Меню Рубрики

Анализ проб воды на бактериологический анализ

Исследованию подлежит вода:

1) централизованного водоснабжения;

2) из колодцев различного типа;

3) открытых водоемов (рек, озер, морей);

Примечание. Пробы хлорированной воды берут во флаконы с дехлоратором (гипосульфитом).

Отбор проб воды. Из открытых водоемов воду берут с помощью специальных бутылей или батометров, снабженных грузилами. Пробу воды рекомендуют брать на глубине 10-15 см от поверхности (так как поверхность подвергается воздействию атмосферных факторов) и на расстоянии 1,5 м от берега (вода у самого берега может быть загрязнена микрофлорой почвы).

Для отбора проб водопроводной воды используют стерильные флаконы вместимостью 500 мл, закрытые ватно-марлевыми пробками и покрытые бумажными колпачками.

Кран предварительно обжигают тампоном, смоченным спиртом, после чего воду спускают в течение 10-15 мин и набирают во флаконы. Заполненные флаконы закрывают стерильными пробками.

Примечание. Исследуют 333 мл воды (табл. 54).


Таблица 54. Эмпирическая таблица ГОСТ 16963-73

В распределительной сети водопровода отбор проб воды осуществляют в зависимости от количества населения, проживающего в зоне обслуживания.

Стандартные методы исследования регламентированы для воды центрального водоснабжения (ГОСТ 18963-73) и предусматривают:

1. Определение общего числа микроорганизмов (в 1 мл исследуемой воды должно быть не более 100).

2. Определение коли-индекса и коли-титра (коли-индекс 3, коли-титр 333 и выше; для Москвы и Ленинграда коли-индекс не более 2, а коли-титр более 500).

3. Исследование по эпидемиологическим показаниям на патогенную микрофлору (патогенных микроорганизмов не должно быть обнаружено).

Согласно ГОСТу 18963-73 общее число бактерий — это то количество микроорганизмов, которое содержится в 1 мл исследуемой воды, способных в течение суток при температуре 37° С образовывать колонии, видимые невооруженным глазом (или при увеличении с помощью лупы).

При исследовании водопроводной воды засевают 2 чашки. В одну из них вносят 1 мл неразведенной воды, в другую 1 мл воды, разведенной в 10 раз (т. е. 0,1 мл исходной пробы).

При исследовании более загрязненной воды засевают 1 мл воды, разведенной в 100 раз. Это соответствует 0,01 и 1 мл .воды, разведенной в 1000 раз (0,001 мл) и т. д. Для получения таких объемов готовят последовательно десятикратные разведения, по 1 мл каждого разведения вносят в чашку и заливают тонким слоем (12-15 мл) растопленного и остуженного до 45° С питательного агара. Для равномерного распределения исследуемой воды залитые агаром чашки перемешивают путем вращения их. После застывания агара посевы ставят в термостат и инкубируют при температуре 37° С 24 ч.

Чашки с посевами вынимают из термостата и подсчитывают число выросших колоний. Учитывают только те чашки, где число колоний находится в пределах 30-300. Если колоний немного, их подсчитывают невооруженным глазом или при помощи лупы.

Если колоний много, то подсчет можно вести с помощью специального прибора для счета микробных колоний (рис. 54).


Рис. 54. Прибор для счета колоний микроорганизмов. 1 — столик для чашки Петри; 2 — игла с пружинным устройством; 3 — показатель счетчика; 4 — тумблер для включения импульсного счетчика; 5 — тумблер для включения лампы освещения счетчика

Подсчитанное количество колоний умножают на разведение и узнают число микробов в 1 мл исследуемой воды.

Наличие БГКП (бактерий группы кишечной палочки) является показателем фекального загрязнения, интенсивность которого характеризуют:

Коли-индекс — количество кишечных палочек, обнаруженных в 1 л воды.

Коли-титр — наименьшее количество воды, в котором обнаруживают присутствие кишечной палочки * .

* ( Коли-титр и коли-индекс — это один показатель, различно выраженный.)

Для выявления в воде БГКП можно пользоваться двумя методами: титрационным (бродильным) и методом мембранных фильтров.

Для исследования воды используют среду накопления глюкозопептонную (ГПС) среду Эйкмана с индикатором и бродильными трубками. Среда готовится концентрированной (в 10 раз) и нормальной концентрации — для посева 1 мл воды.

Исследуемую воду засевают по 100 мл в 3 колбы, по 10 мл в 3 пробирки (с концентрированной средой) и по 1 мл в 3 пробирки (со средой нормальной концентрации) — всего 333 мл. Посевы инкубируют в термостате при 37° С 24 ч.

Вынимают посевы из термостата и просматривают их.

При наличии помутнения в колбах или пробирках из них производят посев петлей на сектора среды Эндо в чашках Петри. Посевы инкубируют в термостате при 37° С.

Вынимают чашки из термостата. Из подозрительных колоний делают мазки. При наличии грамотрицательных палочек ставят пробу на оксидазную активность. Положительная проба на оксидазу дает право дать отрицательный ответ.

Проба на оксидазу. 1-й способ: со среды Эндо снимают петлей 2-3 колонии каждого типа и наносят на поверхность фильтровальной бумаги, смоченной диметилпарафенилендиамином. Положительная реакция характеризуется посинением штрихов, сделанных из колоний.

2-й способ: реактив можно нанести на изолированную колонию на среде Эндо (красная колония — синеет) (рис. 55).


Рис. 55. Определение коли-индекса воды титрационным методом

Отрицательная проба на оксидазу свидетельствует о наличии в воде БГКП. В этом случае вычисляют коли-индекс и коли-титр с помощью стандартных (эмпирических) таблиц ГОСТа 16963-73 (см. табл. 54).

Эти таблицы предусматривают любую возможную комбинацию объемов посева, из которых выделена кишечная палочка.

Для фильтрации воды можно использовать воронку Гольдмана вместимостью 700-800 мл.

В воронку смонтированного и простерилизованного фильтровального прибора Зейтца наливают отмеренный объем исследуемой воды. С помощью насоса создают вакуум в приемном сосуде (обычно воду фильтруют через фильтры № 2 и 3). По окончании фильтрации стерильным или обожженным в огне пинцетом снимают фильтр и накладывают его на среду Эндо в чашке Петри так, чтобы поверхность с осевшими на ней микробами была обращена вверх (на одну чашку можно помещать 3-4 мембранных фильтра).

Посевы инкубируют в термостате при температуре 37° С 18-24 ч.

Чашки с посевами (фильтрами) вынимают из термостата. Отсутствие подозрительных колоний дает право дать отрицательный ответ.

Учету подлежат все красные и розовые колонии с металлическим блеском или без него. Из выросших колоний делают мазки, окрашивают по Граму (рис. 56).


Рис. 56. Определение коли-индекса воды методом мембранных фильтров

При наличии грамотрицательных палочек ставят пробу на оксидазу. Положительная оксидазная проба дает право дать отрицательный ответ. При отрицательной оксидазной пробе производят посев на полужидкую среду с глюкозой и индикатором или на среду ГПС с бродильными трубками — для выявления ферментации углевода до кислоты и газа. При наличии кислоты и газа вычисляют коли-индекс. Например, на всех фильтрах, находящихся на среде Эндо, выросло 3 колонии, пропущено через фильтр было 300 мл воды.

Примечание. Титрационный метод более точный и может быть использован при наличии в воде примесей. Метод мембранных фильтров экономичнее и дает возможность дать ответ на 2-й день.

Для определения наличия в воде свежих фекальных кишечных палочек производят посев воды (3-х объемов) на лактозопептонную среду с борной кислотой. Инкубируют при 43° С 24 ч. Наличие кислоты и газа свидетельствует о свежем фекальном загрязнении.

По эпидемиологическим показаниям в воде определяют сальмонеллы, шигеллы, энтеровирусы.

Примечание. Общепринятым дополнительным показателем фекального загрязнения питьевой воды являются энтерококки. При проведении бактериологического исследования определяют все группы энтерококков, хотя санитарное значение имеют преимущественно фекальные стрептококки, обнаружение которых является показателем свежего фекального загрязнения.

1. Какова основная задача санитарной микробиологии?

2. Что такое санитарно-показательные микроорганизмы?

3. Что такое коли-индекс и коли-титр?

4. Какие Вы знаете методы определения БГКП?

Определите общее число микробов в исследуемой пробе воды. Среда ГПС (Эйкмана).

ГПС (Эйкмана) концентрированная. В 1 л воды растворяют 100 г пептона, 50 г хлорида натрия. Нагревают смесь до кипения, фильтруют, прибавляют 100 г глюкозы, устанавливают рН 7,4-7,6 и разливают по 10 мл в колбы вместимостью 250 мл, по 1 мл в 3 пробирки (концентрированной среды) и по 1 мл в 3 пробирки со средой нормальной концентрации (во всех емкостях среду до нужной концентрации доводят стерильной водой).

Примечание. При исследовании особенно загрязненных вод делают большие разведения (например, 10 -6 , 10 -7 и т. д.).

источник

С целью охраны здоровья населения, для предупреждения желудочно-кишечных инфекций советским санитарным законодательством предусмотрены необходимые мероприятия по содержанию в надлежащем санитарном состоянии источников водоснабжения. Показатели качества воды постоянно действующих водопроводных сооружений и артезианских скважин нормируются Государственным общесоюзным стандартом — ГОСТ 2874-54.

При лабораторно-производственном контроле микробиологическое исследование воды из действующей водопроводной сети и постоянно действующих артезианских скважин должно производиться не реже 1 раза в месяц. Использование новых скважин допускается в тех случаях, когда коли-титр воды укладывается в нормы, допускаемые ГОСТом. Анализ воды таких скважин в первый год их эксплуатации проводят чаще.

Для выполнения микробиологического анализа воды бактериологическая лаборатория должна иметь запас стерильной посуды: бутылки емкостью 0,5 л, пипетки на 100, 10 и 1 мл, мерные цилиндры и чашки Петри. Тщательно вымытые и высушенные бутылки закрывают ватными пробками, накрывают бумажными колпачками и завязывают шпагатом или толстыми нитками. Помещают бутылки в бумажные пакеты и стерилизуют в сушильном шкафу при температуре 160 °С в течение 1 ч или в автоклаве при 120°С в течение 30 мин. При стерилизации бутылок с притертыми пробками бутылки и пробки стерилизуют отдельно: бутылки перед стерилизацией плотно закрывают ватной пробкой, а для стеклянной пробки делают небольшой пакетик из бумаги и привязывают ее к горлышку бутылки.

Пробу воды для исследования на фекальное загрязнение отбирают в количестве 0,5 л. При исследовании нескольких скважин или колодцев пробы отбирают от каждого объекта отдельно в часы наибольшего расхода воды. Из вновь сооруженной скважины или колодца при отсутствии постоянного отлива воды пробы отбирают после предварительной откачки воды в течение не менее 12 ч.

Отбор пробы воды из водопроводного крана производят следующим образом. Водопроводный кран обжигают в пламени горящего ватного тампона, смоченного спиртом. Затем кран открывают на 10-15 мин, давая воде стечь. Бутылку вынимают из пакета, развязывают бумажный колпачок, вынимают пробку, захватив ее между ладонью и двумя последними пальцами правой руки, и держат ее, стараясь не загрязнить. Подставляют бутылку под струю воды так, чтобы не замочить ее снаружи и не замочить пробку. Наполнив бутылку водой, закрывают ее пробкой над пламенем горелки, завязывают колпачок и делают запись для данной пробы: откуда взята проба, дата и час отбора пробы, цель исследования и фамилия лица, производившего отбор пробы.

Вода должна быть исследована тотчас же после взятия пробы, но не позднее 2 ч после ее отбора. При невозможности выполнения этого условия анализ должен быть произведен не позднее чем через 6 ч после отбора пробы при условии сохранения воды при температурах от 1 до 5°С. Пробы следует предохранять от резких толчков, чтобы не замочить пробок. При санитарно-гигиенической оценке воды по действующему ГОСТу 2874-54 исходят из следующих бактериологических показателей: общего количества микробов в воде (микробное число), коли-титра, коли-индекса.

Воду артезианских скважин и водопроводную, поступающую в городскую сеть, анализируют в количествах от 500 до 10 мл, воду открытых водоемов в зависимости от предполагаемой степени загрязнения — до 0,001 мл.

Под микробным числом воды понимают количество колоний, вырастающих на мясопептонном агаре в чашке Петри из 1 мл исследуемой воды после инкубации посева при 37 °С в течение 24 ч. У питьевой воды микробное число должно быть не более 100. В воде колодцев и открытых водоемов микробное число допускается до 1000.

При микробиологическом исследовании заведомо чистой воды вносят 1 мл ее в стерильную чашку Петри, заливая 15 мл расплавленного и охлажденного до 45°С мясопептонного агара. При исследовании загрязненных вод делают разведение в 10 или в 100 раз и высевают 1 мл соответствующего разведения.

На крышках чашек делают надпись с указанием номера пробы, разведения и даты посева. После инкубации посевов производят подсчет колоний по обычной методике.

Показателями фекального загрязнения воды являются коли-титр и коли-индекс. Под титром кишечной палочки (коли-титром) подразумевается наименьшее количество исследуемого материала (воды), выраженное в миллилитрах (или граммах), в котором обнаруживается хотя бы одна кишечная палочка. Для питьевой воды титр кишечной палочки должен быть не ниже 300 (для Москвы и Ленинграда — не ниже 500).

Коли-индекс кишечной палочки — количество особей кишечной палочки, обнаруженное в 1 л жидкости (воды) или в 1 г плотного вещества. Установив коли-титр исследуемого вещества, можно произвести перерасчет на коли-индекс, и наоборот. Для получения коли-индекса нужно разделить 1000 на коли-титр.

Вода колодцев и открытых водоемов признается доброкачественной при коли-титре не менее 90 и коли-индексе не более 11. Определение коли-титра чаще всего производится трехфазным методом бродильных проб.

1-й этап — первый день (первая бродильная проба). Исследуемую воду засевают (с соблюдением правил стерильности) в бродильные сосуды с глюкозо-пептонной средой (ГПС). Для выявления газообразования в посевах на дно бродильных сосудов перед заполнением их питательной средой предварительно должны быть опущены поплавки — маленькие пробирочки, перевернутые вверх дном (см. стр. 192). В каждый бродильный сосуд помещают по одному поплавку. Во время стерилизации поплавки заполняются средой.

Если микроорганизмы при развитии на данной питательной среде образуют газ, то он, скапливаясь в поплавке, вытесняет из него жидкость и поплавок поднимается над поверхностью среды в пробирке или флаконе.

В зависимости от характера источника для посева берут 300-500 мл исследуемой воды. Посев 300 мл воды производят следующим образом: два объема воды по 100 мл засевают в два флакона с 10 мл концентрированной глюкозо-пептонной среды и 10 объемов воды по 10 мл засевают в 10 пробирок, содержащих по 1 мл ГПС. При посеве 500 мл воды 4 объема засевают во флаконы по 100 мл и 10 объемов по 10 мл в пробирки.

При исследовании сильно загрязненных вод необходимо засевать меньшие объемы воды — от 10 до 0,0001 мл и даже 0,00001 мл (по 1 мл из соответствующих разведений). В этом случае посев производится в пробирки, содержащие по 10 мл разведенной глюкозо-пептонной среды. Посев производят по схеме — четыре десятикратно убывающих объема исследуемой воды, например: 100, 10, 1 и 0,1 или 10, 1, 0,1 и 0,01 мл (в зависимости от предполагаемого загрязнения воды).

Посевы инкубируют 24 ч при 43°С. При возникновении газообразования и помутнения среды бродильные сосуды (флаконы и пробирки) отмечают знаком « + »; при отсутствии газообразования и помутнения — знаком «-».

2-й этап — второй день. Из сосудов с признаками микробного роста (помутнение или помутнение и газообразование) производят высев петлей на среду Эндо в чашки Петри. Засеваемый материал наносят на поверхность среды в виде пересекающихся штрихов или растирают шпателем для получения изолированных колоний. Посевы выращивают при 37 °С в течение 24 ч. Во избежание расплывчатого роста колоний чашки со средой Эндо перед посевом следует слегка подсушить в термостате в течение 30 мин.

Читайте также:  Что означает в анализе воды tds

По окончании выращивания посевы в чашках Петри просматривают. Отсутствие роста дает окончательный отрицательный ответ: фекальное загрязнение отсутствует. При наличии роста приготовляют мазки, окрашивают их по Граму, исследуя все подозрительные на кишечную палочку колонии — как ярко-красные, так и бесцветные или с розовым оттенком и красным центром. Обнаружение при микроскопировании в мазках грамотрицательных неспороносных палочек указывает на возможное наличие бактерий кишечной группы. В этом случае необходимо провести вторую бродильную пробу — третий этап исследования.

3-й этап — третий день (вторая бродильная проба). Материал из подозрительных на кишечную палочку колоний со среды Эндо пересевают в пробирки с разведенной ГПС и поплавками и выдерживают 24 ч при температуре 43°С. Если на среде Эндо изолированных колоний не было или наблюдалась смешанная культура, необходимо повторить пересев на свежую чашку Петри со стерильной средой Эндо до получения изолированных колоний.

По истечении 24 ч просматривают посевы в пробирках. Наличие газа дает окончательный положительный ответ о присутствии кишечной палочки. Результаты анализа выражают в виде коли-титра и коли-индекса, пользуясь таблицами (табл. 8, 9 и 10).

При исследовании водопроводной воды предпочтительнее производить определение коли-индекса путем посева воды на мембранные фильтры (рис. 82). Этот метод позволяет концентрировать микрофлору, содержащуюся в значительном объеме воды, на небольшом участке поверхности плотной питательной среды.

Исследование воды на фекальное загрязнение методом мембранных ультрафильтров в последние годы получило довольно широкое распространение в бактериологических лабораториях благодаря следующим преимуществам:

1) срок анализа сокращается до 24 ч, что значительно экономит время;

3) обнаруживаются самые незначительные количества микробов в воде;

4) проводится прямой и достаточно точный подсчет количества колоний;

5) метод позволяет выделить каждый микроб в чистой культуре.

Мембранные фильтры (ультрафильтры) — это пористые нитроцеллюлозные пленки, которые выпускаются в виде кружков диаметром 35 мм и толщиной 0,1 мм с различным диаметром пор. Для исследования воды применяют фильтры № 3. В сухом виде мембранные фильтры пригодны к использованию в течение одного года. Для более продолжительного хранения их помещают в герметически закрытую склянку с притертой пробкой, в которую наливают 30%-ный водный раствор спирта.

Техника выполнения анализа следующая:

1-й день. Мембранные фильтры перед употреблением помещают в стакан с дистиллированной водой, подогревают воду до 50-60°С, меняя ее 2-3 раза. Затем снова наливают чистую дистиллированную воду и кипятят 20-30 мин до полного удаления воздуха и органических примесей (растворителей), применявшихся при изготовлении ультрафильтров.

Фильтрацию исследуемой воды осуществляют на металлических фильтрах Зейтца с сеткой. Непосредственно перед фильтрованием металлические фильтры обжигают или кипятят. После охлаждения прибора в него укладывают на сетку мембранный фильтр матовой поверхностью вверх. Укладывание фильтра нужно производить осторожно обожженным и охлажденным пинцетом с гладкими краями. Во избежание повреждения фильтра на него накладывают кружочки стерильной фильтровальной бумаги, предварительно смоченные стерильной дистиллированной водой. На фильтре закрепляют воронку и приступают к фильтрованию отобранной пробы исследуемой воды. Объемы воды, подлежащие фильтрации, варьируют от 300 до 500 мл в зависимости от общей предполагаемой характеристики источника водоснабжения.

При анализе загрязненных вод следует производить фильтрование после предварительного разведения: в 100 мл стерильной воды вводят 1 мл исследуемой пробы и приступают к фильтрации после тщательного перемешивания. Для фильтрации прибор необходимо подсоединить к водоструйному или вакуумному насосу. Вакуум в колбе Бунзена должен быть не менее 0,5 ат (4,9 * 10000 н/м2).

По окончании фильтрации снимают воронку с прибора, фильтр захватывают обожженным пинцетом и накладывают на поверхность среды Эндо в чашки Петри. Чашки помещают в термостат при 37 °С на 24 ч.

2-й день. Через 24 ч инкубации посевы просматривают и выявляют на поверхности фильтров колонии, типичные для группы кишечной палочки: ярко-красные колонии с металлическим блеском — колонии Е. coli commune; слабо-розовые или бесцветные без блеска, выпуклые, слизистые — колонии Е. paracoli. Подсчет колоний производят при помощи лупы.

Из колоний, характерных для кишечной группы, делают мазки и окрашивают по Граму. При обнаружении в мазках грамотрицательных палочек материал из этих колоний пересевают в пробирки с разведенной глюкозо-пептонной средой. Посевы помещают в термостат при 43 °С на 24 ч.

3-й день. После инкубации посевы просматривают и отмечают наличие или отсутствие газообразования. Газообразование свидетельствует о наличии кишечной палочки и наоборот. Расчет коли-титра и коли-индекса производится следующим образом.

источник

Исследованию подлежит вода централизованного водоснабжения, колодцев, открытых водоемов, бассейнов, сточные воды.

Отбор проб водопроводной воды. Кран стерилизуют обжиганием с последующим стоком воды в течение 10 мин при полностью открытом кране. Пробу воды забирают в стерильную стеклянную посуду с плотно закрывающимися пробками. Доставка воды производится в контейнерах-холодильниках при температуре 4-10 0 С.

Для оценки санитарно-бактериологического состояния воды используют следующие показатели:

1. определение общего микробного числа (ОМЧ);

2. определение бактерий семейства Enterobacteriaceae и термотолерантных колиформных бактерий;

3. определение спор сульфитредуцирующих клостридий;

5. определение патогенных бактерий кишечной группы.

Исследование питьевой воды на наличие колифагов, патогенных бактерий кишечной группы проводится по эпидемиологическим показателям. Определение спор сульфитредуцирующих клостридий проводится при оценке эффективности технологий обработки воды.

Определение общего микробного числа (ОМЧ)

Для определения ОМЧ вносят два объема воды по 1 мл в стерильные чашки Петри, в которые выливают по 6-8 мл расплавленного и остуженного до 45 0 С МПА. Содержимое чашки смешивают, оставляют до застывания агара и помещают в термостат на 24 ч. Подсчитывают количество колоний на чашках, вычисляют среднее арифметическое. Результат выражают числом КОЕ (колониеобразующих единиц) в 1 мл воды.

Определение бактерий семейства Enterobacteriaceae

и термотолерантных колиформных бактерий

Термотолерантные колиформные бактерии обладают всеми признаками бактерий семейства Enterobacteriaceae, но они способны ферментировать лактозу до кислоты и газа при температуре 44 0 С в течение 24 ч.

Для выявления бактерий семейства Enterobacteriaceae и термотолерантных колиформных бактерий используют два метода: 1) метод мембранных фильтров, 2) титрационный метод.

Метод мембранных фильтров. Необходимый объем воды — 300 мл -фильтруют через мембранные фильтры по 100 мл. Фильтры переносят на среду Эндо в чашке Петри и инкубируют при 37 0 С 24 ч. Подсчитывают число красных и красных с металлическим блеском колоний.

Идентификацию бактерий проводят по оксидазному тесту и тесту образования кислоты и газа при ферментации лактозы (маннита) для чего исследуют не менее 10 колоний.

Так как, микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae и термотолерантные колиформные бактерии не обладают оксидазной активностью, то оксидазоположительные культуры дальше не исследуются.

Все лактозоположительные колонии засевают в две пробирки с одной из лактозных сред и 1 пробирку инкубируют при 37 0 (для культивирования микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae), а другую при 44 0 (для культивирования термотолерантных колиформных бактерий).

Учитывают бактерии семейства Enterobacteriaceae – показатели давнего фекального загрязнения воды и термотолерантные колиформные бактерии – показатели свежего фекального загрязнения.

Результаты анализа выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) бактерий семейства Enterobacteriaceae и термотолерантных колиформных бактерий в 100 мл воды.

Титрационный метод. Принцип метода заключается в посеве установленного объема воды (300 мл – 3 объема по 100 мл – качественный анализ и 333 мл – 3 объема по 100 мл, 3 объема по 10 мл, 3 объема по 1 мл – количественный анализ) в лактозно-пептонную (или глюкозо-пептонную) среду, с последующим пересевом в среду Эндо и идентификацией культуры по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам для определения бактерий семейства Enterobacteriaceae.

Для выявления термотолерантных колиформных бактерий делают посев 2-3 изолированных колоний в пробирки с лактозной средой, нагретой на водяной бане или в термостате до 44 0 С.

При обнаружении бактерий семейства Enterobacteriaceae и термотолерантных колиформных бактерий хотя бы в одном из трех объемов делают заключение – об обнаружении колиформных бактерий в 100 мл воды.

Определение спор сульфитредуцирующих бактерий

Сульфитредуцирующие клостридии, преимущественно C. perfringens – спорообразующие анаэробные палочки, редуцирующие сульфит натрия на железосульфитном агаре при 44 0 в течение 24 ч.

Определение сульфитредуцирующих клостридий проводят двумя методами: 1) метод мембранных фильтров, 2) прямым посевом.

Метод мембранных фильтров. Метод основан на фильтровании воды через мембранные фильтры, выращивании посевов в железо-сульфитном агаре в анаэробных условиях и подсчете черных колоний.

Результаты анализа выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) спор сульфитредуцирующих клостридий в 20 мл воды.

Метод прямого посева. Производят посев 20 мл воды в пробирки с железо-сульфитным агаром (2 объема по 10 мл в 2 пробирки или 4 объема по 5 мл в 4 пробирки) инкубируют при 44 0 С 24 ч и посчитывают черные колонии. Результаты выражают числом КОЕ в 20 мл воды.

Колифаги – вирусы, лизирующие кишечную палочку и образующие зоны лизиса (бляшки) на бактериальном газоне.

Определение колифагов проводят прямым и титрационным методами.

Прямой метод. Исследуемую воду вносят в 5 стерильных чашек по 20 мл. В 6-ю — контрольную воду не берут. Затем во все чашки заливают расплавленный и остуженный до 45 0 агар с добавлением суточной культуры E.сoli, штамм К2 (1,5 мл смыва E.сoli в концентрации 10 9 на 150 мл агара). Перемешивают, оставляют для застывания и инкубируют при 37 0 С 24 ч.

Учитывают результат подсчетом бляшек в чашках Петри в БОЕ (бляшкообразующих единицах) в 100 мл воды. В контрольной чашке бляшки должны отсутствовать.

Титрационный метод. В основе метода — предварительное подращивание колифагов в среде обогащения в присутствии E.сoli и последующее выявления бляшек колифага на газоне E.сoli.

Определение бактерий родов сальмонелла и шигелла

Для выявления патогенных энтеробактерий исследуемый объем воды (не менее 2-3 мл) засевают в среды обогащения (Мюллера-Кауфмана, магниевая среда) с последующим высевом на плотные селективные и дифференциально-диагностические среды – Плоскирева, Эндо, Левина, висмут-сульфитный агар. Выделенные культуры идентифицируют по морфологическим, тинкториальным, биохимическим и серологическим свойствам.

Оценка воды по микробиологическим показателям

Критерии оценки воды разработаны дифференциально в зависимости от ее категории и назначения. Вода плавательных бассейнов по своим качествам должна соответствовать ГОСТу питьевой воды (табл. 3).

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник

Вода может быть фактором распространения таких инфекционных заболеваний как холера, брюшной тиф, паратифы, дизентерия, гепатит А, полиомиелит, лептоспироз, сибирская язва, туляремия, туберкулез, Q-лихорадка, грибковые заболевания. В основном вода загрязняется через сточные воды.

Непосредственное определение в воде патогенных микробов очень трудоемко, поэтому сначала определяют наличие СПМ, а затем определяют патогенных возбудителей.

Безопастность воды в эпидемическом отношении определяется ее соответствием нормативам по следующим индикаторным показателям для:

питьевой воды централизованного водоснабжения – термотолерантным колиформным бактериям общим колиформным бактериям, общему микробному числу, колифагам, спорам сульфитредуцирующих клостридий (Сан Пин 10-124 РБ 99 «Питьевая вода. Гигиенические к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества»);

воды басейнов – общим колиформным бактериям, колифагам, термотолерантным колифорным бактериям, синегнойной палочке, золотистому стафилококку, отсутствию возбудителей кишечных инфекций (Сан Пин 2.1.2 10-39-2002 «Гигиенические требования к устройству, эксплуатации и качеству воды плавательных бассейнов»);

требования к качеству воды при нецентрализованном водоснабжении. Санитарная охрана источников (Сан Пин 8-83-98 РБ-98);

методы санитарно-микробиологического анализа питьевой воды. Методические указания (МУК 4.2. 671-97).

Санитарно-показательными микробами для воды считают бактерии группы кишечной палочки – колиформные бактерии. Под этим общим названием объединяют бактерии семейства Enterobacteriaceae, родов Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella. Это грамотрицательные, не образующие спор и не обладающие оксидазной активностью палочки, ферментирующие глюкозу и лактозу и маннит до кислоты и газа при 37°С в течение 24 часов. Данные бактерии выделяются во внешнюю среду с испражнениями человека и теплокровных организмов.

Среди колиформных микроорганизмов выделяют группу термотолерантных бактерий, которые ферментируют лактозу при 44°С в течение 24 ч. Эти бактерии являются показателями свежего фекального загрязнения.

Санитарные показатели воды:

1. Общее микробное число – количество мезофильных хемоорганотрофных бактерий в 1 мл воды, способных образовывать колонии на питательном агаре при температуре 37 о С в течение 24 часов. Согласно санитарных правил и норм оно не должно превышать 50 колониеобразующих единиц (КОЕ) бактерий в 1 см 3 воды.

2.Термотолерантные колиформные бактерии – оценивается число термотолерантных колиформных бактерий в 100 см 3 воды, по нормативам в 300 мл исследованной воды они должны отсутствовать.

3.Общие колиформные бактерии – оценивается число общих колиформных бактерий в 100 см 3 воды, по нормативам в 300 мл исследованной воды они также должны отсутствовать.

Это основные показатели, которые определяют при микробиологическом контроле качества питьевой воды. По эпидемиологическим показаниям и при производственном контроле качества питьевой воды оценивают также количество колифагов, которые являются косвенными показателями присутствия в воде энтеровирусов, спор сульфитредуцирующих клостридий (С. perfringens), цист лямблий (все они в норме в исследуемой питьевой воде не должны быть обнаружены).

Отбор проб воды для санитарно-бактериологических исследований. Цель исследований – определение состава и свойств воды по показателям, регламинтированным в нормативных документах, определение источников загрязнения водного объекта, установление программы исследований, принятие соответствующих мер.

Пробы воды для бактериологического исследования отбирают в стерильную посуду, после наполнения емкость закрывают стерильной пробкой, обеспечивающей герметичность. Пробу воды отбирают непосредственно из крана без резиновых шлангов, водораспределительных сеток и других насадок. Объем воды зависит от того, какие микроорганизмы должны быть определены:

при анализе воды на индикаторные микроорганизмы – не менее 500 см 3 ;

при анализе воды на индикаторные и патогенные микроорганизмы (сальмонеллы, шигеллы) – 300 см 3 .

Отобранную пробу маркируют, прикрепляют этикетки к емкости, составляется акт об отборе проб воды с указанием расположением и наименованием места отбора проб, даты отбора, метода отбора, времени отбора, климатических условий окружающей среды при отборе проб, температуре воды, должности и фамилии исполнителя.

В лабораторию пробы питьевой воды доставляют в контейнерах-холодильниках при температуре 4-10 0 С. Время начала исследований от момента отбора проб не должно превышать 6 часов, если пробы нельзя охладить, то их анализ проводят в течение 2 часов после забора пробы.

Определение общего числа микроорганизмов, образующих колонии на питательном агаре. Из каждой пробы производят посев не менее двух объемов по 1 мл, далее вносят по 1мл воды в стерильные чашки Петри и прибавляют в каждую чашку по 8-12 мл расплавленного и остуженного до 45 0 С питательного агара. Содержимое чашек быстро и равномерно смешивают, избегая образования пузырьков воздуха и попадания агара на края и крышку чашки. Чашки с застывшим агаром инкубируют; учитывают только те из них, на которых выросли не более 300 изолированных колоний. Результат выражают числом KOЕ в 1 мл исследуемой пробы воды.

Читайте также:  Что определяют на анализе воды

Термотолерантные и общие колиформные бактерии оценивают методом мембранной фильтрации или титрационным методом.

Метод мембранной фильтрации. Берут объем воды равный 300 мл и фильтруют по 100 мл через разные стерильные нитроцеллюлозные фильтры фильтры (используются микрофильтрационные установки с диаметром фильтрующей поверхности 35 или 47 мм и вакуумным насосом для создания разрежения 0,5-1 атм), которые затем накладывают на поверхность дифференциальной диагностической среды Эндо. Подсчитывают количество красных лактозоположительных колоний на среде Эндо, готовят из колоний мазки, окрашивают по Граму в поисках грамотрицательных палочек, определяют оксидазный тест, который должен быть у энтеробактерий отрицательным.

Затем пересевают колонии с грамотрицательными палочками и отрицательным оксидазным тестом на полужидкую среду с лактозой (маннитом, глюкозой) и инкубируют в термостате при 37°С в течение 24 часов для определения количества общих колиформных бактерий. Для определения термотолерантных колиформных бактерий посев производят в среду, подогретую до 44 о С, и инкубируют в термостате при 44 о С в течение 24 часов.

Колонии учитывают как общие колиформные бактерии при отрицательном оксидазном тесте, ферментации лактозы или маннита (глюкозы) при 37 о С с образованием кислоты и газа.

Колонии учитывают как термотолерантные колиформные бактерии при отрицательном оксидазном тесте и ферментации лактозы или маннита (глюкозы) при 44 о С с образованием кислоты и газа.

Титрационный метод. Его обычно используют для качественной оценки питьевой воды при невозможности применения метода мембранной фильтрации или при наличии в воде большого количества взвешенных веществ. Объем воды 300 мл разделяют на 3 объема по 100 мл, засевают эти пробы на лактозопептонную среду и инкубируют при 37 о С в течение 24-48 часов. При наличии роста делают пересев из этих объемов на среду Эндо, далее лактозоположительные колонии идентифицируют как в предыдущем методе. Количество колиформных бактерий в этом методе определяют по специальным таблицам.

Определение спор сульфитредуцирующих клостридий методом мембранной фильтрации. Сульфитредуцирующие клостридии (в основном это Clostridium perfringens) – палочки, грамположительные, строгие анаэробы, имеющие спору и редуцирующие сульфит натрия при температуре 44 0 С в течение 24 часов на железо-сульфитном агаре.

Метод основан на фильтровании 20 мл воды через мембранные фильтры, помещении их в горячий железо-сульфитный агар, сразу же после посева пробирку с агаром и фильтром для создания анаэробных условий быстро охлаждают, культивируют посевы при температуре 44 0 С в течение 24 часов. При учете результатов подсчитывают черные изолированные колонии, выросшие как на фильтрах, так и в толще питательной среды. Результат анализа выражают числом колонийобразующих единиц (КОЭ) спор сульфитредуциирующих клостридий в 20 мл воды.

Определение колифагов производят титрационным и прямым методами. Колифаги способны лизировать E. coli (используется эталонная тест-культура E. coli К12Str R ) при температуре 37 0 С и образовывать через 18-20 часов на питательном агаре зоны лизиса.

Принцип метода основан на предварительном подращивании колифагов в среде обогащения в присутствии E. coli и образовании бляшек колифага на газоне E. coli на питательном агаре. Определение наиболее вероятного числа колифагов производят по специальной таблице.

Санитарно–бактериологическое исследование воздуха и безопастность воздуха в эпидемиологическом отношении определяется соответствием его нормативам (Сан Пин 2.1.6. 9-18-2002 «Гигиенические требования к охране атмосферного воздуха населенных пунктов»). Методы микробиологического исследования воздуха подразделяют на седиментационные и аспирационные. Наиболее простым является седиментационный метод Коха: стерильные чашки Петри с плотной питательной средой открывают в местах отбора проб воздуха и выдерживают в течение определенного времени (5-30 мин), после чего закрывают и термостатируют. По количеству выросших колоний подсчитывают микробное число воздуха. Для определения патогенных стафилококков берут чашки с желточно-солевым агаром и выдерживают 15 минут, для определения стрептококков используют чашки с кровяным агаром, для определения плесневых и дрожжевых грибов – среду Сабуро, для определения грамотрицательных неферментирующих бактерий – чашки с МПА или ЦПХ-агаром, выдерживают открытыми 2 часа. После экспозиции чашки закрывают, переворачивают, помещают в термостат и инкубируют при температуре 37 0 С в течение 24 часов. После инкубации проводят учет количества выросших колоний микроорганизмов и при необходимости проводят идентификацию до рода и вида. Наиболее точными являются аспирационные методы исследования воздуха, основанные на фильтрации или аспирации (просасывании) воздуха через специальные фильтры, жидкости, порошки, адсорбирующие микрофлору.

Отбор проб воздуха в помещениях стационара производят на уровне дыхания лежащего больного или на высоте рабочего стола.

Количество микробов в воздухе варьирует в широких диапазонах – от нескольких бактерий до десятков тысяч в 1 м 3 . В 1 г пыли может содержаться до 1млн бактерий. Большое значение имеет чистота воздуха в операционных, реанимационных и перевязочных отделениях хирургического стационара. Общее количество микробов в операционных до операции не должно превышать 500 в 1 м 3 , а после операции – 100 в 1 м 3 .

Санитарно–бактериологическое исследование почвы включает определение микробного числа и содержания санитарно-показательных микроорганизмов почвы.

Гигиеническая оценка почвы населенных мест проводится согласно инструкции 2.1.7. 11-12-5-2004.

Оценка санитарного состояния почвы проводится по результатам анализов почв на объектах повышенного риска (детские сады, игровые площадки, зоны санитарной охраны) и в санитарно-защитных зонах по следующим показателям – санитарно-показательные микроорганизмы бактерий группы кишечной палочки (БГКП) – общие колиформные бактерии, фекальные энтерококки. На свежее фекальное загрязнение почвы указывает наличие высокого индекса БГКП при низких титрах нитрофикаторов, термофилов и высоком содержании вегетативных форм Clostridium perfringens. Обнаружение энтерококков свидетельствует о свежем фекальном загрязнении.

Обнаружение возбудителей кишечных инфекций, патогенных энтеробактерий и энтеровирусов свидетельствует об эпидемической опасности почвы.

Почву оценивают как чистую при отсутствии патогенных бактерий и индексе санитпрно-показательных микроорганизмов до 10 клеток на 1 г почвы.

При загрязнении почвы сальмонеллами индекс санитарно-показательных микроорганизмов БГКП и энтерококков достигает 10 клеток на 1 г почвы и более.

Концентрация колифага в почве на уровне 10 БОЕ/г свидетельствует о загрязнении почвы.

Отбор проб для бактериологического анализа проводится не реже 1 раза в год в местах возможного нахождения людей, животных, в местах загрязения органическими отходами.

Образец почвы тщательно перемешивают, из него отбирают навески, величины которых вибирают исходя из предполагаемой степени загрязнения почвы и планируемых определений. Для учета почвенных микроорганизмов достаточно навески от 1 до 10 г. Первое разведение навески почвы (1:10) делают в стерильной посуде на стерильной водопроводной воде. После приготовления разведений применяют соответствующую обработку почвы с целью извлечения клеток микроорганизмов из почвенных агрегатов при помощи 10-минутного вериткального встряхивания почвенной суспензии первого разведения в пробирках с резиновыми пробками. Почву разводят до 0,0001-0,00001 г/мл. приготовленные разведения используют для посева на различные питательные среды.

Микробное число почвы – это общее количество микроорганизмов, содержащихся в 1 г почвы.

По микробному числу почвы судят об общей численности в основном сапрофитных микроорганизмов, вырастающих на МПА и сусло-агаре; если же необходимо выделить определенные группы микроорганизмов (например, азотфиксирующие, разлагающие клетчатку, продуцирующие антибиотики, нитрифицирующие, некоторые патогенные и т.д.), используют специальные среды и методы посева.

Для определения коли-титра почвы используют элективные питательные среды, содержащие желчь и генциановый фиолетовый, подавляющие рост многочисленных микроорганизмов, населяющих почву, но не препятствующие росту кишечной палочки. Наиболее употребительной является жидкая среда Кесслера, которая, кроме вышеназванных компонентов, содержит пептон и лактозу, сбраживаемую E.сoli, для улавливания образовавшегося газа служат поплавок. После суточной инкубации посевов разведений почвы на среде Кесслера отбирают положительные пробы, в которых наблюдается обильное газообразование и диффузный рост, эти признаки характерны для развития E. coli, ферментирующей лактозу с образованием газа, скапливающегося в поплавке. Из отобранных посевов делают высевы на среду Эндо, инкубируют при 37°С 24 ч, отмечают характерные для E. coli темно-красные колонии с металлическим блеском, производят микроскопию и при наличии в мазках мелких грамотрицательных палочек делают вывод о присутствии E. coli.

Перфрингенс-титр почвы – наименьшее ее количество, выраженное в граммах, в котором содержится одна жизнеспособная клетка C. perfringens. Для определения C. perfringens в почве используют железо-сульфитный агар (среду Вильсона-Блера).

Перфрингенс-титр определяется максимальным разведением почвенной суспензии, при посеве которого развиваются характерные черные колонии. В некоторых случаях, кроме среды Вильсона-Блера, используют молочные среды (среду Тукаева). На этой среде C. perfringens энергично сбраживает лактозу, молоко быстро (в течение 3-4 ч) створаживается, образующийся газ разрывает сгустки казеина и вытесняет их в верхнюю часть пробирки. Наличие C. perfringens на средах Вильсона-Блера и Тукаева подтверждается микроскопически. В мазках, окрашенных по Граму, бациллы имеют вид крупных грамположительных палочек с прямыми концами, которые могут располагаться цепочками.

Присутствие в почве E. coli и Enterococcus faecalis указывает на свежее фекальное загрязнение; бактерии родов Citrobacter, Enterobacter и Clostridium perfringens – на давнее фекальное загрязнение. Высокая численность сапрофитной микрофлоры свидетельствует об органическом загрязнении.

Определение общих колиформных бактерий (ОКБ). При анализе почв, для которых предполагается невысокая степень фекального загрязнения, рекомендуется использовать титрационный метод. В качестве ускоренного метода для ана­лиза слабозагрязненных почв можно использовать метод мем­бранной фильтрации. При анализах проб с предполагаемой высокой степенью фекального загрязнения целесообразно про­водить прямой посев разведении суспензии на поверхность среды Эндо.

Титрационный метод. Из первого разведения почвенной сус­пензии (1:10), прошедшей предварительную обработку, сте­рильной пипеткой берут 10 мл, что соответствует 1 г почвы, и засевают во флаконы с 50 мл жидкой лактозо-пептонной среды или среды Кесслера. Посев меньших количеств (0,01 г; 0,001 г и т.д.) делают по 1 мл из соответст­вующих разведении почвенной суспензии в пробирки с 9 мл той же среды. Посевы инкубируют в течение 48 ч при 37±1 0 С. Через 24±2 ч инкубации проводят предварительную оценку посевов. При отсутствии газообразования и помутнения через 48 ч инкубации выдают отрицательный ответ.

При наличии в посевах признаков роста (помутнения и газообразования или только помутнения) производят высев на среду Эндо и инкубируют в течение 18—24 ч при температуре 37±1 0 С. При наличии роста на поверхности среды Эндо розо­вых или красных колоний, малиновых с металлическим блес­ком или без него проводят микроскопию колоний с последую­щей постановкой оксидазного теста.

Метод мембранной фильтрации. Метод основан на фильтра­ции установленного объема — 5-10 мл почвенной суспензии первого разведения (1:10). Метод фильтрации почвы через мембранные фильтры проводится так же, как и фильтрация воды.

После окончания фильтрования фильтр переносят, не пере­ворачивая его, на питательную среду Эндо с добавлением розоловой кислоты.

Под каждым фильтром на дне чашки делают надпись с указанием объема профильтрованной пробы, номера и даты посева.

Чашки с фильтрами ставят в термостат дном вверх и инку­бируют посевы при температуре 37±1 0 С в течение 24±2 ч.

Если на фильтрах обнаружен рост изолированных типичных лактозоположительных колоний: темно-красных, красных с металлическим блеском или без него или других подобною типа колоний с отпечатком на обратной стороне фильтра, подсчитывают число колоний каждого типа отдельно и подтверждают их принадлежность к ОКБ (наличие оксидазной активности, отношение к окраске по Граму, ферментация лактозы до кислоты и газа).

Прямой поверхностный посев на агаризованные питательные среды. Посев почвенной суспензии в количестве 0,1 или 0,2 ми производят на поверхность среды Эндо шпателем. Посев при анализе сравнительно чистых почв производят из разведений от 1:10 до 1:1000, т.е. от 10 -1 до 10 -3 . При работе с загрязненными почвами обычно используют разведения до 10 -6 . Посевы выращивают в термостате при 37±1°С в течении 24 ч и проводят идентификацию выросших микроорганизмов аналогично тому, как изложено при описании титрационного метода и подсчета количества колиформных бактерий в 1 г почвы. Для этого среднее число колиформных колоний, выросших на чашке, умножают на степень десятикратного разведения. Ре­зультат выражают индексом.

Определение энтерококков. Энтерококки — грамположительные, не образующие каталазу кокки, слегка вытянутые, с заостренными концами, рас полагающиеся попарно или в виде коротких цепочек, реже одиночными кокками, полиморфны, при росте на жидких средах (лактозопептонная среда) и щелочная энтерококковая среда вызывают диффузное помутнение и образование осадка. Энтерококки определяют титрационным методом и методом мембранной фильтрации.

Титрациоиный метод. Из разведений почвенной суспензии, прошедшей предварительную обработку, стерильной пипеткой берут 10 мл и засевают во флаконы с 50 мл жидкой среды ЛПС или ЩЭС. Посевы инкубируют при температуре 37±0,5°С 24 ч. Из среды накопления, где отмечены признаки роста, производят высев петлей на одну из плотных питательных сред МИС, ЖСТ. Через 24-48 ч инкубации посевов при температуре 37±0.5 °С на молоч-но-ингибиторной среде отмечают наличие аспидно-черных, выпуклых, с металлическим блеском (Е. faecalis) или сероватых мелких, плоских колоний (Е. faecium). Подтверждают принад­лежность колоний к энтерококкам с помощью микроскопирования окрашенных по Граму мазков и постановкой каталазного теста.

Метод мембранных фильтров. Объем испытуемой пробы для посева выбирают с таким расчетом, чтобы не менее чем на двух фильтрах выросли изолированные колонии в количестве от 5 до 50.

Через мембранные фильтры профильтровывают два-три деся­тикратных объема испытуемой пробы. Фильтры с посевом поме­щают на азидную среду или среду ЖСТ и инкубируют при температуре 37±0,5 0 С в течение 24-48 ч.

На среде ЖСТ через 24-28 ч колонии энтерококков плоские крупные с ровными краями, белые или бледно-окрашенные с небольшим кремовым или розовым оттенком, а также мали­новые. Последние образованы Е. faecalis.

На азидной среде колонии энтерококков выпуклые с ров­ными краями, розовые, светло-розовые, равномерно окрашен­ные или с темно-красным нечетко оформленным центром.

Все колонии, которые растут на азидной среде, можно от­нести к фекальным энтерококкам, имеющим индикаторное значение.

При обнаружении в мазках энтерококков подсчитывают число колоний на фильтрах, суммируют и делят на объем профильтрованной воды.

Определение колифагов. Для выявления колифагов исходную почвенную суспензию интенсивно встряхивают 10-15 мин на аппарате для встряхи­вания жидкости или вручную, центрифугируют при 4000 об/мин в течение 15 мин. Далее берут 10 мл надосадочной жид­кости, устанавливают рН 7,0, добавляют 1 мл хлороформа для освобождения воды от сопутствующей бактериальной флоры, интенсивно встряхивают и оставляют на 15 мин для осаждения хлороформа.

Обработанную исходную пробу почвы или другие последую­щие разведения засевают по 1 мл на поверхность двух чашек с 1,5% МПА (рецепт 93) и сверху наслаивают 3 мл расплав­ленного и остуженного до 45 0 С 1,5% МПА, содержащего 0,2 мл суточной или 0,4 мл 4-часовой бульонной культуры E.coli К12 Str R .

Читайте также:  Что определяет химический анализ воды

Для контроля культуры 0,1 мл смыва бактерий E.coli К12 Sti R (или 0,2 мл 4-часовой бульонной культуры) вносят в чашку Петри и заливают 1,5% питательным агаром. После застыва­ния чашки в перевернутом виде помещают в термостат на 18—24 ч при температуре 37±0,1 0 С.

Через 18—24 ч просматривают посевы в проходящем свете. Проба считается положительной при наличии полного лизиса, просветления нескольких бляшек или одной бляшки на чашке с пробой почвы при отсутствии зон лизиса на контрольной чашке.

Учет результатов. Подсчитывают число БОЕ на двух чашках, делят на 2 и умножают на степень разведения. Результат выражают количеством БОЕ в 1 г почвы.

Определение С. perfringens в почве. По 1 мл разведении почвы (до 1:10 6 ), прогретой при темпе ратуре 75±5 0 С в течение 20 мин для исключения вегетативным форм, вносят в два параллельных ряда пробирок. Затем по стенке пробирок, избегая образования пузырьков воздуха, наливают по 9-10 мл железосульфитный агар, приготовленный ex tempore и прогретый до 70-80 0 С. Для создания анаэробных условий роста пробирки быстро охлаждают, помещая в емкости с холодной водой. Посевы инкубируют при 44±1 0 С в течение 16—18 ч. При росте в среде черных крупных колоний (грамположительные, каталазоотрицательные) выдают положительный ответ о присутствии С. perfringens в 1 г почвы

Определение С. perfringens методом фильтрования в пробирках и в чашках Петри проводят аналогично исследованию питьевой воды.

Определение общей численности почвенных микроорганизмов (ОМЧ). Навеску почвы, используемой для приготовления первого разведения, доводят путем добавления небольшого количеств) стерильной водопроводной воды до пастообразного состояния, растирают в течение 5 мин. Затем готовят первое разведение (1:10), т.е. 10 1 почвы на стерильной водопроводной воде, после чего производят разведение суспензии обычным способом. Из каждого разведения делают посев не менее двух объемов по 0,1 или 0,2 мл на поверхность почвенного агара, разлитого в стерильные чашки Петри, и равномерно шпателем растирают посев по всей поверхности чашки. Термостатирование за сеянных чашек ведут при 28-30°С в течение 72 ч. При учете результатов количество колоний на обеих чашках подсчитывают и суммируют, делят на два и умножают на степень разведения.

Санитарная микробиологии пищевых продуктов.

Многие инфекционные заболеания бактериальной и вирусной природы передаются через пищевые продукты (брюшной тиф, сальмонеллезы, дизентерия, эшерихиозы, ботулизм, холера, бруцеллез, полиомиелит и др.).

Пища содержит большое количество факторов роста и витаминов, способствующих размножению микробов. Необходимо учитывать, что пролностьб освободить пищевые продукты от микроорганизмов без изменения их пищевых качеств невозможно. Несоблюдение санитарных правил получения, траспортировки, хранения, приготовления готовых блюд может приводить к загрязнению продуктов микробами и токсинами, что служит предпосылкой возникновения пищевых отравлений.

Нормирование микробиологических показателей безопастности пищевых продуктов осущетсвляют для большинства групп микроорганизмов по альтернативному принципу, т.е. нормируют массу продукта, в которой недопустимо присутствие БГКП, большинства условно-патогенных микроорганизмов, в том числе сальмонелл и Listeria monocytogents. В других случаях норматив отражает количество КОЕ в 1 г (см 2 ) продукта.

VII. Антимикробная терапия

7.1. Антимикробные средства

Все антимикробные средства можно разделить на следующие основные группы:

II. Биологические препараты:

– бактериальные препараты – живые культуры микроорганизмов, как правило – представители нормальной микрофлоры человека, способные выделять вещества с антимикробной активностью;

– бактериофаги – вирусы бактерий, которые используются с лечебной или профилактической целью;

– иммунобиологические препараты – антитела против микроорганизмов и их токсинов (сыворотки и иммуноглобулины), препараты цитокинов (например, интерфероны, интерлейкины и др.)

III. Физические факторы (температура, излучение и др.)

Химиотерапия – лечение бактериальных, вирусных и паразитарных заболеваний с помощью химиотерапевтических препаратов, которые избирательно подавляют развитие и размножение соответствующих инфекционных агентов в организме человека.

Химиопрофилактика – назначение химиопрепаратов с профилактической целью. Более часто в клинике используется термины антибиотикотерапия и антибиотикопрофилактика.

Основоположником химиотерапии является немецкий ученый П. Эрлих, который в начале XX века синтезировал сальварсан, неосальварсан и другие препараты и доказал, что клетки избирательно взаимодействуют с определенными химическими веществами благодаря наличию у них специфического рецепторного аппарата. Механизм действия сульфаниламидов на микроорганизмы был открыт Р. Вудсом, который установил, что сульфаниламиды являются структурными аналогами парааминобензойной кислоты (ПАБК), участвующей в биосинтезе фолиевой кислоты, которая необходима для биохимических процессов, протекающих в клетке. Бактерии, используя сульфаниламид вместо ПАБК, погибают. В настоящее время получено большое количество антибактериальных и антипаразитарных химиотерапевтических препаратов.

Химиопрепараты должны действовать этиотропно, а не органотропно. Безвредность препаратов устанавливают с помощью химиотерапевтического индекса (ХТИ) – отношение минимальной терапевтической дозы к максимально переносимой дозе. Он должен быть меньше единицы, если индекс больше единицы, то препарат применять нельзя.

Различают бактериостатическое действие препарата – прекращение роста и размножения бактерий за счет нарушения биохимических процессов в клетке (тетрациклин, левомицетин, макролиды); бактерицидное действие – гибель клетки (пенициллин, стрептомицин, цефалоспорины, аминогликозиды); бактериолитическое действие – лизис микроорганизма за счет гидролиза связей между ацетилмурамовой кислотой и ацетилглюкозамином в полисахаридных цепях пептидогликанового слоя клеточной стенки (например, лизоцим).

7.2. Микробиологические основы химиотерапии

Антибиотики необходимо использовать только при наличии показаний. При возможности до назначения лечения необходимо:

взять материал от больного;

выделить чистую культуру микроорганизма и идентифицировать возбудителя;

— определить чувствительность выделенной культуры микроорганизма к антимикробным препаратам.

Фармакологический принцип с обязательным учетом фармакокинетики препарата.

Успешное проведение антимикробной терапии у больных зависит от понимания фармакологии применяемых препаратов. Препарат для оптимальной терапии должен обладать следующими свойствами:

— высокой активностью против возбудителя (предполагаемого или установленного);

— вводиться таким способом, чтобы активные его формы достигали места локализации инфекции в концентрациях, превышающих минимально ингибирующую, в том числе и при внутриклеточной локализации возбудителя;

— правильная дозировка препарата с соблюдением интервала между введениями;

— минимальное количество побочных эффектов назначаемого препарата.

Выбор препарата и длительность его применения зависят от формы, течения, стадии заболевания, состояния органов и систем макроорганизма.

При широком использовании антибиотиков наблюдается распространение устойчивости к ним микроорганизмов в стационарах и формирование госпитальных штаммов, имеющих значительную эпидемиологическую опасность, отсюда при проведении антимикробной терапии необходимо учитывать уровень резистентности циркулирующих госпитальных штаммов.

Необходимо учитывать срок годности препарата, условия его хранения (могут образовываться токсичные продукты деградации).

Антибиотики – химиотерапевтические вещества природного (микробного, грибкового, животного, растительного и т.д.), полусинтетического или синтетического происхождения, которые в малых концентрациях вызывают торможение размножения и/или гибель чувствительных к ним микроорганизмов и опухолевых клеток во внутренней среде макроорганизма.

К антибиотикам предъявляют требования:

— высокая избирательность (селективность) антимикробного эффекта в дозах, нетоксичных для макроорганизма;

— сохранение антимикробного эффекта в жидкостях и тканях организма, низкий уровень инактивации белками сыворотки крови и тканевыми ферментами;

— хорошее всасывание, распределение и выведение, обеспечивающие высокие терапевтические концентрации в макроорганизме, в течение достаточно длительного времени;

— предупреждение развития эндотоксического шока при инфекциях, вызванных грам(-) микроорганизмами;

— отсутствие или медленное развитие резистентности при их применении;

— отсутствие или небольшой процент побочных эффектов;

— должен быть длительный период полураспада (прием 1-2 раза в сутки);

— низкая стоимость на курс терапии и высокая эффективность;

— лекарственная форма должна быть удобной для практического использования в разных возрастных группах, при различной локализации процесса и стабильной при хранении.

На практике ни один из препаратов не отвечает всем требованиям.

источник

Отбор проб и доставка в лабораторию

В практике текущего санитарного надзора за объектами общественного питания, торговой сети, пищеблоками детских дошкольных и подростковых учреждений, а также буфетами — раздаточными лечебно-профилактических учреждений широко используется метод смывов с целью контроля эффективности санитарной обработки инвентаря, оборудования, посуды, санитарной одежды и рук персонала. Метод смывов дает возможность объективно оценить санитарное содержание обследуемых учреждений.

При проведении санитарно-бактериологических исследований смывов в основном ограничиваются выявлением бактерий группы кишечной палочки, обнаружение их расценивается как одно из подтверждений нарушения санитарного режима.

При выявлении вторичного массивного обсеменения готового продукта со значительным превышением в нем общего количества микробов, в смывах также необходимо определять общую бактериальную обсемененность и наличие бактерий рода Proteus и St. aureus.

При взятии смывов с оборудования, инвентаря, посуды, столовых приборов записывается: номер образца по порядку, место взятия смыва, в каком техническом и санитарном состоянии находилось оборудование (инвентарь, посуда и т. д.), с которого взят смыв, время забора.

При взятии смывов с рук записывается: номер по порядку, фамилия, имя и отчество сотрудника, выполняемая работа, время забора.

Доставка проб должна производиться в термоконтейнерах.

Время доставки проб продуктов и смывов в лаборатории для осуществления исследования не должно превышать двух часов, так как затягивание этого срока отражается на достоверности результатов анализа.

Взятие смывов производится с помощью стерильных увлажненных ватных тампонов. Стерильные ватные тампоны на стеклянных, металлических или деревянных палочках, вмонтированных в пробирки с ватными пробками, заготавливают заранее в лаборатории. В день взятия смывов в каждую пробирку с тампоном наливают (в условиях бокса над горелкой) по 5 мл стерильного 0,1% водного раствора пептона таким образом, чтобы ватный тампон не касался жидкости.

Непосредственно перед взятием смыва тампон увлажняют средой.

Смывы с крупного оборудования и инвентаря берут с поверхности 100 см2, для ограничения поверхностей используют шаблон (трафарет), сделанный из проволоки. Трафарет имеет площадь 25 см2, чтобы взять смывы с площади в 100 см2 его накладывают 4 раза в разных местах поверхности контролируемого объекта.

При взятии смывов с мелких инструментов обтирается вся поверхность предмета, при заборе смывов с тарелок протирают всю внутреннюю поверхность. При взятии смывов с мелких предметов одним тампоном протирают три одноименных объекта— три тарелки, три ложки и т. п. У столовых приборов протирают их рабочую часть.

При исследовании стаканов протирают внутреннюю поверхность и верхний наружный край стакана на 2 см вниз.

При взятии смывов с рук протирают тампоном ладонные поверхности обеих рук, проводя не менее 5 раз по каждой ладони и пальцам, затем протирают межпальцевые пространства.

При взятии смывов с санитарной одежды протирают 4 площадки по 25 см2 — нижнюю часть каждого рукава и 2 площадки с верхней и средней частей передних пол спецовки. С различных мест полотенца берут 4 площадки по 25 см2.

Методика исследования смывов. Объем исследования

На предприятиях общественного питания исследование смывов проводят на присутствие бактерий группы кишечных палочек.

Исследование на наличие золотистого стафилококка и протея, определение общей бактериальной обсемененности производится по показаниям.

а) исследование смывов на стафилококки проводят при обследовании кремово-кондитерских цехов, столовых и ресторанов, молочных кухонь и других пищеблоков, обращая особое внимание на контроль рук персонала; б) общую микробную обсемененность можно определить для установления эффективной обработки посуды, а также при оценке моющих и дезинфицирующих средств.

Методика посева смывов на бактерии группы кишечных палочек

При плановых санитарно-гигиенических обследованиях для выявления БГКП производят посевы смывов на среды Кесслера с лактозой или Кода, при этом в пробирку со средой опускают тампон и переносят оставшуюся смывную жидкость.

Посевы на средах Кесслера или Кода инкубируют при 37°С, через 18—24 часа со среды Кесслера производят высев на плотную дифференциальную среду Эндо, со среды Кода высев производят в случае изменения окраски среды или ее помутнения.

Посевы помещают в термостат при температуре 37 °С на 24 часа, после чего просматривают. Из колоний, подозрительных или типичных для БГКП, готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Обнаружение грамотри-цательных палочек указывает на наличие БГКП.

Методика посева на общую бактериальную обсемененность

Перед посевом смывов в пробирку с тампоном добавляют 5 мл 0,1% пептонной воды или изотонического раствора хлорида натрия. Тампон тщательно отмывают, после чего 1,0 мл смывной жидкости помещают в чашку Петри и заливают расплавленным МПА. Чашки помещают в термостат при 30°С. Предварительный подсчет выросших колоний производят через 48 часов, окончательный — через 72 часа. Количество колоний, выросших на чашке, умножают на 10 для определения общего количества бактерий, содержащихся на поверхности исследуемого предмета.

Методика посева на золотистый стафилококк

Для выявления золотистого стафилококка посев смывов производят на чашки с желточно-солевым агаром, непосредственно втирая посевной материал тампоном, затем последний погружают в пробирку с 6,5% солевым бульоном.

Обнаружение санитарно-показательных и условно-патогенных бактерий в смывах с поверхностей чистых, подготовленных к работе предметов, инвентаря и оборудования, а также рук персонала свидетельствует о нарушении санитарного режима и дает основание для проведения административных мер.

Метод смывов используется с целью контроля эффективности санитарной обработки инвентаря, оборудования, посуды, санитарной одежды и рук персонала. Метод смывов дает возможность объективно оценить санитарное содержание обследуемых учреждений.

При проведении санитарно-бактериологических исследований смывов в основном ограничиваются выявлением бактерий группы кишечных палочек, обнаружение их расценивают, как одно из подтверждений нарушения санитарного режима.

При выявлении вторичного массивного обсеменения готового продукта со значительным превышением в нем общего количества микробов, в смывах также необходимо определять общую бактериальную обсемененность и наличие бактерий рода Proteus u St.aureus.

Особое внимание при проведении смывов уделяют контролю оборудования и аппаратуры, которые используются по ходу технологического процесса приготовления продуктов, не подвергающихся в дальнейшем тепловой обработке (холодный цех).

Бактериологический контроль методом смывов с поверхностей инвентаря, оборудования, рук и санитарной одежды персонала может преследовать две цели:

а) установить эффективность санитарной обработки, для этого смывы с инвентаря, оборудования, рук и санитарной одежды персонала производят перед началом работы, или, если это невозможно, в перерывах, после того, как руки и оборудование подверглись санитарной обработке, т.е. смывы производят с чистых объектов. Кроме того, смывы с рук берутся у персонала после посещения туалета до возобновления работы;

б) определить роль оборудования и рук персонала в бактериальном обсеменении продукта или готового блюда по ходу технологического процесса производства, обращая особое внимание на производство продуктов готовых блюде прошедшие термическую обработку или употребляемых в пищу без предварительной обработки (некоторые овощи гастрономические продукты, салаты, винегреты и др.). Для решения поставленной задачи одновременно со взятием смывов отбирают повторные пробы пищевых продуктов (смывы берутся с необработанных рук и поверхностей).

Ответственность за своевременность организации, полноту и достоверность осуществляемого производственного контроля несут как юридические лица, так и индивидуальные предприниматели. Надзор за организацией и проведением производственного контроля осуществляют территориальные органы Роспотребнадзора, в обязанности которых наряду с согласованием плана также входит информирование юридических лиц и предпринимателей о действующих санитарных правилах, гигиенических нормативах, методах контроля факторов среды обитания и т.д.

источник