Меню Рубрики

Анализ воды на яйца гельминтов

МУК 4.2.964-00 Санитарно-паразитологическое исследование воды хозяйственного и питьевого использования. Методические указания

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Санитарно-паразитологическое исследование воды хозяйственного и питьевого использования

Санитарно -паразитологическое исследование воды хозяйственного и питьевого использования: Методические указания. — М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2000.

1. Подготовлены коллективом авторов: Г.И. Новосильцев (к.м.н.), Н.А. Романенко (д.м.н., академик РАЕН), В.А. Рябченко (к.б.н.), Г.С. Горяинова, Т.А. Семенова (к.б.н.), М.Е. Батаева (к.м.н.), Ю.А. Рахманин (д.м.н., академик РАМН), Р.Э. Михайлова (д.м.н.) — ИМПиТМ им. Е.И. Марциновского Минздрава России, НИИКВОВ АКХ им. К.Д. Памфилова, НИИЭЧиГОС им. А.Н. Сысина РАМН. Использованы материалы, разработанные Н.А. Русановой (к.м.н), Г.Л. Медришем (к.т.н.) — НИИКВОВ АКХ им. К.Д. Памфилова.

2. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 22 марта 2000 г.

3. С введением настоящих методических указаний утрачивают силу МУК 4.2.668-97 «Санитарно-паразитологическое исследование воды» и раздел «Контроль качества питьевой воды по паразитологическому показателю (содержание цист лямблий)», пункты 4, 5, 6 Информационно-методического письма «О дополнительных мерах по осуществлению контроля качества питьевой воды по микробиологическим и паразитологическим показателям» от 24 июля 1998 г. № 1100/1670-98-11.

1. Назначение и область применения . 2

2. Методика санитарно-паразитологического исследования воды хозяйственного и питьевого использования . 2

2.2. Чувствительность метода . 2

3. Оборудование и материалы .. 3

3.3. Приготовление рабочих растворов реактивов . 4

4. Отбор и хранение проб . 4

6. Оценка результатов исследования . 6

7. Визуальная оценка вероятной жизнеспособности цист патогенных простейших кишечника и яиц гельминтов . 7

санитарный врач Российской

Федерации — Первый заместитель

Дата введения: 1 июня 2000 г.

Санитарно-паразитологическое исследование воды хозяйственного и питьевого использования

1.1. Настоящие методические указания устанавливают метод лабораторного исследования качества воды хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования по паразитологическим показателям безопасности для здоровья человека, проводимого в порядке государственного санитарно-эпидемиологического надзора.

1.2. Методические указания предназначены для применения в лабораториях учреждений, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор, а также ведомственный лабораторный контроль качества окружающей среды на соответствие:

· СанПиН 2.1.4.559-96 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества»;

· СанПиН 2.1.2.568-96 «Гигиенические требования к устройству, эксплуатации и качеству воды плавательных бассейнов»;

· СанПиН 3.2.563-96 «Профилактика паразитарных болезней на территории Российской Федерации»;

· действующим санитарным правилам по охране поверхностных вод от загрязнения.

Методика предназначена для обнаружения в воде цист патогенных простейших кишечника (лямблий, амебы дизентерийной, балантидия) и яиц гельминтов, представляющих непосредственную угрозу для здоровья человека при их заглатывании, при осуществлении контроля качества воды по паразитологическим показателям в источниках хозяйственно-питьевого водоснабжения (поверхностных водоемах, ручьях, каптажах, колодцах, артезианских скважинах), в распределительной сети систем централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения, а также в водоемах рекреационного назначения*.

* Настоящая методика не предназначена для индикации в воде ооцист криптоспоридий, т.к. для их определения требуются более сложная подготовка диагностического материала и использование дорогостоящих специальных тест-систем, не выпускаемых в настоящее время отечественными производителями.

Цисты патогенных простейших кишечника и яйца гельминтов обнаруживаются при микроскопическом исследовании осадка, получаемого после центрифугирования не менее 4-кратно разведенного раствора флотанта с плотностью 1,26, в который искомые паразитарные агенты попадают из осадка, смываемого с мембранных фильтров после фильтрации через них исследуемой воды. Осаждение цист простейших и яиц гельминтов происходит за счет резкого снижения плотности флотанта, которая после разведения достигает 1,03 и менее, что ниже плотности паразитарных агентов. Плотность их приводится в разделе 7.

Метод обладает чувствительностью с пределом обнаружения, равным единичным цистам лямблий на 1 л. Эффективность выделения цист лямблий данным методом зависит от исходной концентрации паразитарных патогенов в пробе, объема пробы, мутности, обилия фитопланктона и квалификации исполнителя.

3.1.1. Устройство для вакуумной фильтрации через мембранные фильтры: стационарное устройство, используемое для бактериологических и химических исследований в лабораториях водоочистных станций и центров госсанэпиднадзора: фильтровальный аппарат АФ или «Прибор вакуумного фильтрования» ПВФ-142/ЭМ. При отсутствии указанных стационарных установок может быть использован аппарат Гольдмана, состоящий из воронки Гольдмана, колбы для фильтрования под вакуумом номинальной вместимостью 2000-5000 мл (ГОСТ 6514-63), водоструйного насоса (ГОСТ 10696-75) или насоса Комовского, а в полевых условиях — ручного велосипедного насоса или других установок, прошедших гигиеническую оценку и имеющих гигиеническое заключение.

3.1.2. Мембранные фильтры с порами размером 3-5 мк и диаметром мембранного диска, соответствующим размерам фильтровальной ячейки фильтрующего устройства, — от 35 ± 2 мм и более. В качестве мембранных фильтров могут быть применены фильтрующие мембраны «Владипор» марки МФАС-СПА ТУ 6-55-221-15-18-98 (предназначены для использования в приборе ПВФ-142/ЭМ), «Миллипор», «Прагопор», «Сарториус» или другие с аналогичными свойствами, прошедшие гигиеническую оценку и имеющие гигиеническое заключение.

3.1.3. Лабораторная центрифуга типа ОПН-3, ОПН-8, ЦЛС-31М со сменным ротором или другие с аналогичными параметрами, обеспечивающие 1500-2500 об/мин (600-650 g ), позволяющие центрифугировать пробы воды в центрифужных пробирках объемом 10-250 мл.

3.1.4. Холодильник электрический или газовый, поддерживающий температуру 4-6 °С.

3.1.5. Термостат электрический типа ТС-80 или аналогичный с автоматическим терморегулятором и термометром с ценой деления 0,2 °С.

3.1.6. Микроскоп биологический (типа МБИ, «Биолам» и др.), снабженный бинокулярной насадкой (АУ-12 и др.), препаратоводителем (типа СТ-12 и др.), имеющий объективы 10, 20, 40 и объектив 90-100х масляной иммерсии, а также желательно объектив 40-65х водной иммерсии, обеспечивающий увеличение от 100 до 1000 крат, имеющий объектив и укомплектованный окуляр-микрометром и объект-микрометром для калибровки первого, а также имеющий оптику фазового контраста, расширяющую возможности дифференциации цист от фитопланктона.

3.1.7. Осветитель ОИ-19 для микроскопа или другой аналогичный с мощностью лампы не менее 50 ватт.

3.1.8. Весы лабораторные для взвешивания в диапазоне 50 мг — 200 г равноплечные ручные (аптекарские) с разновесами, ВЛР-200 и др.

3.1.9. Денсиметры (ареометры) типа 1 (А1) с пределами измерения от 1,000 до 1,400 кг/м 3 ГОСТ 1300-74.

3.1.10. Дозаторы пипеточные П1-0,1, П1-0,5, П1-1,0 мл ТУ 64-339-81 или аналогичные.

3.1.11. Пинцет анатомический.

3.1.12. Кисти мягкие из волоса белки, колонка или соболя для живописи №№ 12-18.

3.1.13. Стаканы стеклянные высокие с носиком (ВН) номинальной вместимостью 50-100 мл ГОСТ 10394-63.

3.1.14. Пробирки центрифужные градуированные (ПЦГ) емкостью 10 мл ГОСТ 1770-64.

3.1.15. Стекла предметные 25 ´ 75 мм.

3.1.16. Стекла покровные 18 ´ 18, 24 ´ 24 мм ГОСТ 6672-59.

3.1.17. Чашки биологические (Петри) ГОСТ 25336-82.

3.1.18. Часы песочные на 3-5 мин или часы сигнальные.

3.1.19. Штативы лабораторные для пробирок ТУ 64-1-707-80.

3.1.20. Емкости для отбора проб воды из нейтрального материала, пригодные для обеззараживания принятыми методами: канистры пластмассовые емкостью 5-10-20-25 л, стеклянные бутыли, фляги молочные металлические емкостью 30-35 л, эмалированные бидоны.

3.1.21. Цилиндры измерительные с носиком 1-100, 1-250, 1-500 ГОСТ 1770-74.

3.1.22. Колба 2-50-2, 2-100-2, 1-1000 ГОСТ 1770-74.

3.1.23. Капельница для многократной дозировки по Манну ГОСТ 9876-61.

3.1.24. Широкогорлые стеклянные или пластиковые флаконы емкостью 100-500 мл с притертыми или завинчивающимися крышками.

3.1.27. Ножницы с прямыми браншами.

3.2.1. Формальдегид 40 %-ный (продажный).

3.2.2. Сульфат цинка семиводный ( ZnS О42О) х.ч.

3.2.4. Сульфат магния ( MgS О4) ч.д.а.

3.2.5. Тиосульфат натрия ГОСТ 244-76.

3.2.6. Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72.

3.2.7. Натрий хлористый х.ч. ГОСТ 4233-77.

3.2.8. Йод кристаллический х.ч.

3.2.9. Калий йодистый ( KI ) х.ч.

3.2.11. Метиленовый синий сухой х.ч.

3.2.12. Кислота хлористоводородная (НС l ) 30 % х.ч.

3.2.15. Сульфат меди ( CuS О4) x .ч.

3.2.17. Сода двууглекислая ( Na 2 CO 3 ).

3.3.1. Флотанты — любой из трех ниже названных:

· 33 %-ный водный раствор семиводного сульфата цинка : 331 г семиводного сульфата цинка растворяют в 1 дм 3 кипящей дистиллированной воды;

· 30 %-ный водный раствор сахарозы: 300 г сахарозы ч.д.а. растворяют в 1 дм 3 горячей (70-80 °С) дистиллированной воды;

· раствор, состоящий из смеси насыщенных растворов сульфата магния (250 г соли растворяют в 1 л воды при температуре 80 °С), тиосульфата натрия (300 г соли растворяют в 1 л кипящей воды) и дистиллированной воды, соотношение компонентов 3:3:1.

После приготовления флотанта и снижения его температуры до 18 °С контролируют его удельную плотность ареометром. Для выделения цист простейших и яиц гельминтов, представляющих непосредственную опасность заражения человека при заглатывании с водой, удельная плотность флотанта должна быть 1,25-1,26. Если величина этого показателя ниже, ее нужно откорректировать, добавляя более концентрированные растворы соответствующих веществ.

3.3.2. 3 %-ный раствор Люголя: 1,5 г йода кристаллического и 3 г калия йодистого растворяют в 100 мл дистиллированной воды (первым растворяют калий йодистый), выдерживают в темноте при 37 °С в течение 3 суток, после чего используют в работе.

3.3.3. 2 %-ный водный раствор формалина: 1 часть 40 %-ного формальдегида растворяют в 20 частях дистиллированной воды.

3.3.4. Жидкость Барбагалло: 3 %-ный формалин на физиологическом растворе (0,85 % хлорида натрия).

3.3.5. 1 %-ный водный раствор эозина.

3.3.6. Раствор, состоящий из 1 части метиленового синего и 50000 частей дистиллированной воды, готовят путем последовательных разведений.

3.3.7. Смесь (искусственный дуоденальный сок), состоящая из 0,5 г панкреатина, 0,9 г двууглекислой соды и 5 мл дистиллированной воды.

3.3.8. Раствор хлористоводородной кислоты 1 %-ный.

Отбор проб питьевой воды и воды плавательных бассейнов по количеству и кратности проводят в соответствии с СанПиН 2.1.4.559-96 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества» и СанПиН 2.1.2.568-96 «Гигиенические требования к устройству, эксплуатации и качеству воды плавательных бассейнов».

Контроль воды подземных водоисточников по паразитологическим показателям может быть рекомендован при условии неоднократных неудовлетворительных микробиологических результатов исследования.

Количество проб и точек забора в распределительной сети утверждается по согласованию с санитарно-эпидемиологической службой при разработке рабочей программы с учетом численности водопотребителей.

Отбор проб воды производится в чистые емкости. Сосуды больших объемов — молочные фляги, металлические и пластмассовые ведра и т.п., которые тщательно промываются кипяченой водой и ополаскиваются отбираемой для анализа водой.

Пробы воды могут доставляться в лабораторию без обработки или, в целях облегчения их транспортирования, после предварительной обработки (концентрирования материала путем фильтрования на месте отбора проб, в лаборатории водопроводной станции и др.).

С этой же целью может быть использована методика первичной концентрации паразитарных патогенов с помощью таких коагулянтов, как сульфат аммония, сульфат железа, сульфат меди в дозе 0,1-0,3 г/л.

В пробу воды на месте отбора добавляют коагулянт, затем тщательно перемешивают и отстаивают 1-2 ч. После этого надосадочную жидкость удаляют, а осадок переносят в сосуд объемом 1 л и доставляют в лабораторию. Содержимое сосуда вновь отстаивают 1-2 ч, а осадок после удаления надосадочной жидкости переносят в центрифужные пробирки 10-50 мл (в зависимости от объема осадка) и центрифугируют в течение 5 мин при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, а к осадку добавляют 3 мл 1 %-ного раствора хлористоводородной кислоты для растворения хлопьев коагулянта, перемешивают и центрифугируют в таком же режиме. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок обрабатывают по нижеописанной методике.

Пробы, не прошедшие предварительную обработку, могут храниться при температуре 15-20 °С не более двух суток.

В случае если первичная обработка пробы воды (фильтрование) проводилась вне лаборатории, использованные фильтры помещают в широкогорлый флакон или стеклянную банку, добавляют 30-50 мл исходной воды; закрывают флакон или банку завинчивающейся или притертой крышкой, маркируют, указывают дату, место отбора, количество профильтрованной воды и транспортируют в лабораторию для дальнейшего исследования. При невозможности исследования в день отбора материал хранят при 4 °С не более суток; при отсутствии необходимости определения жизнеспособности цист кишечных простейших и яиц гельминтов материал хранят при 4 °С не более 3-4 суток после добавления в него формальдегида с таким расчетом, чтобы концентрация его в суспензии составила 2 %.

Перед началом фильтрации мембранные фильтры должны быть подвергнуты 10-минутному кипячению в дистиллированной воде для удаления посторонних частиц из пор фильтров, препятствующих оптимальному проведению процесса фильтрации.

Питьевая вода исследуется в объеме не менее 50 л, вода водоисточников — в объеме не менее 25 л.

Исследуемый объем воды с помощью фильтровального устройства пропускают через мембранные фильтры (см. раздел «Оборудование и материалы»). По мере замедления процесса фильтрации из-за загрязнения фильтра его заменяют новым, а использованные фильтры с осадком помещают в широкогорлую емкость (стаканчики ВН) с помощью чистого пинцета (предварительно прокипяченного или обработанного спиртом) и заливают исследуемой водой в количестве 30-50 мл для сохранения их во влажном состоянии.

По окончании фильтрации всей пробы осуществляется смыв осадка с фильтров. Каждый фильтр чистым пинцетом опускается в стаканчик с дистиллированной водой; придерживая пинцетом фильтр, осторожно смывают осадок при помощи чистой мягкой кисточки, затем фильтр еще раз прополаскивают в другой порции дистиллированной воды. При использовании фильтров с диаметром диска более 35 мм рекомендуется разрезать их чистыми ножницами на несколько частей для удобства и более эффективной отмывки. Данную операцию удобнее проводить в чашках Петри.

По окончании отмывки всех фильтров кисточку также тщательно прополаскивают в небольшом объеме дистиллированной воды (5-10 мл). Процедура отмывки фильтров и кисточки требует особой тщательности во избежание возможных потерь цист простейших и яиц гельминтов.

Весь полученный смыв центрифугируют в пробирках емкостью 10 мл или более в течение 5 мин при 1500 об/мин (600 g ). Надосадочную жидкость сливают. При отсутствии необходимости определения жизнеспособных цист и яиц гельминтов осадок помещают в 6-8 мл 2 %-ного водного раствора формалина и размешивают.

Если предполагается определение жизнеспособности паразитарных патогенов, к осадку добавляют воду для отмывания его. Суспензии вновь центрифугируют в прежнем режиме, после чего удаляют надосадочную жидкость, а к осадку добавляют 3 мл одного из флотантов и тщательно перемешивают чистой стеклянной палочкой. Центрифугируют 5 мин при 2000 об/мин, или 10 мин при 1500 об/мин, после чего надосадочную жидкость переносят пипеткой в центрифужную пробирку, разбавляют не менее чем в 4 раза дистиллированной водой. Центрифугируют в прежнем режиме, удаляют надосадочную жидкость, а из осадка готовят препараты на предметных стеклах.

В зависимости от задач исследования препарат не окрашивают или подвергают окраске. Если нужно провести только подсчет паразитарных агентов без определения их жизнеспособности, препарат не окрашивается или его окрашивают 1 каплей 3 %-ного раствора Люголя. Вероятную жизнеспособность цист лямблий можно определять, окрашивая препарат 1 каплей 1 %-ного водного эозина.

Готовые препараты накрывают покровным стеклом и микроскопируют, сканируя всю площадь покровного стекла, с использованием 100-600-кратного увеличения (объективы — 10х, 40х, окуляры — 10х, 15х) сухой оптической системы. Для определения более тонких внутренних структур цист простейших, имеющих значение для их идентификации, используют масляно-иммерсионный 90-100-кратный объектив или фазово-контрастное микроскопирование. Таким образом микроскопируется весь объем полученного осадка. При необходимости проводят визуальную оценку вероятной жизнеспособности цист лямблий и других простейших, а также яиц гельминтов.

Читайте также:  Сдать горячую воду на анализ

Микроскопирование и идентификация паразитарных патогенов в пробах воды должны выполняться специалистом, умеющим отличать их от фитопланктона и яиц гидробионтов.

На обработку одной пробы требуется не менее 10 человеко-часов. Результат анализа может быть получен не ранее чем на следующий рабочий день после доставки пробы.

При микроскопировании подсчитывают число паразитарных патогенов во всем объеме осадка, что соответствует их числу во всей исследованной пробе. Одновременно определяют систематическую принадлежность обнаруживаемых паразитических организмов; идентификация их проводится по следующим признакам.

Цисты лямблий — овальная форма, размеры 10-14 мк в длину и 6-10 мк в ширину; незрелые цисты содержат 2 ядра, зрелые — 4; ядра находятся у переднего полюса цисты. Оболочка цисты отчетливо выражена и большей частью отстает от протоплазмы, что является одним из характерных отличий цист лямблий от цист других простейших. Внутри цисты вдоль по средней линии проходят две опорные нити — аксостили; в косом или поперечном направлении лежат характерные парабазальные тела (2 — в незрелых и 4 — в зрелых цистах), нередко заметен сложно свернутый жгутиковый аппарат. Плотность 1,06-1,09.

Цисты амебы дизентерийной — округлая, редко овальная форма, размеры от 10 до 16 мк; молодые цисты содержат 1-2 ядра с центрально расположенной звездчатой кариосомой, зрелые цисты содержат 4 ядра, в зрелых четырехъядерных и незрелых двухъядерных цистах ядра расположены в различных плоскостях; оболочка цист двухконтурная в виде светлого прозрачного ободка. Одноядерные цисты почти всегда содержат в большом количестве гликоген, который в виде крупной вакуоли с нерезкими очертаниями занимает обычно больше половины цисты и раствором Люголя окрашивается в темно-коричневый цвет. Плотность 1,08-1,1.

Следует иметь в виду, что в природной воде могут встречаться цисты Entamoeba dispar , идентичные цистам дизентерийной амебы, но не обладающие патогенными свойствами для человека. В этом случае следует в протоколе исследования отмечать находки без указания видовой принадлежности таких цист. Для идентификации их необходимы дополнительные специальные исследования. Однако и в данной ситуации должна быть настороженность в отношении эпидемического неблагополучия.

Цисты балантидия кишечного — правильная круглая форма, плотная двухконтурная оболочка, средний размер около 50 мк. Внутри цист имеется крупное бобовидное ядро. Протоплазма однородна, гликоген в ней распылен равномерно. Под оболочкой в некоторых цистах заметно углубление, представляющее собой редуцированный цитостом — органеллу, соответствующую началу пищеварительной трубки многоклеточных. Ресничный покров отсутствует. Плотность 1,1.

Яйца аскариды человеческой (свиной) — оплодотворенные яйца овальной или шаровидной формы. Наружная оболочка крупнобугристая, толстая, коричневого цвета (иногда встречаются яйца без наружной бугристой оболочки). Размеры яиц 50-70 ´ 40-50 мк. Яйцеклетка мелкозернистая и шаровидная, расположена в центре яйца. Плотность 1,10-1,14.

Зрелое яйцо (способное заразить при заглатывании) содержит внутри подвижную личинку, свернувшуюся кольцевидно или перекрестно.

Яйца токсокары (аскариды собачьей) — почти круглые, 65-75 мк в диаметре, с нежноячеистой наружной толстой оболочкой темно-коричневого цвета, внутри яйца видна округлая зародышевая клетка. Зрелые инвазионные яйца содержат внутри подвижную свернувшуюся кольцом или перекрестно личинку. Плотность 1,22.

Яйца власоглава — симметричные, имеют лимонообразную или бочонковидную форму. Оболочка темно-коричневая, толстая. На обоих полюсах имеются светлоокрашенные пробковидные образования. Размеры яиц 50-54 ´ 23-26 мк. В зрелых инвазионных яйцах видна подвижная личинка. Плотность 1,16-1,22.

Яйца острицы — асимметричные. Одна сторона заметно уплощена, другая выпукла. Размеры яиц 50-60 ´ 30-32 мк. Оболочка тонкая, гладкая и бесцветная. Яйца могут быть на различных стадиях созревания, до головастикоподобной личинки включительно. Плотность 1,14.

Яйца цепня карликового — оболочка яйца бесцветная, тонкая, гладкая. Форма овальная. Размер яиц 40 ´ 50 мк, эмбриофора (зародыш) почти шаровидная (29 ´ 30 мк), с длинными нитевидными придатками на полюсах. Плотность 1,12.

Онкосферы тениид (цепня свиного и эхинококков) — овальная форма, размеры 31-40 ´ 2-30 мк; имеют тонкую наружную оболочку и толстую радиально-исчерченную внутреннюю оболочку темно-коричневого цвета. Внутри онкосферы находится зародыш-эмбриофора с шестью зародышевыми крючьями. Плотность 1,24.

Отрицательный результат анализа не гарантирует отсутствия паразитарных патогенов в пробе, поэтому результат исследования должен представляться в протоколе термином «не обнаружены». Обнаружение даже одного экземпляра паразитарных патогенов в 1 пробе питьевой воды указывает на эпидемиологическое неблагополучие в системе питьевого водоснабжения.

7. Визуальная оценка вероятной жизнеспособности цист патогенных простейших кишечника и яиц гельминтов

Оценка вероятной жизнеспособности цист патогенных простейших и яиц гельминтов визуально проводится по следующим критериям, подтверждающим жизнеспособность:

· целостность наружной оболочки (отсутствие ее разрывов, вдавлений, выбухания, сморщивания);

· четкая внутренняя структура цисты или яйца: у цист — четко видны ядра, отсутствует зернистость. У цист лямблий, кроме того, видны аксостили, жгутиковый аппарат, медиальное тело. Для яиц гельминтов (аскарид, токсокар, власоглавов, остриц) характерно наличие дробящейся зародышевой клетки или подвижной личинки. У живых онкосфер тениид и карликового цепня зародышевые крючья расположены попарно, а у мертвых — беспорядочно;

· при окраске препарата 1 %-ным водным раствором эозина жизнеспособные цисты лямблий не воспринимают окраску в течение первых 5 мин, мертвые окрашиваются сразу же в розовый цвет. Поэтому указанную окраску следует использовать до микроскопии только в том случае, когда на изучение препарата потребуется не более 5 мин. Часто просмотр мазка длится 15-30 мин, тогда 1 %-ный водный эозин можно вводить аккуратно, не сдвигая препарат, под покровное стекло пипеткой в точке, где при предварительном просмотре уже обнаружены цисты лямблий;

· жизнеспособность онкосфер тениид и яиц аскарид, содержащих личинку, определяют путем окрашивания препарата смесью, содержащей метиленовый синий (см. п. 4.3.6). Живые онкосферы тениид, а также личинки, находящиеся внутри яиц аскарид, не окрашиваются в течение первых 15 мин. Мертвые окрашиваются сразу в синий цвет;

· жизнеспособность онкосфер тениид можно также определить по движению зародышей при воздействии на них пищеварительными ферментами. Для этого исследуемый осадок, содержащий онкосферы, помещают на часовое стекло в искусственный дуоденальный сок (см. п. 4.3.7). Стекло ставят в термостат при 36-38 °С на 4 ч. Живые зародыши освобождаются от оболочек, а мертвые — нет;

· оболочки жизнеспособных онкосфер растворяются также в подкисленном пепсине (рН 5-6) и в щелочном растворе трипсина (рН 8-8,5) через 6-8 ч при температуре 38 °С.

· Схема выполнения методики санитарно-паразитологического исследования воды и изображения определяемых с ее помощью цист кишечных простейших и яиц гельминтов представлены в приложениях 1, 2, 3.

Схема методики санитарно-паразитологического исследования воды (последовательность операций)

Цисты амебы дизентерийной

Циста балантидия кишечного

Яйца аскариды человеческой (свиной),

слева — оплодотворенное яйцо,

Яйца аскариды собачьей (токсокары)

вверху — яйцо на начальной стадии развития,

Цисты патогенных кишечных простейших и яйца гельминтов, определяемые методикой санитарно-паразитологического исследования воды

Яйца гельминтов, определяемые методикой санитарно-паразитологического исследования воды

источник

При помощи санитарно-гельминтологических исследований обнаруживают яйца и личинки гельминтов в окружающей среде, определяют видовой, количественный состав, их жизнеспособность.

Исследование почвы на яйца гельминтов. Пробы почвы массой 100— 300 г отбирают на глубине 10—60 см вблизи выгребов, мусорных ящиков, на детских площадках и т. д. Заливают их 0,85% водным раствором натрия хлорида или 3% жидкостью Барбагалло и хранят до исследования в бытовом холодильнике. Срок хранения проб — не более 1 мес. Исследуют почву по методу Романенко (1968, 1982): 25 г почвы помещают в центрифужные пробирки объемом 250 мл, приливают 3% раствор натриевого или калиевого основания в соотношении 1:1. Полученную смесь тщательно размешивают, отстаивают в течение 20— 30 мин, после чего центрифугируют 5 мин при 800 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок промывают 1—5 раз до получения прозрачной надосадочной жидкости. Затем к осадку добавляют 150 мл насыщенного раствора азотнокислого натрия (относительная плотность — 1,38—1,40), тщательно размешивают и центрифугируют, после чего в каждую пробирку добавляют тот же раствор до уровня на 2—3 мм ниже их краев. Пробирки накрывают предметным стеклом так, чтобы оставался зазор шириной не более 10 мм, через который пипеткой добавляют раствор азотнокислого натрия до соприкосновения его с нижней поверхностью предметного стекла. Затем осторожно полностью закрывают предметным стеклом пробирку и после 20—25-минутного отстаивания стекло снимают и переворачивают его нижней поверхностью вверх. На место снятого стекла ставится второе, а при необходимости — и третье. На снятые стекла наносится капля 50% раствора глицерина, накрывается покровным стеклом и микроскопируется под световым микроскопом. Можно исследовать поверхностную пленку непосредственно в центрифужной пробирке под бинокулярным микроскопом МБС (Н. Л. Чекина, 1977).

На личинки гельминтов почву исследуют по методу Бермана.
Исследование воды на яйца гельминтов. Пробу воды отбирают и* водоемов в количестве от 0,5 до 10 л, что зависит от степени ее загрязнения, а из колодцев — от 20 до 25 л. Рекомендуется отбирать воду по« 0,5 — 1 л через каждые 3—5 мни. Содержащиеся в воде яйца концентрируют путем осаждения или фильтрации при помощи мембранных, бумажных или тканевых фильтров. Анализ воды осуществляют по методу Васильковой.

Исследование сточных вод на яйца гельминтов. Пробы сточной воды в условиях малых очистных сооружений отбирают на следующих этапах ее очистки: до поступления на очистные сооружения («сырая» вода), в отстойной части установки, контактном резервуаре, при впадении в биоируд или открытый водоем. На централизованных очистных: сооружениях воду отбирают до поступления на очистные сооружения,, после механической очистки, после вторичных отстойников, биологических прудов, полей фильтрации, земледельческих полей орошения. «Сырую» воду исследуют в количестве от 2 до 5 л, а в процессе искусственной биологической очистки и после завершения ее — от 10 до 15 л. Пробы отбирают через каждый час в течение суток (среднесуточная) или с 7 до 20 ч (среднедневная). Исследуют сточную воду по методу Романенко. Сточную воду наливают в стеклянный цилиндр емкостью 1—2 л, добавляют один из коагулянтов (сернокислые алюминий, железо или медь) в дозе 0,3—0,5 г/л и тщательно размешивают. Спустя 40—50 мин осветленную надосадочную жидкость удаляют сифоном, а осадок переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 3 мин при 1000 об/мин. Затем сливают жидкую часть, а к осадку приливают 2—4 мл 1—3% раствора соляной кислоты для растворения хлопьев коагулянта. Полученную смесь центрифугируют, удаляют жидкую часть, а осадок исследуют в дальнейшем по методике Романенко, применяемой для анализа почвы.
И. К. Падченко с соавторами (1982) разработал следующие методики исследования почвы, воды и сточных вод на яйца гельминтов.

Исследование почвы на яйца гельминтов. Отобранную пробу почвы (не менее 300 г) вносят в большую фаянсовую ступку, постепенно добавляют к ней 3% раствор натриевого или калиевого основания и тщательно растирают пестиком до образования гомогенной массы. Полученную смесь выливают в стеклянный цилиндр емкостью 10 л, предварительно наполненный на 3/4 объема водопроводной водой, и отстаивают в течение 5 мин. Всплывшие на поверхности смеси плотные примеси удаляют петлей с сеткой. После 5-минутного отстаивания надосадочную жидкость переливают сифоном в другой большой цилиндр, а образовавшийся осадок переносят в цилиндр емкостью 1 л и повторно отмывают водопроводной водой (не менее 2—3 раз). Образующуюся при этом в малом цилиндре надосадочную жидкость каждый раз переливают сифоном после 5-минутного отстаивания в большой цилиндр, где она смешивается с жидкой частью смеси, полученной после первого 5-минутного отстаивания. К собранной в большом цилиндре жидкости добавляют один из коагулянтов (сернокислый алюминий, сернокислое железо и др.) из расчета 0,3 г на 1 л жидкости и отстаивают ее 1—1,5 ч до полного просветления. Образовавшуюся надосадочную жидкость удаляют сифоном, а к осадку добавляют 1—3% раствор соляной кислоты для растворения хлопьев коагулянта. Полученную смесь отстаивают 18—24 ч, после чего жидкую часть удаляют сифоном, а осадок исследуют на яйца гельминтов. С этой целью осадок тщательно встряхивают и пастеровской пипеткой наносят 1 каплю полученной взвеси на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и микроскопируют. Исследуют не менее 1 мл осадка, а затем математически пересчитывают на весь его объем. При незначительном загрязнении проб почвы микроскопическому исследованию подлежит весь осадок.

Исследование сточной воды на яйца гельминтов. Пробы сточной воды, взятые на разных этапах ее очистки на очистных сооружениях, наливают в 10-литровые цилиндры и отстаивают 5 мин. Всплывшие на поверхность жидкости плотные примеси удаляют петлей. После 5-минутного отстаивания надосадочную жидкость переливают сифоном в другой большой цилиндр, а осадок удаляют. Полученную жидкую часть сточной воды смешивают в большом цилиндре с коагулянтом и исследуют в дальнейшем по той же методике, что и почву (на этапе добавления коагулянта).
Пробы воды из водопроводной сети и различных водоемов смешивают в большом цилиндре с коагулянтом и исследуют в дальнейшем по той же методике, что и сточную воду.

Исследование осадков сточных вод на яйца гельминтов. Пробы осадков сточных вод отбирают с 5—10 мест по 100 мл, помещают в стеклянные сосуды объемом 1—2 л. Сухие осадки забирают по той же методике, что и почву. Вносят 100—150 мл осадка в центрифужную пробирку объемом 250 мл, центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин. Затем жидкую часть сливают, а к осадку добавляют чистую воду до прежнего объема, тщательно размешивают и центрифугируют. Такую промывку осадка повторяют 2—3 раза, после чего к нему добавляют 3—5 г чистого песка и полученную смесь исследуют по той нее методике, что и почву.
Согласно нашим данным, осадок сточных вод исследуют на яйца гельминтов по следующей методике: пробу осадка в количестве 1 л тщательно растирают пестиком в большой фаянсовой ступке, постепенно добавляя к нему 3% раствор натриевого или калиевого основания, а в дальнейшем исследуют по той же методике, что и почву.

Исследование смывов на яйца гельминтов. Объекты внешней среды, подлежащие исследованию, смывают ватными тампонами, смоченными в 1% растворе натриевого основания или в 20% растворе глицерина. Тампоны смывают в центрифужные пробирки 2—3% раствором гидрокарбоната натрия или 1% раствором натриевого основания и центрифугируют. Полученный осадок микроскопируют.

Читайте также:  Сдать сточную воду на анализ

Определение жизнеспособности яиц и личинок гельминтов. Жизнеспособность яиц и личинок гельминтов по внешнему виду определяют при помощи витальных красителей, методов культивирования и постановки биопроб на лабораторных животных.
Под световым микроскопом у мертвых или дегенерирующих яиц гельминтов оболочки разорваны или деформированы, цитоплазма разрыхлена, мутная. При подогревании зрелых яиц аскариды, власоглава, острицы до температуры +37° С личинки этих гельминтов проявляют активную подвижность.

Культивирование яиц и личинок гельминтов. Незрелые яйца аскариды культивируют при температуре +24. +30°С в чашках Петри (влажная камера) в 3% растворе формалина, приготовленном на 0,85% растворе натрия хлорида, а яйца власоглава — в 3% растворе хлористоводородной кислоты при температуре +30. +35°С, яйца остриц —в 0,85% растворе натрия хлорида при температуре Ч-37°С. Чашки Петри 1—2 раза в неделю открывают для аэрации и увлажняют в них фильтровальную бумагу чистой водой. Развитие яиц контролируют 2 раза в неделю по наличию признаков деления протопласта на отдельные бластомеры. В первые дни яйцо развивается до 16 бластомеров, переходящих в стадию морулы (вторая стадия). Если в течение 2—3 мес у янц не наблюдается признаков развития, их следует считать погибшими.

источник

Многие источники пресной воды в настоящее время отвечают требованиям санитарной безопасности далеко не в полной мере.

Поэтому, чтобы обеспечить её соответствующую обработку, выполняется комплекс санитарно-микробиологических анализов, в число которых входит и анализ паразитологический.

О порядке его проведения пойдет речь в статье.

Данные виды работ проводятся в строгом соответствии с требованиями действующих в настоящее время методических указаний, зарегистрированных под № МУК 4.2.1884-04. Указанный документ, 03.03.04, был утверждён главным государственным (ГГСВ) санитарным врачом РФ. На сегодня действует редакция документа от 23.12.10.

Третья глава документа регламентирует собственно паразитологические исследования. В комплекте с указанным документом в обязательном порядке рассматриваются требования иных действующих нормативных актов. Например, СанПиН 2.1.5.980-00.

Методика указанных исследований для различных источников водоснабжения имеет свою специфику. Например, если забор осуществляется из поверхностных водоёмов, используют методики, ориентированные на выявление в воде наличия цист простейших кишечных патогенов (дизентерийных амёб, криптоспоридий, балантидий, лямблий), а также яиц гельминтов, которые непосредственно угрожают здоровью и жизни человека при попадании внутрь организма.

Выполняя микроскопические исследования тех осадков, которые получаются после центрифигурирования раствора флотанта, разведённого минимум в четыре раза (исходная плотность — 1,26) можно получить выпадающих из данного осадка паразитных агентов.

Осаждение указанной патогенной микрофлоры достигается тем, что плотность флотанта резко понижается (1,03 и меньше). Этот показатель гораздо ниже плотности самих паразитных агентов.

Мембраны этого типа производятся из прозрачной тонкой полиэтилентеренфалатной плёнки, имеющей сквозные поры, диаметр которых лежит в диапазоне 0,1 – 5,0 мкм.
Выполнить дифференциацию пор указанных мембран с осевшими на них объектами паразитологии несложно. Объясняется это тем, что яйца гельминтов почти в 20 раз, а цист лямблий почти в 4 раза по своим размерам больше размеров пор.

Главным назначением данной методики является, как видно из названия, выявление наличия ооцист криптоспоридий. Метод позволяет определить наличие яиц гельминтов и цист лямблий.

Указанный метод предусматривает последовательную фильтрацию воды через специальную систему аналитических трековых (АТМ) мембранных фильтров.

Идентификация возбудителей паразитарных болезней кишечника, выявленных в процессе вышеперечисленных исследований

Выполняется микроскопирование, в процессе, которого проводится подсчёт паразитарных патогенов, содержащихся в полном объёме выпавших осадков. Таким образом, получается число паразитических организмов во всей пробе, взятой на исследование. Параллельно с этим обнаруженных паразитов систематизируют и идентифицируют.

Для этого руководствуются рядом характерных признаков, присущих тому или иному паразиту. А также учитывают тот факт, что весьма часто природная вода содержит формы цисты Entamoeba dispar, которые практически неотличимы от дизентерийной амёбы, на патогенного влияния на организм человека они не оказывают.

В таких случаях поступают следующим образом. Их отмечают в протоколе, не указывая видовой принадлежности. А для более точной идентификации выполняют дополнительную серию исследований.

Если в результате анализа на наличие в воде паразитов получены отрицательные результаты, это далеко не всегда означает реальное отсутствие патогенов в пробах. Поэтому в протоколе просто проставляется термин «не обнаружено».

Наиболее часто применяемыми для целей паразитологического анализа воды приборами являются сегодня приборы напорного и вакуумного фильтрования. С их помощью концентрируется осадок и осуществляется выделение в исходном продукте паразитарных объектов. Далее исследуемая проба проходит фильтрацию через специальный мембранный фильтр.

По завершению процесса фильтрации из прибора изымается фильтр. С поверхности его мембраны смывают сконцентрировавшийся на ней осадок, либо сразу проводят микроскопирование.

Это изделие позволяет выполнить быстрое фильтрование с последующим сливом отфильтрованной воды. Прибор изготовлен специально под мембранный фильтр, диаметр которого составляет 142мм.

Потребитель получает ПВФ-142 в следующей комплектации:

  • собственно вакуумная станция;
  • ячейка фильтровальная;
  • устройство заборно-фильтровальное;
  • устройство заборное;
  • шланги соединительные в комплекте.

Габариты прибора 180*210*310. Масса – 3,2 кг.

В указанной комплектации можно одновременно выполнять фильтрование не одной, а двух проб:

  • первая проба на фильтре мембранном, диаметр которого составляет 142мм. Здесь выполняются исследования на цисты лямблий, личинки гельминов, яйца;
  • вторая – на мембранном фильтре, диаметр которого составляет 35мм (вариант – 47мм). Осуществляется выявление ооцисты криптоспоридий.

Потребитель получает прибор в следующей комплектации:

  • ячейка фильтровальная с воронкой для установки фильтра 47/35 мм (объём воронки 300мл);
  • ячейка фильтровальная для установки основного фильтра диаметром 142мм;
  • собственно вакуумная станция;
  • ячейка фильтровальная;
  • устройство заборно-фильтровальное;
  • устройство заборное;
  • шланги соединительные в комплекте.

Габариты прибора 180*210*310. Масса – 3,2 кг.

Изделие функционирует без потребления электричества, исключительно под давлением воды, поступающей из водопроводной сети. После прибора вода сбрасывается в канализацию. Оснащается стандартным фильтром диаметром 142 мм.

Прибор поставляется потребителю в следующей комплектации:

  • ячейка фильтровальная;
  • насос водоструйный;
  • устройство заборно-фильтровальное;
  • устройство заборное;
  • шланги соединительные в комплекте.

Габариты прибора 180*210*310. Масса – 3,2 кг.

Прибор ПВФ-142П Б (вакуумного фильтрования)

Это мобильный прибор, работоспособность которого не зависит от внешних источников питания. Он представляет собой узел фильтрации для выполнения работ непосредственно на исследуемом водоёме. В нём вакуумная станция и фильтровальная ячейка смонтированы на переносной раме. Такие приборы дают возможность выполнять предварительную обработку проб непосредственно во время их забора.

Используется для выполнения фильтрования воды, поступающей непосредственно из водоёма на объект надзора.

Комплектация прибора: ячейка фильтровальная; насос ножной; устройство заборно-фильтровальное; шланги соединительные в комплекте.

Позволяет фильтровать воду из крана водопровода. Работает от давления водопроводной сети. Рассчитан на работу с фильтром, диаметр которого составляет 70мм. Изделие состоит из: ячейки фильтровальной; насоса ручного; ёмкости мерной.

Паразитологический анализ позволяет своевременно выявить угрозу жизни и здоровья человека, исходящую от потребления зараженной патогенной микрофлорой питьевой воды и принять необходимые меры для её обеззараживания.

источник

Исследование проб почвы. С целью определения загрязненности яйцами и личинками гельминтов почвы ее берут около помещений, на пастбищах, прогонах и в других местах на глубине до 15—20 см. С каждого участка через каждые 10 м берут около 50 г почвы, перемешивают ее и со средней пробы отбирают 100 г почвы.

А. И. Корчагин (1984) с целью выявления в почве или в соскобах с твердых покрытий животноводческих помещений яиц аскаридат или стронгилят предлагает из отобранных образцов брать по 15—25 г почвы, а в качестве флотационной жидкости применять раствор нитрата аммония плотностью 1,3 или нитрата натрия плотностью 1,38. Пробу почвы помещают в центрифужную пробирку емкостью 250 мл, добавляют 100 мл 3%-ного раствора едкого натрия, перемешивают стеклянной палочкой и центрифугируют 3—5 минут со скоростью 1000 об/мин. После этого надосадочную жидкость сливают, а к осадку добавляют 150 мл воды, опять хорошо перемешивают и повторно центрифугируют. Надосадочную жидкость сливают, а к осадку добавляют 150 мл раствора нитрата аммония, перемешивают и фильтруют через капроновое или металлическое ситечко с размерами ячеек 0,5х0,5 мм в другую пробирку и опять центрифугируют. После этого пробирки со смесью ставят в штатив и в каждую из них доливают раствор нитрата аммония до уровня ниже края пробирки на 2—4 мм. После этого берут предметные стекла размером 6х6 см, покрывают ими пробирки, в которые пипеткой добавляют раствор нитрата аммония до соприкосновения его с нижней поверхностью стекла. Через полчаса стекла снимают и подсчитывают количество яиц гельминтов в пробе.

При исследовании соскобов пробу берут в количестве 15—25 г с разных мест пола, нижних участков стен, перегородок через каждые 5 м. Для исследования соскобов применяют те же флотационные растворы и аналогичные подходы, что и при исследовании почвы.

Для выявления в почве личинок нематод применяют метод Бермана. С этой целью 30—40 г почвы помещают на молочные фильтры в воронки аппарата Бермана, заполняют теплой водой (40 °С). Через 3—4 ч содержимое переливают в пробирки, центрифугируют 1—2 минуты со скоростью 1000 об/мин, верхний слой жидкости в пробирках сливают, а осадок микроскопируют.

Исследование проб навоза на наличие яиц и личинок гельминтов проводят теми же методами, что и исследование почвы, но при исследовании навоза на наличие яиц гельминтов пробы фильтруют через металлические ситечки, чтобы крупные частицы не мешали при микроскопировании поверхностной пленки.

Жидкие и плотные фракции навоза на наличие яиц гельминтов исследуют по модифицированному методу А. А. Черепанова (1972). Из плотной фракции отбирают 100 г навоза, из жидкой фракции — 0,5 кг. Пробу плотной фракции навоза смешивают с небольшим количеством воды, растирают в ступке и фильтруют через марлю под напором струи воды из водопровода. Фильтрат помещают в пробирки и центрифугируют 3 мин со скоростью 1500 об/мин. Надосадочную жидкость в пробирке сливают, а к осадку добавляют раствор нитрата натрия или аммиачной селитры и повторно центрифугируют. После этого в пробирки наливают доверху флотационный раствор, покрывают предметными стеклами и через 20-25 минут их микроскопируют. После фильтрации жидкую фракцию навоза исследуют аналогичным образом.

Методика Н. А. Акулина для исследования травы на выявление личинок стронгилят. Перед началом исследований готовят оборудование: тазы диаметром 36 см и высотой 15 см; стеклянные воронки диаметром 20 см, к которым прикрепляются пробирки с помощью резиновых трубок; штатив для воронок; микроскопы; сита диаметром 31 см с высотой боковой стенки 12 см, размер ячеек сетки сита 1 мм; глазные пипетки, предметные стекла, раствор Люголя.

Отбирают пробы травы по 100—120 г и помещают их в сито. Его ставят в таз с теплой водой (22—24 °С). Между сеткой сита и дном таза должно оставаться расстояние в 5—7 см. Через 24 ч сито с травой вынимают из таза, а через полчаса воду из таза осторожно сливают, оставляя осадок в количестве примерно 1,5 л. После этого в штатив вставляют воронки с прикрепленными к ним пробирками и в воронки выливают осадок из таза, перед этим хорошо перемешав его. Через 2 ч пробирки от воронок отделяют и осадок в них исследуют с помощью микроскопа. При необходимости обездвиживания личинок применяют раствор Люголя, добавляя одну каплю его к капле исследуемой на предметном стекле жидкости. В пастбищный сезон для выявления личинок диктиокаул траву рекомендуется исследовать один раз в неделю, а для обнаружения стронгилят желудка и кишечника жвачных — через каждые две недели.

Исследование воды для обнаружения яиц и личинок гельминтов. При исследовании воды крупных водоемов в различных местах берут пробы в объемах от 0,5 до 10 л. С поверхности воды пробы берут малыми емкостями — 0,5-1 л через каждые 3-5 минут, чтобы через час средняя проба составила 10 л. Из колодцев, водопровода проба воды должна быть не менее 25 л. Целесообразно пробы воды брать в различные сроки дня и в различные периоды года для установления динамики загрязненности ее личинками и яйцами гельминтов.

Метод исследования воды по 3. Г. Васильковой (1955). Отбирают пробу воды и фильтруют ее через крупнопористые фильтры (диаметр пор 3—5 мкм). При этом задерживаются яйца и личинки гельминтов. В ветеринарной лаборатории воду можно фильтровать через воронку Гольдмана с применением насоса Комовского. В полевых условиях применяют ручной насос, при этом за 1 ч фильтруют 10 л воды, используя 10—20 фильтров. После этого фильтры помещают на большие предметные стекла и микроскопируют.

Для фильтрации можно применять также бумажные фильтры для исследования речной и сточной воды. При этом за 1 ч удается исследовать 2—3 л воды с применением около 50 фильтров.

Если нет фильтров, воронок Гольдмана и другого оборудования, в полевых условиях воду просто отстаивают в 10-литровой посуде, осадок сливают в пробирки, центрифугируют и исследуют.

Все описанные выше методы исследований почвы, навоза, воды и травы могут быть применены при гельминтологической оценке пастбищ при многих геогельминтозах.

Обследование пастбищ и водоемов при биогельминтозах

Заражение животных на пастбищах, в местах прогона и из водоемов биогельминтами зависит исключительно от наличия там промежуточных хозяев, а также степени их зараженности гельминтами.

В европейской части нашей страны промежуточным хозяином для фасциол служит пресноводный моллюск Galba truncatula (L. truncatula) — малый, или усеченный, прудовик. При влажности ниже 45 % малые прудовики погибают (В. В. Горохов, 1973). Биотопы малого прудовика отличаются большим разнообразием — это небольшие лужи, мочажины, неглубокие болота, пруды и т. д. Плотность его на 1 м 2 колеблется от единичных экземпляров до нескольких сотен. Биотопы малого прудовика могут быть постоянными или временными. Малый прудовик предпочитает поселяться на богатых гумусом почвах, хорошо освещенных солнцем. Как правило, его нет в водоемах на глубине более 20 см или он там встречается редко.

Малый прудовик откладывает яйца на остатках растительности, на кусках дерева, на камнях или просто на влажной почве, даже в самой воде. В каждой кладке одного моллюкса содержится от 4 до 30 яиц. Подсчитано, что за 16 дней один такой моллюск может отложить до 400 яиц (S. В. Кеndall, 1953). Молодые особи выходят из яиц через 10-32 дня после их откладки (в зависимости от температуры и влажности), а половозрелыми моллюски малого прудовика становятся через 21-63 дня после вылупления из яиц. При благоприятных условиях уже во второй генерации потомство одного моллюска малого прудовика может достичь 160 тыс. экземпляров (Е. Е. Шумакович, 1973). В условиях Беларуси и Нечерноземной зоны России яйцекладка малого прудовика может проходить с мая по сентябрь, в течение этого времени каждый моллюск откладывает яйца 2-3 раза. Считают, что срок жизни малого прудовика от года до 4 лет.

Читайте также:  Сдать родниковую воду на анализ

На наличие моллюсков малого прудовика осматривают прибрежную часть водоемов, берега, растительность, дно у берега водоемов на глубину до 20 см. Определяют плотность популяции из расчета на 1 м 2 . Обследование пастбищ проводят в теплое время года при температуре не ниже 20 °С. Особое внимание необходимо уделять низменным местам, заросшим травой. Отобранных в биотопах моллюсков определяют до вида.

Исследование некоторых промежуточных и резервуарных хозяев на наличие гельминтов

Моллюски могут принимать участие в развитии трематод, некоторых цестод и нематод. Для исследования моллюска освобождают от раковины, помещают в чашки Петри, расчленяют на отдельные части и микроскопируют с помощью компрессория. Малых прудовиков, планорбид и других мелких моллюсков исследуют, не снимая раковин. При микроскопии в поле зрения можно найти тре-матод в различных стадиях развития — спороцисты, редии, церкарии, метацеркариев.

Для исследования малого прудовика — промежуточного хозяина фасциолы обыкновенной из каждого биотопа берут не менее 100 экземпляров. Для более точного определения степени инвазированности моллюсков гельминтами исследуют из каждого биотопа 300-400 экземпляров. Этот моллюск имеет коническую тонкостенную раковину серовато-желтого цвета с 5-6 выпуклыми оборотами. Устье моллюска яйцевидное, высота раковины—до 10 мм. Моллюска исследуют полностью или отрезают верхушку раковины, где расположена печень с развивающимися в ней личинками: спороцистами, редиями и церкариями.

Спороциста — первая стадия партеногенетического развития трематод. Образуется она чаще в печени моллюска из проникшего в него мирацидия. Спороцисты трематод бывают различны по форме, у фасциол они веретенообразной формы с закругленными концами. Стенки их тонкие, пищеварительной системы нет, внутри они заполнены клетками. При оптимальных условиях развития внутри спороцисты уже на 8-й день появляются редии. Спороцисты без редий обнаружить трудно, так как они небольшие по размеру (0,1—0,2 мм) и неподвижны.

Редия является второй стадией партеногенетического поколения трематод. После созревания в спороцисте редии разрывают ее оболочку и находятся в основном в печени. Форма тела у редий сигарообразная. Они имеют ротовое отверстие, глотку, кишечник, а также выделительную систему. Сформировавшиеся молодые редии фасциол имеют длину до 0,47 мм, 13-дневные—0,63мм, 19-дневные—до 1,5мм. Внутри молодых редий находятся зародышевые клетки, из которых затем вырастают или дочерние редии, или церкарии. При благоприятных погодных условиях церкарии могут обнаруживаться уже в 24-дневных редиях. Молодых редий фасциол, как и спороцист, нельзя дифференцировать от редий других трематод.

Церкарии после созревания выходят из редий через «родильное отверстие». В зрелом возрасте церкарии фасциолы обыкновенной молочного цвета. Он состоит из двух обособленных отделов —переднего (овального) и заднего — хвостового придатка. Тело церкария размером 0,22—0,35х0,17—0,22 мм имеет ротовую и брюшную присоски, глотку, кишечник и цистогенные железы. Длина хвоста церкария 0,25—0,55 мм. После пребывания в воде 30—40 минут хвосты у церкариев отпадают и они превращаются в адолескариев. Несмотря на то, что отдельные виды трематод развиваются только в моллюсках определенных видов, многие моллюски являются промежуточными хозяевами одновременно для ряда трематод. В связи с этим в них могут быть обнаружены разные церкарии, которых необходимо отличать друг от друга по характерным морфологическим признакам.

Исследование катушек планорбид проводится с целью обнаружения в них личинок парамфистоматид. Установлено, что в хозяйствах Беларуси промежуточными хозяевами парамфистоматид являются моллюски Р1аnоrbis planorbis, Аnisus vоrtех и др. Они находятся в мелиоративных каналах, в небольших водоемах, богатых травянистой растительностью с дерново-глеевыми и пе-регнойно-иловато-глеевыми почвами (рН 5,2—5,5). Плотность их составляет от единичных экземпляров до 75 (и более) на 1 м 2 поверхности биотопа.

Катушек исследуют с помощью компрессория. При этом личинок парамфистоматид можно обнаружить как в самом моллюске, так и в жидкости, вытекающей при раздавливании их между стеклами компрессория. С апреля до первой половины июля обычно проводят исследование взрослых перезимовавших моллюсков, так как в молодых моллюсках церкариев парамфистоматид можно обнаружить лишь с середины июля до октября. Из одного биотопа вскрывают и исследуют не менее 100—200 моллюсков. В катушках можно обнаружить церкарии различных трематод, поэтому церкариев парамфистоматид необходимо уметь отличать от остальных гельминтов.

Церкарии парамфистоматид темно-коричневого цвета, тело овальной формы, сплющенное, размером 0,21-0,45х0,17-0,30 мм. Передний конец тела оттянут и притуплен, задний более широкий и закруглен. На переднем конце личинки располагается фаринкс, по бокам основания которого находятся два черных глазка треугольной формы. В месте прикрепления к телу хвоста располагается брюшная присоска круглой формы. Длина хвоста составляет 0,59—0,75 мм.

Наземные моллюски исследуются с целью обнаружения в них личинок дикроцелий, эуритрем, протостронгилид и др. На территории европейской части России промежуточными хозяевами для дикроцелий (D. lаnсеаtum) являются следующие виды моллюсков семейства Неlicidае: Неliсеlla саndicans, Неlicopsis instabilis, Monacha cartusiana, Моnасhа truticicola, Рsеudotrichia rubidinosa, Enomphalia strigella и др., а также некоторые моллюски семейств Вгаgуbаеnidае, Сосhlicopidaе, Zonitidae, Gimacidaе, Еnidае и др.

Инвазированность мелких моллюсков личинками дикроцелиев определяют при раздавливании их между стеклами и микроскопированием препаратов. Крупных моллюсков исследуют после освобождения их от раковин и извлечения пищеварительной железы. Последнюю помещают в каплю воды на предметное стекло, измельчают и микроскопируют. При этом необходимо обнаружить материнские и дочерние спороцисты или церкарии. Последние представляют собой овально-удлиненной формы личинку с длинным хвостом. Зрелых церкариев обнаруживают в моллюсках чаще в весенне-летний период.

В моллюсках церкарии проникают в их дыхательную полость, покрываются клейким слизистым веществом, образуя слизистые комочки, в которых содержится до 200 церкариев и более. Из тела моллюска слизистые комочки выталкиваются и прилипают к растениям.

Муравьи находят слизистые комочки с церкариями дикроцелий и охотно их поедают. В теле муравья церкарии мигрируют в его брюшную полость, покрываются цистой и превращаются в метацеркариев. Для заражения животных дикроцелиями необходимо, чтобы муравьи с метацеркариями этих гельминтов попали в организм. В связи с этим для гельминтологической оценки пастбищ на дикроцелиоз необходимо провести исследование муравьев. Для этого отыскивают и устанавливают зараженность не всех собранных муравьев, а только тех, которые находятся в состоянии «оцепенения». Насекомых помещают в пробирку и на 3-5 минут кладут туда ватный тампон, смоченный эфиром. Затем на предметном стекле препаровальными иглами у муравьев вскрывают брюшко и просматривают под микроскопом или лупой на наличие метацеркариев. Они бывают видны заключенными в цисту длиной 0,28—0,4 и шириной 0,2—0,26 мм. В одном муравье может находиться от единичных до 350 метацеркариев и более.

Исследования панцирных клещей из родов Schelozibates, Zygoribatula, Сеrаtozetеs и др. проводятся с целью обнаружения личинок мониезий и других цестод из семейства Акантоцефалид. Для этого берут поверхностный слой почвы и с помощью аппарата Тульгрена выделяют орибатид. Клеща помещают на предметное стекло в каплю воды, панцирь его расщепляют иглами, покрывают покровным стеклом и микроскопируют. Цистицеркоид мониезий представляет собой шаровидное образование диаметром 0,16—0,20 мм, в центре которого находится сколекс с присосками.

Обследование объектов внешней среды для обнаружения клещей и паразитических насекомых

Обследование пастбищ для обнаружения иксодовых клещей. На деревянный стержень длиной 100 см прикрепляют кусок марли или ткани размером 60х80 см и медленно обеими сторонами проводят по траве или мелкому кустарнику обследуемого пастбища. После этого марлю или ткань осматривают и собирают клещей.

Для сбора иксодовых клещей можно пользоваться также специальным экраном, представляющим собой легкую деревянную раму размером 180-200х80-100 см. С одной стороны раму затягивают белой бязью, разграфленной на восемь — десять поперечных полос на равном расстоянии одна от другой. Один человек проносит экран в вертикальном положении через заросли, второй наблюдает за экраном и снимает прикрепившихся к нему клещей, которых затем исследуют или консервируют.

Исследование иксодовых клещей на наличие пироплазматид проводят по методу А. А. Цапруна и А. А. Маркова. Отбирают самок клещей, умерщвляют их хлороформом или эфиром, затем проводят через 96°-ный этиловый спирт. В чашку Петри, дно которой покрыто парафином, наливают физиологический раствор и переносят туда клещей. С помощью ножниц отсекают задний край брюшка клеща, а затем разрезают наружные края брюшка. После этого клеща прикрепляют к парафину тонкими булавками, препаровальной иглой приподнимают задний край его хитиновой покрышки, пинцетом отводят ее вперед и отсекают ее у основания хоботка.

По бокам передней части тела клеща располагаются слюнные железы, их отделяют от трахей, жирового тела и органа Жанэ, помещают на обезжиренное предметное стекло в каплю воды и размельчают препаровальной иглой до получения мелкой суспензии. Из нее готовят тонкий мазок, тщательно его высушивают (в термостате при 37 °С в течение 3 ч, при комнатной температуре — 12ч) и фиксируют метиловым спиртом 10 минут. Окраску мазков проводят по Романовскому-Гимза или по Нохту.

При микроскопировании препаратов пироплазматид находят в виде образований овальной, округлой, грушевидной или червеобразной формы, в которых хорошо видны ядро и протоплазма.

Исследование гемолимфы иксодовых клещей для обнаружения пироплазматид проводят по методу И. В. Абрамова. Для этого самку клеща обмывают дистиллированной водой и высушивают фильтровальной бумагой. Затем ножницами отрезают одну конечность. При этом выступает капелька гемолимфы, которую наносят на обезжиренное предметное стекло и делают мазок. Его высушивают, фиксируют 10 минут метиловым спиртом, красят по Романовскому-Гимза и микроскопируют с использованием иммерсионной системы.

Методы обнаружения аргасовых и гамазовых клещей. Для обнаружения аргасовых и гамазовых клещей в птичниках собирают остатки сухого корма, пыль из трещин в банки с притертыми пробками. После этого небольшими порциями собранный материал помещают на чашку Петри и подогревают на спиртовке. Выползших клещей собирают влажной кисточкой и микроскопируют.

Для обнаружения клещей можно применять и метод флотации. С этой целью небольшое количество сора из птичника или из гнезда (5—10 г) помещают в стеклянный цилиндр емкостью 200 мл, заливают водой, тщательно перемешивают и отстаивают. С поверхности удаляют всплывшие посторонние частицы, воду осторожно сливают, а осадок помещают в пробирку и центрифугируют при 1500 об/мин 1—2 минуты. Жидкость из пробирки сливают, а осадок микроскопируют.

Сбор орибатидных клещей. Применение аппарата Тульгрена для сбора орибатидных клещей. Вначале собирают аппарат Тульгрена. Для этого берут крупную стеклянную воронку, к узкому концу которой с помощью резиновой трубки прикрепляют пробирку. Раструб воронки затягивают марлей или покрывают металлической сеткой с мелкими отверстиями.

На марлю или сетку помещают исследуемый материал (пробу травы, почвы, мха и др.). Аппарат укрепляют в штативе и на расстоянии 20—25 см от пробы материала помещают электролампу мощностью 100 Вт, постоянно освещающую пробу. В результате подсыхания и под действием света орибатидные клещи выползают из исследуемой пробы, проваливаются через отверстия марли или сетки и попадают в пробирку. Через 1—2 суток пробирку снимают, а клещей помещают на предметное стекло и микроскопируют.

Метод С. Н. Никольского. Почву или дерн размером 10х10х2 см после тщательного измельчения просеивают через ряд сит. Наиболее мелкую часть отсева насыпают тонким слоем в часовые стекла, которые перед этим ставят в наполненные водой чашки Петри и в таком виде выставляют на хорошо освещенные подоконники. Под влиянием света орибатидные клещи выползают на край часовых стекол и сваливаются в воду, из которой их извлекают акварельными кисточками, помещают на предметное стекло и микроскопируют.

Сбор паразитических насекомых в помещениях и на пастбищах. Мух-жигалок вылавливают с помощью пробирок, энтомологических сачков или мухоловок. В помещениях они встречаются на протяжении всего лета, но больше всего в августе и сентябре.

Мухи других видов чаще встречаются в летнее время возле животноводческих помещений, навозохранилищ, мусорных ям и т. д. Они предпочитают теплые и освещенные поверхности. После отлова мух умерщвляют в морилке, накалывают на энтомологические булавки или же помещают в склянки с притертой пробкой, куда перед этим наливают 70°-ный этиловый спирт.

Комаров в помещениях отлавливают в различных затемненных местах, а также на окнах, стенах, потолках. Зимой их можно обнаружить в теплых подвалах, погребах, животноводческих помещениях. Их отлавливают с помощью пробирки, после чего помещают в нее ватный тампон, смоченный хлороформом или эфиром.

На пастбищах насекомых отлавливают с помощью энтомологического сачка, который представляет собой мешок длиной 75—100 см, натянутый на обод диаметром 30—35 см и укрепленный на деревянную палку длиной 1,2—1,5 м. Мешок обычно делают из марли.

Энтомологическим сачком кроме мух и комаров отлавливают также слепней. Их обычно находят в местах, заросших кустарником или тростником, возле водоемов, на опушках леса. Отлов их производят также возле животноводческих помещений или летних лагерей для животных.

Следует учитывать, что лет слепней наблюдается с конца мая до августа — сентября при температуре воздуха более 15°С. Особенно интенсивным лет слепней бывает в жаркие и безветренные дни. Умерщвленных в морилке слепней помещают в бумажные коробочки и в дальнейшем высушивают. Применять для консервации слепней спирт, эфир, хлороформ или другие жидкости не следует, так как потом невозможно определить их вид.

Оводов подкожных и желудочных также можно отлавливать с июня до сентября энтомологическим сачком в теплые безветренные дни, когда температура достигает 16—18°С и более. Полостных оводов овец собирают утром руками с помощью ловчего цилиндра или пробирками на стенах животноводческих помещений, на ограде или скирдах сена в безветренную солнечную погоду.

Личинок полостных оводов различных стадий развития можно извлечь из носовой полости животного с помощью различных лекарственных веществ. Для этой цели можно применять также марлевые тампоны, пропитанные смесью лизола и глицерина (1:50). Тампоны прикрепляют к эластичному пищеводному зонду и вводят в глубь носовой полости, проводя легкие продольные и круговые движения им. Некоторые личинки на тампоне оседают и их извлекают из носовой полости животного.

источник