Меню Рубрики

Санитарно микробиологический анализ питьевой воды

Санитарно-микробиологическое исследование воды

Через воду могут передаваться самые различные инфекционные заболевания. При решении вопроса снабжения населения доброкачественной водой необходимо учитывать возможность водного пути передачи инфекций, в частности, брюшного тифа (паратифов), дизентерии, холеры, лептоспироза, туляремии, полиомиелита, вирусных гепатитов А и Е.

В зависимости от предназначения вода может быть классифицирована на:

ü питьевую воду централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения;

ü воду подземных и поверхностных источников централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения;

ü децентрализованную питьевую воду (из колодцев, артезианских скважин и родников);

ü воду объектов в зонах рекреации;

ü воду плавательных бассейнов с пресной и морской водой;

ü хозяйственно-бытовые сточные воды после обеззараживания и очистки.

Для всех видов водопользования имеется нормативно-техническая документация — государственные стандарты (ГОСТы), санитарные нормы и правила (СанПиНы), методические указания, методические рекомендации, информационные письма. Эта нормативно-техническая документация (НТД) включает гигиенические требования, нормативы качества воды и методы исследования.

Среди многочисленных нормируемых показателей следует особо выделить микробиологические и паразитологические. Косвенно данные показатели отражаются и при проведении химического анализа воды. Например, органические соединения азота — показатель загрязнения воды органическими веществами белковой природы, в том числе и за счёт сапрофитных и патогенных мик-ов. Ионы аммония, азотной и азотистой кислот также являются конечными продуктами распада микроорганизмов. Окисляемость воды и биохимическая потребность её в кислороде косвенно свидетельствует о возможном загрязнении воды патогенными микроорганизмами.

Санитарно-микробиологическое исследование воды централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения

Включает определение как патогенных микроорганизмов, так и СПМО (косвенно свидетельствующих о возможном присутствии в воде патогенных микроорганизмов). Определение патогенных микроорганизмов проводят по эпидемиологическим показаниям, а при плановых санитарно-микробиологических исследованиях воды анализ включает в себя следующие показатели по требованиям СанПиН 2.1.4.1074-01

Санитарно-показательные микроорганизмы в воде централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения

Показатель Единица измерения Норматив
ОМЧ Колониеобразующие единицы (КОЕ) в 1 см 3 меньше или равно 50
Общие колиформные бактерии (ОКБ) Число бактерий в 100 см 3 Отсутствует
Термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ) Число бактерий в 100 см 3 Отсутствует
Коли-фаги Бляшкообразующие единицы (БОЕ) в 100 см 3 Отсутствует
Споры сульфитредуцирующих клостридий Число спор в 20 см 3 Отсутствует
Цисты лямблий Число цист в 50 см 3 Отсутствует

При этом, оценивая количество ОКБ и ТКБ в 100 см 3 воды, следует анализировать не менее трёх объёмов воды (по 100 см 3 каждый). При оценке ОКБ и ОМЧ превышение норматива не допускается в 95% проб, отбираемых в течение года. Коли-фаги определяют только в системах водоснабжения из поверхностных источников перед подачей воды в распределительную сеть, то же касается и наличия цист лямблий. Содержание спор сульфитредуцирующих клостридий определяют только при оценке эффективности технологии обработки воды. В случае обнаружения ТКБ, ОКБ, коли-фагов вновь проводят экстренное исследование воды на ТКБ, ОКБ и коли-фаги обжиганием.

Определяемые показатели кол-ва и периодичность исследования зависят от типа источника волоснабжения, типа населения. МУК по анализу воды 4.2.1018-01. В данных методических указаниях регламентированы методы санитарно-микробиологического котроля качества питьевой воды.

2.1.1. Отбор, хранение и транспортировка проб воды

Пробы воды отбирают в стерильную одноразовую посуду или ёмкости многократного применения с плотно закрывающимися пробками (силиконовыми, резиновыми), снабжёнными защитным колпачком из алюминиевой фольги или плотной бумаги. Многоразовая посуда, в том числе пробки, должны выдерживать стерилизацию сухим жаром и автоклавирование. Для нейтрализации присутствующего в воде хлора в ёмкость (до стерилизации) вносят серноватисто-кислый натрий из расчёта 10 мг на каждую половину объёма исследуемой воды. Если вода гиперхлорированная, то количество нейтрализатора увеличивают: при концентрации остаточного хлора 2 мг на литр хлора добавляют 20 мг нейтрализатора, 3 мг/л — 30 мг и так далее.

Стерильную ёмкость открывают непосредственно перед отбором воды, удаляя пробку вместе со стерильным колпачком. Во время отбора пробка и края ёмкости не должны соприкасаться с посторонними предметами. При отборе проб из распределительной сети металлический кран стерилизуют обжиганием. Затем воду спускают в течение 10 минут при полностью открытом кране, при постоянном изливании воды или наличии на кране резинового силиконового шланга, отбор проб проводят без предварителного обжигания. Между пробкой и уровнем воды в емкости должно оставаться пространство, чтобы пробка не смачивалась при транспортировке. После отбора пробы емкость закрывают стерлиьной пробкой и колпачком. Пробу маркируют и в сопроводителньом документе указывают место, дату и время отбора пробы, фамилию специалиста и дополнительные сведения при необходимости. Анализ необходимо провести в течение 2 ч после отбора пробы. Если нет возможности доставитьдоставить в эти срокия, то при условии транспортировки и хранения пробы в контейнерах-холодильниках при температуре +4-10градусов, время можно увеличить до 6 часов.

Определение общего числа микроорганизмов

Общее число микроорганизмов (ОМЧ) — это общее число видимых при двукратном увеличении мезофильных, аэробных и факультативно анаэробных мик-ов, которые способны образовывать колонии на питательной среде при температуре +37 °С в течение 24 ч.

определения их количества могут быть использованы бактериологический и микроскопический методы.

Основные этапы бактериологического исследования: гомогенизация образца, десорбция микроорганизмов с плотных частиц, приготовление разведений, посев на питательные среды, идентификация выделенных культур.

Гомогенизацию образца проводят для равномерного распределения бактерий в анализируемом объекте. При исследовании жидких, плотных, сыпучих продуктов, в зависимости от характеристик испытуемого материала, используют перемешивание простым встряхиванием или специальные приборы.

Десорбция бактерий с плотных частиц необходима для анализа объектов твёрдой консистенции. Для этого материал суспензируют в жидкости или с поверхности объекта берут смывы и отпечатки. При суспензировании к навеске образца массой 10г добавляют 90 см 3 воды и интенсивно перемешивают (вручную или в гомогенизаторе). В дальнейшем условно принимают 1 см 3 полученной суспензии эквивалентным 0,1 г исходного материала.

Для определения количества бактерий чаще используют метод 10-кратных разведений, когда концентрация микроорганизмов каждого последующего разведения в 10 раз меньше предыдущего, затем разведения высевают на питательные среды.

Несмотря на кажущуюся техническую простоту, этот этап — один из наиболее существенных источников ошибок при определении количества микроорганизмов в объекте, поэтому в процессе подготовки разведений необходимо строго выполнять регламентированные процедуры.

В стерильные пробирки, соблюдая правила асептики, разливают стерильную воду или специальный раствор по 9 см3. Заранее стерилизовать мерно разлитую жидкость не рекомендуется, так как при автоклавировании её объём может измениться.

Для приготовления 1-го разведения 1:10 1 см 3 анализируемого материала стерильной пипеткой переносят в пробирку с 9 см3 жидкости для разведения. Пипетку нельзя погружать в воду более чем на 3 мм, во избежание смывания микроорганизмов с её наружной поверхности. Новой стерильной пипеткой тщательно перемешивают содержимое пробирки путём многократного заполнения и опорожнения пипетки, набирают 1 см 3 разведения 1:10 и переносят в следующую пробирку с 9 см 3 жидкости, получая разведение 1:100 (10 -2 ). Эти операции повторяют до получения необходимого ряда разведений.

В случаях когда идентификация не требуется используют метод глубинного посева в плотные питательные среды. С этой целью питательную среду расплавляют и охлаждают до температуры 45±5 С. В пустые стерильные чашки Петри, соблюдая правила асептики, стерильной пипеткой вносят 1 см 3 образца (после его перемешивания) или заранее приготовленного разведения. Чашки предварительно маркируют со стороны горлышка, а не крышки.

Разведения выбирают с таким расчётом, чтобы на чашке выросло от 30 до 300 колоний. Из каждой пробы засевают два разведения. Не позднее чем через 15 мин после внесения материала в чашку наливают 10-12 см 3 питательного агара или питательнуой среды, толщина слоя которого должна быть не менее 4—5 мм. Расплавленную среду и посевной материал незамедлительно тщательно перемешивают круговыми движениями, чтобы микроорганизмы равномерно распределились в массе среды. Чашки после этого оставляют на холодной горизонтальной поверхности на 10—15 мин для охлаждения и застывания среды, после чего посевы помещают в термостат и инкубируют при заданной температуре и экспозиции.

Для дальнейшей работы выбирают чашки, на которых выросло от 30 до 300 колоний, а при посеве нативного материала — от 1 до 300 колоний. Количество колоний на поверхности и в глубине агара подсчитывают визуально или при помощи лупы с 2—5-кратным увеличением (для этого чашку помещают вверх дном на поверхность чёрного цвета) либо специального прибора для счёта бактерий, с помощью которого подсчёт колоний осуществляется за 0,2 сек. Если на чашке с посевом максимального разведения выросло более 300 колоний, допустимо вести их подсчёт при помощи пластинки с лупой и сетки из оргстекла со стороной квадрата 1 см при сильном боковом освещении. Колонии считают не менее чем в 20 квадратах, определяют их среднее число на 1 см2 и умножают на площадь поверхности питательной среды в чашке.

В тех случаях, когда после подсчёта колоний может возникнуть необходимость в выделении чистой культуры и её идентификации, для определения кол-ва жизнеспособных мик-ов используют метод поверхностного посева. Питательную среду разливают в чашки Петри и после застывания подсушивают, переворачивая чашки вверх дном и выдерживая их открытыми в термостате 30 минут при температуре 48-50 градусов.

В центр маркированной чашки Петри вносят заданное количество исследуемого материала или его разведения (например, 0,01—0,001 см3) и немедленно равномерно распределяют по поверхности среды стерильным стеклянным или пластиковым шпателем до тех пор, пока на агаре не останется видимых следов жидкости. Засеянные чашки немедленно переворачивают и быстро помещают в термостат, установленный на соответствующий температурный режим. В период нахождения чашек в термостате допускают кратковременные колебания температуры, в частности, при загрузке или разгрузке.

Учёт посевов проводят непосредственно после извлечения чашек из термостата, если это невозможно, их хранят в холодильнике не более 24 ч. При подсчёте колоний учитывают рост микроорганизмов только с заданными культуральными свойствами, а при использовании дифференциальных сред — с соответствующими биохимическими характеристиками.

Из каждой пробы делают посев не менее двух объёмов по 1 см 3 . Кол-во колоний на обеих чашках суммируют делят на два. Результат выражают в КОЕ 1 см 3 пробы. Если на одной из двух чашек подсчёт колоний невозможен, то учитывают колонии, выросшие на одной чашке.

Дата добавления: 2016-03-25 ; просмотров: 1487 | Нарушение авторских прав

источник

Особенности стрептококков как СПМ:

Стрептококки не очень устойчивы в окружающей среде, они могут сохраняться только в течение нескольких дней в пыли помещений, на белье, предметах обихода больного. Однако сроки сохранения их жизнеспособности близки к продолжительности жизни ряда патогенных бактерий, попадающих в окружающую среду воздушно-капельным путем (например, таких как возбудитель дифтерии и др.)

Показателем более свежего загрязнения воздуха помещений является α-гемолитический стрептококк как наименее устойчивый. В воздухе необитаемых человеком помещений стрептококки не обнаруживаются.

Методы индикации и идентификации стрептококков более сложны и трудоемки в сравнении с таковыми стафилококков.

Особое место среди СПМ занимают термофильные микробы, присутствие которых в почве или воде водоемов свидетельствует о загрязнении их навозом, компостом или разложившимися фекалиями людей.

К термофильным микроорганизмам относятся грамположительные бактерии, кокки, бациллы, спириллы, актиномицеты, немногие виды грибов, которые способны активно размножаться при температуре 60 0 С и выше. Большая часть термофилов – аэробы.

Термофилы содержатся в кишечнике человека и животных в небольших количествах (10 1 – 10 3 в 1 г), в связи с этим они не могут служить показателем фекального загрязнения окружающей среды.

Термофильные микроорганизмы размножаются в компостных кучах и навозе, в которых благодаря их жизнедеятельности происходит нагревание до 60-70 0 С поверхностных слоев. В таких условиях идет процесс биотермического обезвреживания органических масс, подвергающихся самонагреванию, погибают патогенные микроорганизмы и кишечные палочки.

Таким образом, присутствие термофилов свидетельствует о давнем загрязнении почвы компостами, при этом БГКП (ОКБ) обнаруживаются в незначительных количествах. И, напротив, высокий титр БГКП (ОКБ) при малом числе термофилов – показатель свежего фекального загрязнения.

Термофилы служат также санитарно-показательными микроорганизмами для характеристики отдельных этапов процесса минерализации органических отходов.

САНИТАРНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ ВОДЫ

Вода является естественной средой обитания разнообразных. микроорганизмов (различные виды бактерий, грибы, простейшие и водоросли). Совокупность всех водных организмов называетсямикробиальный планктон. На количественный состав микрофлоры основное влияние оказывает происхождение воды – пресные поверхностные (проточные воды рек, ручьев; и стоячие озер, прудов, водохранилищ), подземные (почвенные, грунтовые, артезианские), атмосферные и соленые воды. По характеру пользования выделяют питьевую воду (централизованного и местного водоснабжения), воду плавательных бассейнов, лед медицинский и хозяйственную. Особого внимания требуют сточные воды.

Микрофлору водоемов образуют две группы:

-аллохтонные (попадающие извне при загрязнении из различных источников) микроорганизмы.

1. Автохтонная микрофлора – совокупность микроорганизмов, постоянно живущих и размножающихся в воде. Как правило, микрофлора воды напоминает микробный состав почвы, с которой вода соприкасается. В ее состав входят микрококки, сарцины, некоторые виды Proteus и Leptospira. Из анаэробов –Bacillus cereus и некоторые виды клостридий. Эти микроорганизмы играют значительную роль в круговороте веществ, расщепляя органические отходы, клетчатку и др.

2. Биологическое загрязнение водоемов.

Со сточными, ливневыми, талыми водами в водоемы попадают многие виды микроорганизмов, резко изменяющих микробный биоценоз. Основной путь микробного загрязнения – попадание неочищенных городских отходов и сточных вод. Также – при купании людей, скота, стирке белья и др. В воду могут попадать представители нормальной микрофлоры человека, УП, патогенной (возбудители кишечных инфекций, лептоспирозов, иерсиниозов, вирусы полиомиелита, гепатита А и т.д.). Следует помнить, что вода не является благоприятной средой для размножения патогенных микроорганизмов, для которых биотопами являются организм человека или животных.

Освобождение от контаминирующих микроорганизмов наблюдается после органического загрязнения водоемов за счет конкурентной активации сапрофитной микрофлоры, что приводит к быстрому разложению органических веществ, уменьшению численности бактерий, особенно «фекальных». Существует термин «сапробность» — (sapros– гнилой, греч.) обозначает комплекс особенностей водоема, в том числе состав и количество микроорганизмов в воде, содержащей органические и неорганические вещества в определенных концентрациях. Процессы самоочищения воды в водоемах происходят последовательно и непрерывно. Различают полисапробные, мезасапробные и олигосапробные зоны.

Полисапробные зоны– зоны сильного загрязнения. Содержат большое количество органических веществ и почти лишены кислорода. Количество бактерий в 1 мл воды в полисапробной зоне достигает миллиона и более.

Мезасапробные зоны – зоны умеренного загрязнения. Количество микроорганизмов – сотни тысяч в 1 мл.

Олигосапробные зоны – зоны чистой воды. Характеризуются окончившимся процессом самоочищения. Количество бактерий от 10 до 1000 в 1 мл воды.

Таким образом, патогенные микроорганизмы, попадающие в водоем, достаточно обильны в полисапробных зонах, постепенно отмирают в мезосапробных и практически не обнаруживаются в олигосапробных зонах.

При санитарно-микробиологическом исследовании воды выделяют ОКБ, энтерококки, стафилококки и патогенные микроорганизмы (сальмонеллы, холерные вибрионы, лептоспиры, шигеллы и др.). Все санитарно-микробиологические исследования воды регламентируют соответствующие ГОСТ.

Основания для санитарно-микробиологического исследования воды:

Выбор источника централизованного водоснабжения и контроль за ним;

Контроль эффективности обеззараживания питьевой воды централизованного водоснабжения;

Наблюдение за подземными источниками водоснабжения (артезианские скважины, почвенные воды и т.д.);

Наблюдение за источниками индивидуального водопользования (колодцы, родники и др.);

Наблюдение за санитарно-эпидемиологическим состоянием воды открытых водоемов;

Контроль эффективности обеззараживания воды плавательных бассейнов;

Проверка качества очистки и обеззараживания сточных вод;

Расследование водных вспышек инфекционных болезней.

Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды

В настоящее время регламентируется Методическими указаниями МУК 4.2.1018-01.

1. Определение ОМЧ– общее число мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, способных образовывать колонии на питательном агаре приt 0 37 0 Cв течение 24 часов.

Из каждой пробы делают посев не менее двух объемов по 1 мл в 2 чашки Петри по 1 мл воды + 8-12 мл расплавленного остуженного (45-49 0 С) питательного агара, перемешивают, дают застыть, ставят в термостат 37 0 С, 24 часа. Затем подсчитывают все выросшие на чашке колонии при увеличении в 2 раза (но не более 300 колоний на чашке). Количество колоний на чашках суммируют и делят на 2 – результат выражают в КОЕ на 1 мл воды. Допускается до 50 КОЕ на 1 мл воды.

Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий методом мембранной фильтрации (основной метод).

Общие колиформные бактерии — ОКБ –грам-, оксидаза-, не образующие спор палочки, способные расти на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу до КГ приt 0 37 0 С в течение 24 часов.

Термотолерантные колиформные бактерии — ТКБ –входят в число ОКБ, обладают всеми их признаками, кроме того, способны ферментировать лактозу до КГ при t 0 44 0 С в течение 24 часов.

Метод основан на фильтрации установленного объема воды через мембранные фильтры, выращивании посевов на дифференциальной питательной среде с лактозой и последующей идентификации колоний по культуральным и биохимическим признакам.

Анализируют 3 объема по 100 мл, можно дробить объемы (10, 40, 100, 150 мл). Отмеренный объем воды фильтруют через мембранные фильтры. Фильтры помещают на среду Эндо (до трех фильтров на 1 чашку) и инкубируют t 0 37 0 С в течение 24 часов.

Если нет роста – отрицательный результат – ОКБ и ТКБ не обнаружены. Если есть типичные лактозопозитивные колонии с отпечатком на обратной стороне фильтра, подсчитывают, подтверждают их принадлежность к ОКБ и ТКБ. Для этого исследуется

-принадлежность к грамотрицательным бактериям

-ферментация лактозы до КГ (в двух пробирках – при t 0 37 0 С и 44 0 С).

Результат высчитывают по формуле Х=а∙100/V, где

Х – число колоний в 100 мл воды.

Результат выражают в КОЕ ОКБ (ТКБ) в 100 мл воды. В норме ОКБ (ТКБ) в 100 мл воды питьевой не должны определяться.

Споры сульфитредуцирующих клостридий – спорообразующие анаэробные палочковидные бактерии, редуцирующие сульфит натрия на железо-сульфитном агаре приt 0 44 0 С в течение 16-18 часов. Метод основан на выращивании посевов в железо-сульфитном агаре в условиях, приближенных к анаэробным, и подсчете числа черных колоний.

Объем воды 20 мл прогревают на водяной бане 75-80 0 С в течение 15 минут для исключения вегетативных форм, затем фильтруют через бактериальный фильтр, который помещают в пробирку с расплавленным железо-сульфитным агаром (70-80 0 С), остужают, помещают в термостатt 0 44 0 С на 16-18 часов.

Колифаги – вирусы бактерий, способные лизировать E.coliи формировать приt 0 37 0 С через 18-20 часов зоны лизиса бактериального газона (бляшки) на питательном агаре. Число бляшек не подсчитывается – анализ качественный.

Исследование сточных вод регламентируетсяМУ 2.1.5.800 – 99 «Организация Госсанэпиднадзора за обеззараживанием сточных вод», 1999 год. Применяют прямой посев на 4 чашки со средой Эндо по 0,5 мл (2 мл – весь объем). Затем подсчитывают количество КОЕ ОКБ и ТКБ, делают перерасчет на 100 мл воды.

Вода бассейнов исследуется по Санитарно-эпидемиологическим правилам и нормативам —СанПиН 2.1.2.1188-03. В100 мл водыбассейновдопускается не более 1 КОЕ ОКБ, не допускается ТКБ, колифаги, золотистый стафилококк, возбудители кишечных инфекций, синегнойная палочка. Лабораторный контроль по основным микробиологическим показателям (ОКБ, ТКБ, колифаги и золотистый стафилококк) проводится 2 раза в месяц. Исследования на наличие возбудителей кишечных инфекций проводятся при неблагоприятной эпидемической ситуации.

При появлении спорадических случаев пневмоний неясной этиологии или возникновении среди посетителей бассейна эпидемических внесезонных вспышек ОРЗ проводятся исследования воды на наличие легионелл (Legionella pneumophilia), размножению которых способствует теплая вода и брызги. При дыхании мелкодисперсный аэрозоль, содержащий легионеллы, попадает в легкие, что может вызвать «болезнь легионеров» или понтиакскую лихорадку.

Получение неудовлетворительных результатов исследований воды по основным микробиологическим, паразитологическим показателям; обнаружение возбудителей кишечных инфекционных или паразитарных заболеваний, синегнойной палочки является основанием для полной смены воды в ванне. Смена воды в ванне бассейна должна сопровождаться механической чисткой ванны, удалением донного осадка и дезинфекцией с последующим отбором проб на анализ.

ЗАБОЛЕВАНИЯ ИНФЕКЦИОННОЙ ПРИРОДЫ,

КОТОРЫЕ МОГУТ ПЕРЕДАВАТЬСЯ ЧЕРЕЗ ВОДУ ПЛАВАТЕЛЬНЫХ БАССЕЙНОВ

Степень связи с водным фактором

1.Адено-вирусная фаринго-конъюктивальная лихорадка

2.Эпидермофития («чесотка пловцов»)

6.Отиты, синуситы, тонзиллиты, конъюктивиты

8.Грибковые заболевания кожи

16.Острые сальмонеллезные гастроэнтериты

Связь с водным фактором: +++ — высокая, ++ — существенная, + — возможная

Микробиологический анализ воды открытых водоемов регламентируется МУК 4.2.1884-04 «Санитарно-микробиологический и санитарно-паразитологический анализ воды поверхностных водных объектов».

САНИТАРНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЧВЫ

Почва является главным резервуаром и естественной средой обитания микроорганизмов, которые участвуют в процессах самоочищения почвы, а также в круговороте веществ в природе. Качественный состав почвы очень разнообразен и включает преимущественно спорообразующие бактерии, актиномицеты, спирохеты, простейшие, сине-зеленые водоросли, микоплазмы, грибы и вирусы. Наиболее многообразен микробный пейзаж в околокорневой зоне растений – ризоферная зона. Количество микроорганизмов в почве достигает нескольких миллиардов в 1 г. Живая масса микроорганизмов в почве на 1 га – около 1000 кг.

Микроорганизмы распределены в почве неравномерно. На поверхности (1-2 мм) их относительно мало. Наиболее многообразна и многочисленна микрофлора на глубине 10-20 см, где идут основные биохимические процессы превращения органических веществ. При этом патогенные микроорганизмы и попавшие в почву представители нормальной микрофлоры тела человека и животных, как правило, длительно не выживают. Однако, многие бактерии, входящие в состав нормальной микрофлоры человека, также включаются в биоценоз почвы. Существует трудность в разделении микрофлоры почвы на резидентную и временно присутствующую. Для выяснения роли почвы в передаче инфекционных болезней необходимо знать возможную продолжительность сохранения патогенных бактерий в почве.

1-я группавключает патогенные микроорганизмы, постоянно обитающие в почве, например,Clostridium botulinum. Бактерии попадают в почву с испражнениями человека и животных, их споры сохраняются в ней неопределенно долго.

2-я группа включает спорообразующие патогенные микроорганизмы, для которых почва является вторичным резервуаром. Бактерии попадают в почву с выделениями человека и животных, а также с трупами погибших животных. При благоприятных условиях они могут размножаться и сохраняться в виде спор длительное время.

3-я группа включает патогенные микроорганизмы, попадающие в почву с выделениями человека и животных и сохраняющиеся в течение нескольких недель или месяцев. В нее входят споронеобразующие бактерии.

Читайте также:  Анализ химического состава вод озер

Санитарно-микробиологическое исследование воды проводят с учетом комплекса показателей: общее количество сапрофитных микроорганизмов и наличие СПМ (ОКБ, ТКБ, Clostridium perfringens и др.). Высокая численность сапрофитной микрофлоры свидетельствует об органическом загрязнении, при микробной контаминации преобладают СПМ.

САНИТАРНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ ВОЗДУХА

Воздух является средой, в которой микроорганизмы не способны размножаться. Бактериальная обсемененность воздуха закрытых помещений всегда превышает обсемененность атмосферного воздуха, в том числе и патогенными микроорганизмами, попадающими в воздух от больных людей, животных и бактерионосителей. Микрофлору воздуха условно разделяют на резидентную (более часто обнаруживаемую) и временную, менее стойкую к воздействию различных факторов (обнаруживают спорадически).

Постоянная микрофлора воздуха формируется за счет почвенных микроорганизмов. В основном это микрококки, сарцины, B.subtilis, некоторые виды Actinomices, Penicillum, Aspergillus и др.

Временная микрофлора воздуха также формируется преимущественно за счет микроорганизмов почвы, а также за счет видов, поступающих с поверхности водоемов.

Контаминация воздуха патогенными микроорганизмами происходит в основном капельным путем в составе аэрозоля, образующегося при разговоре, кашле, чихании. В зависимости от размера капель, их электрического заряда, скорости движения в воздухе аэрозоль может иметь капельную и пылевую фазы, а также капельные ядрышки.

А) Капельная фаза – представлена мелкими каплями, длительно сохраняющимися в воздухе и испаряющимися до оседания.

Б) Пылевая фаза –представлена крупными, быстро оседающими и испаряющимися каплями; в результате образуется пыль, способная подниматься в воздушную среду.

В) Капельные ядрышки – мелкие капельки аэрозоля (до 100 нм), высыхая, остаются в воздухе во взвешенном состоянии и образуют устойчивую аэродисперсную систему. В них частично сохраняется влага, поддерживающая жизнеспособность микроорганизмов. Последние в составе капельных ядрышек могут переноситься на значительные расстояния.

Санитарно-микробиологические исследования воздуха.

Основной задачей исследований является гигиеническая и эпидемиологическая оценка воздушной среды, а также разработка комплекса мероприятий, направленных на профилактику аэрогенной передачи возбудителей инфекционных болезней. При оценке санитарного состояния закрытых помещений в зависимости от задач исследования определяют ОМЧ, наличие СПМ (стафилококков, α- и β-гемолитических стрептококков, являющихся показателями контаминации микрофлорой носоглотки человека).

Отбор проб в закрытых помещениях: точки отбора на каждые 20 м 2 — одна проба, по типу конверта.

Методы отбора: -седиментационные и

-аспирационные – основанные на принудительном осаждении микроорганизмов из воздуха на поверхность плотной питательной среды или в улавливающую жидкость. Используют прибор для отбора проб воздуха (ПОВ – 1), пробоотборник аэрозольный бактериологический (ПАБ – 1). Отбор проб проводят со скоростью 20-25 л/мин в течение 5-4 минут. Т.о., определяется микрофлора в 100 л воздуха.

Исследование микробной обсемененности воздушной среды в лечебных учрежденияхпроводят в соответствии с Приказом №720 от 31 июля 1978 года «Об улучшении медицинской помощи больным с гнойными хирургическими заболеваниями и усилении мероприятий по борьбе с внутрибольничной инфекцией».

Бактериологическое исследование предусматривает:

-определение общего содержания микробов (ОМЧ) в 1 м 3 воздуха;

-определение содержания золотистого стафилококка в 1 м 3 воздуха. Отбор проб проводят в следующих помещениях:

-отделениях и палатах реанимации и др. помещениях, требующих асептических условий.

Пробы воздуха отбирают аспирационным методом со скоростью протягивания воздуха 25 л/мин. Количество пропущенного воздуха должно составлять 100 литров для определения ОМЧ и 250 литров для определения наличия золотистого стафилококка.

Критерии оценки микробной обсемененности воздуха

источник

Чистая вода — здоровье человека. Лабораторный санитарно-бактериологический анализ воды — единственный способ определить, с какой по качеству жидкостью контактируют человек. Когда необходимо проводить исследование? Кто может помочь провести качественную диагностику воды? В «чистой» жидкости могут быть органические и неорганические примеси, биологические загрязнители и соли, выявить которые может только санитарно-бактериологический анализ воды и ряд иных исследований. Перечисленные «наполнители» отравляют организм, вызывая онкологические, кардиологические, кожные и прочие заболевания. Заметить токсины невооруженным взглядом невозможно. Как же узнать, что мы пьем? Провести санитарно-микробиологический анализ воды, взятой из-под водопроводного крана или из колодца на даче. Его можно заказать в нашей лаборатории. Мы проведем комплексное исследование предоставленного образца. Гарантируем профессионализм и качество.

Вода для питья должна быть безопасной по составу и безвредной по радиационным и эпидемиологическим показателям. Гигиенические нормы предоставляемых нам образцов специалисты компании определяют рядом анализов:

  • Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды. Проводится с целью выявления специфических патогенов, позволяет дать заключение о безопасности образца. Исследование, проведенное на современном оборудовании, позволяет определить: общий объем микроб, наличие колиморфных бактерий и термотолерантных колибактерий.
  • Бактериологический анализ. Выявляет (дает отрицательный результат) наличие в образце микроорганизмов: микробы, вирусы и иные болезнетворные объекты. Проведение анализа поможет определить источник заражения и принять меры по обеззараживанию.
  • Химический анализ. Как и микробиологический анализ воды, химический дает возможность выявить небезопасные для здоровья «наполнители». А именно: марганец, железо, соли тяжелых металлов, сероводород и прочие химические соединения. Также дать заключение о жесткости образца.

При наличии тяжелых металлов, патогенов, солей и микроорганизмов питье жидкости запрещено. В лаборатории у нас по доступной цене можно заказать любой из видов исследования. Мы используем современное лабораторное оборудование и применяем инновационные методики.

Определяя химические, бактериологические и микробиологические показатели воды, применяют следующие методы исследований:

  • Фотометрический — молекулярно-абсорбционный спектральный анализ, дающий возможность выявить нитраты/нитриты, фосфаты, фосфор, сероводород и прочие.
  • Титриметрический — количественный анализ. Позволяет выявить хлориды.
  • Нефелометрический — химико-количественный анализ. Определяет сульфаты, растворенные вещества.

Чтобы провести бактериологический, химический и микробиологический анализ воды, используются питательные специфические среды, суспензии, тест-культуры и создаются оптимальные условия (температура, давление) для развития микроорганизмов. Тип исследования определяет и время проведения анализа — он может длиться от 5 дней до недели. По результатам исследований можно дать заключение о мерах, которые необходимо предпринять для повышения качества используемой жидкости. Наши эксперты детально о них расскажут, дадут советы и рекомендации.

Воду можно пить, если химический, бактериологический и микробиологический контроль воды показали, что:

  • Количество невредных минералов не более 1 г/л.
  • Жесткость образца составляет менее 7 ммоль/л.
  • Кислотность колеблется в рамках 7-7,5 pH.
  • Биологический анализ воды отрицателен на токсины.
  • Химические примеси полностью отсутствуют.

Это минимальные требования к чистоте и качеству образца. Наша лаборатория предоставит максимально развернутые результаты. Мы рекомендуем доверять исследование независимой лаборатории, которая не сотрудничает с водоснабженческими организациями. Наша компания является независимой. Мы предлагаем по доступной стоимости полный комплекс лабораторных услуг и высокий уровень обслуживания.

Специалисты лаборатории рекомендуют: переезжая в новый дом, покупая дачный участок, пробурив скважину, исследовать местную воду. Совет относится и к поиску поставщика качественной бутылированой воды. Потребуется просто провести отбор проб воды для микробиологического анализа и иных тестов. Исследованию подлежит и водопроводная вода, даже если домочадцы не будут ее пить, она все равно требует проверки, поскольку присутствие бактерий и тяжелых металлов способно спровоцировать различные кожные недуги.

Чтобы узнать удовлетворяет ли нормам ГОСТ вода, отбор проб для микробиологического анализа и прочих исследований должен происходить в соответствии с рядом требований:

  • Перед сбором материала спустить воду — 15-20 минут. Если скважина длительное время не эксплуатировалась, то не менее 2 часов.
  • Отбор проводят в специальную тару с крышкой, которую можно купить в нашей лаборатории. Тару нельзя мыть, необходимо слегка сполоснуть той водой, которая будет анализироваться.
  • Сбор проводят тонкой струйкой по стенке — необходимо избежать ненужной аэрации.
  • Тара заполняется с переливом — нельзя допустить попадания воздуха.
  • После сбора образца следует сразу же закрыть плотно крышкой тару.
  • Следует доставить образец к нам в лабораторию в течение не более пары часов.

Чтобы бактериологический, химический или микробиологический анализ питьевой воды был достоверным и объективным, отбор проб лучше доверить нашим специалистам. Позвоните нам, если у вас остались вопросы. Наши специалисты расскажут вам, как обезопасить себя и близких, какие меры стоит предпринять. Контактная информация представлена на сайте компании.

источник

При проведении исследований определяют:

1. Общее число микроорганизмов, образующих колонии на питательном агаре

2. Содержание общих и термотолерантных колиформных бактерий (ОКБ и ТКБ)

3. Содержание спор сульфитредуцирующих клостридий

Пробу (в объеме 500 см 3 ) отбирают в стерильную емкость, снабженную пробкой и колпачком, после предварительной стерилизации крана обжиганием и последующего спуска воды не менее 10 минут при полностью открытом кране. При отборе пробы напор воды уменьшают.

Определение общего числа микроорганизмов, образующих колонии на питательном агаре.

Метод определяет в питьевой воде общее число мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (ОМЧ), способных образовывать колонии на питательном агаре при температуре 37 о С в течение 24 часов, видимые с увеличением в 2 раза.

Проведение анализа. Из каждой пробы делают высев не менее двух объемов по 1см 3 . Вносят по 1 см 3 воды в две стерильные чашки Петри, затем в каждую чашку вливают 8-12 см 3 расплавленного и остуженного до 45-49 о С питательного агара. Быстро смешивают содержимое чашек на горизонтальной поверхности. После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат вверх дном и инкубируют 24 часа при 37 о С.

Учет результатов. Подсчитывают все выросшие на чашках колонии, наблюдаемые при двукратном увеличении. Количество колоний на обеих чашках суммируют и делят на два. Результат выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл исследуемой пробы воды. Если на двух чашках наблюдается рост расплывчатых колоний или выросло более 300 колоний, подсчитывают сектор чашки с последующим пересчетом на всю поверхность. В этих случаях в протоколе отмечают «число КОЕ / см 3 — ориентировочно». Если подсчет на чашках невозможен, то в протоколе отмечают «сплошной рост».

Норматив: в 1 см 3 питьевой воды должно быть не более 50 КОЕ.

Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий.

1.1.2.1. Метод мембранной фильтрации (основной метод).Общие колиформные бактерии (ОКБ) представлены грамотрицательными, оксидаза-отрицательными, не образующими спор палочками, способными расти на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре 37 о С в течение 24-48 часов.

Термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ) входят в число общих колиформных бактерий, обладают их признаками и, кроме того, они способны ферментировать лактозу до кислоты, альдегида и газа при 44 о С в течение 24 часов.

Метод основан на фильтрации установленного объема воды через мембранные фильтры, выращивание посевов на дифференциальной питательной среде с лактозой и последующей идентификацией колоний по культуральным и биохимическим свойствам.

Проведение анализа.При исследовании питьевой воды изучают три пробы объемом по 100 мл. При получении стабильных отрицательных результатов допустима фильтрация 300 см 3 воды через один фильтр.

При фильтрации воды неизвестного качества целесообразно увеличить количество фильтруемых объемов для получения изолированных колоний на фильтре (например, 10, 40, 100, 150 см 3 воды).

Фильтры помещают на чашки со средой Эндо и затем ставят в термостат дном вверх и инкубируют посевы 24 часа при 37 о С. Если на фильтрах нет роста или выросли колонии пленчатые, губчатые, плесневые, расплывчатые, выдают отрицательный ответ, свидетельствующий об отсутствии ОКБ и ТКБ в 100 мл исследуемой воды. Анализ заканчивают через 24 часа.

Если на фильтрах обнаружен рост изолированных типичных лактоза-положительных колоний: темно-красных; красных с металлическим блеском или без него или других подобного типа колоний с отпечатком на обратной стороне фильтра, подсчитывают число колоний каждого типа отдельно и приступают к подтверждению их принадлежности к ОКБ и ТКБ.

Каждую отобранную изолированную колонию исследуют на:

а) наличие оксидазной активности; б) отношение к окраске по Граму (микроскопия окрашенного по Граму препарата или постановка теста Грегерсена); 3) ферментацию лактозы до кислоты и газа.

.Постановка оксидазного теста. Полоску фильтровальной бумаги помещают в чистую чашку Петри и смачивают 2-3 каплями реактива для оксидазного теста (например, 1% водным раствором тетраметил-n-фенилендиамина гидрохлорида) или используют СИБ-оксидазу. Готовые бумажные системы смачивают дистиллированной водой. Часть изолированной колонии стеклянной палочкой или платиновой петлей наносят штрихом на подготовленную фильтровальную бумагу. Реакция считается положительной, если в течение 1 мин появляется фиолетово-коричневое или синее (СИБ-оксидаза) окрашивание штриха. При отрицательной реакции цвет в месте нанесения культуры не меняется. При положительном результате эту колонию их дальнейшего исследования исключают.

Определение отношения к окраске по Граму. Из оксидаза-отрицательной колонии делают мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют.

Окраска по Граму может быть заменена тестом Грегерсена: в капле 3% водного раствора КОН на предметном стекле эмульгируют бактерийную массу, взятую с плотной среды. После нескольких секунд перемешивания петлей взвесь ослизняется и за петлей тянутся слизистые нити, что указывает на принадлежность испытуемой культуры к грамотрицательному виду. У грамположительных бактерий слизистые нити не образуются – реакция отрицательная.

Определение ферментации лактозы. Оставшуюся часть оксидаза-отрицательной грамотрицательной колонии засевают параллельно в две пробирки с лактозной средой;

— для подтверждения наличия ОКБ посев инкубируют при 37 о С 48 часов (просматривают через 24 часа);

— для подтверждения наличия ТКБ посев осуществляют в среду, предварительно прогретую до 43-44 о С, и инкубируют при 44 о С 24 часа.

Учет результатов. При отсутствии ОКБ и ТКБ на всех фильтрах результат записывают «не обнаружено КОЕ ОКБ в 100 см 3 » и «не обнаружено КОЕ ТКБ в 100 см 3 ». В случае идентификации всех выросших подозрительных колоний число КОЕ ОКБ и ТКБ подсчитывают на всех фильтрах и выражают результат анализа КОЕ в 100 см 3 воды.

Вычисление проводят по формуле X = , где Х – число колоний в 100 см 3 воды; V – профильтрованный объем воды через фильтры, на которых велся учет; a – число подсчитанных на этих фильтрах колоний в сумме.

Окончательный результат выдают: количество КОЕ ОКБ в 100 см 3 воды, из них количество КОЕ ТКБ в 100 см 3 .

Дата добавления: 2018-08-06 ; просмотров: 181 ; ЗАКАЗАТЬ РАБОТУ

источник

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование
Российской Федерации

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды

Методические указания
МУК 4.2.1018-01

1. Разработаны НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А. Н. Сысина РАМН (Недачин А. Е., Доскина Т. В., Дмитриева Р. А., Тишкова Н. Ю., Сидоренко С. Г.), Федеральным научным центром гигиены им. Ф. Ф. Эрисмана Минздрава России (Трухина Г. М., Мойсеенко Н. Н., Сарафанюк Е. В.), Аналитическим центром контроля качества воды «Роса» (Кашкарова Г. П.), Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава России (Кривопалова Н. С., Сорокина Р. С.), Центром госсанэпиднадзора в г. Москве (Салова Н. Я., Малышева З. Г., Кожевникова Н. А.), Центром госсанэпиднадзора в Московской области (Козлова А. Т.), Московским НИИ генетики (Бовыкина Н. М.), НИИ коммунального водоснабжения и очистки воды (Русанова Н. А.), Российской медицинской академией последипломного образования (Власова И. В.), Российским государственным медицинским университетом (Пивоваров Ю. П.).

2. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации — Первым заместителем министра здравоохранения Российской Федерации 9 февраля 2001 г.

3. С момента ввода данных методических указаний считаются утратившими силу методические указания МУК 4.2.671-97 «Методы санитарно-микробиологического анализа питьевой воды» и Информационно-методическое письмо Департамента государственного санитарно-эпидемиологического надзора Министерства здравоохранения Российской Федерации № 1100/1670-98-111 «О дополнительных мерах по осуществлению контроля качества питьевой воды по микробиологическим и паразитологическим показателям».

3. Отбор, хранение и транспортирование проб . 2

3.1. Общие требования к отбору проб . 2

3.2. Хранение и транспортирование проб . 3

4. Оборудование, расходные материалы, реактивы, питательные среды .. 3

4.2. Расходные материалы .. 4

4.3. Химические реактивы .. 4

4.5. Тест-культуры микроорганизмов . 6

5. Приготовление питательных сред и реактивов . 6

5.4. Фуксин-сульфитная среда Эндо . 7

5.5. Лактозо-пептонная среда . 7

5.6. Питательные среды для подтверждения способности ферментировать лактозу до кислоты и газа . 7

5.7. Реактивы для оксидазного теста . 8

5.8. Железо-сульфитный агар . 8

5.9. Реактивы для окраски препаратов по Граму . 8

6. Подготовка к анализу . 9

6.1. Подготовка посуды и материалов . 9

6.2. Подготовка проб воды .. 9

7. Методика работы при использовании мембранных фильтров . 9

7.1. Подготовка мембранных фильтров . 9

7.2. Подготовка фильтровального аппарата . 9

8.1. Определение общего числа микроорганизмов, образующих колонии на питательном агаре . 10

8.2. Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий методом мембранной фильтрации (основной метод) 10

8.3. Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий титрационным методом .. 13

8.4. Определение спор сульфитредуцирующих клостридий . 15

8.5. Определение колифагов . 16

Главный государственный санитарный врач

Российской Федерации — Первый заместитель

Министра здравоохранения Российской Федерации

Дата введения: 1 июля 2001 г.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды

Методические указания
МУК 4.2.1018-01

1.1. Настоящие методические указания устанавливают методы санитарно-микробиологического контроля качества питьевой воды в отношении ее эпидемической безопасности по показателям СанПиН 2.1.4.559-96 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества».

1.2. Методические указания предназначены для лабораторий организаций, предприятий и иных хозяйственных субъектов, осуществляющих производственный контроль, а также органов санитарно-эпидемиологической службы, обеспечивающих государственный и ведомственный санитарно-эпидемиологический надзор за качеством питьевой воды централизованных систем питьевого водоснабжения.

2.1. Санитарные правила и нормы. «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества». СанПиН 2.1.4.559-96.

2.2. Санитарные правила «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности и гельминтами». СП 1.2.731-99.

2.3. ГОСТ 18963-73. Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа.

3.1.1. Отбор проб производит специалист после прохождения инструктажа по технике выполнения отбора проб для микробиологического анализа.

3.1.2. Для отбора проб воды используют специально предназначенную для этих целей одноразовую посуду или емкости многократного применения, изготовленные из материалов, не влияющих на жизнедеятельность микроорганизмов.

3.1.3. Емкости должны быть оснащены плотно закрывающимися пробками (силиконовыми, резиновыми или из других материалов) и защитным колпачком (из алюминиевой фольги, плотной бумаги). Многоразовая посуда, в т.ч. пробки, должна выдерживать стерилизацию сухим жаром или автоклавированием.

3.1.4. При отборе проб в одной и той же точке для различных целей первыми отбирают пробы для бактериологических исследований. Если отбирают воду после обеззараживания химическими реагентами, то для нейтрализации остаточного количества дезинфектанта в емкость, предназначенную для отбора проб, вносят до стерилизации натрий серноватисто-кислый в виде кристаллов из расчета 10 мг на 500 мл воды.

3.1.5. Пробу отбирают в стерильные емкости. Емкость открывают непосредственно перед отбором, удаляя пробку вместе со стерильным колпачком. Во время отбора пробка и края емкости не должны чего-либо касаться. Ополаскивать посуду запрещается.

3.1.6. При исследовании воды из распределительных сетей отбор проб из крана производят после предварительной его стерилизации обжиганием и последующего спуска воды не менее 10 мин при полностью открытом кране. При отборе пробы напор воды может быть уменьшен. Пробу отбирают непосредственно из крана без резиновых шлангов, водораспределительных сеток и других насадок. Если через пробоотборный кран происходит постоянный излив воды, отбор проб производят без предварительного обжига, не изменяя напора воды и существующей конструкции (при наличии силиконовых или резиновых шлангов).

При заполнении емкостей должно оставаться пространство между пробкой и поверхностью воды, чтобы пробка не смачивалась при транспортировании.

После наполнения емкость закрывают стерильной пробкой и колпачком.

3.1.7. Отобранную пробу маркируют и сопровождают документом отбора проб воды с указанием места, даты, времени забора, фамилии специалиста, отбиравшего пробу, и другой информации.

3.2.1. Доставку проб питьевой воды осуществляют в контейнерах-холодильниках при температуре (4 — 10) °С. В холодный период года контейнеры должны быть снабжены термоизолирующими прокладками, обеспечивающими предохранение проб от промерзания. При соблюдении указанных условий срок начала исследований от момента отбора проб не должен превышать 6 ч.

Если пробы нельзя охладить, их анализ следует провести в течение 2 ч после забора.

Если не может быть соблюдено время доставки пробы и температура хранения, анализ пробы проводить не следует.

Пробы питьевой воды должны доставляться в отдельных продезинфицированных контейнерах.

Термостат для температурного режима (37 ± 1) °С

Термостат для температурного режима (44 ± 1) °С

Термостат или водяная баня для температурного режима (44 ± 0,5) °С

Водяная баня для температурного режима (75 ± 5) °С

Водяная баня или термостат для температурного режима (45 — 49) °С (для питательных сред)

Прибор для мембранной фильтрации под вакуумом с диаметром фильтрующей поверхности 35 или 47 мм и устройство для создания разрежения (0,5 — 1,0) атм

Весы лабораторные общего назначения 4 кл. точности, с пределом взвешивания до 1000 г

Максимальный термометр ртутный с диапазоном измерения от 20 до 200 °С с ценой деления шкалы 1 °С

Термометр ртутный с диапазоном измерения от 0 до 100 °С с ценой деления шкалы 0,5 °С

рН-метр, обеспечивающий измерение с погрешностью до 0,01

Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды не ниже

Стерилизатор суховоздушный для температурного режима (180 ± 5) °С

Холодильник бытовой электрический

Вытяжной шкаф для работы с хлороформом при проведении анализа на колифаги

Нагревательный прибор для варки питательных сред либо магнитные мешалки с подогревом до 300 °С

Прибор для счета колоний бактерий

Лупа с двукратным увеличением

Дозаторы для разлива питательных сред

Оптический стандарт мутности на 10 ед.

Горелки газовые или спиртовки

Пинцеты для работы с мембранными фильтрами

Мембранные фильтры для микробиологических целей с диаметром пор не более 0,45 мкм и размером диска 35 или 47 мм и другие фильтрующие мембраны с аналогичной способностью фильтрации, имеющие сертификат качества

Индикаторы бумажные для определения рН в диапазоне 6 — 8 с интервалом определения 0,2 — 0,3

Фольга алюминиевая, колпачки силиконовые, металлические

Пипетки, вместимостью 1,5, 10 мл с ценой деления 0,1 мл многоразового или одноразового использования)

Читайте также:  Анализ химического состава сточной воды

Пробирки (многоразового или одноразового использования)

Цилиндры, вместимостью 100, 250, 500 мл или мензурки, вместимостью 250, 500, 1000 мл

Чашки бактериологические (Петри)

Пробки (силиконовые, резиновые и другие, выдерживающие стерилизацию сухим жаром или автоклавированием)

Бумага фильтровальная лабораторная

Вата хлопковая медицинская гигроскопическая

Карандаши или фломастеры по стеклу

Все химические реактивы должны соответствовать квалификации не ниже ч. д. а.

Железо серно-кислое закисное (7-водное)

Натрий серноватисто-кислый (тиосульфат натрия) 5-водный

Спирт этиловый ректификованный медицинский

Спирт этиловый технический

Натрий сернисто-кислый (сульфит натрия)

Фенилендиаминовые соединения* (тетраметил-п-фенилендиамин гидрохлорид, диметил-п-фенилендиамин соляно-кислый)

Генциан фиолетовый кристаллический

* Вещества обладают канцерогенным и мутагенным действием, работа с ними требует соблюдения мер предосторожности.

Сухой препарат с индикатором ВР и лактозой или среда Гисса с лактозой

Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей

Системы индикаторные бумажные (СИБ)

Допускаются к использованию коммерческие питательные среды, диагностические препараты и системы идентификации производства зарубежных фирм, предназначенные для целей описываемых методов. Питательные среды и биологические препараты зарубежного производства должны иметь международный сертификат качества ISO 9000 или EN 29 000.

При использовании следует руководствоваться рекомендациями фирмы-производителя.

Все обезвоженные коммерческие питательные среды и препараты отечественного производства должны иметь сертификат соответствия.

4.5.1. Контрольный колифаг М82, штамм ВКПМ-3254 Е. coli К12 F + Str r получают в ГНИИ Генетика — Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ — Россия, 113545, г. Москва, 1-ый Дорожный проезд, д. 1).

4.5.2. Штамм Е. coli М17-02 и один из штаммов: Pseudomonas aeruginosa или Pseudomonas fluorescens получают в Государственном Национальном Органе контроля медицинских и биологических препаратов им. Л. А. Тарасовича Минздрава России (Россия, 121002, г. Москва, ул. Сивцев-Вражек, д. 41).

В производственных лабораториях, расположенных на территории водопроводных станции, следует использовать штамм Pseudomonas fluorescens .

Предпочтительно использование стандартизованных сухих питательных сред промышленного производства.

При использовании промышленных сухих питательных сред их приготавливают в соответствии с указаниями изготовителя на этикетке.

В этом случае следует соблюдать способ применения и срок хранения питательных сред, указанные на упаковках.

Сухие питательные среды хранят в сухих помещениях, в темноте, при комнатной температуре. Открытые упаковки тщательно закупоривают. Среды с измененным внешним видом (уплотненные, с комками), а также с истекшим сроком годности не используют.

Для приготовления растворов, реактивов и питательных сред применяют воду дистиллированную по ГОСТу 6709-72.

Питательные среды готовят в посуде из инертного материала.

Учитывая возможное изменение рН питательных сред после кипячения и стерилизации, окончательный контроль рН проводят в готовой среде при температуре 25 °С с использованием индикаторной бумаги.

После стерилизации питательные среды оставляют для охлаждения при комнатной температуре. При необходимости розлива в чашки Петри среды охлаждают до температуры (50 — 60) °С.

Температура сред, хранящихся в холодильнике, перед посевом должна быть доведена до комнатной.

5.2.1. Готовят из сухого препарата промышленного производства по способу, указанному на этикетке.

5.2.2. Питательный бульон (десятикратный) для колифагов готовят путем увеличения в 10 раз навески сухого препарата, указанной на этикетке.

5.3.1. Готовят из сухого препарата промышленного производства по способу, указанному на этикетке.

5.3.2. Питательный агар для определения колифагов прямым методом готовят, увеличивая навеску сухого препарата в 2 раза от прописи.

5.3.3. Питательный агар запрещается выдерживать в расплавленном состоянии более 8 ч. Оставшийся неиспользованным агар повторному расплавлению не подлежит.

5.3.4. Полужидкий питательный агар готовят следующим образом: сухой питательный бульон (15 г) и агар микробиологический (3 г) растворить при нагревании в 1000 мл дистиллированной воды. Довести рН до 7,0 — 7,2, разлить в пробирки и стерилизовать автоклавированием при 121 °С в течение 15 мин.

5.3.5. Питательный агар со стрептомицином готовят из расчета содержания 100 мкг стрептомицина на 1 мл питательного агара, приготовленного по стандартной прописи. Стерильно на стерильной дистиллированной воде готовят раствор стрептомицина в концентрации 10 мг на 1 мл. В готовый питательный агар, отмеренный по объему и остуженный до температуры (45 — 49) °С, вносят приготовленный стерильный раствор стрептомицина из расчета 0,1 мл на 10 мл питательного агара. Разливают в пробирки для приготовления скошенного агара. Повторное расплавление питательной среды со стрептомицином запрещается.

Готовят из сухого препарата по способу, указанному на этикетке. Если на поверхности среды заметны следы влаги, чашки перед посевом необходимо подсушить. Срок хранения чашек со средой не более 2 — 3 суток в темноте, если производителем не оговорены другие сроки.

5.4.2. Повышение дифференцирующих свойств среды

Для повышения дифференцирующих свойств среды в готовую и охлажденную до (60 — 70) °С среду перед разливкой в чашки допускается прибавлять на 100 мл среды 0,2 мл 5 %-ного спиртового раствора основного фуксина. Срок хранения раствора фуксина — не более 1 мес.

5.4.3. Модификация среды с добавлением розоловой кислоты

В случаях, когда мембранные фильтры зарастают микрофлорой, не относящейся к бактериям кишечной группы, помимо фуксина, допускается добавление на 100 мл среды Эндо 0,2 мл 5 %-ного спиртового раствора розоловой кислоты. Срок хранения раствора розоловой кислоты — не более 1 мес.

Модификацию среды Эндо с добавлением розоловой кислоты используют только при работе методом мембранной фильтрации.

10 г пептона, 5 г натрия хлористого, 5 г лактозы растворяют при нагревании в 1 л дистиллированной воды. После растворения ингредиентов устанавливают рН 7,4 — 7,6, разливают по 10 мл в пробирки, стерилизуют при (112 ± 2) °С 12 мин.

Для приготовления концентрированной лактозо-пептонной среды все ингредиенты, кроме воды, увеличивают в 10 раз, разливают по 1 мл в пробирки и по 10 мл во флаконы.

5.6.1. Полужидкая среда с лактозой из сухого препарата

Готовят по способу, указанному на этикетке.

Срок хранения — не более 2 недель при комнатной температуре.

Посев производят уколом до дна пробирки. При образовании кислоты цвет питательной среды изменяется в соответствии с использованным индикатором. При газообразовании газ скапливается или по уколу, или на поверхности, или в толще среды появляются разрывы. При инкубации посевов более 5 ч газ может улетучиться. В таких случаях на присутствие газа указывают оставшиеся в толще среды «карманы» — потемнения среды на месте бывшего пузырька газа.

5.6.2. Полужидкая среда с лактозой

Готовят при отсутствии сухого препарата.

В 1 л дистиллированной воды растворяют 10 г пептона, 5 г натрия хлористого, (4 — 5) г агар-агара, доводят до кипения, устанавливают рН 7,2 — 7,4, добавляют 1 мл 1,6 %-ного спиртового раствора бромтимолового синего. Стерилизуют при (120 ± 2) °С 20 мин. В расплавленную среду вносят 5 г лактозы, нагревают до кипения, разливают в стерильные пробирки на высоту (3 — 5) см и стерилизуют при (112 ± 2) °С 12 мин. Срок хранения — не более 2 недель при комнатной температуре.

Правильно приготовленная среда зеленого цвета с синеватым оттенком (цвет бутылочного стекла). При Образовании кислоты цвет среды изменяется на желтый.

5.6.3. Лактозо-пептонная среда

Готовят по п. 5.5 с добавлением 1 мл 1,6 %-ного спиртового раствора бромтимолового синего на 1 л и разливают по (3 — 5) мл в пробирки с поплавком.

Готовят по прописи завода-изготовителя.

1 %-ный водный раствор тетраметил-п-фенилендиамина гидрохлорид. Готовят перед употреблением.

Реактив № 1. 1 %-ный спиртовой раствор α-нафтола.

Реактив № 2. 1 %-ный водный раствор фенкпендиаминового соединения.

Растворы сохраняют в темных флаконах с притертыми пробками:

1 — до одного месяца, 2 — до одной недели. Перед употреблением к трем частям первого раствора добавляют семь частей второго раствора.

Могут быть использованы коммерческие тест-системы для постановки оксидазного теста (СИБ-оксидаза или аналоги).

Перед работой с каждой серией проб реактивы или тест-системы на оксидазу следует испытывать с тест-культурами микроорганизмов, дающих положительную ( Ps . aeruginosa , Ps . fluorescens ) и отрицательную оксидазную реакцию (E. coli).

В 1000 мл стерильного расплавленного питательного агара (по п. 5.4) добавляют 10 г глюкозы, нагревают до растворения, разливают мерно во флаконы, автоклавируют при (112 ± 2) °С 12 мин (основная среда).

20 %-ный раствор сульфита натрия ( Na 2 SO 3 ) и 8 %-ный раствор железа серно-кислого закисного ( FeSO 4 ) или железа хлористого ( FeCl 2 ) готовят непосредственно перед употреблением в стерильной посуде на стерильной дистиллированной воде. Раствор сульфита натрия нагревают до полного растворения. Перед выполнением анализа в 100 мл расплавленной основной среды вносят 5 мл 20 %-ного раствора сульфита натрия, перемешивают, затем вносят 1 мл 8 %-ного раствора сернокислого железа, перемешивают и стерильно разливают в пробирки высоким столбиком (12 — 15) см для работы методом мембранной фильтрации или во флаконы для работы методом прямого посева.

5.9.1. Карболовый раствор генциана фиолетового готовят следующим образом: 1 г генциана фиолетового, 10 мл ректификованного этилового спирта, 5 г фенола растирают в ступке, добавляя 100 мл дистиллированной воды.

5.9.2. Раствор Люголя готовят следующим образом: 1 г йода, 2 г йодистого калия растворяют в 300 мл дистиллированной воды. Хранить во флаконе из темного стекла.

5.9.3. Фуксин Циля готовят следующим образом: 1 г основного фуксина, 10 мл спирта этилового ректификованного, 54 г фенола растирают в ступке, добавляя 100 мл дистиллированной воды.

Лабораторную посуду моют, ополаскивают сначала водопроводной, затем дистиллированной водой и высушивают.

Пробирки, колбы, бутылки, флаконы закрывают силиконовыми или ватно-марлевыми пробками и колпачками (силиконовые, металлические, из фольги или плотной бумаги).

Пипетки со вставленными тампонами из ваты укладывают в металлические пеналы или заворачивают в бумагу.

Чашки Петри укладывают в металлические пеналы или заворачивают в бумагу. Бумага, используемая для обертывания лабораторной посуды, не должна разрушаться при стерилизации.

Подготовленную посуду стерилизуют в сушильном шкафу при температуре 160 °С в течение 2 ч или 180 °С 1 ч, считая с момента достижения указанной температуры. Стерильную посуду вынимают из стерилизационного шкафа после его охлаждения ниже 60 °С. Срок хранения стерильной посуды — не более 10 дней.

Материалы и лабораторную посуду, разрушающиеся при температуре (160 — 180) °С (резина и т.п.), следует стерилизовать в паровом стерилизаторе при температуре (121 ± 2) °С 20 мин.

Новые резиновые пробки кипятят в 2 %-ном растворе натрия двууглекислого 30 мин и 5 раз промывают водопроводной водой (кипячение и промывание повторяют дважды). Затем пробки кипятят в дистиллированной воде 30 мин, высушивают, заворачивают в бумагу или фольгу и стерилизуют в паровом стерилизаторе. Резиновые пробки, использованные ранее, обеззараживают, кипятят 30 мин в водопроводной воде с нейтральным моющим средством, промывают в водопроводной воде, высушивают, монтируют и стерилизуют.

После выполнения анализа все использованные чашки, пробирки и пипетки обеззараживают в автоклаве при (126 ± 2) °С в течение 60 мин, в исключительных случаях допускается обеззараживание кипячением в 2 %-ном растворе пищевой соды или 0,5 %-ном моющего средства в течение 60 мин с момента закипания (в закрытой емкости с полным погружением в раствор).

Перед посевом пробу тщательно перемешивают и фламбируют горящим тампоном край емкости. Используемые пробирки и чашки маркируют.

Перед каждым отбором новой порции воды для анализа пробу перемешивают стерильной пипеткой.

Мембранные фильтры должны быть подготовлены к анализу в соответствии с указаниями изготовителя.

Воронку и столик фильтровального аппарата обтирают марлевым (ватным) тампоном, смоченным спиртом ректификованным, и фламбируют. После охлаждения на столик фильтровального аппарата кладут фламбированным пинцетом стерильный мембранный фильтр, прижимают его воронкой.

В воронку прибора для фильтрования наливают отмеренный объем воды, затем создают вакуум.

При посеве нескольких объемов одной пробы следует фильтровать через один фильтровальный аппарат без обеззараживания сначала меньшие, а затем большие объемы воды, меняя каждый раз фильтры. Перед фильтрованием каждой новой пробы прибор обеззараживают.

Следует начинать с фильтрования проб обеззараженной воды или тех проб, которые предположительно не загрязнены, а затем фильтровать загрязненные пробы.

При фильтровании 1 мл исследуемой воды следует в воронку налить предварительно не менее 10 мл стерильной воды, а затем внести анализируемую воду.

После окончания фильтрования и осушения фильтра отключают вакуум, воронку снимают, фильтр осторожно поднимают за край фламбированным пинцетом и переносят его, не переворачивая, на питательную среду, разлитую в чашки Петри, избегая пузырьков воздуха между средой и фильтром. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх.

Под каждым фильтром на дне чашки делают надпись с указанием объема профильтрованной воды, номера пробы и даты посева. На одну чашку можно поместить 3 — 4 фильтра с условием, чтобы фильтры не соприкасались.

8.1.1. Определение понятия показателя

Метод определяет в питьевой воде общее число мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (ОМЧ), способных образовывать колонии на питательном агаре при температуре 37 °С в течение 24 ч, видимые с увеличением в 2 раза.

Из каждой пробы делают посев не менее двух объемов по 1 мл.

После тщательного перемешивания пробы воды вносят по 1 мл в стерильные чашки Петри, слегка приоткрывая крышки. После внесения воды в каждую чашку вливают (8 — 12) мл (на чашку диаметром 90 — 100 мм) расплавленного и остуженного до (45 — 49) °С питательного агара после фламбирования края посуды, в которой он содержится. Затем быстро смешивают содержимое чашек, равномерно распределяя по всему дну, избегая образования пузырьков воздуха, попадания агара на края и крышку чашки. Эту процедуру производят на горизонтальной поверхности, где чашки оставляют до застывания агара.

Расплавленный агар на период проведения анализа помещают в водяную баню или термостат, поддерживающие температуру (45 — 49) °С.

После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат вверх дном и инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение (24 ± 2) ч.

Подсчитывают все выросшие на чашке колонии, наблюдаемые при увеличении в 2 раза. Учитывают только те чашки, на которых выросло не более 300 изолированных колоний.

Количество колоний на обеих чашках суммируют и делят на два. Результат выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл исследуемой пробы воды.

Если на одной из 2 чашек подсчет невозможен, результат выдают на основании учета колоний на одной чашке. Если на двух чашках имеет место рост расплывчатых колоний, не распространяющийся на всю поверхность чашки, или выросло более 300 колоний и анализ нельзя повторить, подсчитывают сектор чашки с последующим пересчетом на всю поверхность. В этих случаях в протоколе отмечают «число КОЕ/мл — ориентировочно».

Если подсчет колоний на чашках невозможен, то в протоколе отмечают «сплошной рост».

8.2. Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий методом мембранной фильтрации (основной метод)

8.2.1. Определение понятия показателя

Общие колиформные бактерии (ОКБ) — грамотрицательные, оксидазоотрицательные, не образующие спор палочки, способные расти на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре (37 + 1) °С в течение (24 — 48) ч.

Термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ) входят в число общих колиформных бактерий, обладают всеми их признаками и, кроме того, способны ферментировать лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре (44 ± 0,5) °С в течение 24 ч.

Метод основан на фильтрации установленного объема воды через мембранные фильтры, выращивании посевов на дифференциальной питательной среде с лактозой и последующей идентификации колоний по культуральным и биохимическим свойствам.

8.2.3.1. Порядок исследования

При исследовании питьевой воды анализируют 3 объема по 100 мл.

При получении стабильных отрицательных результатов допустима фильтрация 300 мл воды через один фильтр.

При фильтрации воды неизвестного качества целесообразно увеличение количества фильтруемых объемов для получения изолированных колоний на фильтре (например, 10, 40, 100, 150 мл воды).

Отмеренный объем воды фильтруют через мембранные фильтры с соблюдением требований, изложенных в п. 7.

Фильтры помещают на среду Эндо, приготовленную по п. 5.4. Чашки с фильтрами ставят в термостат дном вверх и инкубируют посевы при температуре (37 ± 1) °С в течение (24 ± 2) ч.

Если на фильтрах нет роста или выросли колонии пленчатые, губчатые, плесневые, прозрачные, расплывчатые, выдают отрицательный ответ: отсутствие ОКБ и ТКБ в 100 мл исследуемой воды. Анализ заканчивают через 24 ч.

Если на фильтрах обнаружен рост изолированных типичных лактозоположительных колоний: темно-красных, красных с металлическим блеском или без него или других подобного типа колоний с отпечатком на обратной стороне фильтра, подсчитывают число колоний каждого типа отдельно и приступают к подтверждению их принадлежности к ОКБ и ТКБ.

Для подтверждения наличия ОКБ исследуют:

· все колонии, если на фильтрах выросло менее 5 колоний;

· не менее 3 — 4 колоний каждого типа.

Для подтверждения наличия ТКБ исследуют все типичные колонии, но не более 10.

Каждую выбранную изолированную колонию исследуют на:

· наличие оксидазной активности;

· принадлежность к Граму (микроскопия окрашенного по Граму препарата или постановка теста Грегерсена);

· ферментацию лактозы до кислоты и газа.

8 2.3 2. Постановка оксидазного теста

Полоску фильтровальной бумаги помещают в чистую чашку Петри и смачивают 2 — 3 каплями реактива для оксидазного теста по п. 5.7. Готовые бумажные системы смачивают дистиллированной водой. Часть изолированной колонии стеклянной палочкой или платиновой петлей (металлическая петля из нихрома может дать ложноположительную реакцию) наносят штрихом на подготовленную фильтровальную бумагу. Реакция считается положительной, если в течение 1 мин появляется фиолетово-коричневое ( п. 5.7.1 вариант 1) или синее ( п. 5.7.2 вариант 2 и СИБ-оксидаза) окрашивание штриха. При отрицательной реакции цвет в месте нанесения культуры не меняется. При положительном результате эту колонию из дальнейшего исследования исключают.

Если при исследовании колоний, окрашенных в темно-красный цвет, получают недостаточно четкий результат, необходимо пересеять культуру со среды Эндо на питательный агар. После инкубации тест повторяют.

8.2.3.3. Определение принадлежности к Граму

Из оксидазоотрицательной колонии делается мазок, окрашивается по Граму и микроскопируется.

На обезжиренное спиртом предметное стекло наносят петлей 1 каплю дистиллированной воды, вносят небольшое количество культуры из анализируемой колонии и распределяют по поверхности стекла. Мазок высушивают при комнатной температуре и фиксируют трехкратным проведением через пламя горелки. На препарат накладывают полоску фильтровальной бумаги и на нее наливают карболовый раствор генциана фиолетового на (0,5 — 1) мин, снимают бумагу, наливают раствор Люголя на (0,5 — 1) мин, сливают раствор Люголя и стекло промывают в этиловом спирте в течение (0,5 — 1) мин, пока не перестанет отходить краситель. Затем стекло тщательно промывают водой и докрашивают в течение (1 — 2) мин фуксином Циля, разведенным 1:10 дистиллированной водой. После промывания и просушивания препарата мазок микроскопируют.

Приготовление реактивов для окраски по Граму изложено в п. 5.9.

Грамотрицательные микроорганизмы имеют розовую окраску, грамположительные окрашиваются в синий цвет. Колиформные бактерии являются грамотрицательными палочками.

Окраска по Граму может быть заменена тестом Грегерсена, не требующим использования оптики.

Тест Грегерсена: в капле 3 %-ного водного раствора КОН на предметном стекле эмульгируют бактерийную массу, взятую с плотной среды. После нескольких секунд перемешивания петлей взвесь ослизняется и за петлей тянутся слизистые нити, что указывает на принадлежность испытуемой культуры или колонии к грамотрицательному виду. У грамположительных бактерий слизистые нити не образуются — реакция отрицательная.

8.2.3.4. Определение ферментации лактозы

Оставшуюся часть оксидазоотрицательной грамотрицательной изолированной колонии засевают параллельно в две пробирки с лактозной средой ( п. 5.6):

· для подтверждения наличия ОКБ посев инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение 48 ч;

· для подтверждения наличия ТКБ посев осуществляют в среду, предварительно прогретую до температуры (43 — 44) °С, и инкубируют при температуре (44 ± 0,5) °С в течение 24 ч.

Первичный учет образования кислоты и газа на подтверждающих полужидких средах и СИБ ( п. 5.6) возможен через (4 — 6) ч. При обнаружении кислоты и газа дают положительный ответ. При отсутствии кислоты и газа или при наличии только кислоты пробирки с посевами для окончательного учета ТКБ оставляют до 24 ч. Пробирки с посевами для подтверждения наличия ОКБ после просмотра через 24 ч и получения отрицательного результата оставляют для окончательного учета до 48 ч.

Если колония, подлежащая исследованию, незначительных размеров, ее пересевают на скошенный питательный агар и после инкубации в течение (18 — 24) ч выполняют все необходимые подтверждающие тесты.

8.2.3.5. Постановка подтверждающих тестов при наложении колоний или сплошном росте

Если на части или на всей поверхности фильтра наблюдается наложение колоний или сплошной рост, выполняют оксидазный тест путем помещения мембранного фильтра на кружок фильтровальной бумаги большего диаметра, чем фильтр, обильно смоченный реактивом, или на диск СИБ-оксидаза, смоченный дистиллированной водой. При появлении первых признаков реакции, но не более чем через 5 мин, мембранный фильтр переносят обратно на среду Эндо. После четкого проявления реакции определяют результат. При появлении фиолетово-коричневого или синего окрашивания (в зависимости от примененного реактива) оксидазный тест считают положительным.

Если на фильтрах все колонии оксидазоположительные, они не учитываются и выдают ответ об отсутствии ОКБ и ТКБ и завершают анализ.

При отрицательной оксидазной реакции проводят рассев до получения изолированных колоний и подтверждают их принадлежность к ОКБ и ТКБ по п. п. 8.2.3.3 — 8.2.3.4 (анализ качественный).

8.2.4.1. Грамотрицательные колонии учитываются как ОКБ при отрицательном оксидазном тесте и ферментации лактозы при температуре 37 °С с образованием кислоты и газа.

Грамотрицательные колонии учитываются как ТКБ при отрицательном оксидазном тесте и ферментации лактозы при температуре 44 °С с образованием кислоты и газа.

8.2.4.2. При отсутствии общих и термотолерантных колиформных бактерий на всех фильтрах результат записывают «не обнаружено КОЕ ОКБ в 100 мл» и «не обнаружено КОЕ ТКБ в 100 мл».

Читайте также:  Анализ химического состава питьевой воды

8.2.4.3. В случае идентификации всех выросших подозрительных колоний число колониеобразующих единиц ОКБ и ТКБ подсчитывают на всех фильтрах и выражают результат анализа КОЕ в 100 мл воды.

Вычисление проводят по формуле:

, где

Х — число колоний в 100 мл;

V — профильтрованный объем воды через фильтры, на которых велся учет;

а — число подсчитанных на этих фильтрах колоний в сумме.

1. При посеве 3 фильтров по 100 мл выросло две колонии в 100 мл, на остальных двух фильтрах нет роста. Число общих или термотолерантных колиформных бактерий будет:

КОЕ ОКБ (ТКБ) в 100 мл

2. При посеве 10, 40, 100 и 150 мл на фильтрах с профильтрованным объемом 40 мл выросло 4 изолированные колонии, с профильтрованным объемом 100 — 3 ОКБ. Фильтры с объемами 10 мл и 150 мл заросли и учету не подлежат. Суммируют общее число колоний ОКБ (ТКБ) на тех фильтрах, где получены изолированные колонии, и пересчитывают на объем 100 мл.

КОЕ в 100 мл

8.2.4.4. Если при выборочной проверке колоний одного типа получены неодинаковые результаты, то вычисляют числа ОКБ или ТКБ среди колоний этого типа по формуле:

, где

Х — число подтвержденных бактерий одного типа;

а — общее число колоний этого типа;

b число проверенных из них;

с — число колоний с положительным результатом.

Полученные результаты учета по каждому типу колоний суммируют и далее подсчитывают по п. 8.2.4.3 — 8.2.4.4.

8.2.4.5. Окончательный результат выдают: количество КОЕ ОКБ в 100 мл, из них количество КОЕ ТКБ в 100 мл.

Ориентировочный результат может быть выдан при обнаружении типичных колиформных колоний на среде Эндо, образованных грамотрицательными оксидазоотрицательными бактериями. Окончательный ответ подтверждается по результатам ферментации лактозы.

8.2.4.6. При наложении колоний или сплошном росте на всех фильтрах ( п. 8.2.3.5) в случае подтверждения принадлежности к ОКБ и ТКБ выдается качественный результат «обнаружено ОКБ в 100 мл».

Если все колонии на фильтре оксидазоположительные или не подтвердилась их принадлежность к ОКБ и ТКБ, анализ завершается, в протоколе отмечают «зарост фильтров».

В обоих случаях анализ повторяют.

8.3.1. Определение понятия показателя

Определение понятия показателей ОКБ и ТКБ по п. 8.2.1.

Титрационный метод может быть использован:

· при отсутствии материалов и оборудования, необходимых для выполнения анализа методом мембранной фильтрации;

· при анализе воды с большим содержанием взвешенных веществ;

· в случае преобладания в воде посторонней микрофлоры, препятствующей получению на фильтрах изолированных колоний общих колиформных бактерий.

Метод основан на накоплении бактерий после посева установленного объема воды в жидкую питательную среду, с последующим пересевом на дифференциальную плотную питательную среду с лактозой и идентификации колоний по культуральным и биохимическим тестам.

При исследовании питьевой воды качественным методом (текущий санэпиднадзор, производственный контроль) засевают 3 объема по 100 мл.

При исследованиях воды с целью количественного определения ОКБ и ТКБ при повторном анализе производят посев: 3 объемов по 100 мл, 3 объемов по 10 мл, 3 объемов по 1 мл.

Каждый объем исследуемой воды засевают в лактозо-пептонную среду, приготовленную по п. 5.5. Посев 100 мл и 10 мл воды производят в 10 и 1 мл концентрированной лактозо-пептонной среды, посев 1 мл пробы проводят в 10 мл среды обычной концентрации.

Посевы инкубируют при (37 ± 1) °С в течение 48 ч. Не ранее 24 час инкубации проводят предварительную оценку посевов. Из емкостей, где отмечено наличие роста (помутнение) и образование газа, производят высев бактериологической петлей на сектора среды Эндо ( п. 5.4.1) для получения изолированных колоний.

Емкости без наличия роста и образования газа оставляют в термостате и окончательно просматривают через 48 ч. Посевы без признаков роста считают отрицательными и дальнейшему исследованию они не подлежат. Из емкостей, где отмечено помутнение и образование газа или только помутнение, делают высев на сектора среды Эндо.

Посевы на среде Эндо инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение (18 — 20) ч.

При образовании помутнения и газа в среде накопления и росте на среде Эндо колоний, типичных для лактозоположительных бактерий: темно-красных или красных, с металлическим блеском или без него, выпуклых с красным центром и отпечатком на питательной среде, дают положительный ответ на присутствие общих колиформных бактерий в данном объеме пробы.

Наличие ОКБ требуется подтвердить:

· если в среде накопления отмечено только помутнение;

· если принадлежность к лактозоположительным колониям вызывает сомнение у исследователя.

· проверяют наличие отпечатка на среде Эндо после снятия петлей подозрительной колонии;

· выполняют оксидазный тест по п. 8.2.3.2;

· подтверждают принадлежность к Граму по п. 8.2.3.3;

· подтверждают способность к газообразованию при посеве изолированных 1 — 2 колоний каждого типа с каждого сектора на среду с лактозой по п. 5.6 с последующей инкубацией посевов при температуре (37 ± 1) °С в течение (24 — 48) ч.

При отсутствии изолированных колоний проводят рассев на среду Эндо общепринятыми бактериологическими методами.

Отрицательный ответ дают, если:

· в среде накопления нет признаков роста;

· на секторах среды Эндо нет роста;

· на секторах среды Эндо выросли не характерные для колиформных бактерий колонии (прозрачные с неровными краями, расплывчатые и т.п.);

· все колонии оказались оксидазоположительными;

· все колонии оказались грамположительными;

· если в подтверждающем тесте на среде с углеводом не отмечено газообразования.

Для определения термотолерантных колиформных бактерий работают с секторами среды Эндо, где выросли типичные лактозоположительные колонии. Делают посев 2 — 3 изолированных колоний каждого типа с каждого сектора в пробирки с любой из лактозных сред, приготовленных по п. 5.6.

Среду перед посевом нагревают на водяной бане или в термостате до 44 °С. Немедленно после посева пробирки помещают в термостат и инкубируют при температуре (44 ± 0,5) °С в течение 24 ч. Допускается просмотр посевов через (4 — 6) ч.

При образовании газа в среде накопления, росте на среде Эндо лактозоположительных бактерий и выявлении способности этих бактерий ферментировать лактозу до кислоты и газа в течение 24 ч при температуре 44 °С дают положительный ответ на наличие в этом объеме пробы воды ТКБ. Во всех остальных случаях дают отрицательный ответ.

Допустимо для ускорения выдачи ответа на присутствие ТКБ производить высев 1 мл из объемов среды накопления, где отмечено помутнение и газообразование в пробирке с лактозо-пептонной средой с поплавком по п. 5.6 и прогретой предварительно до температуры 44 °С. Посевы выдерживают в термостате при температуре (44 ± 0,5) °С в течение 24 ч. При обнаружении кислоты и газа дают положительный ответ.

При исследовании 3 объемов по 100 мл результаты оцениваются качественно и при обнаружении ОКБ и ТКБ хотя бы в одном из 3 объемов, делается запись в протоколе «обнаружены в 100 мл».

При исследовании количественным методом определяют наиболее вероятное число (НВЧ) ОКБ и ТКБ по табл. 1.1 приложения 1.

Результат сообщают без доверительного интервала.

При отрицательном ответе на наличие ОКБ и ТКБ во всех исследованных объемах выдают заключение в протоколе «не обнаружены в 100 мл».

8.4.1. Определение понятия показателя

Сулъфитредуцирующие клостридии — спорообразующие анаэробные палочковидные микроорганизмы, редуцирующие сульфит натрия на железо-сульфитном агаре при температуре (44 ± 1) °С в течение (16 — 18) ч.

Метод основан на выращивании посевов в железо-сульфитном агаре в условиях, приближенных к анаэробным, и подсчете числа черных колоний.

8.4.3.1. Пробу воды 20 мл прогревают на водяной бане в пробирках при температуре (75 ± 5) °С в течение 15 мин для исключения вегетативных форм.

При исследовании хлорированной воды прогревание пробы можно не производить.

Из каждой пробы питьевой воды делают посев или фильтруют 20 мл. При необходимости подбирают объемы с таким расчетом, чтобы в посевах (на фильтрах) выросло не более 10 — 15 колоний. При этом ориентируются на результаты предыдущих исследований.

Фильтрование воды производят в соответствии с требованиями, изложенными в п. 7.

8.4.3.2. Определение методом фильтрования в пробирках

Перед посевом пробирки с железо-сульфитным агаром, приготовленным по п. 5.8, расплавляют на водяной бане (не кипятить!). В течение посева поддерживают среду нагретой до (70 — 80) °С в водяной бане.

После фильтрования установленного объема воды мембранный фильтр фламбированным пинцетом берут за два противоположных края и согнутый в виде трубочки помещают в пробирку с горячим агаром. Сторона фильтра с осевшими бактериями обращена внутрь. При этом фильтр распрямляется и располагается по стенке пробирки.

Сразу же после посева пробирку с агаром и фильтром для создания анаэробных условий быстро охлаждают, помещая в емкость с холодной водой. Культивируют посевы при (44 ± 1) °С в течение (16 — 18) ч.

8.4.3.3. Определение методом фильтрования в чашках Петри

Чашки Петри диаметром (55 — 60) мм заливают тонким слоем железо-сульфитного агара. После фильтрации фильтр поместить фильтрующей поверхностью вниз на застывшую питательную среду так, чтобы под фильтром не было пузырьков воздуха. Затем заливают расплавленным железо-сульфитным агаром до верхнего края чашки, чтобы крышка плотно прилегала к среде для создания анаэробных условий. Культивируют посевы при (44 ± 1) °С в течение (16 — 18) ч.

8.4.3.4. Определение прямым посевом

Железо-сульфитный агар во флаконах и пробу воды готовят, как это описано в п. 8.4.3.1.

В стерильные пробирки вносят:

· по 10 мл в 2 пробирки (объемом не менее 30 мл) или

· по 5 мл в 4 пробирки (объемом по 15 мл).

Посевы заливают горячим железо-сульфитным агаром в количестве, превышающем объем воды в 2 раза. Среду заливать по стенке пробирки, избегая образования пузырьков воздуха. После этого пробирку быстро охлаждают, помещая ее в емкость с холодной водой для создания анаэробных условий. Посевы инкубируют при (44 ± 1) °С в течение (16 — 18) ч.

Количественному учету подлежат только те посевы, где получены изолированные колонии. Подсчитывают черные колонии, выросшие как на фильтрах, так и в толще питательной среды.

Результат анализа выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) спор сульфитредуцирующих клостридий в 20 мл воды.

При отсутствии роста черных колоний на всех фильтрах дают ответ «не обнаружено в 20 мл воды».

При невозможности учета колоний из-за сливного роста результат оценивается как качественный, в протоколе отмечают «обнаружено в 20 мл». При необходимости получения количественного результата анализ повторяют.

8.5.1. Определение понятия показателя

Колифаги — бактериальные вирусы, способные лизировать E. coli и формировать при температуре (37 ± 1) °С через (18 ± 2) ч зоны лизиса бактериального газона (бляшки) на питательном агаре.

8.5.2. Титрационный метод определения колифагов

Определение колифагов в питьевой воде заключается в предварительном накоплении колифагов в среде обогащения на культуре E. coli и последующем выявлении зон лизиса (просветления) газона E. coli на питательном агаре.

Метод предназначен для проведения текущего контроля качества питьевой воды.

8.5.2.3. Подготовка тест-культуры E. coli К12 Str R .

На всех этапах исследования используют бактериальную взвесь, приготовленную следующим образом: культуру E. coli засевают в пробирку со скошенным питательным агаром со стрептомицином ( п. 5.3.5). Через (18 ± 2) ч инкубации при температуре (37 ± 1) °С произвести смыв бактерий с косяка 5 мл стерильного физиологического раствора (0,85 %-ный раствор NaCl ) и по стандарту мутности готовят взвесь E. coli в концентрации 10 9 бактериальных клеток в 1 мл.

Допускается использование 4-часовой бульонной культуры E. coli, полученной путем подращивания в термостате при температуре 37 °С. Концентрация 10 9 бактериальных клеток E. coli содержится в 2 мл.

8.5.2.4. Проведение качественного анализа

В исследуемую пробу воды объемом 100 мл вносят 10 мл 10-кратного питательного бульона (приготовленного по п. 5.2.2) и 1 мл подготовленного смыва тест-культуры или 2 мл 4-часовой бульонной культуры ( п. 8.5.2.3).

Для контроля культуры 0,1 мл смыва бактерий Е. c oli (или 0,2 мл 4-часовой бульонной культуры) помещают в чашку Петри и заливают питательным агаром.

Исследуемую пробу воды (100 мл) и чашку Петри с контролем E. coli помещают в термостат и инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение (18 ± 2) ч.

После инкубации из исследуемой пробы воды отливают в пробирку 10 мл и добавляют 1 мл хлороформа.

Пробирку закрывают стерильной резиновой или силиконовой пробкой, энергично встряхивают для равномерного распределения хлороформа по объему пробы и оставляют при комнатной температуре не менее 15 мин до полного осаждения хлороформа.

В предварительно расплавленный и остуженный до (45 — 49) °С питательный агар добавляют приготовленный смыв бактерий E. coli ( п. 8.5.2.3) из расчета 1,0 мл смыва (или 2 мл 4-часовой бульонной культуры) на 100 мл агара.

В стерильную чашку Петри пипеткой из пробирки переносят 1 мл обработанной хлороформом пробы (не касаясь хлороформа) и заливают смесью расплавленного и остуженного до (45 — 49) °С питательного агара объемом (12 — 15) мл, а также одну дополнительную чашку Петри для контроля культуры E. coli и осторожно покачивают для равномерного перемешивания пробы воды и агара. Для полного застывания чашки оставляют на столе при комнатной температуре на 10 мин. После застывания чашки переворачивают и помещают в термостат на (18 ± 2) ч при 37 °С.

При выполнении серии проб ставится общий контроль для всей серии.

Просмотр посевов осуществляют в проходящем свете.

Проба считается положительной при наличии полного лизиса, просветления нескольких бляшек, одной бляшки на чашке с пробой воды при отсутствии зон лизиса на контрольной чашке.

В протоколе анализа отмечается: колифаги обнаружены или не обнаружены в 100 мл воды (результат качественный).

При наличии зон лизиса в контроле культуры результат считается недействительным.

8.5.2.5. Проведение количественного анализа

Исследуемую пробу воды в количестве 100 мл разлить на 6 объемов: 1 флакон 50 мл и 5 пробирок по 10 мл. В 50 мл пробы добавить 5 мл десятикратного питательного бульона (по п. 5.2.2) и 0,5 мл смыва (или 1 мл 4-часовой бульонной культуры) бактерий E. coli ( п. 8.5.2.3). В каждые 10 мл пробы внести по 1 мл десятикратного питательного бульона и 0,1 мл смыва (или 0,2 мл 4-часовой бульонной культуры) бактерий E. coli.

Для контроля культуры 0,1 мл смыва бактерий (или 0,2 мл 4-часовой бульонной культуры) E. coli помещают в чашку Петри и заливают питательным агаром.

Посевы инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение 18 ± 2 ч.

После инкубации из объема 50 мл отлить в пробирку 10 мл. Во все исследуемые 6 объемов добавить по 1 мл хлороформа. Пробирки закрыть стерильными резиновыми или силиконовыми пробками, энергично встряхнуть для равномерного распределения хлороформа по объему пробы и оставить при комнатной температуре не менее 15 мин для осаждения хлороформа.

В предварительно расплавленный и остуженный до (45 — 49) °С питательный агар добавить приготовленный смыв бактерий E. coli ( п. 8.5.2.3) из расчета 1,0 мл смыва (или 2 мл 4-часовой бульонной культуры) на 100 мл агара. Приготовленную смесь разлить в чашки Петри: 1 чашку для контроля культуры E. coli на лизогенность и по одной чашке на каждую исследуемую пробу воды. При одновременном анализе нескольких проб воды ставится один контроль культуры E. coli.

После застывания агара чашки, предназначенные для посева проб, разделить на 6 секторов, промаркировать их в соответствии с исследуемыми объемами. На каждый сектор из соответствующей пробирки нанести пастеровской пипеткой (микропипеткой или бактериологической петлей продольным штрихом) по 1 капле надосадочной жидкости (без хлороформа).

После подсыхания капель чашки с исследуемыми пробами и контрольную чашку поместить в термостат при (37 ± 1) °С на (18 ± 2) ч.

Просмотр результатов осуществляется в проходящем свете.

Учет проводится по наличию зон просветления (лизиса) на секторах газона E. coli.

При применении капельного способа посева пипеткой образуется зона лизиса в виде округлого пятна или отдельных бляшек. При посеве продольным штрихом бактериологической петлей отмечается лизис по ходу штриха.

Проба считается положительной при наличии зоны лизиса хотя бы на одном секторе при отсутствии зон лизиса на контрольной чашке.

Оценка проводится по таблице наиболее вероятного числа (НВЧ) бляшкообразующих единиц (БОЕ) (табл. 1.2). В протоколе анализа указывается наиболее вероятное количество колифагов в 100 мл воды и диапазон возможных колебаний: НВЧ БОЕ (нижний предел — верхний предел) колифагов в 100 мл. Результат полуколичественный.

При наличии зон лизиса в контрольной чашке результат считать недействительным.

8.5.3. Прямой метод определения колифагов

Определение колифагов в питьевой воде заключается в исследовании нормируемого объема воды (100 мл) путем его прямого посева и последующего учета зон лизиса (бляшек) на газоне E. coli в чашках Петри с питательным агаром.

Прямой метод выделения колифагов из воды проводят параллельно с титрационным при исследованиях по эпидемическим показаниям.

В питательный агар двойной концентрации ( п. 5.3.2), расплавленный и остуженный до (45 — 49) °С, добавить смыв E. coli ( п. 8.5.2.3) из расчета 2,0 мл смыва (или 4 мл 4-часовой бульонной культуры) на каждые 100 мл агара, перемешать. Исследуемые 100 мл воды разлить по 20 мл в большие пробирки, нагреть до (35 — 44) °С и немедленно (не более чем через 5 мин по достижении требуемой температуры) разлить в 5 чашек Петри и сразу же внести в каждую чашку по 20 мл смеси агара с культурой E. coli.

Для контроля культуры E. coli в одну чашку Петри внести 20 мл стерильной водопроводной воды, предварительно прогретой до (35 — 44) °С, залить 20 мл приготовленного агара с E. coli и осторожно перемешать.

Содержимое чашек осторожно перемешать и оставить при комнатной температуре до застывания. Чашки с застывшим агаром поместить дном вверх в термостат и инкубировать при температуре (37 ± 1) °С в течение (18 ± 2) ч.

Просмотр посевов осуществляется в проходящем свете.

Учет результатов проводят путем подсчета и суммирования бляшек, выросших на 5 чашках Петри. Результаты выражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ) на 100 мл пробы воды. В контрольной чашке бляшки должны отсутствовать.

Наиболее часто зоны лизиса выглядят прозрачными пятнами на фоне газона тест-культуры питательного агара в виде круглых изолированных бляшек (от 1 до 5 — 7) мм в диаметре с четко выраженными либо стертыми границами.

При высоких концентрациях фага наблюдается разная картина лизиса.

Слияние негативных колоний дает «ажурный» газон E. coli, рост единичных колоний E. coli на фоне сплошного лизиса, либо полное отсутствие роста на чашке.

При прямом посеве возможен лизис, маскируемый негомогенно застывшим агаром, а также закрытый сопутствующей микрофлорой. Капли конденсата и негомогенно застывший при прямом посеве агар могут приводить к образованию артефактов на газоне E. coli, визуально напоминающих лизис.

Предварительный учет результатов можно проводить через (5 — 6) ч инкубации. На этом этапе при наличии четких зон лизиса может быть выдан предварительный ответ о присутствии колифагов в воде.

Окончательный количественный учет прямого посева проводится через (18 ± 2) ч. Результаты выражают количеством бляшкообразующих единиц (БОЕ) на 100 мл пробы воды.

Если отмечен сливной рост бляшек и счет затруднителен, то по данным прямого посева может быть выдан качественный результат: «обнаружено в 100 мл воды».

При получении отрицательного результата при работе прямым методом окончательный ответ выдается по результатам титрационного метода.

При наличии зон лизиса в контрольной чашке результат исследования считается недействительным.

8.5.4.1. Отрицательный контроль

Отрицательный контроль подтверждает отсутствие контаминации фагом питательных сред, лабораторной посуды, оборудования на этапах подготовки и проведения анализа, а также позволяет оценить способность тест-культуры E. coli давать равномерный газон.

Отрицательным контролем служит исследование стерильной водопроводной воды, проводимое аналогично анализируемой пробе воды. Так, при анализе воды титрационным методом 10 мл стерильной водопроводной воды вносят в дополнительную пробирку. При анализе воды прямым посевом в дополнительную шестую чашку Петри вносят 20 мл стерильной водопроводной воды.

Дополнительные посевы исследуются на колифаги аналогично основным пробам.

При анализе серии проб отрицательный контроль может быть один на каждый вид анализа: титрационный и прямой. В этом случае постановка отрицательного контроля поэтапно осуществляется после обработки всех проб данной серии.

В случае обнаружения бляшек колифагов в чашках с отрицательным контролем результаты исследования всей серии проб воды недействительны.

Следует проверить стерильность лабораторного оборудования, посуды, питательных сред, а также повторить контрольный посев на чистоту тест-штамма E. coli К12 F + Str R .

Кратность проведения отрицательного контроля — 1 раз в день.

8.5.4.2. Методика подтверждения фаговой природы лизиса

В сомнительных случаях при работе как титрационным, так и прямым методами необходимо провести контрольный посев на подтверждение фаговой природы лизиса.

С этой целью бактериологической петлей извлекают участок агара, подозрительный на колифаги, помещают его в 5 мл питательного бульона, куда добавляют каплю тест-культуры E. coli и инкубируют при 37 °С в течение (16 — 18) ч. Полученную культуру обрабатывают хлороформом и исследуют на наличие фага. Высев осуществляют петлей или пипеткой на сектора питательного агара аналогично способу, описанному в п. 8.5.2.5. Лизис на любом из секторов расценивается как подтверждение наличия фага.

Таблицы расчета наиболее вероятного числа микроорганизмов

Расчет наиболее вероятного числа бактерий в 100 мл питьевой воды

источник