Меню Рубрики

Методики анализа вода почва воздух

Микроорганизмы – мельчайшие, главным образом одноклеточные существа, широко распространенные в природе. Они обнаруживаются во всех средах (воздухе, почве, воде), в организме человека и животных, в растениях.

Качественное разнообразие и количество микроорганизмов зависят в первую очередь от питательных соединений. Однако немаловажное значение имеют также влажность, температурный режим, аэрация, действие солнечных лучей и прочие факторы.

Методы санитарно-микробиологического исследования природных сред позволяют выявить наличие патогенных микроорганизмов, определить их количество и, в соответствии с полученными результатами, выработать меры по устранению или предупреждению инфекционных заболеваний. Кроме того, количественный учет необходим для моделирования экосистем и разработке принципов управления естественными процессами. Рассмотрим далее, какими бывают методы микробиологического исследования .

Она рассматривается учеными как один из возможных путей передачи инфекционных патологий. С выделениями больных людей или животных в почву проникают патогенные микроорганизмы. Некоторые из них, в частности, споровые, способны сохраняться в грунте продолжительное время (иногда несколько десятков лет). В почву попадают возбудители таких опасных инфекций, как столбняк, сибирская язва, ботулизм и пр. Методы санитарно-микробиологического исследования почвы позволяют определить «микробное число» (кол-во микроорганизмов в грамме грунта), а также коли-индекс (количество кишечных палочек).

К методам микробиологического исследования почвы следует в первую очередь отнести прямое микроскопирование и посев на плотную питательную среду. Популяции микроорганизмов и их группы, населяющие грунт, различаются по таксономическому положению и экологическим функциям. В науке они объединены под общим термином «почвенная биота». Грунт – среда обитания огромного числа микроорганизмов. В грамме почвы присутствует от 1 до 10 млрд их клеток. В этой среде активно протекает разложение органических веществ при участии разнообразных сапрофитных микроорганизмов.

Анализ среды начинается с отбора образцов. Для этого используют предварительно очищенный и протертый спиртом нож (можно использовать лопату). После этого осуществляется подготовка образца. Следующий этап – подсчет клеток на окрашенных мазках. Рассмотрим каждую стадию в отдельности.

При анализе пахотной почвы, как правило, пробы берут с глубины всего слоя. Сначала удаляется 2-3 см сверху грунта, так как в нем может присутствовать посторонняя микрофлора. После этого с изучаемого участка грунта берут монолиты. Длина каждого из них должна соответствовать толщине слоя, из которого нужно взять образец.

На участке в 100-200 кв. м отбирается 7-10 проб. Вес каждой – порядка 0.5 кг. Пробы необходимо тщательно перемешать в мешке. После этого берут средний образец, весом приблизительно 1 кг. Его следует поместить в пергаментный (стерильный) пакет, вложенный в тканевый мешок. До непосредственного анализа образец хранится в холодильнике.

Перемешанная почва высыпается на сухое стекло. Предварительно его необходимо протереть спиртом и обжечь над горелкой. При помощи шпателя почва тщательно перемешивается и раскладывается ровным слоем. В обязательном порядке необходимо удалить корешки, прочие посторонние элементы. Для этого используется пинцет. Перед работой пинцет и шпатель прокаливают над горелкой и остужают.

Из различных участков почвы, распределенной по стеклу, отбираются небольшие порции. Их взвешивают в фарфоровой чашке на технических весах. Обязательным этапом микроскопического метода микробиологического исследования является специальная обработка образца. Заранее необходимо подготовить 2 стерильные колбы. Их емкость не должна превышать 250 мл. В одну из колб наливают 100 мл водопроводной воды. Из нее берут 0.4-0.8 мл жидкости и увлажняют навеску почвы до пастообразного состояния. Смесь необходимо растереть пальцем или резиновым пестиком в течение 5 мин.

Водой из первой колбы почвенную массу переносят в пустую колбу. Далее ее снова растирают. После этого масса переносится в колбу возле пламени горелки. Емкость с почвенной суспензией встряхивают на качалке на протяжении 5 мин. После этого ее оставляют отстаиваться около 30 с. Это необходимо для того, чтобы крупные частицы осели. Через полминуты массу используют для приготовления препарата.

Прямое микроскопическое изучение грунта осуществляется по методу микробиологического исследования , разработанному Виноградским. В определенном объеме приготовленной суспензии подсчитывается число клеток микроорганизмов. Изучение фиксированных мазков позволяет сохранять препараты в течение длительного срока и выполнять подсчеты в любое удобное время.

Приготовление препарата осуществляется следующим образом. Определенный объем суспензии (как правило, 0.02-0.05 мл) наносится с помощью микропипетки на предметное стекло. К нему добавляют каплю раствора агар-агара (смеси полисахаридов агаропектина и агарозы, извлеченных из бурых и красных водорослей Черного моря), быстро перемешивают и распределяют на площади 4-6 кв. см. Мазок высушивается на воздухе и фиксируется 20-30 мин. спиртом (96 %). Далее препарат увлажняют дистиллированной водой, помещают в р-р карболового эритрозина на 20-30 мин.

После окрашивания его промывают и высушивают на воздухе. Подсчет клеток осуществляется с иммерсионным объективом.

Микроскопические методы микробиологического исследования позволяют выявить большое количество микроорганизмов. Но, несмотря на это, метод посева считается наиболее распространенным в практике. Суть его состоит в высеве объема препарата (почвенной суспензии) в чашке Петри на плотную среду.

Этот метод микробиологического исследования позволяет учитывать не только количество, но и групповой, а в ряде случаев и видовой состав микроскопической флоры. Подсчет числа колоний производится, как правило, со дна чашки Петри в проходящем свете. На подсчитанном участке ставится точка маркером либо чернилами.

Микрофлора водного объекта, как правило, отражает микробный состав почвы около него. В этой связи методы санитарно-микробиологического исследования воды и почвы имеют особое практическое значение при изучении состояния конкретной экосистемы. В пресных водоемах содержатся, как правило, кокки, палочковидные бактерии.

Анаэробы в воде обнаруживаются в малом количестве. Как правило, они размножаются на дне водоемов, в иле, принимая участие в процессах очищения. Микрофлора океанов и морей представлена преимущественно солелюбивыми (галофильными) бактериями.

В воде артезианских скважин микроорганизмов практически нет. Это обуславливается фильтрующей способностью почвенного слоя.

Общепринятыми методами микробиологического исследования воды считаются определение микробного числа и коли-титра либо коли-индекса. Первый показатель характеризует количество бактерий в 1 мл жидкости. Коли-индекс представляет собой количество кишечных палочек, присутствующих в литре воды, а коли-титр – минимальное количество или максимальное разведение жидкости, в котором их еще можно обнаружить.

Этот метод санитарно микробиологического исследования воды состоит в следующем. В 1 мл воды определяют количество факультативных анаэробов и мезофильных (промежуточных) аэробов, способных на мясопептонном агаре (основной питательной среде) при 37 град. на протяжении суток формировать колонии, видимые при увеличении в 2-5 р. или невооруженным глазом.

Ключевой стадией рассматриваемого метода микробиологического исследования воды является посев. Из каждой пробы делается посев не менее 2-х разных объемов. При анализе водопроводной воды в каждую чашку вносят по 1-0.1 мл чистой жидкости и по 0.01-0.001 мл загрязненной. Для посева 0.1 мл или меньшего объема жидкость разводится дистиллированной (стерильной) водой. Последовательно готовят десятикратные разведения. По 1 мл от каждого из них вносят в две чашки Петри.

Разведения заливаются питательным агаром. Его необходимо предварительно растопить и остудить до 45 град. После активного перемешивания среду оставляют на горизонтальной поверхности для застывания. При 37 град. посевы выращивают на протяжении суток. Рассматриваемый метод микробиологического исследования воды позволяет учитывать результаты на тех чашках, где количество колоний находится в пределах от 30 до 300.

Он считается транзитной средой для микроорганизмов. Основными методами микробиологического исследования воздуха являются седиментация (оседание) и аспирация.

Микрофлора воздушной среды условно разделяется на переменную и постоянную. К первой относятся дрожжи, пигментообразующие кокки, спороносные бациллы, палочки и прочие микроорганизмы, устойчивые к высыханию, воздействию света. Представители переменной микрофлоры, проникая в воздух из привычной для них среды обитания, недолго сохраняют свою жизнеспособность.

В воздухе крупных мегаполисов микроорганизмов намного больше, чем в воздушной среде сельской местности. Над морями, лесами бактерий очень мало. Очищению воздуха способствуют осадки: снег и дождь. В закрытых помещениях микробов намного больше, чем на открытых пространствах. Их количество повышается в зимний период при отсутствии регулярного проветривания.

Этот метод микробиологического исследования в микробиологии считается простейшим. Он основывается на оседании капель и частиц на поверхности агара в открытой чашке Петри под действием силы тяжести. Метод седиментации не позволяет точно определить число бактерий в воздухе. Дело в том, что на открытой чашке уловить мелкие фракции пылевых частиц и бактериальных капель довольно сложно. На поверхности задерживаются преимущественно крупные частицы.

Этот метод не используется при анализе атмосферного воздуха. Этой среде свойственны большие колебания скорости движения воздушных потоков. Седиментация, однако, может использоваться при отсутствии более совершенных приборов или источника электроэнергии.

Определение микробного числа осуществляется по методу Омелянского. В соответствии с ним, за 5 минут на поверхности агара площадью 100 кв. см оседает такое число бактерий, которое присутствует в 10 л воздуха.

Бактериологический анализ занимает важнейшее место в комплексе клинико-лабораторных мероприятий, направленных на диагностику, профилактику и лечение разнообразных инфекционных заболеваний. Однако исследованием окружающей среды они не ограничиваются.

Особое значение имеет бактериологический анализ биологического материала в лечебных учреждениях. К исследованиям, проводимым в медучреждениях, предъявляются повышенные требования. Целью Приказа «Об унификации микробиологических методов исследования» является совершенствование бактериологического анализа, повышение качества и эффективности микробиологической диагностики.

Оно является ключевым методом анализа при диагностике инфекций, передающихся половым путем, и оппортунистических заболеваний (вызываемых условно-патогенными бактериями).

Микроскопический анализ позволяет оценить качественный и количественный состав микрофлоры, проверить правильность взятия пробы. К примеру, наличие вагинального эпителия в мазке, взятом из цервикального канала, указывает на нарушение правил отбора биологической пробы.

Стоит сказать, что микробиологическое обследование в данном случае вообще сопровождается определенными проблемами. Они связаны с тем, что в нижних отделах полового тракта в норме присутствует разнообразная микрофлора, изменяющаяся в различные возрастные периоды. Для повышения эффективности исследования и были разработаны унифицированные правила.

Она осуществляется методами выявления РНК и ДНК-возбудителей. Они базируются преимущественно на определении нуклеотидных последовательностей в патологическом материале. Для этого используются молекулярные зонды. Они представляют собой искусственно полученные нуклеиновые кислоты, комплементарные (дополняющие) вирусным кислотам, меченные радиоактивной меткой или биотином.

Особенность метода состоит в многократном копировании конкретного фрагмента ДНК, включающего в себя несколько сотен (или десятков) нуклеотидных пар. Механизм репликации (копирования) заключается в том, что достраивание может начаться исключительно в определенных блоках. Для их создания используются праймеры (затравки). Они представляют собой синтезированные олигонуклеотиды.

ПЦР-диагностика (полимеразная цепная реакция) проста в исполнении. Этот метод позволяет быстро получить результат при использовании небольшого объема патологического материала. С помощью ПЦР-диагностики выявляются острые, хронические и латентные (скрытые) инфекции.

При чувствительности этот метод считается более предпочтительным. Однако в настоящее время тест-системы недостаточно надежны, поэтому ПЦР-диагностика не может полностью заменить традиционные методики.

источник

Цель занятия.Ознакомить студентов с основными методами и показателями, необходимыми для санитарно-микробиологической оценки объектов внешней среды.

Оборудование и материалы. Прибор для подсчета колоний, колбы с пробами воды, бактериологические пробирки с 9 мл воды, пробирки с 10 мл расплавленного агара, мерные стериль­ные пипетки на 2 мл, стерильные чашки Петри, чашки Петри с МПА, чашки Петри с кровяным МПА, навески почвы, стериль­ная водопроводная вода в колбе — 270 мл, пробирки со средой Кесслера, Вильсона—Блера.

Для оценки санитарно-гигиенического состояния объектов окружающей среды проводят санитарно-бактериологические ис­следования, цель которых состоит в определении эпизоотологической и эпидемиологической безопасности. Показателем небла­гополучия служит выявление патогенных микроорганизмов. Од­нако прямое их обнаружение связано с большими трудностями, и прежде всего с низкой концентрацией данных микробов, кото­рые в основном не могут размножаться в воде, воздухе и почве. Поэтому в санитарно-микробиологической практике используют косвенные методы, направленные на определение микробной обсемененности объекта и обнаружение в нем так называемых санитарно-показательных бактерий. О бактериальной обсеме­ненности судят по микробному числу — общему коли­честву микроорганизмов, содержащихся в единице объема или массы (1 мл воды, 1 г почвы, 1 м 3 воздуха).

Содержание санитарно-показательных бактерий определяют по двум показателям: титру и индексу. Титром называют минимальный объем или массу, в которых выявляют данные бактерии, индексом — количество санитарно-показательных бактерий, содержащихся в соответствующем количестве среды.

К санитарно-показательным бактериям относят представи­телей облигатной микрофлоры организма человека и тепло­кровных животных, для которых среда обитания — кишечник или воздушно-дыхательные пути. Они характеризуются следую­щими свойствами: 1) постоянно выделяются с калом или ка­пельками слизи из воздушно-дыхательных путей; 2) не имеют других мест обитания; 3) способны сохраняться в окружающей среде то же время, что и патогенные бактерии, паразитирующие в кишечнике или воздушно-дыхательных путях; 4) не способны интенсивно размножаться вне организма хозяина и изменять свои свойства.

Перечисленные признаки присущи бактериям, признанным санитарно-показательными для различных объектов окружаю­щей среды.

Санитарно-показательные бактерии группы кишечных пало­чек принадлежат к различным родам семейства энтеробактерий.

Обнаружение кишечной палочки в разных объектах окружаю­щей среды считают наиболее достоверным признаком свежего фекального загрязнения. Наличие в этих же объектах бактерий родов Citrobacter и Enterobacter указывает на относительно давнее фекальное загрязнение.

Присутствие С. perfringens, С. sporogenes и других клостридий в почве свидетельствует о ее фекальном загрязнении, причем как свежем, так и давнем, поскольку эти бактерии образуют споры, что позволяет им длительно переживать в окружающей среде (в частности, в почве).

Обнаружение в объектах окружающей среды Streptococcus faecalis также свидетельствует об их фекальном загрязнении. Рез­кое увеличение количества этих бактерий в саморазогревающем­ся навозе и компостах может свидетельствовать о загрязнении почвы разлагающимися отбросами.

Гемолитические стрептококки, будучи облигатными обитате­лями носоглотки и зева, выделяются с капельками слизи ораль­но-капельным путем. Сроки выживания гемолитических стреп­тококков в окружающей среде практически не отличаются от сроков, характерных для большинства других возбудителей воз­душно-капельных инфекций. Обнаружение гемолитических стрептококков в воздухе помещений указывает на возможное его загрязнение микроорганизмами, содержащимися в зеве, носо­глотке, верхних дыхательных путях и вызывающими инфекции, передаваемые воздушно-капельным путем.

Staphylococcus aureus — также факультативный обитатель но­соглотки и зева. Его присутствие в воздухе помещений служит показателем орально-капельного загрязнения.

Читайте также:  По анализу воды в ростове

Одновременное обнаружение золотистого стафилококка и ге­молитических стрептококков свидетельствует о высокой степени загрязнения воздуха.

Санитарно-микробиологическое исследование воды. Вода — ес­тественная среда обитания микробов, которые в большом коли­честве поступают из почвы, воздуха, с отбросами, стоками. Осо­бенно много микроорганизмов в открытых водоемах и реках. Кроме сапрофитов в воде могут находиться возбудители инфек­ций животных и человека.

При контроле санитарного состояния воды исследованию подлежат: вода централизованного водоснабжения, колодцев, открытых водоемов (реки, озера), плавательных бассейнов, сточ­ные жидкости.

Отбор проб воды. Из открытых водоемов пробы воды отбира­ют с глубины 10. 15 см от поверхности и на расстоянии 10. 15 см от дна. Водопроводную воду набирают в стерильные флаконы объемом 0,5 л с притертой пробкой. Предварительно кран обжи­гают и спускают воду в течение 10. 15 мин. Хлорированную воду перед исследованием нейтрализуют тиосульфатом натрия из рас­чета 10 мл на 1л воды. Бактериологическое исследование проб воды следует проводить в течение двух часов после отбора или шести часов при температуре хранения 1. 5°С.

Определение микробного числа воды. Водопроводную воду засе­вают в количестве 1мл, воду открытых водоемов — по 1,0; 0,1; 0,01 мл. Все пробы вносят в стерильные чашки Петри, после чего их заливают 10. 12 мл расплавленного и охлажденного до 40. 45 °С питательного агара, который тщательно перемешивают с водой. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 1. 2сут. Воду из открытых водоемов засевают параллельно на две серии чашек, одну из которых инкубируют при 37 ºС в течение суток, другую — 2 сут при 20 °С. Затем подсчитывают количество выросших на поверхности и в глубине колоний и вычисляют микробное число воды — количество микроорганизмов в 1 мл.

Определение коли-титра и коли-индекса воды. Минимальное количество воды в мл, в котором обнаруживают бактерии группы кишечных палочек (БГКП), называют коли-титром воды, количество БГКП, содержащихся в 1л исследуемой воды, называют кол и-и ндексом воды. Коли-титр и коли-индекс воды определяют титрационным (бродильным) ме­тодом или методом мембранных фильтров.

Титрационный метод. В глюкозо-пептонную среду (1%-я пептонная вода, 0,5%-й раствор хлорида натрия, 0,5%-й раствор глюкозы, индикатор Андреде и поплавок) проводят посевы различных объемов воды.

Воду открытых водоемов исследуют в объемах 100; 10; 1 и 0,1 мл. Для анализа водопроводной воды делают посевы трех объемов по 100 мл, трех объемов по 10 мл и трех объемов по 1 мл. Посевы инкубируют при 37 °С в течение суток. О брожении судят по образованию пузырьков газа в поплавке. Из забродивших или помутневших проб делают посевы на среду Эндо. Из выросших колоний готовят мазки, окрашивают по Граму и ставят оксидазный тест, с помощью которого дифференцируют бактерии родов Escherichia, Citrobacter и Enterobacter от грамотрицательных бак­терий семейства Pseudomonadaceae и других оксидазоположительных бактерий, обитающих в воде. С этой целью 2. 3 изоли­рованные колонии наносят «штрихом» на фильтровальную бума­гу, смоченную диметил-n-фенилендиамином. При отрицатель­ном оксидазном тесте цвет бумаги не изменяется, при положительном она окрашивается в синий цвет в течение 1 мин. Грамотрицательные палочки, не образующие оксидазу, вновь ис­следуют в бродильном тесте — вносят в полужидкий питатель­ный агар с 0,5 % глюкозы и инкубируют при 37 °С в течение су­ток. При положительном результате определяют коли-титр и коли-индекс по статистической таблице.

Метод мембранных фильтров. Определенный объем воды про­пускают под давлением через мембранный фильтр № 3, предва­рительно стерилизованный кипячением в дистиллированной воде. Водопроводную воду и воду артезианских скважин фильт­руют в объеме 333 мл. Чистую воду открытых водоемов фильтру­ют в объеме 100, 10, 1 и 0,1 мл, более загрязненную воду перед фильтрованием разводят стерильной водой. Фильтры накладыва­ют на агар Эндо в чашки Петри и после инкубации при 37 °С в течение суток подсчитывают количество выросших красных колоний. Из двух-трех колоний делают мазки, окрашивают их по Граму и ставят оксидазный тест. Грамотрицательные палочки, не образующие оксидазу, принадлежат к БГКП. По существующим нормативам (ГОСТ 2874—82) питьевую воду считают качествен­ной, если ее коли-индекс не более 3, а микробное число — не бо­лее 100.

Общепринятым дополнительным показателем фекального загрязнения воды служит количество S.faecalis. Для определе­ния его титра цельную воду и ее 10-кратные разведения засева­ют в жидкую элективную среду (щелочная полимиксиновая сре­да). После инкубирования при 37 ºС в течение двух суток, а за­тем еще через сутки и двое суток делают высевы на плотные элективные среды. Фекальные стрептококки идентифицируют по морфологическим, культуральным и тинкториальным свой­ствам.

Есть данные о корреляции между содержанием в воде фекаль­ных кишечных палочек и фагами бактерий группы кишечных па­лочек. Поэтому определение данных фагов служит косвенным показателем возможного присутствия кишечных палочек в ис­следуемой пробе воды.

Санитарно-микробиологическое исследование воздуха. Мик­рофлора воздуха зависит от микрофлоры почвы и воды. Воз­дух — неблагоприятная среда для обитания микроорганизмов из-за отсутствия питательных веществ, действия солнечных лучей, высушивания. Наряду с сапрофитами в воздухе могут находиться патогенные бактерии, споры грибов родов Aspergillus, Mucor и др.

Санитарную оценку воздуха осуществляют по двум показате­лям: 1) определение микробного числа воздуха; 2) определение количества санитарно-показательных бактерий — гемолитичес­ких стрептококков и стафилококков.

Количественные микробиологические методы исследования воздуха основаны на принципах осаждения (седиментации), ас­пирации или фильтрации.

Седиментационный метод осаждения Коха. Чашки Петри с МПА оставляют открытыми на 5. 10 мин. Для определения са­нитарно-показательных бактерий берут чашки Петри с кровя­ным МПА и время экспозиции увеличивают до 40 мин. Чашки выдерживают при 37 °С и комнатной температуре 24 ч и подсчи­тывают выросшие колонии.

Микробное число воздуха (общее количество бактерий в 1 м3) определяют по формуле Омелянского

Х= а * 100 * 1000 * 5 / (b * 10 * T),

где X— количество микробов в 1 м 3 (1000 л) воздуха; а — количество выросших ко­лоний в чашках; b — площадь чашки; Т— время, в течение которого чашка была открыта; 5 — время по правилу Омелянского; 10 — объем воздуха в литрах. (Прави­ло Омелянского предусматривает, что на поверхности агара в чашке Петри площа­дью 100 см 3 за 5 мин из воздуха оседает такое количество микробов, которое нахо­дится в его 10 л.)

Прямое обнаружение патогенных микробов воздуха проводят только при специальных показаниях.

Аспирационный метод. Более точный количественный способ определения микробного числа воздуха, так как посев микроор­ганизмов из воздуха производят с помощью приборов. При использовании аппарата Кротова воздух с заданной скоростью за­сасывается через щель плексигласовой пластины и ударяется о поверхность питательной среды открытой чашки Петри, находя­щейся на вращающейся подставке, благодаря чему происходит равномерный посев бактерий из воздуха на поверхность МПА (при определении микробного числа) или кровяного МПА (при выделении гемолитических стафилококков и стрептококков). После инкубации в термостате в течение двух суток подсчитыва­ют количество выросших колоний и определяют микробное чис­ло воздуха. При исследовании воздуха могут быть использованы и другие приборы (Дьякова, Киктенко, ПАБ-1 — прибор аэро­зольный бактериологический и ПОВ-1 — прибор для отбора воз­духа). В практику входят ускоренные методы индикации микро­флоры воздуха с помощью мембранных фильтров, каскадных им-пакторов, фильтров Петрякова и др.

Санитарно-микробиологическое исследование почвы. Анализ почвы включает в себя определение микробного числа, коли-тит-ра, перфрингенс-титра и титра термофильных бактерий. По эпи­демиологическим признакам проводят определение в почве па­тогенных микроорганизмов: сальмонелл, шигелл, возбудителей столбняка, ботулизма, злокачественного отека, сибирской язвы. Бактериологический анализ почвы нужен при выборе террито­рии под пастбище, ферму, хозяйственные постройки, детские сады, больницы и др.

Предварительно делают отбор проб почвы. На обследуемой территории площадью до 1000 м 3 выделяют два участка по 25 м 3 (один — вблизи источника загрязнения, другой — в отдалении от него), берут пробы из 5 точек (4 — по углам участка, 1 — в цент­ре) на глубине 10. 20 см стерильным совком (из более глубоких мест — с помощью специального бура Некрасова или Френкеля). Пробы почвы по 200. 300 г отбирают в широкогорлые стеклян­ные банки с ватными пробками (можно все взятые с одного уча­стка пробы перемешать и на исследование направить 1 кг). На банки наклеивают этикетки, отправляют с нарочным и сопрово­дительным письмом. Пробы почвы полагается исследовать сразу же или в течение 6. 18 ч, сохраняя их при температуре не выше 1. 5ºС.

В лаборатории почву измельчают, освобождают от камней, ос­колков стекол, корней растений, просеивают через сито, тща­тельно перемешивают и отвешивают 30 г. В колбу на 500 мл наливают 270 мл стерильной водопроводной воды и вносят в нее отвешенную пробу почвы, все интенсивно встряхивают 10 мин, не давая отстояться частицам суспензии, готовят серию десятикратных последовательных разведений. Для относительно чис­тых почв достаточно 4 степени разведения, для загрязненных — 6. 9 разведений. В штатив ставят нумерованные пробирки с 9 мл стерильной воды в каждой. В первую вносят 1 мл суспензии про­бы почвы, смешивают, затем 1 мл из первой пробирки вносят во вторую, смешивают, из нее — 1 мл в третью и т. д. В результате в пробирке № 1 получается разведение 1 : 100, № 2 — 1 : 1000 и т.д. Подготовленные таким образом пробы почвы исследуют.

Определение общего микробного числа. Из последних 3. 4 про­бирок с разведенной суспензией отдельными стерильными пи­петками вносят по 1 мл в стерильные чашки Петри (каждое раз­ведение в отдельности). В каждую чашку добавляют еще по 10. 15 мл расплавленного и охлажденного до 45 ºС МПА. Равно­мерными осторожными круговыми движениями содержимое ча­шек перемешивают, оставляют на столе для уплотнения (затвердения) агара. С застывшей средой чашки перевертывают вверх дном, надписывают и помещают в термостат для культивирова­ния на 24. 48 ч при 37 °С. Выросшие колонии подсчитывают в каждой чашке, умножают на степень разведения, полученные числа суммируют и вычисляют среднеарифметическое число, что составит количество микробов, содержащихся в 1 г почвы.

Определение коли-титра, перфрингенс-титра и титра термо­фильных бактерий почвы. Для определения коли-титра почвы раз­личные разведения почвенной взвеси засевают по 1 мл в пробир­ки со средой Кесслера (на 1л дистиллированной воды — 10г пептона, 50 мл бычьей желчи — 2,5 г лактозы, 4 мл 1%-го водного раствора генцианвиолета) и инкубируют при 43 ºС в течение 48 ч. В дальнейшем исследования проводят по схеме, применяемой при определении коли-титра воды. Наибольшее разведение поч­венной суспензии, в котором отмечена ферментация лактозы (газообразование), соответствует коли-титру почвы. Для опреде­ления перфрингенс-титра почвы различные разведения почвен­ной суспензии по 1 мл засевают в пробирки со стерильным обез­жиренным молоком или железосульфитной средой Вильсона— Блера, приготовленной ex tempore. Посевы инкубируют при 43 °С в течение 24. 48 ч, после чего учитывают результаты по сверты­ванию молока или по образованию черных колоний С. perfringens в агаровом столбике среды Вильсона—Блера. Из колоний делают мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют и вычисляют перфрингенс-титр, который соответствует наибольшему разведе­нию почвы, вызвавшему почернение и разрыв среды Вильсона— Блера в первые 12 ч роста.

Для определения титра термофильных бактерий разведения почвенной суспензии по 1 мл вносят в чашки Петри, заливают расплавленным и охлажденным агаром. Посевы инкубируют в течение суток при 60 ºС, а затем подсчитывают количество вы­росших колоний и пересчитывают на 1 г почвы.

Санитарно-микробиологическую оценку почвы проводят по комплексу показателей, из которых наиболее важный ление степени фекального загрязнения.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Определить микробное загрязнение воздуха.

2. Провести исследование воды с целью установления мик­робного числа и коли-титра.

3. Определить микробное число и перфрингенс-титр почвы.

1. Что такое санитарно-показательные микроорганизмы?

2. Как определяют коли-титр воды?

3. Как определяют микробное число почвы?

4. Как определяют перфрингенс-титр почвы?

5. Какие методы применяют для определения микробного числа воздуха?

6. Что такое санитарно-показательные микробы воздуха и как их определяют?

193.124.117.139 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.

Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)

очень нужно

источник

Вода может быть фактором распространения таких инфекционных заболеваний как холера, брюшной тиф, паратифы, дизентерия, гепатит А, полиомиелит, лептоспироз, сибирская язва, туляремия, туберкулез, Q-лихорадка, грибковые заболевания. В основном вода загрязняется через сточные воды.

Непосредственное определение в воде патогенных микробов очень трудоемко, поэтому сначала определяют наличие СПМ, а затем определяют патогенных возбудителей.

Безопастность воды в эпидемическом отношении определяется ее соответствием нормативам по следующим индикаторным показателям для:

питьевой воды централизованного водоснабжения – термотолерантным колиформным бактериям общим колиформным бактериям, общему микробному числу, колифагам, спорам сульфитредуцирующих клостридий (Сан Пин 10-124 РБ 99 «Питьевая вода. Гигиенические к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества»);

воды басейнов – общим колиформным бактериям, колифагам, термотолерантным колифорным бактериям, синегнойной палочке, золотистому стафилококку, отсутствию возбудителей кишечных инфекций (Сан Пин 2.1.2 10-39-2002 «Гигиенические требования к устройству, эксплуатации и качеству воды плавательных бассейнов»);

требования к качеству воды при нецентрализованном водоснабжении. Санитарная охрана источников (Сан Пин 8-83-98 РБ-98);

методы санитарно-микробиологического анализа питьевой воды. Методические указания (МУК 4.2. 671-97).

Санитарно-показательными микробами для воды считают бактерии группы кишечной палочки – колиформные бактерии. Под этим общим названием объединяют бактерии семейства Enterobacteriaceae, родов Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella. Это грамотрицательные, не образующие спор и не обладающие оксидазной активностью палочки, ферментирующие глюкозу и лактозу и маннит до кислоты и газа при 37°С в течение 24 часов. Данные бактерии выделяются во внешнюю среду с испражнениями человека и теплокровных организмов.

Среди колиформных микроорганизмов выделяют группу термотолерантных бактерий, которые ферментируют лактозу при 44°С в течение 24 ч. Эти бактерии являются показателями свежего фекального загрязнения.

Санитарные показатели воды:

1. Общее микробное число – количество мезофильных хемоорганотрофных бактерий в 1 мл воды, способных образовывать колонии на питательном агаре при температуре 37 о С в течение 24 часов. Согласно санитарных правил и норм оно не должно превышать 50 колониеобразующих единиц (КОЕ) бактерий в 1 см 3 воды.

Читайте также:  По равнине вод лазурной анализ

2.Термотолерантные колиформные бактерии – оценивается число термотолерантных колиформных бактерий в 100 см 3 воды, по нормативам в 300 мл исследованной воды они должны отсутствовать.

3.Общие колиформные бактерии – оценивается число общих колиформных бактерий в 100 см 3 воды, по нормативам в 300 мл исследованной воды они также должны отсутствовать.

Это основные показатели, которые определяют при микробиологическом контроле качества питьевой воды. По эпидемиологическим показаниям и при производственном контроле качества питьевой воды оценивают также количество колифагов, которые являются косвенными показателями присутствия в воде энтеровирусов, спор сульфитредуцирующих клостридий (С. perfringens), цист лямблий (все они в норме в исследуемой питьевой воде не должны быть обнаружены).

Отбор проб воды для санитарно-бактериологических исследований.Цель исследований – определение состава и свойств воды по показателям, регламинтированным в нормативных документах, определение источников загрязнения водного объекта, установление программы исследований, принятие соответствующих мер.

Пробы воды для бактериологического исследования отбирают в стерильную посуду, после наполнения емкость закрывают стерильной пробкой, обеспечивающей герметичность. Пробу воды отбирают непосредственно из крана без резиновых шлангов, водораспределительных сеток и других насадок. Объем воды зависит от того, какие микроорганизмы должны быть определены:

при анализе воды на индикаторные микроорганизмы – не менее 500 см 3 ;

при анализе воды на индикаторные и патогенные микроорганизмы (сальмонеллы, шигеллы) – 300 см 3 .

Отобранную пробу маркируют, прикрепляют этикетки к емкости, составляется акт об отборе проб воды с указанием расположением и наименованием места отбора проб, даты отбора, метода отбора, времени отбора, климатических условий окружающей среды при отборе проб, температуре воды, должности и фамилии исполнителя.

В лабораторию пробы питьевой воды доставляют в контейнерах-холодильниках при температуре 4-10 0 С. Время начала исследований от момента отбора проб не должно превышать 6 часов, если пробы нельзя охладить, то их анализ проводят в течение 2 часов после забора пробы.

Определение общего числа микроорганизмов, образующих колонии на питательном агаре.Из каждой пробы производят посев не менее двух объемов по 1 мл, далее вносят по 1мл воды в стерильные чашки Петри и прибавляют в каждую чашку по 8-12 мл расплавленного и остуженного до 45 0 С питательного агара. Содержимое чашек быстро и равномерно смешивают, избегая образования пузырьков воздуха и попадания агара на края и крышку чашки. Чашки с застывшим агаром инкубируют; учитывают только те из них, на которых выросли не более 300 изолированных колоний. Результат выражают числом KOЕ в 1 мл исследуемой пробы воды.

Термотолерантные и общие колиформные бактерии оценивают методом мембранной фильтрации или титрационным методом.

Метод мембранной фильтрации. Берут объем воды равный 300 мл и фильтруют по 100 мл через разные стерильные нитроцеллюлозные фильтры фильтры (используются микрофильтрационные установки с диаметром фильтрующей поверхности 35 или 47 мм и вакуумным насосом для создания разрежения 0,5-1 атм), которые затем накладывают на поверхность дифференциальной диагностической среды Эндо. Подсчитывают количество красных лактозоположительных колоний на среде Эндо, готовят из колоний мазки, окрашивают по Граму в поисках грамотрицательных палочек, определяют оксидазный тест, который должен быть у энтеробактерий отрицательным.

Затем пересевают колонии с грамотрицательными палочками и отрицательным оксидазным тестом на полужидкую среду с лактозой (маннитом, глюкозой) и инкубируют в термостате при 37°С в течение 24 часов для определения количества общих колиформных бактерий. Для определения термотолерантных колиформных бактерий посев производят в среду, подогретую до 44 о С, и инкубируют в термостате при 44 о С в течение 24 часов.

Колонии учитывают как общие колиформные бактерии при отрицательном оксидазном тесте, ферментации лактозы или маннита (глюкозы) при 37 о С с образованием кислоты и газа.

Колонии учитывают как термотолерантные колиформные бактерии при отрицательном оксидазном тесте и ферментации лактозы или маннита (глюкозы) при 44 о С с образованием кислоты и газа.

Титрационный метод. Его обычно используют для качественной оценки питьевой воды при невозможности применения метода мембранной фильтрации или при наличии в воде большого количества взвешенных веществ. Объем воды 300 мл разделяют на 3 объема по 100 мл, засевают эти пробы на лактозопептонную среду и инкубируют при 37 о С в течение 24-48 часов. При наличии роста делают пересев из этих объемов на среду Эндо, далее лактозоположительные колонии идентифицируют как в предыдущем методе. Количество колиформных бактерий в этом методе определяют по специальным таблицам.

Определение спор сульфитредуцирующих клостридий методом мембранной фильтрации. Сульфитредуцирующие клостридии (в основном это Clostridium perfringens) – палочки, грамположительные, строгие анаэробы, имеющие спору и редуцирующие сульфит натрия при температуре 44 0 С в течение 24 часов на железо-сульфитном агаре.

Метод основан на фильтровании 20 мл воды через мембранные фильтры, помещении их в горячий железо-сульфитный агар, сразу же после посева пробирку с агаром и фильтром для создания анаэробных условий быстро охлаждают, культивируют посевы при температуре 44 0 С в течение 24 часов. При учете результатов подсчитывают черные изолированные колонии, выросшие как на фильтрах, так и в толще питательной среды. Результат анализа выражают числом колонийобразующих единиц (КОЭ) спор сульфитредуциирующих клостридий в 20 мл воды.

Определение колифаговпроизводят титрационным и прямым методами. Колифаги способны лизировать E. coli (используется эталонная тест-культура E. coli К12 Str R ) при температуре 37 0 С и образовывать через 18-20 часов на питательном агаре зоны лизиса.

Принцип метода основан на предварительном подращивании колифагов в среде обогащения в присутствии E. coli и образовании бляшек колифага на газоне E. coli на питательном агаре. Определение наиболее вероятного числа колифагов производят по специальной таблице.

Санитарно–бактериологическое исследование воздухаи безопастность воздуха в эпидемиологическом отношении определяется соответствием его нормативам (Сан Пин 2.1.6. 9-18-2002 «Гигиенические требования к охране атмосферного воздуха населенных пунктов»).Методы микробиологического исследования воздухаподразделяют на седиментационные и аспирационные. Наиболее простым является седиментационный метод Коха: стерильные чашки Петри с плотной питательной средой открывают в местах отбора проб воздуха и выдерживают в течение определенного времени (5-30 мин), после чего закрывают и термостатируют. По количеству выросших колоний подсчитывают микробное число воздуха. Для определения патогенных стафилококков берут чашки с желточно-солевым агаром и выдерживают 15 минут, для определения стрептококков используют чашки с кровяным агаром, для определения плесневых и дрожжевых грибов – среду Сабуро, для определения грамотрицательных неферментирующих бактерий – чашки с МПА или ЦПХ-агаром, выдерживают открытыми 2 часа. После экспозиции чашки закрывают, переворачивают, помещают в термостат и инкубируют при температуре 37 0 С в течение 24 часов. После инкубации проводят учет количества выросших колоний микроорганизмов и при необходимости проводят идентификацию до рода и вида. Наиболее точными являются аспирационные методы исследования воздуха, основанные на фильтрации или аспирации (просасывании) воздуха через специальные фильтры, жидкости, порошки, адсорбирующие микрофлору.

Отбор проб воздуха в помещениях стационара производят на уровне дыхания лежащего больного или на высоте рабочего стола.

Количество микробов в воздухе варьирует в широких диапазонах – от нескольких бактерий до десятков тысяч в 1 м 3 . В 1 г пыли может содержаться до 1млн бактерий. Большое значение имеет чистота воздуха в операционных, реанимационных и перевязочных отделениях хирургического стационара. Общее количество микробов в операционных до операции не должно превышать 500 в 1 м 3 , а после операции – 100 в 1 м 3 .

Санитарно–бактериологическое исследование почвывключает определение микробного числа и содержания санитарно-показательных микроорганизмов почвы.

Гигиеническая оценка почвы населенных мест проводится согласно инструкции 2.1.7. 11-12-5-2004.

Оценка санитарного состояния почвы проводится по результатам анализов почв на объектах повышенного риска (детские сады, игровые площадки, зоны санитарной охраны) и в санитарно-защитных зонах по следующим показателям – санитарно-показательные микроорганизмы бактерий группы кишечной палочки (БГКП) – общие колиформные бактерии, фекальные энтерококки. На свежее фекальное загрязнение почвы указывает наличие высокого индекса БГКП при низких титрах нитрофикаторов, термофилов и высоком содержании вегетативных форм Clostridium perfringens. Обнаружение энтерококков свидетельствует о свежем фекальном загрязнении.

Обнаружение возбудителей кишечных инфекций, патогенных энтеробактерий и энтеровирусов свидетельствует об эпидемической опасности почвы.

Почву оценивают как чистую при отсутствии патогенных бактерий и индексе санитпрно-показательных микроорганизмов до 10 клеток на 1 г почвы.

При загрязнении почвы сальмонеллами индекс санитарно-показательных микроорганизмов БГКП и энтерококков достигает 10 клеток на 1 г почвы и более.

Концентрация колифага в почве на уровне 10 БОЕ/г свидетельствует о загрязнении почвы.

Отбор проб для бактериологического анализа проводится не реже 1 раза в год в местах возможного нахождения людей, животных, в местах загрязения органическими отходами.

Образец почвы тщательно перемешивают, из него отбирают навески, величины которых вибирают исходя из предполагаемой степени загрязнения почвы и планируемых определений. Для учета почвенных микроорганизмов достаточно навески от 1 до 10 г. Первое разведение навески почвы (1:10) делают в стерильной посуде на стерильной водопроводной воде. После приготовления разведений применяют соответствующую обработку почвы с целью извлечения клеток микроорганизмов из почвенных агрегатов при помощи 10-минутного вериткального встряхивания почвенной суспензии первого разведения в пробирках с резиновыми пробками. Почву разводят до 0,0001-0,00001 г/мл. приготовленные разведения используют для посева на различные питательные среды.

Микробное число почвы – это общее количество микроорганизмов, содержащихся в 1 г почвы.

По микробному числу почвы судят об общей численности в основном сапрофитных микроорганизмов, вырастающих на МПА и сусло-агаре; если же необходимо выделить определенные группы микроорганизмов (например, азотфиксирующие, разлагающие клетчатку, продуцирующие антибиотики, нитрифицирующие, некоторые патогенные и т.д.), используют специальные среды и методы посева.

Для определения коли-титра почвы используют элективные питательные среды, содержащие желчь и генциановый фиолетовый, подавляющие рост многочисленных микроорганизмов, населяющих почву, но не препятствующие росту кишечной палочки. Наиболее употребительной является жидкая среда Кесслера, которая, кроме вышеназванных компонентов, содержит пептон и лактозу, сбраживаемую E.сoli, для улавливания образовавшегося газа служат поплавок. После суточной инкубации посевов разведений почвы на среде Кесслера отбирают положительные пробы, в которых наблюдается обильное газообразование и диффузный рост, эти признаки характерны для развития E. coli, ферментирующей лактозу с образованием газа, скапливающегося в поплавке. Из отобранных посевов делают высевы на среду Эндо, инкубируют при 37°С 24 ч, отмечают характерные для E. coli темно-красные колонии с металлическим блеском, производят микроскопию и при наличии в мазках мелких грамотрицательных палочек делают вывод о присутствии E. coli.

Перфрингенс-титр почвы – наименьшее ее количество, выраженное в граммах, в котором содержится одна жизнеспособная клетка C. perfringens. Для определения C. perfringens в почве используют железо-сульфитный агар (среду Вильсона-Блера).

Перфрингенс-титр определяется максимальным разведением почвенной суспензии, при посеве которого развиваются характерные черные колонии. В некоторых случаях, кроме среды Вильсона-Блера, используют молочные среды (среду Тукаева). На этой среде C. perfringens энергично сбраживает лактозу, молоко быстро (в течение 3-4 ч) створаживается, образующийся газ разрывает сгустки казеина и вытесняет их в верхнюю часть пробирки. Наличие C. perfringens на средах Вильсона-Блера и Тукаева подтверждается микроскопически. В мазках, окрашенных по Граму, бациллы имеют вид крупных грамположительных палочек с прямыми концами, которые могут располагаться цепочками.

Присутствие в почве E. coli и Enterococcus faecalis указывает на свежее фекальное загрязнение; бактерии родов Citrobacter, Enterobacter и Clostridium perfringens – на давнее фекальное загрязнение. Высокая численность сапрофитной микрофлоры свидетельствует об органическом загрязнении.

Определение общих колиформных бактерий (ОКБ).При анализе почв, для которых предполагается невысокая степень фекального загрязнения, рекомендуется использовать титрационный метод. В качестве ускоренного метода для ана­лиза слабозагрязненных почв можно использовать метод мем­бранной фильтрации. При анализах проб с предполагаемой высокой степенью фекального загрязнения целесообразно про­водить прямой посев разведении суспензии на поверхность среды Эндо.

Титрационный метод. Из первого разведения почвенной сус­пензии (1:10), прошедшей предварительную обработку, сте­рильной пипеткой берут 10 мл, что соответствует 1 г почвы, и засевают во флаконы с 50 мл жидкой лактозо-пептонной среды или среды Кесслера. Посев меньших количеств (0,01 г; 0,001 г и т.д.) делают по 1 мл из соответст­вующих разведении почвенной суспензии в пробирки с 9 мл той же среды. Посевы инкубируют в течение 48 ч при 37±1 0 С. Через 24±2 ч инкубации проводят предварительную оценку посевов. При отсутствии газообразования и помутнения через 48 ч инкубации выдают отрицательный ответ.

При наличии в посевах признаков роста (помутнения и газообразования или только помутнения) производят высев на среду Эндо и инкубируют в течение 18—24 ч при температуре 37±1 0 С. При наличии роста на поверхности среды Эндо розо­вых или красных колоний, малиновых с металлическим блес­ком или без него проводят микроскопию колоний с последую­щей постановкой оксидазного теста.

Метод мембранной фильтрации. Метод основан на фильтра­ции установленного объема — 5-10 мл почвенной суспензии первого разведения (1:10). Метод фильтрации почвы через мембранные фильтры проводится так же, как и фильтрация воды.

После окончания фильтрования фильтр переносят, не пере­ворачивая его, на питательную среду Эндо с добавлением розоловой кислоты.

Под каждым фильтром на дне чашки делают надпись с указанием объема профильтрованной пробы, номера и даты посева.

Чашки с фильтрами ставят в термостат дном вверх и инку­бируют посевы при температуре 37±1 0 С в течение 24±2 ч.

Если на фильтрах обнаружен рост изолированных типичных лактозоположительных колоний: темно-красных, красных с металлическим блеском или без него или других подобною типа колоний с отпечатком на обратной стороне фильтра, подсчитывают число колоний каждого типа отдельно и подтверждают их принадлежность к ОКБ (наличие оксидазной активности, отношение к окраске по Граму, ферментация лактозы до кислоты и газа).

Читайте также:  По результатам анализа питьевой воды

Прямой поверхностный посев на агаризованные питательные среды. Посев почвенной суспензии в количестве 0,1 или 0,2 ми производят на поверхность среды Эндо шпателем. Посев при анализе сравнительно чистых почв производят из разведений от 1:10 до 1:1000, т.е. от 10 -1 до 10 -3 . При работе с загрязненными почвами обычно используют разведения до 10 -6 . Посевы выращивают в термостате при 37±1°С в течении 24 ч и проводят идентификацию выросших микроорганизмов аналогично тому, как изложено при описании титрационного метода и подсчета количества колиформных бактерий в 1 г почвы. Для этого среднее число колиформных колоний, выросших на чашке, умножают на степень десятикратного разведения. Ре­зультат выражают индексом.

Определение энтерококков.Энтерококки — грамположительные, не образующие каталазу кокки, слегка вытянутые, с заостренными концами, рас полагающиеся попарно или в виде коротких цепочек, реже одиночными кокками, полиморфны, при росте на жидких средах (лактозопептонная среда) и щелочная энтерококковая среда вызывают диффузное помутнение и образование осадка. Энтерококки определяют титрационным методом и методом мембранной фильтрации.

Титрациоиный метод. Из разведений почвенной суспензии, прошедшей предварительную обработку, стерильной пипеткой берут 10 мл и засевают во флаконы с 50 мл жидкой среды ЛПС или ЩЭС. Посевы инкубируют при температуре 37±0,5°С 24 ч. Из среды накопления, где отмечены признаки роста, производят высев петлей на одну из плотных питательных сред МИС, ЖСТ. Через 24-48 ч инкубации посевов при температуре 37±0.5 °С на молоч-но-ингибиторной среде отмечают наличие аспидно-черных, выпуклых, с металлическим блеском (Е. faecalis) или сероватых мелких, плоских колоний (Е. faecium). Подтверждают принад­лежность колоний к энтерококкам с помощью микроскопирования окрашенных по Граму мазков и постановкой каталазного теста.

Метод мембранных фильтров. Объем испытуемой пробы для посева выбирают с таким расчетом, чтобы не менее чем на двух фильтрах выросли изолированные колонии в количестве от 5 до 50.

Через мембранные фильтры профильтровывают два-три деся­тикратных объема испытуемой пробы. Фильтры с посевом поме­щают на азидную среду или среду ЖСТ и инкубируют при температуре 37±0,5 0 С в течение 24-48 ч.

На среде ЖСТ через 24-28 ч колонии энтерококков плоские крупные с ровными краями, белые или бледно-окрашенные с небольшим кремовым или розовым оттенком, а также мали­новые. Последние образованы Е. faecalis.

На азидной среде — колонии энтерококков выпуклые с ров­ными краями, розовые, светло-розовые, равномерно окрашен­ные или с темно-красным нечетко оформленным центром.

Все колонии, которые растут на азидной среде, можно от­нести к фекальным энтерококкам, имеющим индикаторное значение.

При обнаружении в мазках энтерококков подсчитывают число колоний на фильтрах, суммируют и делят на объем профильтрованной воды.

Определение колифагов.Для выявления колифагов исходную почвенную суспензию интенсивно встряхивают 10-15 мин на аппарате для встряхи­вания жидкости или вручную, центрифугируют при 4000 об/мин в течение 15 мин. Далее берут 10 мл надосадочной жид­кости, устанавливают рН 7,0, добавляют 1 мл хлороформа для освобождения воды от сопутствующей бактериальной флоры, интенсивно встряхивают и оставляют на 15 мин для осаждения хлороформа.

Обработанную исходную пробу почвы или другие последую­щие разведения засевают по 1 мл на поверхность двух чашек с 1,5% МПА (рецепт 93) и сверху наслаивают 3 мл расплав­ленного и остуженного до 45 0 С 1,5% МПА, содержащего 0,2 мл суточной или 0,4 мл 4-часовой бульонной культуры E.coli К12 Str R .

Для контроля культуры 0,1 мл смыва бактерий E.coli К12 Sti R (или 0,2 мл 4-часовой бульонной культуры) вносят в чашку Петри и заливают 1,5% питательным агаром. После застыва­ния чашки в перевернутом виде помещают в термостат на 18—24 ч при температуре 37±0,1 0 С.

Через 18—24 ч просматривают посевы в проходящем свете. Проба считается положительной при наличии полного лизиса, просветления нескольких бляшек или одной бляшки на чашке с пробой почвы при отсутствии зон лизиса на контрольной чашке.

Учет результатов. Подсчитывают число БОЕ на двух чашках, делят на 2 и умножают на степень разведения. Результат выражают количеством БОЕ в 1 г почвы.

Определение С. perfringens в почве.По 1 мл разведении почвы (до 1:10 6 ), прогретой при темпе ратуре 75±5 0 С в течение 20 мин для исключения вегетативным форм, вносят в два параллельных ряда пробирок. Затем по стенке пробирок, избегая образования пузырьков воздуха, наливают по 9-10 мл железосульфитный агар, приготовленный ex tempore и прогретый до 70-80 0 С. Для создания анаэробных условий роста пробирки быстро охлаждают, помещая в емкости с холодной водой. Посевы инкубируют при 44±1 0 С в течение 16—18 ч. При росте в среде черных крупных колоний (грамположительные, каталазоотрицательные) выдают положительный ответ о присутствии С. perfringens в 1 г почвы

Определение С. perfringens методом фильтрования в пробирках и в чашках Петри проводят аналогично исследованию питьевой воды.

Определение общей численности почвенных микроорганизмов (ОМЧ).Навеску почвы, используемой для приготовления первого разведения, доводят путем добавления небольшого количеств) стерильной водопроводной воды до пастообразного состояния, растирают в течение 5 мин. Затем готовят первое разведение (1:10), т.е. 10 1 почвы на стерильной водопроводной воде, после чего производят разведение суспензии обычным способом. Из каждого разведения делают посев не менее двух объемов по 0,1 или 0,2 мл на поверхность почвенного агара, разлитого в стерильные чашки Петри, и равномерно шпателем растирают посев по всей поверхности чашки. Термостатирование за сеянных чашек ведут при 28-30°С в течение 72 ч. При учете результатов количество колоний на обеих чашках подсчитывают и суммируют, делят на два и умножают на степень разведения.

источник

Мониторинг загрязнения окружающей природной среды. Лабораторный анализ атмосферного воздуха, природных вод, почвы (стр. 1 )

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27

Министерство образования и науки Краснодарского края

Государственное бюджетное профессиональное образовательное учреждение Краснодарского края

МОНИТОРИНГ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ.

ЛАБОРАТОРНЫЙ АНАЛИЗ АТМОСФЕРНОГО ВОЗДУХА, ПРИРОДНЫХ ВОД, ПОЧВЫ

по выполнению лабораторных работ для студентов специальности

02.02.01 Рациональное использование природохозяйственных комплексов

Мониторинг загрязнения окружающей природной среды. Лабораторный анализ атмосферного воздуха, природных вод, почвы: Учебно-методическое пособие по выполнению лабораторных работ для студентов специальностей 02.02.01 Рациональное использование природохозяйственных комплексов / , — Краснодар: ГБПОУ КК КТК, 2014. – 121 с.

В предлагаемом учебно-методическом пособии излагаются теоретические представления о современных методах определения загрязняющих веществ в окружающей природной среде, представлены современные экоаналитические методы определения приоритетных загрязнителей воды, воздуха и почвы, приводятся контрольные вопросы для самостоятельного изучения. Кроме того в пособии рассмотрены правила работы в аналитической лаборатории и порядок ведения лабораторного журнала. Это поможет студентам эффективно и грамотно организовать самостоятельную работу при изучении курса МДК.01.01 Мониторинг загрязнения окружающей природной среды.

Рассмотрено на заседании цикловой комиссии технологии и экологии 14.01.15 г., протокол № 5.

, к. х.н., преподаватель ГБПОУ КК КТК

1 Правила работы в аналитической лаборатории

2 Ведение лабораторного журнала

3 Определение загрязнителей в месте отбора (лабораторные работы №№ 1,2)

4 Лабораторный анализ атмосферного воздуха, осадков и снежного покрова (лабораторные работы №№ 3-12)

5 Лабораторный анализ природной, питьевой и сточной воды

(лабораторные работы №№ 13-29)

6 Лабораторный анализ почвы

(лабораторные работы №№ 30-35)

Мониторинг загрязняющих веществ в объектах окружающей среды давно уже стал насущной необходимостью, поскольку постоянно меняется не только качественный и количественный состав загрязнителей, но и неуклонно растёт их число. В воздухе, воде и почве аккумулируется не менее нескольких тысяч токсичных соединений (антропогенные выбросы и выбросы автотранспорта), определение которых в полном объёме является чрезвычайно проблематичным.

В некоторых странах определены списки приоритетных загрязнителей природной среды, которые для различных матриц (вода, почва, воздух и др.) содержат примерно 100-150 наиболее опасных загрязнителей, постоянно встречающихся в различных объектах окружающей среды. Их определение необходимо для оценки качества воздуха и воды и степени загрязнения почвы (оценка экологической ситуации), а также для постоянного контроля загрязнителей при функционировании систем очистки с целью выяснения динамики их роста (или снижения) и изучения возможных изменений (превращений) под действием различных факторов.

Такие списки есть в США и странах Европейского сообщества (ЕС), но в России пока ещё нет научнообоснованных (с точки зрения экологии, токсикологии, гигиены, клинической медицины и экоаналитики) перечней приоритетных загрязнителей для воды, воздуха или почвы, что затрудняет рутинный контроль за их содержанием в различных природных средах.

Проведение мониторинга природных объектов затрудняется тем, что в России стратегия экологического химического анализа, как правило, подразумевает определение индивидуальных загрязнителей по индивидуальным методикам, что практически невыполнимо, так как таких методик (по числу нормированных токсичных веществ в воздухе, воде, почве и биосредах) насчитывается в России более 7000, и их использование для этих целей предоставляется по меньшей мере абсурдным. В самом деле, трудно представить, как должен действовать аналитик-практик, определяя (например, в воде) по индивидуальной методике сначала бензол, затем толуол, ксилолы и т. д.

Такого рода анализы не имеют смысла, так как в воде (как и в других матрицах-воздухе, почве, донных осадках, твёрдых отходах и пр.) обычно присутствует целая группа органических загрязнителей одного класса: 20-30 алкилбензолов, столько же галогеноводородов и многих других органических соединений. В смеси загрязнителей из 100 и более компонентов невозможно за реальное время определить по индивидуальным методикам каждый из этих компонентов. По этой причине зарубежные методики давно уже ориентированы на одновременное определение целых классов органических соединений с использованием традиционных для экоаналитики методов идентификации и количественного анализа.

В настоящем пособии мы постарались наиболее полно представить современные экоаналитические методы определения приоритетных загрязнителей воды, воздуха и почвы, исходя из возможностей учебной лаборатории.

В руководстве приведены подробные инструкции по выполнению 35 лабораторных работ, а также контрольные вопросы к каждой из них. На лабораторные работы в соответствии с рабочей программой отводится 96 часов.

Перед проведением каждой лабораторной работы необходимо проработать соответствующий теоретический материал и ознакомиться с правилами безопасности труда при работе в лаборатории.

Все работы выполняются только в учебной лаборатории колледжа. По окончании работы следует оформить её и ответить на контрольные вопросы. К экзамену по курсу курса МДК.01.01 Мониторинг загрязнения окружающей природной среды допускаются только обучающиеся, выполнившие все лабораторные работы и защитившие их у преподавателя.

1 ПРАВИЛА РАБОТЫ В АНАЛИТИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ

При выполнении лабораторных работ студенту необходимо приобрести основные навыки по технике химического эксперимента, поэтому с начала работы необходимо усвоить правила, являющиеся общими для всех химических лабораторий.

Перед началом выполнения лабораторной работы необходимо полностью ознакомиться с методикой ее выполнения, составить план работы.

Во время работы необходимо поддерживать порядок и чистоту как на рабочем месте, так и в лаборатории.

Не загромождать рабочее место посторонними предметами (сумками, посудой, лишним оборудованием и т. д.)

Не загрязнять реактивы, не оставлять открытыми реактивные склянки.

Опыты, связанные с использованием веществ с резким запахом, выделением газов, дыма, проводить в вытяжном шкафу.

Экономно расходовать реактивы, воду, электроэнергию.

Пользоваться только исправным электрооборудованием.

По возможности следует экономить рабочее время, длительные операции выполнять параллельно с другими операциями.

После окончания работы вымыть посуду, убрать рабочее место, привести в порядок лабораторию. Выключить электроприборы и воду. Сдать рабочее место преподавателю.

2 ВЕДЕНИЕ ЛАБОРАТОРНОГО ЖУРНАЛА

Оформлять лабораторный журнал четко, кратко, по установленной форме. Все записи вести во время занятий непосредственно в лабораторный журнал, а не на отдельных листах.

Учитывая достаточную насыщенность лабораторного практикума, рекомендуется при ознакомлении с методикой составить план работы, где кратко, указать какие реакции следует выполнить. По записям плана оформить лабораторный журнал полностью. Оформление каждой работы начинать с новой страницы, записи вести на обеих страницах по форме.

1. Наименование лабораторной работы;

3. Теоретическая часть (кратко);

5. Обработка результатов (результаты полученных измерений, градуировочный график, расчет по формулам ит. д.);

7. Контрольные вопросы (письменные ответы по желанию).

3 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЗАГРЯЗНИТЕЛЕЙ В МЕСТЕ ОТБОРА

Измерение радиоактивного фона радиометрами. Отбор проб радиоактивных аэрозолей. Оценка радиоактивной обстановки исследуемой местности

Цели: 1. Изучить устройство и принцип действия радиометра;

2. Научиться измерять радиоактивный фон; отбирать радиоактивные аэрозоли и оценивать радиоактивную обстановку местности.

Техника безопасности. К выполнению лабораторной работы допускаются лица, знающие правила техники безопасности при работе с радиоактивными веществами.

Сущность метода. Метод основан на способности излучений ионизировать вещество среды, в которой они распространяются. Ионизация, в свою очередь, является причиной физических и химических изменений в веществе, которые могут быть обнаружены и измерены. К таким изменениям среды относятся: изменения электропроводности веществ (газов, жидкостей, твердых материалов); люминесценция (свечение) некоторых веществ. Под воздействием излучений в изолированном объеме происходит ионизация газа: электрически нейтральные атомы (молекулы) газа разделяются на положительные и отрицательные ионы. Если в этот объем поместить два электрода, к которым приложено постоянное напряжение, то между электродами создается электрическое поле. При наличии электрического поля в ионизированном газе возникает направленное движение заряженных частиц, т. е. через газ проходит электрический ток, называемый ионизационном. Измеряя ионизационный ток, можно судить об интенсивности ионизирующих излучений.

Радиоактивные аэрозоли (РА) – это естественные или искусственные аэрозоли с радиоактивной дисперсной фазой.

Естественные РА возникают в результате радиоактивного распада изотопов радона, выделяемых с поверхности почвы в атмосферу, а также при взаимодействии частиц космического излучения с ядрами атомов химических элементов, входящих в состав воздуха. Образующиеся при этом радиоактивные атомы оседают на частицах нерадиоактивной атмосферной пыли. С поверхности почвы ветром уносится в атмосферу и пыль, содержащая радиоактивные изотопы калия, урана, тория и др. Некоторое количество РА попадает в атмосферу с космической пылью и метеоритами.

источник