкость, моноклональные антитела к HBsAg, связанные с биотином,

— второй конъюгат — прозрачная или слегка опалесцирующая, голубого цвета жидкость, стрептавидин, меченный пероксидазой хрена,

— положительный контрольный образец, инактивированный, прозрачная или слегка опалесцирующая, малиново-красного цвета жидкость, сыворотка крови человека, содержащая HBsAg, не содержащая антитела к ВИЧ-1,2 и вирусу гепатита С и антитела к HBsAg,

— отрицательный контрольный образец, инактивированный, прозрачная или слегка опалесцирующая, светло-зеленого цвета жидкость, сыворотка крови человека, не содержащая HBsAg, антитела к ВИЧ-1,2 и вирусу гепатита С,

— слабоположительный контрольный образец, лиофилизированный, сухая пористая аморфная масса, гигроскопичная, белого или светло-желтого цвета, представляет собой сыворотку крови человека, содержащую HBsAg в концентрации 0,02-0,06 МЕ/мл и не содержащую антитела к ВИЧ-1,2 и вирусу гепатита С и антитела к HBsAg,

— промывочный раствор — прозрачная или слегка опалесцирующая, бесцветная или светло-желтого цвета жидкость, 25-кратный концентрат фосфатно-солевого раствора, содержащий 2,5% твина-20,

— раствор для разведения конъюгата-1, непрозрачная зеленого цвета жидкость,

— раствор для разведения конъюгата-2, прозрачная желтого цвета жидкость,

растворы для разведения конъюгатов представляют собой белково-солевые растворы,

— субстратный буферный раствор, содержащий перекись водорода, прозрачная бесцветная жидкость,

— 3,3’5,5′-тетраметилбензидин в качестве хромогена, прозрачная бесцветная жидкость,

— стоп-реагент — раствор серной кислоты 0,75 моль/л, прозрачная бесцветная жидкость.

В набор включены нейтрализующий реагент, жидкий или лиофилизированный, представляющий собой иммуноглобулины козы, содержащие антитела к HBs-антигену; контрольный реагент, жидкий или лиофилизированный, представляющий собой иммуноглобулины козы, не содержащие антитела к HBs-антигену для подтверждения поверхностного антигена HBsAg.

В качестве биологического материала может быть исследована сыворотка или плазма крови, препарат крови, например, выбранный из группы: альбумин, фибролизин, иммуноглобулин, лейкоцитарный интерферон.

Технический результат, достигаемый настоящим изобретением, заключается в улучшении чувствительности детекции HBsAg до 0,01 МЕ/мл за счет выдерживания в лунке исследуемого образца непосредственно с биотинилированными антителами, а затем без стадии отмывки инкубационная смесь выдерживается с конъюгатом стрептавидин-пероксидаза хрена, что ведет к усилению специфического сигнала.

Данное техническое решение отличается от известных наличием фазы одновременного совместного выдерживания в лунке исследуемого образца с конъюгатами-1 и -2.

Иммуноферментная тест-система для определения (выявления или подтверждения) поверхностного антигена вируса гепатита В («ДС-ИФА-HBsAg-0,01») может быть выполнена в виде 2 наборов.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Для выявления поверхностного антигена гепатита В в сыворотке (плазме) и препаратах крови (альбумине, фибринолизине, иммуноглобулинах и лейкоцитарном интерфероне) предназначен набор 1 («ДС-ИФА-HBsAg-0,01»).

Реагенты, включенные в состав набора 1:

иммуносорбент — моноклональные антитела мыши к HBsAg, сорбированные на стрипах полистиролового планшета; конъюгат-1 — жидкий (концентрат x11) — антитела к HBsAg, конъюгированные с биотином; конъюгат-2 — (концентрат х11) жидкий — стрептавидин, меченный пероксидазой хрена; положительный контрольный образец (К+1), жидкий — сыворотка крови человека, содержащая HBsAg, не содержащая антитела к ВИЧ-1,2 и вирусу гепатита С, инактивированная; слабоположительный контрольный образец (К+2), лиофилизированный — HBsAg с концентрацией 0,04±0,02 МЕ/мл в сыворотке крови человека, не содержащий антитела к ВИЧ-1,2 и вирусу гепатита С, инактивированный; отрицательный контрольный образец (К-), жидкий — сыворотка крови человека, не содержащая HBsAg, не содержащая антитела к ВИЧ-1,2 и вирусу гепатита С, инактивированная; промывочный раствор (ПР, концентрат х25), жидкий; раствор для разведения концентрата конъюгата-1 (РРК-1), жидкий; раствор для разведения концентрата конъюгата-2 (РРК-2), жидкий; субстратный буферный раствор (СБ), жидкий; хромоген — тетраметилбензидин (ТМБ), жидкий; стоп-реагент — серная кислота, раствор, 0,75 моль/л.

Комплект 1 с увеличенным объемом компонентов — на одновременное проведение 192 (96×2) определений, включая контрольные (комплект 1 может быть использован на автоматизированном ИФА-анализаторе).

Комплект 2 — на одновременное проведение 192 (96×2) определений, включая контрольные.

Комплект 3 с увеличенным объемом компонентов — на одновременное проведение 96 (8×12) определений, включая контрольные (комплект 3 может быть использован на автоматизированном ИФА-анализаторе).

Комплект 4 — на одновременное проведение 96 (8×12) определений, включая контрольные.

Слабоположительный контрольный образец. Готовят перед использованием. Содержимое флакона растворить физиологическим раствором в объеме, указанном на этикетке флакона, осторожно перемешать и выдержать до использования 5-10 мин.

Промывочный рабочий раствор — для промывания иммуносорбента. Содержимое флакона с концентратом ПР разводят в 25 раз дистиллированной водой. Полученный раствор тщательно перемешивают. Приготовленный промывочный раствор хранят не более 3-х суток при температуре от 2°С до 8°С.

Конъюгат-1, рабочий раствор. Готовят перед использованием. При использовании целого планшета к 5,0 мл раствора для разведения концентрата конъюгата-1 добавляют 0,5 мл концентрата конъюгата-1 и осторожно перемешивают.

Конъюгат-2, рабочий раствор. Готовят перед использованием. При использовании целого планшета к 5,0 мл раствора для разведения концентрата конъюгата-2 добавляют 0,5 мл концентрата конъюгата-2 и осторожно перемешивают.

Срок годности рабочих растворов конъюгатов — не более 30 мин в защищенном от света месте.

Субстратная смесь. Готовят перед использованием. 1,2 мл тетраметилбензидина перенести в 18,0 мл субстратного буферного раствора и содержимое флакона тщательно перемешать. Хранению не подлежит.

Оставшиеся неиспользованными реагенты хранить во флаконах, укупоренных пробками, на протяжении срока годности тест-системы при температуре от 2°С до 8°С.

Во избежание конденсации влаги внутри лунок необходимо выдержать иммуносорбент при комнатной температуре в закрытом пакете не менее 30 минут.

Перед использованием комплектов 3 и 4 необходимо вскрыть фольгированный пакет с иммуносорбентом. Вынуть из пакета рамку и необходимое количество стрипов. Пакет с неиспользованными стрипами тщательно герметизировать, не удаляя осушитель. После первого вскрытия пакета иммуносорбент стабилен в течение 1 месяца при температуре от 2°С до 8°С.

Перед использованием иммуносорбент любого комплекта промыть 3 раза рабочим раствором ПР, заливая его до краев лунок (от 380 до 400 мкл в лунку), не допуская при этом переливания промывочного раствора через края лунок, выдержать 40 с и удалить промывочный раствор в емкость для сбора инфицированного материала.

Затем в лунки планшета с сорбированными моноклональными антителами к HBsAg вносят по 100 мкл контрольных и исследуемых образцов. Покрытый крышкой планшет выдерживают 30 мин при температуре (42±0,5)°С в условиях влажной камеры. Затем, не удаляя содержимое лунок и не промывая планшет, во все лунки стрипов вносят по 50 мкл рабочего раствора конъюгата-1, окрашенного в зеленый цвет. При этом содержимое лунок изменяет свой цвет на серый. В случае тестирования плазмы или сыворотки, имеющих кислый рН, раствор в лунках становится ярко-желтым. При добавлении конъюгата-1 не следует допускать случайного заноса образца из одного стрипа в другой через наконечники. Содержимое лунок тщательно перемешивают осторожным постукиванием по краям планшета, после чего покрытый крышкой планшет выдерживают в течение 45 мин при температуре (42±0,5)°С в условиях влажной камеры. Затем, не удаляя содержимое лунок и не промывая планшет, во все лунки стрипов вносят по 50 мкл рабочего раствора конъюгата-2, окрашенного в желтый цвет. При добавлении конъюгата-2 не следует допускать случайного заноса образца из одного стрипа в другой через наконечники. Содержимое лунок тщательно перемешивают осторожным постукиванием по краям планшета, после чего покрытый крышкой планшет выдерживают в течение 45 мин при температуре (42±0,5)°С в условиях влажной камеры. Далее содержимое лунок удаляют в емкость для сбора инфицированного материала и планшет промывают 7 раз рабочим промывочным раствором. Во все лунки планшета вносят по 150 мкл субстратной смеси и выдерживают в течение 25 мин в защищенном от света месте при температуре от 20°С до 24°С. Реакцию останавливают добавлением во все лунки планшета по 50 мкл стоп-реагента и через 2-3 мин проводят учет результатов ИФА.

Учет результатов проводят спектрофотометрически при двух длинах волн: 450/620-680 нм с настройкой прибора «по воздуху». Допустим учет результатов при одной длине волны 450 нм. Реакцию следует учитывать, если средние значения оптической плотности (ОП) в лунках с К- не более 0,120, в лунках с К+1 — не менее 0,6. Значения ОП в лунках с К- не должны отличаться от среднего значения ОП К- более чем на 30%. Если одно из значений ОП К- выходит за этот предел, его следует исключить из расчета среднего значения. Если исключению подлежат более одного значения ОП К-, анализ следует повторить. Реакцию считают положительной, если значение ОП в лунке с образцом равно или превышает значение ОП критическое (ОП крит.). ОП крит. рассчитывают по формуле:

ОП крит. = ОП К- ср. + 0,060, где 0,060 — коэффициент, определяемый методом статистической обработки на предприятии-изготовителе.

Слабоположительный контрольный образец, содержащий HBsAg в концентрации 0,04±0,02 МЕ/мл, должен давать положительную реакцию. Общее время постановки ИФА составляет 145 мин.

При постановке иммуноферментного анализа на шейкере контрольные и исследуемые образцы вносят по 100 мкл вместе с рабочим раствором конъюгата-1 в количестве 50 мкл. Планшет выдерживают 40 мин на шейкере при скорости 500 об/мин и температуре (42±0,5)°С. Затем, не удаляя содержимое лунок и не промывая планшет, во все лунки стрипов вносят по 50 мкл рабочего раствора конъюгата-2. Планшет выдерживают 20 мин при 42°С на шейкере при скорости 500 об/мин и температуре (42±0,5)°С. Далее содержимое лунок удаляют в емкость для сбора инфицированного материала и планшет промывают 7 раз рабочим промывочным раствором. Во все лунки планшета вносят по 150 мкл субстратной смеси и выдерживают в течение 25 мин в защищенном от света месте при температуре от 20°С до 24°С. Реакцию останавливают добавлением во все лунки планшета по 50 мкл стоп-реагента и через 2-3 мин проводят учет результатов ИФА.

Общее время постановки ИФА при использовании шейкера составляет 85 мин.

В качестве еще одного варианта осуществления изобретения может быть подтверждение специфичности результатов выявления поверхностного антигена вируса гепатита В в сыворотке (плазме) и препаратах крови (альбумине, фибринолизине, иммуноглобулинах и лейкоцитарном интерфероне) с использованием набора 2 «ДС-ИФА-HBsAg-0,01-подтверждающая».

В дополнение к реагентам, включенным в состав набора 1, в состав набора 2 включены АНТИ-HBs-ПЛЮС (нейтрализующий реагент) — жидкий или лиофилизированный, иммуноглобулины козы, содержащие антитела к HBs-антигену; АНТИ-HBs-МИНУС (контрольный реагент) — жидкий или лиофилизированный, иммуноглобулины козы, не содержащие антитела к HBs-антигену. Лиофилизированное содержимое флаконов растворяют дистиллированной водой в объеме, указанном на этикетке.

Комплект 5 с увеличенным объемом компонентов — на одновременное проведение 48 (4×12) подтверждающих определений, включая контрольные (комплект 1 может быть использован на автоматизированном ИФА-анализаторе).

Комплект 6 — на одновременное проведение 48 (4×12) подтверждающих определений, включая контрольные.

При постановке ИФА контрольные образцы и образцы, подлежащие подтверждению, внести каждый в две лунки по 100 мкл. В первые лунки с контрольными и подтверждаемыми образцами добавить по 25 мкл контрольного реагента — АНТИ-HBs-МИНУС, во вторые — по 25 мкл нейтрализующего реагента — АНТИ-HBs-ПЛЮС. Покрытый крышкой планшет выдержать в течение 30 мин при температуре (42,0±0,5)°С в условиях влажной камеры. Дальнейшее проведение ИФА, а также постановка на шейкере осуществляется аналогично, как описано выше при использовании набора 1.

Учет результатов проводить спектрофотометрически при двух длинах волн — 450 нм и 620-680 нм с настройкой прибора «по воздуху». Допустим учет результатов при одной длине волны — 450 нм. Реакцию следует учитывать, если среднее значение ОП в лунках с К- (без добавления контрольного или нейтрализующего реагентов) (ОП К- ср.) не более 0,12, а в лунке с К+1 (без добавления контрольного или нейтрализующего реагентов) (ОП К+) — не менее 0,6. Значение ОП в лунке с К+1 после добавления нейтрализующего реагента (ОПн К+1) должно быть равным или меньше половины суммы ОП в лунке с К+1 после добавления контрольного реагента (ОПк К+1) и ОП К- ср., т.е. ОПн К+1 0,5×(ОПк К+1+ОП К- ср.). Значения ОП К- после добавления нейтрализующего и контрольного реагентов должны быть ниже значения ОП критического (ОП крит.), т.е. ОПн К- и ОПк К- образец

Классы МПК: G01N33/576 гепатита
Автор(ы): Бурков Анатолий Николаевич (RU) , Уланова Татьяна Ивановна (RU) , Обрядина Анна Петровна (RU) , Егорова Наталия Игоревна (RU) , Иголкина Светлана Николаевна (RU) , Шарипова Ирина Николаевна (RU)
Патентообладатель(и): Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственное объединение «Диагностические системы» (RU)
Приоритеты: 0,5-0,7 40,03 2,5 15,10 Поз
19 Неразв. образец 0,1-0,25 25,27 1,2 5,33 Поз
20 Неразв. образец 0,1-0,25 19,54 0,6 3,62 Поз
Читайте также:  Сдать анализ на гепатит минск

В таблице 4 представлены результаты сравнительного исследования клинической чувствительности тест-системы «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» с использованием панелей производства BBI Diagnostics (Boston Biomedica Inc. (BBI), West Bridgewater, Mass., USA) и Zeptometrix Corporation.

Новый тест с идентичной чувствительностью выявляет HBsAg субтипов ad и ay со значительным преимуществом относительно теста сравнения — системы Abbott Auszyme EIA HBsAg (V2). Из данных таблиц видно, что тест-система «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» с идентичной чувствительностью определяет HBsAg субтипов ay и ad во всех позитивных образцах, представленных в панелях. Коэффициенты позитивности многих HBsAg-положительных образцов в тест-системе «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» существенно превышают коэффициенты позитивности этих же образцов, протестированных на альтернативных тестах. В образцах низкотитражной панели (от 0,05 до 0,6 IU/ml) новая тест-система позволяет также детектировать HBsAg с более высокими коэффициентами позитивности в сравнении с альтернативными тестами.

Анализ сероконверсионных панелей показал, что тест-система «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» позволяет детектировать HBsAg в положительных образцах на более раннем сроке его появления, по сравнению с зарубежными тест-системами, данные по которым приведены в паспортах к панелям. По результатам анализа двух панелей образцов, полученных от одного донора в динамике в период сероконверсии (от момента появления до момента исчезновения HBsAg) (РНМ935А (М) и РНМ935 В), следует, что новая система в сравнении с альтернативными тестами импортного производства начинает выявлять HBsAg на более раннем сроке его появления и продолжает определять на более позднем сроке по мере его исчезновения, в результате чего позитивный по HBsAg период увеличивается на 28 дней в сравнении с системой Abbott Prism HBsAg * .

Было установлено, что использование тест-системы «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» для анализа образцов сероконверсионных панелей позволяет выявлять HBsAg одновременно с вирусной ДНК (BBI-PHM933, BBI-PHM934, BBI-РНМ935А (М), ZeptoMetrix Corporation Cat. No. HBV6281), а в двух случаях (ZeptoMetrix Corporation Cat. No. HBV6277 и Cat. No. HBV6279) опережает время 1-ой детекции ДНК.

Читайте также:  Сдать анализ на гепатит натощак

Известно, что существует проблема выявления HBsAg при коинфицировании. Было проанализировано 473 образца сыворотки крови анти-ВИЧ-позитивных лиц. Среди них в 66 был выявлен HBsAg в тесте «ДС-ИФА-HBsAg». Дополнительно выявлено 16 образцов, содержащих HBsAg в концентрации ниже 0,1 МЕ/мл. Причем 7 из них содержали антитела к HBcore-антигену, а 9 образцов не имели никаких других маркеров, кроме HBsAg, детектируемого только в системе с высокой чувствительностью (таблица 5). Следовательно, повышение чувствительности тестов для выявления HBsAg позволит снизить количество случаев скрытого гепатита В как с наличием дополнительного маркера анти-НВс, так и при отсутствии любых маркеров.

При тестировании 3348 образцов сыворотки крови доноров и 381 образца сыворотки крови беременных женщин в тест-системе «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» было выявлено 6 и 1 образец, соответственно, содержащих HBsAg в концентрации ниже 0,1 МЕ/мл.

За счет повышенной чувствительности нового теста мутантные варианты HBsAg показывают более высокую реактивность в сравнении с другими системами (таблица 6).

Таблица 6
Сравнительное определение мутантных форм рекомбинатного HBsAg (ОПm/ОП крит.)
adw2 ДС-ИФА-HBsAg ДС-ИФА-HBsAg-0,01 «Hepanostika» (Biomerieux) «Рекоматгеп-В-стрип» (Эколаб) «Вектогеп-HBsAg-стрип» компл. №4
K141Е 1,6 10,4 8,6 1,3 2,2
Q129H 1,2 13,0 16,6 1,4 2,3
Q129L 1,5 14,1 11,0 1,7 1,2
M133L 2,8 16,9 13,6 1,6 2,2
T126N 2,9 17,7 8,1 1,6 1,4
G145RI 1,4 9,1 5,8 1,2 1,7
G145RII 1,6 15,7 18,8 1,2 0,8
K142S 2,0 5,6 44,1 1,5 1,3
P142S 1,5 11,8 54,8 1,5 1,4
Т143К 1,5 11,7 2,9 1,2 0,6
K141BI 3,6 2,5 54,6 0,9 0,9
ayw1 G145R 2,5 27,4 45,1 2,1 3,3

Для оценки специфичности тест-системы «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» были использованы образцы сыворотки крови доноров; образцы сыворотки крови больных с различными инфекционными заболеваниями, не связанными с HBV-пневмонией, ангиной, бронхитом, вирусным гепатитом С; образцы сыворотки крови больных с различными неинфекционными заболеваниями — с патологией сердечно-сосудистой системы, желудочно-кишечного тракта, онкозаболеваниями и др.; образцы сыворотки крови беременных женщин; образцы сыворотки крови ВИЧ-инфицированных лиц. Всего протестировано 4710 образцов. Данные по числу ложноположительных результатов в тест-системе «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» в группе здоровых и различных группах больных представлены в таблице 7.

Таблица 7
Оценка специфичности тест-системы «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» на разных категориях населения
Обследуемая группа Количество исследуемых образцов Количество ложноположительных результатов % специфичности в данной группе
Здоровые доноры 3348 7 99,8
Больные с различными инфекционными заболеваниями, не связанными с вирусным гепатитом В 392 5 98,7
Больные с различными неинфекционными заболеваниями 95 1 98,9
Беременные женщины 381 3 99,2
ВИЧ-инфицированные 494 4 99,2
Всего 4710 20 99,6

Таким образом, проведенные исследования показали, что специфичность тест-системы «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» составляет 99,6% при исследовании образцов сыворотки крови нормальных доноров и больных с различными инфекционными и соматическими заболеваниями.

Была изучена возможность использования нового теста для детекции HBsAg в препаратах крови. В ходе исследований анализировался широкий спектр препаратов крови разных фирм-производителей: альбумин, фибринолизин, лейкоцитарный интерферон, иммуноглобулин нормальный для внутривенного введения и внутримышечного введения, иммуноглобулин противоаллергический и иммуноглобулин антистафилококковый. Жидкие препараты крови используют неразведенными; лиофильно высушенные препараты крови перед исследованием в тест-системе разводят в соответствии с инструкцией по применению данного препарата. Специфичность тест-системы по отношению к препаратам крови (были взяты пять разных серий препаратов) была исследована на трех экспериментально-производственных сериях тест-системы (таблица 8).

Таблица 8
Специфичность тест-системы «ДС-ИФА-HBsAg-0,01», установленная при исследовании препаратов крови
Наименование препарата ОП препаратов (о.е.) средняя (n=5) для каждой серии тест-системы
С.1 С.2 С.3
Альбумин 0,017 0,025 0,032
Фибринолизин 0,007 0,009 0,005
Иммуноглобулин внутривенный 0,009 0,011 0,015
Иммуноглобулин внутримышечный 0,014 0,008 0,010
Интерферон 0,005 0,007 0,008
ОП крит.(о. е.) 0,072 о.е. 0,069 о.е. 0,075 о.е.

Из данных таблицы видно, что значения ОП всех препаратов были ниже ОП крит. (о.е.), т.е. тест-система «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» показала 100% специфичность при тестировании препаратов крови.

Преимущество предлагаемой тест-системы для выявления HBsAg «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» заключается в возможности детекции HBsAg в сыворотке (плазме) и препаратах крови с чувствительностью 0,01 МЕ/мл при сохранении высокой специфичности.

1. Тест-система для определения поверхностного антигена вирусного гепатита В (HBsAg) методом иммуноферментного анализа в биологическом образце, характеризующаяся тем, что содержит твердую фазу, содержащую иммуносорбент, представляющий собой сорбированные на стрипах планшета моноклональные антитела мыши к HBsAg; конъюгат-1 — биотин с моноклональными антителами к HBsAg и конъюгат-2 — стрептавидин, меченный пероксидазой хрена, представленные в виде жидких концентратов; положительный контрольный образец; отрицательный контрольный образец; промывочный раствор; растворы для разведения конъюгатов; субстратный буферный раствор; тетраметилбензидин в качестве хромогена; серную кислоту в качестве стоп-реагента; нейтрализующий реагент, жидкий или лиофилизированный, представляющий собой иммуноглобулины козы, содержащие антитела к HBsAg; контрольный реагент, жидкий или лиофилизированный, представляющий собой иммуноглобулины козы, не содержащие антител к HBsAg; слабоположительный контрольный образец, представляющий собой сыворотку крови в лиофилизированном виде, содержащую HBsAg в концентрации 0,02-0,06 МЕ/мл.

Читайте также:  Сдать анализ на генотип гепатит с

2. Тест-система по п.1, отличающаяся тем, что биологический материал представляет собой сыворотку или плазму крови.

3. Тест-система по п.1, отличающаяся тем, что биологический материал представляет собой препарат крови, выбранный из группы альбумин, фибролизин, иммуноглобулин, лейкоцитарный интерферон.

4. Способ определения поверхностного антигена вирусного гепатита В (HBsAg) методом иммуноферментного анализа в биологическом образце с помощью тест-системы по п.1, включающий выдерживание контрольных и исследуемых биологических образцов, внесенных в лунки планшета с сорбированными моноклональными антителами мыши к HBsAg при температуре (42±0,5)°С с последующим добавлением окрашенного раствора конъюгата, который представляет собой моноклональные антитела к HBsAg, связанные с биотином, а затем без стадии отмывки инкубационную смесь тщательно смешивают и выдерживают с окрашенным раствором конъюгата, представляющего собой стрептавидин, меченный пероксидазой хрена, при температуре (42±0,5)°С, реакцию останавливают добавлением стоп-реагента и проводят учет результатов спектрофотометрическим методом.

источник

Поверхностный антиген гепатита В в сыворотке крови в норме отсутствует.
Обнаружение поверхностного антигена (HBsAg) гепатита В в сыворотке подтверждает острое или хроническое инфицирование вирусом гепатита В.

При остром заболевании HBsAg выявляется в сыворотке крови в последние 1-2 недели инкубационного периода и первые 2-3 недели клинического периода. Циркуляция HBsAg в крови может ограничиваться несколькими днями, поэтому следует стремиться к раннему первичному обследованию больных. Метод ИФА позволяет выявить HBsAg более чем у 90% больных. Почти у 5% больных самые чувствительные методы исследования не обнаруживают HBsAg, в таких случаях этиология вирусного гепатита В подтверждается наличием анти-HBсAg JgM или ПЦР.

Концентрация HBsAg в сыворотке крови при всех формах тяжести гепатита В в разгар заболевания имеет значительный диапазон колебаний, вместе с тем имеется определенная закономерность: в остром периоде существует обратная связь между концентрацией HBsAg в сыворотке и тяжестью болезни.

Высокая концентрация HBsAg чаще наблюдается при легких и среднетяжелых формах болезни. При тяжелых и злокачественных формах концентрация HBsAg в крови чаще низкая, причем у 20% больных с тяжелой формой и у 30% со злокачественной антиген в крови может вообще не обнаруживаться. Появление на этом фоне у больных антител к HBsAg расценивается как неблагоприятный диагностический признак; он определяется при злокачественных формах гепатита В.

При остром течении гепатита В концентрация HBsAg в крови постепенно снижается вплоть до полного исчезновения этого антигена. HBsAg исчезает у большинства больных в течение 3 месяцев от начала острой инфекции.

Снижение концентрации HBsAg более чем на 50% к концу 3-й недели острого периода, как правило, свидетельствует о близком завершении инфекционного процесса. Обычно у больных с высокой концентрацией HBsAg в разгар болезни он обнаруживается в крови в течение нескольких месяцев.
У больных с низкой концентрацией HBsAg исчезает значительно раньше (иногда через несколько дней после начала заболевания). В целом срок обнаружения HBsAg колеблется от нескольких дней до 4-5 мес. Максимальный срок обнаружения HBsAg при гладком течении острого гепатита В не превышает 6 месяцев от начала заболевания.

HBsAg может быть обнаружен у практически здоровых людей, как правило, при профилактических или случайных исследованиях. В таких случаях исследуют другие маркеры вирусного гепатита В – анти HBсAg JgM, анти- HBсAg JgG, анти HBеAg и изучают функцию печени.

При отрицательных результатах необходимы повторные исследования на HBsAg.
Если повторные исследования крови в течение более 3 месяцев выявляют HBsAg, такого пациента относят к хроническим больным вирусным гепатитом В.
Наличие HBsAg – довольно распространенное явление. В мире насчитывается более 300 млн. носителей, а у нас в стране – около 10 млн. носителей.
Прекращение циркуляции HBsAg с последующей сероконверсией (образование анти-HBs) всегда свидетельствует о выздоровлении — санации организма.

Исследование крови на наличие HBsAg применяется в следующих целях:

  • для диагностики острого гепатита В:
    • инкубационный период;
    • острый период заболевания;
    • ранняя стадия реконвалесценции;
  • для диагностики хронического вирусного гепатита В;
  • при заболеваниях:
    • персистирующем хроническом гепатите;
    • циррозе печени;
  • для скрининга и выявления больных в группах риска:

  • больные с частыми гемотрансфузиями;
  • больные с хронической почечной недостаточностью;
  • больные с множественным гемодиализом;
  • больные с иммунодефицитными состояниями, в том числе СПИДом.
  • Результаты исследования выражаются качественно – положительный или отрицательный. Отрицательный результат исследования указывает на отсутствие HBsAg в сыворотке крови. Положительный результат – выявление HBsAg свидетельствует об инкубационном или остром периоде острого вирусного гепатита В, а также при хроническом вирусном гепатите В.

    В норме анти-HBcAg JgG в сыворотке отсутствует.
    У больных анти-HBcAg JgG появляются в острый период вирусного гепатита В и сохраняются на протяжении всей жизни. Анти-HBcAg JgG – ведущий маркер перенесенного ВГВ.

    Исследование крови на наличие анти-HBcAg JgG применяются для диагностики:

  • хронического вирусного гепатита В при наличии HBs антигена в сыворотке крови;
  • перенесенного вирусного гепатита В.
  • Результат исследования выражается качественно – положительный или отрицательный. Отрицательный результат исследования указывает на отсутствие анти-HBcAg JgG в сыворотке крови. Положительный результат – выявление анти-HBcAg JgG свидетельствует об острой инфекции, реконвалесценции или ранее перенесенном вирусном гепатите В.

    В норме HBeAg в сыворотке крови отсутствует.
    HBeAg можно обнаружить в сыворотке крови большинства больных острым вирусным гепатитом В. Он обычно исчезает в крови раньше HBs-антигена. Высокий уровень HBeAg в первые недели заболевания или обнаружение его на протяжении более 8 недель дает основание заподозрить хроническую инфекцию.

    Этот антиген часто обнаруживается при хроническом активном гепатите вирусной этиологии. Особый интерес к определению HBeAg связан с тем, что его обнаружение характеризует активную репликативную фазу инфекционного процесса . Установлено, что высокие концентрации HBeAg соответствуют высокой ДНК-полимеразной активности и характеризуют активную репликацию вируса.

    Наличие HBeAg в крови свидетельствует о высокой ее инфекциозности, т.е. присутствии в организме обследуемого активной инфекции гепатита В, и обнаруживается только в случае присутствия в крови HBs-антигена. У больных хроническим активным гепатитом противовирусные препараты применяются только при обнаружении в крови HBeAg. HBeAg – антиген – маркер острой фазы и репликации вируса гепатита В.

    Исследование крови на наличие HBe-антигена применяется для диагностики:

  • инкубационного периода вирусного гепатита В;
  • продромального периода вирусного гепатита В;
  • острого периода вирусного гепатита В;
  • хронического персистирующего вирусного гепатита В.
  • Результат исследования выражается качественно – положительный или отрицательный. Отрицательный результат исследования указывает на отсутствие HBeAg в сыворотке крови. Положительный результат – выявление HBeAg свидетельствует об инкубационном или остром периоде острого вирусного гепатита В или продолжающейся репликации вируса и инфекциозности больного.

    Анти-HBeAg в сыворотке в норме отсутствует. Появление анти-НВeAg антител указывает обычно на интенсивное выведение из организма вируса гепатита В и незначительное инфицирование больного.

    Эти антитела появляются в острый период и сохраняются до 5 лет после перенесенной инфекции. При хроническом персистирующем гепатите анти-НВeAg обнаруживаются в крови больного вместе с НВsAg. Сероконверсия, т.е. переход HBeAg в анти-НВeAg, при хроническом активном гепатите, чаще прогностически благоприятна, но такая же сероконверсия при выраженной цирротической трансформации печени прогноза не улучшает.

    Исследование крови на наличие анти-НВeAg применяются в следующих случаях при диагностике вирусного гепатита В:

  • установление начальной стадии заболевания;
  • острый период инфекции;
  • ранняя стадия реконвалесценции;
  • реконвалесценция;
  • поздняя стадия реконвалесценции.
  • диагностика недавно перенесенного вирусного гепатита В;
  • диагностика хронического персистирующего вирусного гепатита В.
  • Результат исследования выражается качественно – положительный или отрицательный. Отрицательный результат исследования указывает на отсутствие антител к HBeAg в сыворотке крови. Положительный результат – выявление антител к HBeAg, которые могут свидетельствовать о начальной стадии острого вирусного гепатита В, остром периоде инфекции, ранней стадии реконвалесценции, реконвалесценции, перенесенном недавно вирусном гепатите В или персистирующем вирусном гепатите В.

    Критериями наличия хронического гепатита В являются:

  • бнаружение или периодическое выявления ДНК ВГВ в крови;
  • постоянное или периодическое повышение активности АЛТ/АСТ в крови;\
  • морфологические признаки хронического гепатита при гистологическом исследовании биоптата печени.
  • Вирус гепатита В в крови в норме отсутствует.
    Качественное определение вируса гепатита В методом ПЦР в крови позволяет подтвердить наличие вируса в организме больного и тем самым устанавливает этиологию заболевания.

    Данное исследование дает полезную информацию для диагностики острого вирусного гепатита В в инкубационном и раннем периоде развития заболевания, когда основные серологические маркеры в крови у пациента могут отсутствовать. Вирусную ДНК в сыворотке крови обнаруживают у 50% больных при отсутствии HBeAg. Аналитическая чувствительность метода ПЦР составляет не менее 80 вирусных частиц в 5 мкл, прошедшей выявление ДНК пробы, специфичность – 98%.

    Этот метод имеет важное значение для диагностики и мониторинга течения хронического ВГВ. Примерно 5-10% случаев цирроза и других хронических заболеваний печени обусловлены хроническим носительством вируса гепатита В. Маркерами активности таких заболеваний является наличие HBeAg и ДНК вируса гепатита В в крови.

    Метод ПЦР позволяет определять в крови ДНК вируса гепатита В как качественно, так и количественно. Определяемым фрагментом в обоих случаях служит уникальная последовательность ДНК гена структурного белка вируса гепатита В.

    Обнаружение ДНК вируса гепатита В в биоматериале с помощью ПЦР необходимо для:

  • разрешения сомнительных результатов серологических исследований;
  • выявление острой стадии заболевания по сравнению с перенесенной инфекцией или контактом;
  • контроля эффективности противовирусного лечения.
  • Исчезновение ДНК вируса гепатита В из крови – признак эффективности терапии

    Этот метод дает важную информацию об интенсивности развития заболевания, об эффективности лечения и о развитии резистентности к активным препаратам.
    Для диагностики вирусного гепатита методом ПЦР в сыворотке крови применяются тест-системы, чувствительность которых составляет 50-100 копий в пробе, что позволяет детектировать вирус при его концентрации 5 Х 10^3 -10^4 копий/мл. ПЦР при вирусном гепатите В безусловно необходима для суждения о вирусной репликации.

    Вирусную ДНК в сыворотке крови обнаруживают у 50% больных при отсутствии HBeAg. Материалом для выявления ДНК вируса гепатита В могут служить сыворотка крови, лимфоциты, гепатобиоптаты.

    • Оценку уровня виремии осуществляют следующим образом:
    • менее 2.10^5 копий/мл (менее 2.10^5 МЕ/мл) – низкая виремия ;
    • от 2.10^5 копий/мл (2.10^5 МЕ/мл) до 2.10^6 копий/мл (8.10^5 МЕ/мл) – средняя виремия;
    • более 2.10^6 копий/мл – высокая виремия.

    Существует зависимость между исходом острого вирусного гепатита В и концентрацией ДНК ВГВ в крови больного. При низком уровне виремии процесс хронизации инфекции близок к нулю, при средней – хронизация процесса наблюдается у 25-30% больных, а при высоком уровне виремии острый вирусный гепатит В чаще всего переходит в хронический.

    Показаниями для лечения хронического ВГВ интерфероном-альфа следует считать наличие маркеров активной репликации вируса (выявление HBsAg, HBeAg и ДНК ВГВ в сыворотке крови в течение предшествующих 6 месяцев.).

    Критериями оценки эффективности лечения служат исчезновение HBeAg и ДНК ВГВ в крови, что обычно сопровождается нормализацией уровня трансаминаз и долговременной ремиссией заболевания, ДНК ВГВ исчезает из крови к 5-му месяцу лечения у 60%, к 9-му месяцу – у 80% больных. Снижение уровня виремии на 85% и более к третьему дню от начала лечения по сравнению с исходным служит быстрым и достаточно точным критерием для прогнозирования эффективности терапии.

    источник