Анализ воды на кишечную палочку

С целью охраны здоровья населения, для предупреждения желудочно-кишечных инфекций советским санитарным законодательством предусмотрены необходимые мероприятия по содержанию в надлежащем санитарном состоянии источников водоснабжения. Показатели качества воды постоянно действующих водопроводных сооружений и артезианских скважин нормируются Государственным общесоюзным стандартом — ГОСТ 2874-54.

При лабораторно-производственном контроле микробиологическое исследование воды из действующей водопроводной сети и постоянно действующих артезианских скважин должно производиться не реже 1 раза в месяц. Использование новых скважин допускается в тех случаях, когда коли-титр воды укладывается в нормы, допускаемые ГОСТом. Анализ воды таких скважин в первый год их эксплуатации проводят чаще.

Для выполнения микробиологического анализа воды бактериологическая лаборатория должна иметь запас стерильной посуды: бутылки емкостью 0,5 л, пипетки на 100, 10 и 1 мл, мерные цилиндры и чашки Петри. Тщательно вымытые и высушенные бутылки закрывают ватными пробками, накрывают бумажными колпачками и завязывают шпагатом или толстыми нитками. Помещают бутылки в бумажные пакеты и стерилизуют в сушильном шкафу при температуре 160 °С в течение 1 ч или в автоклаве при 120°С в течение 30 мин. При стерилизации бутылок с притертыми пробками бутылки и пробки стерилизуют отдельно: бутылки перед стерилизацией плотно закрывают ватной пробкой, а для стеклянной пробки делают небольшой пакетик из бумаги и привязывают ее к горлышку бутылки.

Пробу воды для исследования на фекальное загрязнение отбирают в количестве 0,5 л. При исследовании нескольких скважин или колодцев пробы отбирают от каждого объекта отдельно в часы наибольшего расхода воды. Из вновь сооруженной скважины или колодца при отсутствии постоянного отлива воды пробы отбирают после предварительной откачки воды в течение не менее 12 ч.

Отбор пробы воды из водопроводного крана производят следующим образом. Водопроводный кран обжигают в пламени горящего ватного тампона, смоченного спиртом. Затем кран открывают на 10-15 мин, давая воде стечь. Бутылку вынимают из пакета, развязывают бумажный колпачок, вынимают пробку, захватив ее между ладонью и двумя последними пальцами правой руки, и держат ее, стараясь не загрязнить. Подставляют бутылку под струю воды так, чтобы не замочить ее снаружи и не замочить пробку. Наполнив бутылку водой, закрывают ее пробкой над пламенем горелки, завязывают колпачок и делают запись для данной пробы: откуда взята проба, дата и час отбора пробы, цель исследования и фамилия лица, производившего отбор пробы.

Вода должна быть исследована тотчас же после взятия пробы, но не позднее 2 ч после ее отбора. При невозможности выполнения этого условия анализ должен быть произведен не позднее чем через 6 ч после отбора пробы при условии сохранения воды при температурах от 1 до 5°С. Пробы следует предохранять от резких толчков, чтобы не замочить пробок. При санитарно-гигиенической оценке воды по действующему ГОСТу 2874-54 исходят из следующих бактериологических показателей: общего количества микробов в воде (микробное число), коли-титра, коли-индекса.

Воду артезианских скважин и водопроводную, поступающую в городскую сеть, анализируют в количествах от 500 до 10 мл, воду открытых водоемов в зависимости от предполагаемой степени загрязнения — до 0,001 мл.

Под микробным числом воды понимают количество колоний, вырастающих на мясопептонном агаре в чашке Петри из 1 мл исследуемой воды после инкубации посева при 37 °С в течение 24 ч. У питьевой воды микробное число должно быть не более 100. В воде колодцев и открытых водоемов микробное число допускается до 1000.

При микробиологическом исследовании заведомо чистой воды вносят 1 мл ее в стерильную чашку Петри, заливая 15 мл расплавленного и охлажденного до 45°С мясопептонного агара. При исследовании загрязненных вод делают разведение в 10 или в 100 раз и высевают 1 мл соответствующего разведения.

На крышках чашек делают надпись с указанием номера пробы, разведения и даты посева. После инкубации посевов производят подсчет колоний по обычной методике.

Показателями фекального загрязнения воды являются коли-титр и коли-индекс. Под титром кишечной палочки (коли-титром) подразумевается наименьшее количество исследуемого материала (воды), выраженное в миллилитрах (или граммах), в котором обнаруживается хотя бы одна кишечная палочка. Для питьевой воды титр кишечной палочки должен быть не ниже 300 (для Москвы и Ленинграда — не ниже 500).

Коли-индекс кишечной палочки — количество особей кишечной палочки, обнаруженное в 1 л жидкости (воды) или в 1 г плотного вещества. Установив коли-титр исследуемого вещества, можно произвести перерасчет на коли-индекс, и наоборот. Для получения коли-индекса нужно разделить 1000 на коли-титр.

Вода колодцев и открытых водоемов признается доброкачественной при коли-титре не менее 90 и коли-индексе не более 11. Определение коли-титра чаще всего производится трехфазным методом бродильных проб.

1-й этап — первый день (первая бродильная проба). Исследуемую воду засевают (с соблюдением правил стерильности) в бродильные сосуды с глюкозо-пептонной средой (ГПС). Для выявления газообразования в посевах на дно бродильных сосудов перед заполнением их питательной средой предварительно должны быть опущены поплавки — маленькие пробирочки, перевернутые вверх дном (см. стр. 192). В каждый бродильный сосуд помещают по одному поплавку. Во время стерилизации поплавки заполняются средой.

Если микроорганизмы при развитии на данной питательной среде образуют газ, то он, скапливаясь в поплавке, вытесняет из него жидкость и поплавок поднимается над поверхностью среды в пробирке или флаконе.

В зависимости от характера источника для посева берут 300-500 мл исследуемой воды. Посев 300 мл воды производят следующим образом: два объема воды по 100 мл засевают в два флакона с 10 мл концентрированной глюкозо-пептонной среды и 10 объемов воды по 10 мл засевают в 10 пробирок, содержащих по 1 мл ГПС. При посеве 500 мл воды 4 объема засевают во флаконы по 100 мл и 10 объемов по 10 мл в пробирки.

При исследовании сильно загрязненных вод необходимо засевать меньшие объемы воды — от 10 до 0,0001 мл и даже 0,00001 мл (по 1 мл из соответствующих разведений). В этом случае посев производится в пробирки, содержащие по 10 мл разведенной глюкозо-пептонной среды. Посев производят по схеме — четыре десятикратно убывающих объема исследуемой воды, например: 100, 10, 1 и 0,1 или 10, 1, 0,1 и 0,01 мл (в зависимости от предполагаемого загрязнения воды).

Посевы инкубируют 24 ч при 43°С. При возникновении газообразования и помутнения среды бродильные сосуды (флаконы и пробирки) отмечают знаком « + »; при отсутствии газообразования и помутнения — знаком «-».

2-й этап — второй день. Из сосудов с признаками микробного роста (помутнение или помутнение и газообразование) производят высев петлей на среду Эндо в чашки Петри. Засеваемый материал наносят на поверхность среды в виде пересекающихся штрихов или растирают шпателем для получения изолированных колоний. Посевы выращивают при 37 °С в течение 24 ч. Во избежание расплывчатого роста колоний чашки со средой Эндо перед посевом следует слегка подсушить в термостате в течение 30 мин.

По окончании выращивания посевы в чашках Петри просматривают. Отсутствие роста дает окончательный отрицательный ответ: фекальное загрязнение отсутствует. При наличии роста приготовляют мазки, окрашивают их по Граму, исследуя все подозрительные на кишечную палочку колонии — как ярко-красные, так и бесцветные или с розовым оттенком и красным центром. Обнаружение при микроскопировании в мазках грамотрицательных неспороносных палочек указывает на возможное наличие бактерий кишечной группы. В этом случае необходимо провести вторую бродильную пробу — третий этап исследования.

3-й этап — третий день (вторая бродильная проба). Материал из подозрительных на кишечную палочку колоний со среды Эндо пересевают в пробирки с разведенной ГПС и поплавками и выдерживают 24 ч при температуре 43°С. Если на среде Эндо изолированных колоний не было или наблюдалась смешанная культура, необходимо повторить пересев на свежую чашку Петри со стерильной средой Эндо до получения изолированных колоний.

По истечении 24 ч просматривают посевы в пробирках. Наличие газа дает окончательный положительный ответ о присутствии кишечной палочки. Результаты анализа выражают в виде коли-титра и коли-индекса, пользуясь таблицами (табл. 8, 9 и 10).

При исследовании водопроводной воды предпочтительнее производить определение коли-индекса путем посева воды на мембранные фильтры (рис. 82). Этот метод позволяет концентрировать микрофлору, содержащуюся в значительном объеме воды, на небольшом участке поверхности плотной питательной среды.

Исследование воды на фекальное загрязнение методом мембранных ультрафильтров в последние годы получило довольно широкое распространение в бактериологических лабораториях благодаря следующим преимуществам:

1) срок анализа сокращается до 24 ч, что значительно экономит время;

3) обнаруживаются самые незначительные количества микробов в воде;

4) проводится прямой и достаточно точный подсчет количества колоний;

5) метод позволяет выделить каждый микроб в чистой культуре.

Мембранные фильтры (ультрафильтры) — это пористые нитроцеллюлозные пленки, которые выпускаются в виде кружков диаметром 35 мм и толщиной 0,1 мм с различным диаметром пор. Для исследования воды применяют фильтры № 3. В сухом виде мембранные фильтры пригодны к использованию в течение одного года. Для более продолжительного хранения их помещают в герметически закрытую склянку с притертой пробкой, в которую наливают 30%-ный водный раствор спирта.

Техника выполнения анализа следующая:

1-й день. Мембранные фильтры перед употреблением помещают в стакан с дистиллированной водой, подогревают воду до 50-60°С, меняя ее 2-3 раза. Затем снова наливают чистую дистиллированную воду и кипятят 20-30 мин до полного удаления воздуха и органических примесей (растворителей), применявшихся при изготовлении ультрафильтров.

Фильтрацию исследуемой воды осуществляют на металлических фильтрах Зейтца с сеткой. Непосредственно перед фильтрованием металлические фильтры обжигают или кипятят. После охлаждения прибора в него укладывают на сетку мембранный фильтр матовой поверхностью вверх. Укладывание фильтра нужно производить осторожно обожженным и охлажденным пинцетом с гладкими краями. Во избежание повреждения фильтра на него накладывают кружочки стерильной фильтровальной бумаги, предварительно смоченные стерильной дистиллированной водой. На фильтре закрепляют воронку и приступают к фильтрованию отобранной пробы исследуемой воды. Объемы воды, подлежащие фильтрации, варьируют от 300 до 500 мл в зависимости от общей предполагаемой характеристики источника водоснабжения.

При анализе загрязненных вод следует производить фильтрование после предварительного разведения: в 100 мл стерильной воды вводят 1 мл исследуемой пробы и приступают к фильтрации после тщательного перемешивания. Для фильтрации прибор необходимо подсоединить к водоструйному или вакуумному насосу. Вакуум в колбе Бунзена должен быть не менее 0,5 ат (4,9 * 10000 н/м2).

По окончании фильтрации снимают воронку с прибора, фильтр захватывают обожженным пинцетом и накладывают на поверхность среды Эндо в чашки Петри. Чашки помещают в термостат при 37 °С на 24 ч.

2-й день. Через 24 ч инкубации посевы просматривают и выявляют на поверхности фильтров колонии, типичные для группы кишечной палочки: ярко-красные колонии с металлическим блеском — колонии Е. coli commune; слабо-розовые или бесцветные без блеска, выпуклые, слизистые — колонии Е. paracoli. Подсчет колоний производят при помощи лупы.

Из колоний, характерных для кишечной группы, делают мазки и окрашивают по Граму. При обнаружении в мазках грамотрицательных палочек материал из этих колоний пересевают в пробирки с разведенной глюкозо-пептонной средой. Посевы помещают в термостат при 43 °С на 24 ч.

3-й день. После инкубации посевы просматривают и отмечают наличие или отсутствие газообразования. Газообразование свидетельствует о наличии кишечной палочки и наоборот. Расчет коли-титра и коли-индекса производится следующим образом.

источник

Исследованию подлежит вода:

1) централизованного водоснабжения;

2) из колодцев различного типа;

3) открытых водоемов (рек, озер, морей);

Примечание. Пробы хлорированной воды берут во флаконы с дехлоратором (гипосульфитом).

Отбор проб воды. Из открытых водоемов воду берут с помощью специальных бутылей или батометров, снабженных грузилами. Пробу воды рекомендуют брать на глубине 10-15 см от поверхности (так как поверхность подвергается воздействию атмосферных факторов) и на расстоянии 1,5 м от берега (вода у самого берега может быть загрязнена микрофлорой почвы).

Для отбора проб водопроводной воды используют стерильные флаконы вместимостью 500 мл, закрытые ватно-марлевыми пробками и покрытые бумажными колпачками.

Кран предварительно обжигают тампоном, смоченным спиртом, после чего воду спускают в течение 10-15 мин и набирают во флаконы. Заполненные флаконы закрывают стерильными пробками.

Примечание. Исследуют 333 мл воды (табл. 54).

Таблица 54. Эмпирическая таблица ГОСТ 16963-73

В распределительной сети водопровода отбор проб воды осуществляют в зависимости от количества населения, проживающего в зоне обслуживания.

Стандартные методы исследования регламентированы для воды центрального водоснабжения (ГОСТ 18963-73) и предусматривают:

1. Определение общего числа микроорганизмов (в 1 мл исследуемой воды должно быть не более 100).

2. Определение коли-индекса и коли-титра (коли-индекс 3, коли-титр 333 и выше; для Москвы и Ленинграда коли-индекс не более 2, а коли-титр более 500).

3. Исследование по эпидемиологическим показаниям на патогенную микрофлору (патогенных микроорганизмов не должно быть обнаружено).

Согласно ГОСТу 18963-73 общее число бактерий — это то количество микроорганизмов, которое содержится в 1 мл исследуемой воды, способных в течение суток при температуре 37° С образовывать колонии, видимые невооруженным глазом (или при увеличении с помощью лупы).

При исследовании водопроводной воды засевают 2 чашки. В одну из них вносят 1 мл неразведенной воды, в другую 1 мл воды, разведенной в 10 раз (т. е. 0,1 мл исходной пробы).

При исследовании более загрязненной воды засевают 1 мл воды, разведенной в 100 раз. Это соответствует 0,01 и 1 мл .воды, разведенной в 1000 раз (0,001 мл) и т. д. Для получения таких объемов готовят последовательно десятикратные разведения, по 1 мл каждого разведения вносят в чашку и заливают тонким слоем (12-15 мл) растопленного и остуженного до 45° С питательного агара. Для равномерного распределения исследуемой воды залитые агаром чашки перемешивают путем вращения их. После застывания агара посевы ставят в термостат и инкубируют при температуре 37° С 24 ч.

Чашки с посевами вынимают из термостата и подсчитывают число выросших колоний. Учитывают только те чашки, где число колоний находится в пределах 30-300. Если колоний немного, их подсчитывают невооруженным глазом или при помощи лупы.

Если колоний много, то подсчет можно вести с помощью специального прибора для счета микробных колоний (рис. 54).

Рис. 54. Прибор для счета колоний микроорганизмов. 1 — столик для чашки Петри; 2 — игла с пружинным устройством; 3 — показатель счетчика; 4 — тумблер для включения импульсного счетчика; 5 — тумблер для включения лампы освещения счетчика

Подсчитанное количество колоний умножают на разведение и узнают число микробов в 1 мл исследуемой воды.

Наличие БГКП (бактерий группы кишечной палочки) является показателем фекального загрязнения, интенсивность которого характеризуют:

Коли-индекс — количество кишечных палочек, обнаруженных в 1 л воды.

Коли-титр — наименьшее количество воды, в котором обнаруживают присутствие кишечной палочки * .

* ( Коли-титр и коли-индекс — это один показатель, различно выраженный.)

Для выявления в воде БГКП можно пользоваться двумя методами: титрационным (бродильным) и методом мембранных фильтров.

Для исследования воды используют среду накопления глюкозопептонную (ГПС) среду Эйкмана с индикатором и бродильными трубками. Среда готовится концентрированной (в 10 раз) и нормальной концентрации — для посева 1 мл воды.

Исследуемую воду засевают по 100 мл в 3 колбы, по 10 мл в 3 пробирки (с концентрированной средой) и по 1 мл в 3 пробирки (со средой нормальной концентрации) — всего 333 мл. Посевы инкубируют в термостате при 37° С 24 ч.

Вынимают посевы из термостата и просматривают их.

При наличии помутнения в колбах или пробирках из них производят посев петлей на сектора среды Эндо в чашках Петри. Посевы инкубируют в термостате при 37° С.

Вынимают чашки из термостата. Из подозрительных колоний делают мазки. При наличии грамотрицательных палочек ставят пробу на оксидазную активность. Положительная проба на оксидазу дает право дать отрицательный ответ.

Проба на оксидазу. 1-й способ: со среды Эндо снимают петлей 2-3 колонии каждого типа и наносят на поверхность фильтровальной бумаги, смоченной диметилпарафенилендиамином. Положительная реакция характеризуется посинением штрихов, сделанных из колоний.

2-й способ: реактив можно нанести на изолированную колонию на среде Эндо (красная колония — синеет) (рис. 55).

Рис. 55. Определение коли-индекса воды титрационным методом

Отрицательная проба на оксидазу свидетельствует о наличии в воде БГКП. В этом случае вычисляют коли-индекс и коли-титр с помощью стандартных (эмпирических) таблиц ГОСТа 16963-73 (см. табл. 54).

Эти таблицы предусматривают любую возможную комбинацию объемов посева, из которых выделена кишечная палочка.

Для фильтрации воды можно использовать воронку Гольдмана вместимостью 700-800 мл.

В воронку смонтированного и простерилизованного фильтровального прибора Зейтца наливают отмеренный объем исследуемой воды. С помощью насоса создают вакуум в приемном сосуде (обычно воду фильтруют через фильтры № 2 и 3). По окончании фильтрации стерильным или обожженным в огне пинцетом снимают фильтр и накладывают его на среду Эндо в чашке Петри так, чтобы поверхность с осевшими на ней микробами была обращена вверх (на одну чашку можно помещать 3-4 мембранных фильтра).

Посевы инкубируют в термостате при температуре 37° С 18-24 ч.

Чашки с посевами (фильтрами) вынимают из термостата. Отсутствие подозрительных колоний дает право дать отрицательный ответ.

Учету подлежат все красные и розовые колонии с металлическим блеском или без него. Из выросших колоний делают мазки, окрашивают по Граму (рис. 56).

Рис. 56. Определение коли-индекса воды методом мембранных фильтров

При наличии грамотрицательных палочек ставят пробу на оксидазу. Положительная оксидазная проба дает право дать отрицательный ответ. При отрицательной оксидазной пробе производят посев на полужидкую среду с глюкозой и индикатором или на среду ГПС с бродильными трубками — для выявления ферментации углевода до кислоты и газа. При наличии кислоты и газа вычисляют коли-индекс. Например, на всех фильтрах, находящихся на среде Эндо, выросло 3 колонии, пропущено через фильтр было 300 мл воды.

Примечание. Титрационный метод более точный и может быть использован при наличии в воде примесей. Метод мембранных фильтров экономичнее и дает возможность дать ответ на 2-й день.

Для определения наличия в воде свежих фекальных кишечных палочек производят посев воды (3-х объемов) на лактозопептонную среду с борной кислотой. Инкубируют при 43° С 24 ч. Наличие кислоты и газа свидетельствует о свежем фекальном загрязнении.

По эпидемиологическим показаниям в воде определяют сальмонеллы, шигеллы, энтеровирусы.

Примечание. Общепринятым дополнительным показателем фекального загрязнения питьевой воды являются энтерококки. При проведении бактериологического исследования определяют все группы энтерококков, хотя санитарное значение имеют преимущественно фекальные стрептококки, обнаружение которых является показателем свежего фекального загрязнения.

1. Какова основная задача санитарной микробиологии?

2. Что такое санитарно-показательные микроорганизмы?

3. Что такое коли-индекс и коли-титр?

4. Какие Вы знаете методы определения БГКП?

Определите общее число микробов в исследуемой пробе воды. Среда ГПС (Эйкмана).

ГПС (Эйкмана) концентрированная. В 1 л воды растворяют 100 г пептона, 50 г хлорида натрия. Нагревают смесь до кипения, фильтруют, прибавляют 100 г глюкозы, устанавливают рН 7,4-7,6 и разливают по 10 мл в колбы вместимостью 250 мл, по 1 мл в 3 пробирки (концентрированной среды) и по 1 мл в 3 пробирки со средой нормальной концентрации (во всех емкостях среду до нужной концентрации доводят стерильной водой).

Примечание. При исследовании особенно загрязненных вод делают большие разведения (например, 10 -6 , 10 -7 и т. д.).

источник

Степень микробного загрязнения воды важно учитывать в тех­нологии пищевых производств. Вода, поступающая на произ­водство, по качеству должна соответствовать санитарным нор­мам. Для контроля за санитарным состоянием такой воды ре­гулярно проводят ее микробиологический анализ. Водо­проводную воду исследуют не реже одного раза в месяц, артезианскую — не реже одного раза в год, воду открытых во­доемов и колодцев — ежедневно.

Пробы воды для микробиологического исследования от­бирают с соблюдением правил асептики, (стерильности) в сте­рильную стеклянную посуду с притертыми или ватно-марлевыми пробками. Перед взятием пробы из водопроводного крана, трубы или колодца с насосом воду спускают в течение 5— 10 мин, а края спускной трубы перед набором воды обжигают пламенем. Из открытых водоемов пробы воды отбирают при помощи специальных приборов — батометров — на расстоя­нии 10—15 см от дна. В проточных водоемах пробы отбирают около берега и в центре течения.

При обычном плановом санитарном контроле должно быть взято не менее 500 мл воды, для исследования на присут­ствие патогенных микроорганизмов — не менее 1 л. Пробы от­бирают в часы наибольшего расходования воды на предприя­тии. Микробиологический анализ воды выполняют не позднее 2 ч с момента взятия пробы. В исключительных случаях допус­кается удлинение срока до 6 ч при обязательном хранении проб при низких положительных температурах (1—5 °С). При транспортировке в теплое время года пробы предохраняют от нагревания, а в зимнее время — от замораживания.

При санитарно-микробиологическом исследовании во­ды определяют микробное число и количество бактерий груп­пы кишечной палочки (коли-титр).

Микробное число — общая микробная загрязненность — опре­деляется числом микробных колоний, которые вырастают на простой питательной среде (МПА) при 37 °С в течение 24 ч из посева 1 мл исследуемой пробы воды.

Данный показатель позволяет учитывать не все микроор­ганизмы, содержащиеся в 1 мл воды, а лишь способные расти на простых средах при указанной температуре (мезофильные, сапротрофные). Однако число сапротрофных микроорганиз­мов, вырастающих на МПА, обычно соответствует степени за­грязненности воды органическими веществами и, таким обра­зом, косвенно характеризует ее санитарное состояние.

Для определения микробного числа делают посевы с со­блюдением правил асептики в чашки Петри с МПА методом заливки с таким расчетом, чтобы на чашках вырастало от 30 до 300 колоний. Поэтому из проб артезианской и водопроводной воды (содержащей обычно меньше микроорганизмов) высева­ют соответственно объемы в 1 мл и 0,1 мл из неразведенных проб. При исследовании воды открытых водоемов высевают по 1 мл из предварительно приготовленных в стерильной воде де­сятикратных разведений исследуемой пробы (10 -1 —10 -3 и бо­лее, в зависимости от предполагаемого загрязнения).

Указанные выше объемы проб воды (1 мл, 0,1 мл) или ее разведений (по 1 мл каждого) вносят стерильной пипеткой в пустые стерильные чашки Петри, в которые затем наливают расплавленный теплый МПА (с температурой не выше 45— 46 о С). Воду и МПА тщательно перемешивают и после засты­вания среды посевы выращивают в термостате при 37 °С в те­чение 24 ч. Затем подсчитывают микробные колонии.

Общее число микробных колоний, выросших на всей чашке Петри, умножают на разведения, из которых был сделан высев 1 мл (чтобы перевести па 1 мл исследуемой воды). Затем определяют среднее арифметическое число колоний — мик­робное число исследуемой пробы.

Кишечная палочка — самый многочисленный и постоянный обитатель толстого отдела кишечника человека и всех тепло­кровных животных. Она выделяется во внешнюю среду с фекальными массами, поэтому используется как индикатор фекального загрязнения внешней среды и косвенный показа­тель наличия в воде болезнетворных микробов — возбудителей кишечных инфекций человека, выделяемых с фекалиями в во­ду и другие объекты.

Таким образом, кишечная палочка служит санитарно-показательным микроорганизмом воды. Поскольку она не образует спор и гибнет при относительно щадящих методах обеззаражи­вания, ее присутствие в консервированных продуктах или воде указывает на нарушение режима консервирования и на недо­статочность обработки воды, так как если кишечная палочка сохранила жизнеспособность, значит, могли выжить и другие неспорообразующие бактерии, такие, как дизентерийная шигелла, брюшнотифозная сальмонелла и другие патогенные бактерии — возбудители желудочно-кишечных заболеваний.

Кали-индекс (индекс кишечной палочки) — это число ки­шечных палочек, обнаруженных в 1 л исследуемой воды (по международным стандартам — в 100 мл).

По существующим нормативам коли-титр питьевой воды не должен быть менее 333 мл (в Москве — не менее 500 мл), а коли-индекс — не более 3 (см. п. 1.4.).

Коли-титр определяют методами бродильных проб. Дан­ные методы основаны на способности кишечной палочки теп­локровных животных и человека развиваться при повышенных температурах (43—44 °С) и сбраживать сахара (маннит, глюко­зу и др.) с выделением газа. Существуют двух- и трехэтапные бродильные методы.

Трех этапный бродильный метод заключается в следую­щем. На первом этапе ставят первую бродильную пробу: различные разведения исследуемой воды при помощи стериль­ных пипеток вносят в колбы и пробирки со специальными уг­леводными жидкими средами (среда Булира, среда Эйкмана, розоловая и др.) и поплавками. В зависимости от предполагаемого микробного загрязнения водоисточника применяют разные схемы посева. Так, при исследовании водопроводной воды делают посевы в общем объеме 300 мл (2 объема по 100 мл и 10 объемов по 10 мл). Во­ду городов Москвы и Санкт-Петербурга засевают в объеме 500 мл (4 объема по 100 мл и 10 объемов по 10 мл). При иссле­довании воды открытых водоемов (речной, озерной и т. д.) не­обходимо посеять воду в общем объеме 111,1 мл (1 объем — 100 мл; I объем — 10 мл и по одному объему в 1 мл и 0,1 мл).

Соотношение между средой и засеваемой водой должно быть 1 : 2. Поэтому посевы малых количеств воды (1 мл, 0,1 мл) выполняют в пробирки с разведенной средой (обычной концентрации), а большие объемы воды (100 мл и 10 мл) — в концентрированную среду.

Посевы выращивают в термостате при 43—44 о С в тече­ние 24 ч. При указанной температуре подавляется развитие микроорганизмов, не имеющих санитарно-показательного зна­чения для воды. Затем просматривают посевы для выявления признаков роста кишечной палочки (наличие пузырьков газа в поплавках, изменение цвета, помутнение).

На втором этапе для подтверждения правильности обнаружения роста кишечной палочки в жидкой среде из посе­ва с признаками роста при помощи бактериальной петли дела­ют высев в чашки Петри со средой Эндо и выращивают куль­туру при 37 °С 24 ч.

Среда Эндо состоит из МПА, лактозы и обесцвеченною индикатора (фуксин обесцвечен сульфитом натрия). На данной среде бактерии группы кишечной палочки теплокровных жи­вотных образуют типичные темно-красные, ярко-красные или розовые колонии с темным центром, имеющие металлический блеск или без него. Столь характерный рост на среде Эндо этих бактерий обусловлен тем, что они активно сбраживают лактозу, продукты расщепления которой вызывают восстановление ин­дикатора фуксина, окрашивающего колонии. При отсутствии характерного роста на пробу дают отрицательный ответ.

При наличии типичных колоний из них делают мазки. которые окрашивают по Граму и микроскопируют. Если в мазках обнаруживают мелкие неспорообразующие грамотрицательные палочки, то переходят к третьему этану для оконча­тельного подтверждения результатов исследования.

На третьем этапе из типичных колоний, в которых при микроскопировании обнаружены характерные микробныеклетки, делают пересев в разведенную жидкую углеводную сре­ду (Булира, Эйкмана и др.). Посевы выращивают при 43— 44 °С в течение 24 ч, после чего учитывают окончательно. При наличии в посевах помутнения, газообразования и изменения цвета дают положительный ответ, результаты которого выра­жают в виде коли-титра. При отсутствии газообразования дает­ся отрицательный ответ, т. с. данные первой бродильной пробы подтверждаются.

Коли-индекс определяют методом мембранных фильтров. Для этой цели используют мембранные фильтры № 3 (ультра­фильтры) — пористые пленки, изготовленные из микроклет­чатки (нитроцеллюлозы), с диаметром пор 0,7 мкм. Перед фильтрацией их подвергают стерилизации двойным кипячени­ем в дистиллированной воде в течение 15—20 мин. Затем сте­рильным пинцетом фильтры помещают на предварительно профламбированную поверхность фильтровального прибора Зейтца. Через фильтр Зейтца проводят фильтрацию под ваку­умом определенного количества исследуемой воды (через один мембранный фильтр — не более 100 мл воды).

По окончании фильтрации освобождают фильтроваль­ную пластинку, частично разбирая прибор. При помощи сте­рильного пинцета фильтр кладут осадком вверх на поверхность среды Эндо, залитой в чашку Петри, плотно прижимая к сре­де. В одну чашку можно поместить 4—5 фильтров. После куль­тивирования в термостате при 37 °С в течение 18—24 ч подсчи­тывают выросшие на фильтре колонии, характерные для груп­пы кишечной палочки. Из 2—3 колоний, типично окрашенных и бесцветных, берут материал для мазков, окрашивают их по Граму и микроскопируют с иммерсионным объективом.

Если в мазках присутствуют мелкие грамотрицательные неспорообразующие палочки, из оставшейся части колонии де­лают пересев в пробирки с небольшим объемом жидкой угле­водной среды (среда Булира или др.). Посевы выращивают при 43—44 °С в течение 24 ч. Наличие газообразования — последний показатель присутствия бактерий группы кишечной палочки.

Материалы и оборудование: среда Булира и пробирках с поплавками, стерильные моровские пи­петки на 1 мл, стерильные чашки Петри, среда Эндо агаризованная, простерилизованная вода в пробирках по 9 мл, образны воды для ис­следования.

источник

Несоответствие воды микробиологическим нормам, так же, как и химическим, делает ее непригодной для питья. Если Ваш источник водоснабжения не защищен от прямого воздействия окружающей среды или коммунальные системы устарели или давно не чистились, то сделать микробиологический анализ воды просто необходимо. От этого зависит Ваше здоровье и безопасность! Особенно это важно для тех, кто пользуется колодцем. Колодезная вода – грунтовая, она на прямую контактирует с почвами, а значит, грозит «напоить» Вас и нитратами, и тяжелыми металлами, и аммиаком, и, конечно, вредными органическими веществами, которые попадают в почву в результате деятельности сельскохозяйственных ферм или угодий.

В таблице 1 представлены микробиологические показатели действующего норматива СанПиН 2.1.4.1074-01 для питьевой воды:

Таблица 1. Микробиологические нормативы для питьевой воды

Стандарный микробиологический анализ питьевой воды в МГУ включает определение трех показателей: общего микробного числа, количества общих колиформных и термотолерантных колиформных бактерий.

Расширенный микробиологический анализ (вода питьевая):

Расширенный микробиологический анализ воды включает анализ пяти показателей: общего микробного числа, количества общих колиформных бактерий, количества термотолерантных колиформных бактерий, титр колифагов и содержание спор сульфитредуцирующих бактерий.

Подать заявку прямо сейчас

Часто на наших участках или поблизости имеются водоемы, где мы и наши дети с удовольствием любим провести время. Конечно, вода в данных водоемах не является питьевой, но ее безопасность для человека также, как и питьевая, регламентируется. В таблице 2 представлены микробиологические показатели действующего норматива по гигиеническим требованиям к охране поверхностных вод (СанПиН 2.1.5.980-00)

Таблица 2. Микробиологические нормативы для рекреационного водопользования, а также в черте населенных мест

Стандартный микробиологический анализ (поверхностные водоемы):

Микробиологический анализ воды, предназначенной не для питья, включает определение количества двух показателей: общих колиформных и колиформных термотолерантных бактерий.

Расширенный микробиологический анализ (поверхностные водоемы):

Помимо двух основных показателей мы предлагаем провести дополнительный анализ на содержание: колифагов, условно-патогенных дрожжей и микромицетов (частых спутников опортунистических заболеваний) и индекса самоотчищения водоема.

Определение бактерий рода Salmonella и рода Enterococcus

При значительном превышении нормативов СанПиН 2.1.5.980-00, а также возможном фекальном загрязнении водоема, мы предлагаем провести анализ на наличие возбудителей кишечных инфекций (род Salmonellaи Enterococcus)

Общая микробная численность (ОМЧ):

Метод определяет в питьевой воде общее число мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (ОМЧ), способных образовывать колонии на питательном агаре при температуре 37 °С в течение 24 ч, видимые с увеличением в 2 раза. Данный индикатор выявляет потенциальных бактерий, способных причинить вред здоровью человека.

Общие колиформные бактерии (ОКБ):

Общие колиформные бактерии (ОКБ) — грамотрицательные, оксидазоотрицательные, не образующие спор палочки, способные расти на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре (37+1) °С в течение (24-48) ч. Многие представители данной группы являются микроорганизмами нормальной микрофлоры желудка, поэтому превышение данной группы микроорганизмов может говорить о возможно антропогенном (в т.ч. и фекальном) загрязнении воды.

Термотолерантные колиформные бактрии (ТКБ):

Термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ) входят в число общих колиформных бактерий, обладают всеми их признаками и, кроме того, способны ферментировать лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре (44±0,5) °С в течение 24 ч. Также, как и ОКБ являются индикаторной группой, однако более устойчивые в оружающей среде: вот почему обнаружение данной группы микроорганизмов в воде может говорить об однозначном загрязнеии ее продуктами жизнедеятельности человека.

Колифаги, определяемые стандартным методом (МУК 4.2.1018-01), являются вирусами кишечной палочки (Escherichia coli) и рассматриваются эпидемиологами как дополнительный, а порой и более чувствительный, метод в определении загрязнения воды микроорганизмами группы кишечной палочки. Вирусные частицы, и в частности колифаги, более устойчивы к окружающей среде, чем их бактерии-хозяева. В связи с этим, наличие колифагов может служить достоверной меткой о более давнем фекальном загрязнении источника воды. Показана прямая корреляция между сордержанием колифагов в воде и опасных для человека энтеровирусов, поэтому наличие колифагов в воде может говорить о вирусном заражении источника. Действующий нормативеный документ (СанПиН 2.1.4.1074-01) подразумевает отсутствие колифагов в 100 мл воды.

Споры сульфитредуцирующие клостридии

Сульфитредуцирующие клостридии – спорообразующие анаэробные палочковидные микроорганизмы, являющиеся дополнительным микробиологическим показателем фекального загрязнения водоема. В отличие от относительно неустойчивых колиформных и термотолерантных колиформных бактрий, споры клостридий могут сохраняться в водоемах долгое время. Клостридии встречаются в кишечнике человека и домашних животных, однако, при попадании с водой в большом количестве могут вызвать пищевые отравления. К сульфитредуцирующим клостридиям относятся в том числе и опасные для человека клостридии (Clostridiumbotulinum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani), вызывающие тяжелейшие заболевания. Согласно действующему нормативу (СанПиН 2.1.4.1074-01) споры клостридий должны отсутствовать в 20 мл воды.

Условно-патогенные дрожжей и микромицеты

К условно-патогенным дрожжам и микромицетам (плесени) относят большую неоднородную группу грибных организмов, способных сапротрофно расти при 37 ?С. В нее входят такие представители, как Candida albicans и Cryptococcus neoformans, которыеявляется частым фактором оппортунистических заболеваний человека, вызывая кандидозы (грибковые заболевания кожи), молочницы и проч. Другие организмы микромицеты (Cladosporium cladosporioides, Aspergillusniger) могут являться активными сенсебилизаторами аллергических реакций, а иногда и самими аллергенами. В РФ не нормируется вода по плесеням и дрожжевым организмам в воде.

Определение индекса самоотчищения (из МУК 4.2.1884-04)

Общее число микроорганизмов не нормируется в воде водоемов в зонах рекреаций, поскольку уровень этой группы микроорганизмов в большей мере зависит от природных особенностей каждого объекта, времени года и т.п.

Однако при выборе нового источника водоснабжения или места рекреации в воде водоемов дополнительно следует определять общую микробную численность, вырастающую

— при температуре 37 ?С в течение 24 часов

— при температуре 22 ?С в течение 72 часов

— ОМЧ при 37 ?С представлена большей частью аллохтонной микрофлорой (внесенную в водоем в результате антропогенного загрязнения, в т.ч. фекального)

— ОМЧ при 20 — 22 ?С представлена, помимо алохтонной, аборигенной микрофлорой (естественной, свойственной для данного водоема)

Соотношение численности этих групп микроорганизмов позволяет судить об интенсивности процесса самоочищения. При завершении процесса самоочищения коэффициент ОМЧ 22 ?С/ ОМЧ 37 ?С?4. В местах загрязнения хозяйственно-бытовыми сточными водами численные значения обеих групп близки.

Показатель позволяет получить дополнительгную информацию о санитарном состоянии водоремов, источниках загрязнения, процессах самоочищения.

источник

Несоответствие воды микробиологическим нормам, так же как и химическим, делает ее непригодной для питья. Если Ваш источник водоснабжения не защищен от прямого воздействия окружающей среды или коммунальные системы устарели или давно не чистились, то сделать микробиологический анализ воды просто необходимо. От этого зависит Ваше здоровье и безопасность! Особенно это важно для тех, кто пользуется колодцем. Колодезная вода – грунтовая, она на прямую контактирует с почвами, а значит, грозит «напоить» Вас и нитратами, и тяжелыми металлами, и аммиаком, и, конечно, вредными органическими веществами, которые попадают в почву в результате деятельности сельскохозяйственных ферм или угодий.

В таблице 1 представлены микробиологические показатели действующего норматива СанПиН 2.1.4.1074-01 для питьевой воды:

Таблица 1. Микробиологические нормативы для питьевой воды

Стандартный микробиологический анализ питьевой воды в МГУ включает определение трех показателей: общего микробного числа, количества общих колиформных и термотолерантных колиформных бактерий.

Расширенный микробиологический анализ воды включает анализ пяти показателей: общего микробного числа, количества общих колиформных бактерий, количества термотолерантных колиформных бактерий, титр колифагов и содержание спор сульфитредуцирующих бактерий.

Часто на наших участках или поблизости имеются водоемы, где мы и наши дети с удовольствием любим провести время. Конечно, вода в данных водоемах не является питьевой, но ее безопасность для человека также, как и питьевая, регламентируется. В таблице 2 представлены микробиологические показатели действующего норматива по гигиеническим требованиям к охране поверхностных вод (СанПиН 2.1.5.980-00)

Таблица 2. Микробиологические нормативы для рекреационного водопользования, а также в черте населенных мест

Микробиологический анализ воды, предназначенной не для питья, включает определение количества двух показателей: общих колиформных и колиформных термотолерантных бактерий.

Помимо двух основных показателей мы предлагаем провести дополнительный анализ на содержание: колифагов, условно-патогенных дрожжей и микромицетов (частых спутников опортунистических заболеваний) и индекса самоочищения водоёма.

При значительном превышении нормативов СанПиН 2.1.5.980-00, а также возможном фекальном загрязнении водоёма, мы предлагаем провести анализ на наличие возбудителей кишечных инфекций (род Salmonella и Enterococcus).

Метод определяет в питьевой воде общее число мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (ОМЧ), способных образовывать колонии на питательном агаре при температуре 37 °С в течение 24 часов, видимые с увеличением в 2 раза. Данный индикатор выявляет потенциальных бактерий, способных причинить вред здоровью человека.

Общие колиформные бактерии (ОКБ) – грамотрицательные, оксидазоотрицательные, не образующие спор палочки, способные расти на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре (37+1) °С в течение (24-48) часов. Многие представители данной группы являются микроорганизмами нормальной микрофлоры желудка, поэтому превышение данной группы микроорганизмов может говорить о возможно антропогенном (в том числе и фекальном) загрязнении воды.

Термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ) входят в число общих колиформных бактерий, обладают всеми их признаками и, кроме того, способны ферментировать лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре (44±0,5) °С в течение 24 часов. Также, как и ОКБ являются индикаторной группой, однако более устойчивые в окружающей среде: вот почему обнаружение данной группы микроорганизмов в воде может говорить об однозначном загрязнении ее продуктами жизнедеятельности человека.

Колифаги, определяемые стандартным методом (МУК 4.2.1018-01), являются вирусами кишечной палочки (Escherichia coli) и рассматриваются эпидемиологами как дополнительный, а порой и более чувствительный, метод в определении загрязнения воды микроорганизмами группы кишечной палочки. Вирусные частицы, и в частности колифаги, более устойчивы к окружающей среде, чем их бактерии-хозяева. В связи с этим, наличие колифагов может служить достоверной меткой о более давнем фекальном загрязнении источника воды. Показана прямая корреляция между содержанием колифагов в воде и опасных для человека энтеровирусов, поэтому наличие колифагов в воде может говорить о вирусном заражении источника. Действующий нормативный документ (СанПиН 2.1.4.1074-01) подразумевает отсутствие колифагов в 100 мл воды.

Сульфитредуцирующие клостридии – спорообразующие анаэробные палочковидные микроорганизмы, являющиеся дополнительным микробиологическим показателем фекального загрязнения водоема. В отличие от относительно неустойчивых колиформных и термотолерантных колиформных бактерий, споры клостридий могут сохраняться в водоемах долгое время. Клостридии встречаются в кишечнике человека и домашних животных, однако, при попадании с водой в большом количестве могут вызвать пищевые отравления. К сульфитредуцирующим клостридиям относятся в том числе и опасные для человека клостридии (Clostridiumbotulinum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani), вызывающие тяжелейшие заболевания. Согласно действующему нормативу (СанПиН 2.1.4.1074-01) споры клостридий должны отсутствовать в 20 мл воды.

К условно-патогенным дрожжам и микромицетам (плесени) относят большую неоднородную группу грибных организмов, способных сапротрофно расти при 37 °С. В нее входят такие представители, как Candida albicans и Cryptococcus neoformans, которые являются частым фактором оппортунистических заболеваний человека, вызывая кандидозы (грибковые заболевания кожи), молочницы и проч. Другие организмы микромицеты (Cladosporium cladosporioides, Aspergillusniger) могут являться активными сенсебилизаторами аллергических реакций, а иногда и самими аллергенами. В РФ не нормируется вода по плесеням и дрожжевым организмам в воде.

Общее число микроорганизмов не нормируется в воде водоемов в зонах рекреаций, поскольку уровень этой группы микроорганизмов в большей мере зависит от природных особенностей каждого объекта, времени года и т.п.

Однако при выборе нового источника водоснабжения или места рекреации в воде водоёмов дополнительно следует определять общую микробную численность, вырастающую:

• при температуре 37 °С в течение 24 часов;
• при температуре 22 °С в течение 72 часов.

1. ОМЧ при 37 °С представлена большей частью алохтонной микрофлорой (внесенную в водоем в результате антропогенного загрязнения, в том числе фекального);
2. ОМЧ при 20-22 °С представлена, помимо алохтонной, аборигенной микрофлорой (естественной, свойственной для данного водоёма).

Соотношение численности этих групп микроорганизмов позволяет судить об интенсивности процесса самоочищения. При завершении процесса самоочищения коэффициент ОМЧ 22 °С/ ОМЧ 37 °С. В местах загрязнения хозяйственно-бытовыми сточными водами численные значения обеих групп близки.

Показатель позволяет получить дополнительную информацию о санитарном состоянии водоемов, источниках загрязнения, процессах самоочищения.

источник

То, что сырая вода из-под крана или из колодца зачастую непригодна для питья, знают многие. Но в чём причина? Как правило, самый распространённый ответ на этот вопрос: там микробы. Но какие именно микроорганизмы в воде представляют реальную опасность для здоровья, как определить загрязнение воды, как очистить воду, например, от кишечной палочки и других болезнетворных бактерий? Обо всём этом читайте в нашей статье.

Для начала разберёмся, что собой представляет кишечная палочка. Эта бактерия живёт в кишечнике человека и животных. Попадая в воду вместе с бытовыми и канализационными стоками, отходами жизнедеятельности, она приводит к её загрязнению. Как может оказаться кишечная палочка в воде? Вариантов несколько.

• попадание фекальных стоков вследствие неполадок или устаревшей канализационной системы
• использование поверхностного водоёма для водопоя крупного рогатого скота
• попадание в водоём бытовых стоков из частных хозяйств

Особенно активно размножается кишечная палочка в воде в тёплое время года, как раз в разгар пляжного сезона. А ведь воду с ней опасно не только пить, но и купаться в ней. Также весной во время таяние снега или после затяжных дождей, кишечная палочка может проникнуть в грунтовые воды, а оттуда – в систему водоснабжения.

То, что кишечная палочка, возможно, присутствует в воде, иногда можно предполагать даже без проведения анализов. Вода имеет очень неприятный запах, может присутствовать желтовато-коричневый оттенок. Но часто бывает, что вроде бы обычная на первый взгляд вода представляет серьёзную опасность для здоровья. Бывает, что кишечная палочка обнаруживается в питьевой воде из-под крана. К этому приводят неполадки в системе водоснабжения или водоподготовки.

Достоверно определить состав поможет только анализ воды в лаборатории.

Кишечная палочка в воде может нанести серьёзный вред здоровью: от банального расстройства желудка до тяжёлых воспалений и поражений внутренних органов. При попадании в организм кишечная палочка может провоцировать:

• кишечные инфекции (чаще всего проявляющиеся в виде диареи, тошноты, рвоты и т.п.)
• воспаления мочевыводящих путей и половых органов
• уретрит (у мужчин)
• гемолитико-уремический синдром (в группе риска, прежде всего, дети и пожилые люди), который может привести к острой почечной недостаточности

Среди множества штаммов кишечной палочки самым опасным считается E. Coli.

Согласно Государственным санитарным нормам, колиморфных бактерий (бактерий группы кишечной палочки) в питьевой воде, подающейся в водопровод, не должно быть вообще. Их наличие может спровоцировать эпидемическую ситуацию в насёлённом пункте. Для того чтобы заразиться кишечной палочкой не обязательно пить сырую воду. Достаточно просто помыть ею овощи, которые не подвергаются дальнейшей термической обработке, и бактерии попадут в организм.

Учитывая возможные негативные последствия от контакта с этой бактерией, закономерным становится вопрос, как убить кишечную палочку в воде. Самыми распространёнными являются:

• химический метод (например, хлорирование воды или добавление других реагентов)
• физический метод (например, кипячение)

Все эти способы призваны подавить жизнедеятельность и размножение бактерий.

Учитывая, что перед подачей в систему водоснабжения вода подвергается обеззараживанию, то риск обнаружить кишечную палочку в питьевой воде из-под крана ниже, чем в воде из колодца. Специалисты отмечают, что значительный процент колодезной воды не соответствует нормам именно по микробиологическим показателям.

Единственным максимально надёжным способом выявить кишечную палочку является бактериологический анализ воды в лаборатории. Если проблема существует, то меры нужно принимать незамедлительно. В случае, если кишечная палочка выявлена в колодце или скважине на вашем участке, необходимо тут же прекратить использование этой воды. Затем провести полную дезинфекцию и установить мощную систему обеззараживания. Если есть возможность, лучше пробурить скважину в другом месте. Когда кишечная палочка обнаружилась в водопроводной воде, нужно проинформировать городской Водоканал и прекратить использование воды, до полного решения ситуации. (Возможно, имеет место неисправность или нарушений технологий обеззараживания воды перед подачей в систему).

Кипячение способно убить кишечную палочку и другие бактерии, но кипятить воду для всех бытовых нужд и для купания очень проблематично. Поэтому более надёжным способом является установка фильтров, в частности, системы обратного осмоса. Это поможет обезопасить себя и свою семью.

источник

В воде различных источников водоснабжения содержится значительное количество микроорганизмов. Наряду с постоянными обитателями – микробами-сапрофитами – в загрязненной воде могут длительно выживать и размножаться различные патогенные микроорганизмы, особенно возбудители кишечных заболеваний – тифа, паратифа, дизентерии, холеры и т.д.

В связи с этим вода хозяйственно-питьевого назначения подлежит строгому санитарно-микробиологическому контролю. Санитарно-микробиологический кон- троль воды на пищевых предприятиях проводят согласно графику, один-два раза в месяц, определяя при этом:

1) микробное число – общее количество микроорганизмов в 1 см 3 воды;

2) количество санитарно-показательных микроорганизмов – кишечных палочек (Escherichia coli), которые являются прямым показателем фекального загрязнения воды и косвенным санитано-бактериологическим показателем возможности загрязнения ее патогенными микробами. Результаты определения количества кишечных палочек в воде выражают в виде коли-титра и коли-индекса.

Коли-титр – это наименьший объем воды, в котором обнаруживается одна кишечная палочка (выражается в см 3 ).

Коли-индекс – это количество кишечных палочек, содержащихся в 1000 см 3 воды.

К питьевой воде, прошедшей очистку, предъявляются следующие санитарно-микробиологические требования: микробное число должно быть не более 100 микробных клеток; коли-титр – не менее 300 см 3 ; коли-индекс – не более трех кишечных палочек.

Пересчет коли-титра по коли-индексу и наоборот производят по следующим формулам:

6.2.1 Определение микробного числа

При исследовании водопроводной воды стерильными градуированными пипетками отбирают 1см 3 неразведенной воды, вносят в две параллельные чашки Петри и заливают расплавленным и охлажденным до 45-50 о С МПА, быстро перемешивают, вращая чашку по поверхности стола. После застывания среды чашки переворачивают крышками вниз, делают на дне крышки надписи, указывающие номер или название пробы, разведение, дату посева. Посевы культивируют в термостате при 37 о С в течение 24-48ч, а затем подсчитывают выросшие колонии с помощью лупы, учитывая в случае надобности посеянный объем или разведение.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое число, полученное при подсчете колоний на двух параллельных чашках одного из разведений.

6.2.2 Определение бактерий группы кишечной палочки –

показателей фекального загрязнения воды (коли-титра, коли-индекса)

Бактерии группы кишечной палочки (БГКП) в зависимости от качества воды определяют двумя методами:

а) метод мембранных фильтров (исследуют прозрачную воду – центральных водопроводов, артезианских скважин);

б) метод бродильных проб (исследуют воду, содержащую коллоидные вещества, посторонние примеси, затрудняющие фильтрование, — воду открытых водоемов, питьевую воду на этапах очистки).

6.2.2.1 Метод мембранных фильтров

Сущность метода мембранных фильтров заключается в концентрации бактерий из определенного объема воды на специальных ультрафильтрах – пористых нитроцеллюлозных пленках, подращивание их на среде Эндо (фуксин-сульфитном агаре) в течение 24 часов при 37 о С, дифференцировании выросших колоний и последующим подсчетом количества БГКП в 1000 см 3 воды. Результат выражают в виде коли-индекса.

При наличии на фильтрах колоний, типичных для БГКП (темно-красных, с металлическим блеском и без него), из нескольких колоний готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При обнаружении в мазках грамотрицательных коротких полиморфных палочек ставят оксидазный тест для дифференциации БГКП от водных сапрофитов, имеющих сходную морфологию. В отличие от кишечной палочки рода Escherichia, они обладают ферментом оксидазой и окисляют фенилендиаминовые соединения до индофенола ярко-синего цвета (оксидазоположительные микроорганизмы). БГКП не обладают этим ферментом и считается оксидазоотрицательными.

Материал из колоний, выросших на среде Эндо, снимают бактериологической петлей и наносят на фильтровальную бумагу, пропитанную реактивом с фенилендиаминовым соединением. При положительном оксидазном тесте бумага синеет, что свидетельствует о наличии в воде бактерий, относящихся к семейству Pseudomonadaceae, которые при анализе не учитываются. Отсутствие изменения цвета бумаги в месте нанесения бактериальной массы свидетельствует о присутствии в воде оксидазоотрицательных БГКП, по которым и рассчитывают коли-титр и коли-индекс.

6.2.2.2 Метод бродильных проб

Сущность метода заключается в посеве определенных объемов анализируемой воды, подращиванием при температуре 37 о С в средах накопления (глюкозо- или лактозопептонной средой с индикатором и поплавками для улавливания газообразования) с последующим высевом на среду Эндо, дифференцированием выросших колоний и определением наиболее вероятного числа БГКП в 1000 см 3 воды по специальным таблицам.

При отсутствии роста на среде Эндо, а также при наличии пленчатых, рубчатых, с неровными краями и поверхностью и других не характерных для кишечных палочек колоний получают отрицательный результат.

Если при засеве из флаконов и пробирок, где отмечено помутнение, кислота и газообразование, на среду Эндо выросли темно-красные с металлическим блеском и без него колонии, то их принадлежность к БГКП подтверждается микроскопированием и постановкой оксидазного теста. Наличие в мазках грамотрицательных палочек и отрицательный оксидазный тест позволяет немедленно дать положительный ответ о наличии кишечной палочки в анализируемом объеме воды.

Дата добавления: 2016-11-18 ; просмотров: 440 | Нарушение авторских прав

источник

Лабораторная работа «САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВОДЫ»

Санитарно-бактериологическое исследование воды заклю­чается в следующем:

1. Определяют общее количество микробов в 1 мл.

2. Определяют титр кишечной палочки.

Взятие проб воды для санитарно-бактериологического ис­следования. Воду для санитарно-бактериологического исследования отбирают в количестве 500 мл в бутылки, предвари­тельно простерилизованные в бумажных пакетах, с ватно-марлевой пробкой, покрытой сверху бумажным колпачком. К горлышку бутылки привязывают пакетик с завернутой в него запасной пробкой.

Из кранов водопроводных сооружений пробы берут в пе­риод наибольшего расхода воды после предварительной стерилизации крана обжиганием пламенем горящего тампона, смоченного спиртом, и последующего спуска воды в течение 10-15 мин при полностью открытом кране.

Пробы хлорированной воды берут во флаконы с дехлоратором, так как под действием хлора микробы в воде погибают. В качестве дехлоратора на 500 мл исследуемой воды добавляют 10 мг серноватистокислого натрия.

К отобранным пробам воды прилагают сопроводительный документ с указанием следующих данных:

1) место расположения крана;

2) дата отбора пробы с указанием года, месяца, числа и часа;

3) особые обстоятельства при отборе пробы (время спуска воды из крана, условия транспортировки и т. д.).

4) цель исследования: сделан ли отбор пробы в порядке текущего санитарного надзора или по особым показаниям.

Бактериологический анализ воды должен быть произведен не позднее 2 ч с момента ее взятия. Указанный срок может быть увеличен до 6 ч при условии сохранения или транспорти­ровки пробы воды при температуре от 1 до 5°С, что достигается с помо­щью резиновых мешков, наполненных зимой теплой водой, а летом — льдом. ГОСТ 2871—82 «Вода питьевая. Гигиенические требования и контроль за качеством» нормирует следующие бактериологические показатели питьевой водопроводной воды:

а) общее число бактерий при посеве 1 мл неразведенной воды, опреде­ляемое числом колонии на мясо-пептонном агаре после 24-часового выращивания при температуре 37°С (не более 100); б) количество кишечных палочек в 1 л воды, определяемое числом колоний на среде Эндо с при­менением концентрации бактерий на мембранных фильтрах (не более 3).

Определение общего числа микробов в воде

Общее микробное загрязнение определяется количеством микроорганизмов в 1 мл воды, которые при посеве на мясо-пептонный агар и инкубации при 37±0,5°С в течение 24 ч образуют колонии, видимые простым глазом или при уве­личении в 2-5 раз.

В зависимости от степени предполагаемого загрязнений производят посев не менее двух различных объемов воды, выбранных с таким расчетом, чтобы на чашках вырастало от 30 до 300 колоний. Водопроводную воду и воду артезианских колодцев засевают в неразведенном виде по 1 мл.

Из исследуемого образца неразведенной воды и из про­бирок с ее разведениями в соответствии со степенью пред­полагаемого загрязнения берут по 1 мл, вносят в стерильные чашки Петри и заливают 10-12 мл растопленного и осту­женного до 45 °С мясо-пептонного агара. Круговыми движе­ниями руки, вращая чашки по горизонтальной поверхности стола, распределяют их содержимое равномерным слоем по всей площади дна. После застудневания агара чашки с посевами вверх дном помещают в термостат при 37±0,5°С на сутки.

После указанного срока выращивания приступают к под­счету колоний, выросших как на поверхности, так и в глуби­не агара.

Если в чашке с наиболее высоким разведением выросло свыше 300 колоний и анализ нельзя повторить, колонии под­считывают при помощи пластинки с сеткой и лупы при силь­ном боковом освещении. Подсчитывают в разных местах чаш­ки не менее 20 квадратов площадью 1 см 2 каждый. Затем вы­водят среднее арифметическое число колоний, приходящееся на 1 см 2 , и умножают его на площадь чашки в квадратных сантиметрах.

Результаты анализа выражают количеством бактерий на 1 мл исследуемой воды, для чего число выросших на чашке колоний умножается на степень разведения воды.

За окончательное количество бактерий принимается среднее арифметическое результата подсчета на двух параллель­ных чашках. При оформлении протокола количество микро­организмов, определенное .в 1 мл исследуемой воды, округля­ют (таблица1).

Таблица 1 Запись результатов определения микробного числа воды

При количестве колоний в 1 мл

Запись результата анализа

Конкретная циф­ра подсчета

Методы определения титра кишечной палочки в воде

Коли-титр в питьевой воде, согласно действующему ГОСТ 2871-82 «Вода питьевая. Гигиенические требования и контроль за качеством», определяют методом мембранных фильтров и бро­дильным методом. Выбор метода зависит от качества иссле­дуемой воды. При исследовании чистой, хорошо фильтру­ющейся воды удобнее пользоваться методом мембранных фильтров. При исследовании воды, содержащей коллоидные вещества и посторонние примеси, затрудняющие процесс фильтрования, пользуются бродильным методом.

Определение титра кишечной палочки методом мембран­ных фильтров. Сущность метода заключается в концентрировании бактерий из определенного объема воды на мембран­ных фильтрах с подращиванием их на среде Эндо при 37 о С, дифференцированием выросших колоний и последующим подсчетом количества бактерий группы кишечных палочек в 1 л воды.

Первый день. 1. Подготовка мембранных фильтров. Для фильтрования воды отбирают мембран­ные фильтры № 3 (без изъянов), помещают их в подогретую до температуры 80°С дистиллированную воду и ставят на слабый огонь до закипания. Кипячение фильтров производят трижды по 10 мин. После первого и второго кипячения воду сливают. После последнего кипячения воду не сливают и фильтры оставляют в ней до употребления.

2. Подготовка фильтровального аппарата. Перед посевом воды фильтровальный аппарат протирают ватным тампоном, смоченным спиртом, и обжигают в целях стерилизации. На охлажденный после прожигания столик фильтровального аппарата помещают с помощью стерильного пинцета с гладкими кончиками мембранный фильтр. Во избе­жание повреждения фильтра под него подкладывают кружок стерильной фильтровальной бумаги. Если вода содержит большое количество взвешенных веществ или клеток фито­планктона, ее сначала фильтруют через предварительный фильтр № 6, помещая его поверх фильтра № 3.

На фильтровальный столик с положенными на него фильт­рами устанавливают и закрепляют верхнюю часть прибора — воронку.

3. Фильтрование воды. В воронку фильтровального аппарата стерильно наливают исследуемый объем воды и с помощью водоструйного насоса создают вакуум в приемном сосуде.

При анализе воды, поступающей в водопроводную сеть, необходимо брать объем не менее 333 мл. При анализе воды неизвестного качества следует засевать 3-4 десятикратных объема. Например, из водопроводной сети можно фильтро­вать 3; 30; 100; 200 мл воды, на этапах очистки — 0,1; I; 10; 100 мл.

Фильтруют сначала меньшие, а затем большие объемы воды через один фильтровальный аппарат, меняя каждый раз фильтры. При фильтровании небольших объемов воды (1 мл и меньше) в воронку сначала наливают 10 мл сте­рильной воды, а затем вносят анализируемую воду. По окон­чании фильтрования снимают воронку прибора, фильтр захватывают обожженным пинцетом и накладывают на по­верхность среды Эндо в чашки Петри.

На одну чашку можно по­местить 4-5 фильтров. Под каждым фильтром делают надпись с указанием даты, номера анализа и объема про­фильтрованной воды. Посевы инкубируют в термостате 18-24 ч при 37°С.

Второй день. 1. По окончании инкубации про­изводят просмотр посевов:

а) отсутствие микробного роста на фильтрах или обнару­жение на них колоний, не характерных для бактерии кишеч­ной группы (губчатые, пленчатые с неровной поверхностью и краем), позволяет на этом этапе анализа закончить иссле­дования (18-24 ч) с выдачей отрицательного результата на присутствие кишечных палочек в анализируемом объеме воды;

б) при обнаружении на фильтре колоний, характерных для кишечных палочек (темно-красных с металлическим блеском или без него, розовых и прозрачных), исследование продолжают. Из нескольких колоний каждого типа готовят мазки, окрашивают их по Граму, микроскопируют. Отсутст­вие в мазках грамотрицательных, неспороносных палочек является основанием для прекращения анализа с регистра­цией отрицательного результата.

При обнаружении в мазке грамотрицательных палочек, морфологически сходных с кишечной (возможны удлинен­ные, нитевидные формы или крупные полярно окрашенные палочки), ставится оксидазная проба.

2. Оксидазный тест предложен для дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae от грамотрицательных бактерий семейства Pseudomanadaсеае и других водных сапрофитов, которые в отличие от кишечных бактерий вырабатывают фермент оксидазу, окисляющую фенилен-диаминовые соединения до индофенола, имеющего ярко-синий цвет.

Для постановки оксидазного теста мембранные фильтры с выросшими на них колониями переносят (не переворачивая) на лист фильтровальной бумаги, предварительно смоченный реактивом для выявления оксидазы (рец. 32). Результат реакции учитывают через 2-4 мин.

Колонии микроорганизмов, продуцирующие оксидазу (не относящиеся к семейству кишечных бактерий), при взаимо­действии с добавленным реактивом, приобретают синий обо­док при периферии или окрашиваются в синий цвет пол­ностью (положительная реакция).

Колонии семейства Enterobacteriaceae, не продуцирующие фермент оксидазу, не изменяют своего первоначального цвета (отрицательная реакция).

При обнаружении на мембранных фильтрах однотипных лактозоположительных колоний (темно-красных с металлическим блеском или без него), не вырабатывающих оксидазы, анализ воды заканчивается на данном этапе подсчетом выросших колоний.

При обнаружении на мембранных фильтрах розовых и бесцветных колоний с отрицательной оксидазной активностью, их подсчитывают и подтверждают принадлежность к бакте­риям группы кишечных палочек посевом 2-3 изолирован­ных колоний каждого типа в полужидкую среду с глюкозой (Рец. 44). Результаты роста учитывают через 4-5 ч инкуба­ции в термостате при 37°С. При образовании кислоты и газа результат считается положительным, при отсутствии кислото- и газообразования — отрицательным. При наличии только кислоты пробирки оставляют в термостате для окончатель­ного учета результатов роста через 24 ч. При отсутствии газообразования через сутки получают окончательный отрицательный результат, при наличии газообразования — положительный результат.

Вычисление коли — индекса. Результат выражают в виде коли-индекса, определяемого посредством суммиро­вания колоний кишечных палочек, выросших на поверхности мембранных фильтров в одной пробе воды, и пересчитывают это количество на 1 л воды.

Пример. При исследовании пробы воды профильтровано 3 объема по 100 мл. Па первом и втором фильтрах выросло по 3 колонии, на треть­ем- 9 колоний. Всего выросло 15 колоний. Таким образом, коли-индекс исследуемого образца воды равен: 1000 X 15 : 300 = 50.

Питьевая вода удовлетворяет требованиям ГОСТ 2871-82 в том случае, когда коли-индекс не превышает 3.

При установлении бактериальной загрязненности воды свыше допустимых норм прибегают к повторному исследованию воды на наличие бактерий свежего фекального загрязнения (преимущественно колибактерий), способных ферментировать лактозу до кислоты и газа при 43±0,5°С, в присутствии ингибиторов посторонней микрофлоры. Исследуемый образец воды фильтруют через мембранный фильтр с последующим подращиванием его на среде Эндо в течение 24 ч при 37 о С.

При повторном обнаружении на фильтрах лактозоположительных темно-красных колоний с металлическим блеском и без него параллельно определению коли-индекса эти колонии в количестве не более 15 засевают в лактозную среду с борной кислотой (рец. 143), предварительно нагретую в водяной бане до 43 о С, и 24 ч инкубируют в термостате при 43 С С. Вместо указанной среды можно пользоваться желчно- лактозной средой с бриллиантовым зеленым (рец. 142), инкубацией посевов при 44,5°С.

Помутнение с образованием кислоты и газа в посевах является показателем свежего фекального загрязнения; появление микробного роста (помутнение среды) без газообразования не учитывается.

Определение титра кишечной палочки бродильным методом. Сущность бродильного метода заключается в посеве определенных объемов исследуемой воды, инкубации ее при 37°С в средах накопления с последующим высевом на среду Эндо, дифференциацией выросших колоний и определением наиболее вероятного числа бактерий группы кишечных палочек в 1 л воды по таблицам.

Первый день. Для установления титра кишечной палочки бродильным методом воду в зависимости от характера водоисточника засевают во флаконы и пробирки с глюкозо-пептонной (рец. 140) или лактозо-пептонной средой (рец. 141) с поплавками или комочками ваты для выявления газообразования:

а) при исследовании воды на этапах очистки и обеззараживания засевают: 100; 10; 1, 0,1 мл;

б) на выходе в водопроводную сеть — три объема по100 мл; три объема по 10 мл; три объема по 1 мл.

Посев воды в объеме 100 и 10 мл производится во флаконы и пробирки, соответственно с 10 и 1 мл концентрированной питательной среды. Посев воды в объеме 1 и 0,1 мл засевается в пробирки с 10 мл среды нормальной концентрации. Флаконы и пробирки с засеянными средами инкубируют в термостате 24 ч при 37 С С.

Второй день. 1. Учитывают результаты посевов:

а) отсутствие помутнения и образования кислоты и газа во флаконах и пробирках, является показателем отрицатель­ного результата на наличие бактерий группы кишечной палоч­ки в исследуемом объеме воды, дающим право закончить исследование через 24 ч;

б) при помутнении питательной среды с образованием кислоты и газа или помутнении и кислотообразовании (на глюкозо-пептонной среде) или только помутнении (на лактозо-пептонной среде) производится высев на среду Эндо. Высев делается бактериальной петлей, густым штрихом, для получения изолированных колоний. Чашки с посевами инку­бируют 16-18 ч при 37 С С.

Третий день. 1 Просматривают посевы на среде Эндо:

а) отсутствие микробного роста или наличие пленчатых, губчатых колоний с неровной поверхностью и краями, а также плесневых и других не характерных для кишечной палочки колоний является основанием для отрицательного ответа;

б) при обнаружении лактозоположительных темно-крас­ных колоний с металлическим блеском или без него необ­ходимо установить принадлежность выросших микроорганиз­мов к семейству кишечных бактерий. С этой целью произ­водится микроскопирование материала колоний и постановка оксидазного теста.

2. Оксидазный тест при исследовании воды бродильным методом ставится следующим образом. Со среды Эндо бак­териальной петлей или стеклянной палочкой снимают по 2-3 колонии каждого типа. Снятую таким образом микроб­ную массу наносят штрихом на фильтровальную бумагу, смоченную реактивом (рец. 32). При отрицательном резуль­тате оксидазного теста бумага в месте нанесения бактери­альной культуры цвета не изменяет. При положительном, результате — в течение минуты -приобретает ярко-синюю окраску. При постановке данного теста одним из обязатель­ных условий является исследование изолированных колоний, так как примесь оксидазоположительных бактерий может привести к ложному посинению материала и необосно­ванному исключению при подсчете колоний кишечных палочек.

Наличие в мазках грамотрицательных неспороносных палочек с отрицательной реакцией оксидазного теста позво­ляет немедленно дать положительный ответ о наличии бак­терий группы кишечной палочки в исследуемой воде.

При исследовании питьевой воды учитывают розовые и бесцветные колонии. В этих случаях из 2-3 колонии разно­го типа делают мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют. При обнаружении грамотрицательных неспороносных палочек с колониями каждого типа ставится оксидазный тест. При наличии грамположительных или спорообразующих бактерий и положительном результате оксидазного теста на 40-42-м часу ведения анализа дается отрицательный результат на наличие бактерий кишечной группы исследуемого объема воды.

3. При выявлении в воде грамотрицательных, бесспоро­вых, оксидазоотрицательных бактерий из 2-3 колоний различного типа берут микробную культуру для высева в полужидкую среду с глюкозой. Результат роста учитывают после 4-5 ч инкубации в термостате при 37° С:

а) При обнаружении кислоты и газа в посеве дается положительный ответ;

6) при отсутствии кислоты и газа дается отрицательный ответ;

в) при наличии в посевах только кислоты пробирки остав­ляют еще на 24 ч для окончательного учета. При отсутствии газообразования на 2-е сутки дается окончательный отрица­тельный результат, при появлении газа — окончательный положительный результат.

Таблица 2 Определение коли-индекса при исследовании 300 мл воды

Количество положительных результатов анализа воды из:

источник