Пневмококк (лат. Streptococcus pneumoniae) – это бактерия шарообразной или яйцеподобной формы, принадлежащая к семейству Стрептококковые (Streptococcaceae).
Другие названия пневмококка: диплококк Вейксельбаума, диплококк Френкеля.
Пневмококк является наиболее частым возбудителем такого заболевания, как – пневмония (воспаление легких). Смертность пневмонии составляет до 5% случаев. Среди других заболеваний пневмококковой этиологии можно выделить – отит, синуситы, ларингит, трахеит, бронхит, менингит, сепсис и другие. Особенно пневмококковая инфекция часто становиться причиной обострения бронхо-легочных заболеваний у детей.
Как и другие виды стрептококков, пневмококки чаще всего существуют парами, иногда выстраиваясь в цепочки. Размер бактерии составляет 0,5-1,25 мкм. По поведению, пневмококковая инфекция неподвижная, анаэробная, грамположительная. Стремительное размножение происходит при увеличении углекислого газа. Основой пневмококка является пептидогликан, в совокупности с поверхностными белками, углеводами, липопротеинами и тейхоевыми кислотами, и все это находиться в защитной мощной полисахаридной капсуле, предотвращающей опсонизации.
Классификация пневмококков насчитывает до 100 штаммов данных бактерий.
Наиболее популярными заболеваниями пневмококковой природы являются:
Наиболее же популярными пневмококковыми заболеваниями являются – пневмония (около 70%), средний отит (около 25%), менингит (от 5 до 15%) и эндокардит (около 3%).
Кроме того, пневмококковая инфекция может присоединиться к уже имеющимся заболеваниями других видов инфекции – стафилококковая, стрептококковая, энтерококковая и т.д.
Бактерия пневмококк погибает при:
- их обработке растворами антисептиков и дезинфектантов;
- воздействии антибактериальных средств.
Как передается пневмококк? Условия, при которых человек начинает заболевать пневмококковыми болезнями, обычно состоят из двух частей – контакт с инфекцией и ослабленный иммунитет. Однако, человек может серьезно заболеть и при обычном контакте с данным видом бактерий, когда ее количество в воздухе составляет большую концентрацию.
Рассмотрим наиболее популярные пути заражения пневмококковой инфекцией:
Воздушно-капельный путь. Основной путь заражения пневмококковой инфекцией — воздушно-капельный. Кашель и чиханье рядом стоящего человека это и есть первопричины большинства заболеваний. Коварность пневмококковой инфекции заключается в том, что ее носитель часто сам не ведает о своей роли, т.к. она может не вызывать каких-либо симптомов у своего носителя. Также стоит отметить, что в период острых респираторных заболеваний (ОРЗ), в воздухе, особенно в закрытых помещениях, концентрация вирусной, бактериальной и других видов инфекции возрастает. Именно поэтому, первыми жертвами инфекционных заболеваний становятся лица, часто пребывающие или работающие в местах большого скопления людей.
Воздушно-пылевой путь. Пыль, в том числе домашняя, состоит из многих частичек – пыльца растений, шерсть животных, частички слущенной кожи и бумаги, а также – вирусы, бактерии, грибки и другая инфекция. Нахождение человека в помещениях, где мало или редко убирается, это еще один фактор, способствующий инфицированию.
Контактно-бытовой путь. Большинство видов инфекции сами по себе не умирают, поэтому, совместной с больным человеком использование одних и тех же кухонных принадлежностей и предметов личной гигиены увеличивает риск заболеть.
Гематогенный путь. Заражение происходит при контакте крови человека с инфицированным предметом. Частыми пациентами становятся лица, употребляющие инъекционные наркотики.
Медицинский путь. Заражение происходит при использовании, например при плановом осмотре, загрязненного медицинского оборудования/инструментов.
Как мы и говорили, вторым фактором, который способствует развитию пневмококкового заболевания – ослабленная иммунная система, которая выполняет защитную функцию организма. Так, при попадание инфекции в организм, иммунитет вырабатывает специальные антитела, которые достигая очага инфицирования или оседания инфекции, купируют ее и уничтожают. Если иммунитет ослаблен, бороться с инфекцией некому, разве лекарственные средства.
Рассмотрим основные причины ослабленного иммунитета:
- Наличие хронических болезней — любое заболевание в организме хронической формы говорит о том, что иммунная система с ним не может самостоятельно справиться, в то время как болезнь постепенно продолжает вредить здоровью;
- Наличие других инфекционных болезней – ОРВИ, грипп, ОРЗ, синуситы, ангина, бронхо-легочные болезни, сахарный диабет, ВИЧ-инфекция, туберкулез, рак;
- Переохлаждение организма;
- Недостаточное количество в организме витаминов и минералов (гиповитаминоз);
- Вредные привычки – курение, алкоголь, наркотические средства;
- Малоподвижный образ жизни;
- Отсутствие здорового сна, стрессы, хроническая усталость;
- Злоупотребление некоторыми лекарственными препаратами, особенно – антибиотиками;
- Очень часто пневмококковую инфекцию в дом приносят дети – со школы и садика. Этому способствует тесный контакт между собой детей, а также не до конца развитый иммунитет. Далее, если в доме не соблюдать определенные профилактически меры, заболевание развивается и у взрослых.
Рассмотрим группу людей, у которых повышены риски, заразиться пневмококковыми заболеваниями:
- Люди преклонного возраста, от 60 лет и дети;
- Лица, работающие в местах большого скопления людей – офисные сотрудники, водители и кондукторы общественного транспорта, работники крупных предприятий, работники медучреждений, работники домов для престарелых и учебных заведений, военнослужащие.
- Люди, у которых присутствуют хронические заболевания дыхательной, сердечно-сосудистой и нервной систем, а также такие заболевания, как – сахарный диабет, бронхиальная астма, эмфизема, цирроз печени, заболевания почек, ВИЧ.
- Лица, употребляющие алкогольные напитки, курильщики.
- Лица, любящие ходить в морозную и/или прохладную сырую погоду без головного убора, в коротких куртках, тонких брюках и другой одежде, из-за которой организм подвергается переохлаждению.
- Лица, переболевшие другими инфекционными заболеваниями – ОРВИ, ОРЗ, грипп, корь и другие.
Симптомы (клиническая картина) пневмококковых болезней весьма обширны, и во многом зависят от места (органа) в котором произошло оседание инфекции, штамма пневмококка, здоровья человека и состояния его иммунитета.
Общими симптомами пневмококка могут быть:
- Боль в горле, грудном отделе;
- Общая слабость, недомогание, боль в мышцах и суставах;
- Затрудненное дыхание, кашель, чиханье, насморк, одышка;
- Повышенная и высокая температура тела, от 37,5 до 40 °С;
- Озноб;
- Головная боль, иногда сильная;
- Головокружение, нарушение сознания;
- Светобоязнь;
- Нарушение обоняния;
- Тошнота, иногда с рвотой;
- Увеличение лимфатических узлов;
- Все виды синусита – ринит, гайморит, этмоидит, сфеноидит и фронтит;
- Болезни дыхательной системы: тонзиллит, фарингит, ларингит, трахеит, бронхит и пневмония;
- Менингит;
- Воспаление сердечной мышцы — миокардит, эндокардит, перикардит;
- Гнойный отит;
- Снижение или потеря голоса, или слуха;
- Абсцесс легких;
- Сепсис;
- Задержка умственного развития;
- Скованность движений;
- Эпилепсия;
- Летальный исход.
Важно! Некоторые клинические осложненные проявления иногда могут сопровождать человека остаток его жизни.
Анализ на пневмококк обычно берется из мазков, взятых из ротоглотки (при заболеваниях верхних дыхательных путей), мокроты из носа и крови.
Таким образом, выделяют следующие анализы и методы обследования организма при пневмококковой инфекции:
Как лечить пневмококк? Лечение пневмококка обычно состоит из нескольких пунктов:
1. Антибактериальная терапия;
2. Укрепление иммунной системы;
3. Восстановление нормальной микрофлоры кишечника, которая обычно нарушается при применении антибактериальных препаратов;
4. Детоксикация организма;
5. Антигистаминные препараты – назначаются детям, при аллергии на антибиотики;
6. Симптоматическая терапия;
7. При одновременном заболевании и другими болезнями, производится и их лечение.
Лечение болезней пневмококковой природы в любом случае начинается с посещения врача и прохождения больным диагностики. Это необходимо сделать для исключения других видов инфекции, а также проверки резистентности (восприимчивости) инфекции к тому или иному антибактериальному препарату.
Перед рассмотрением антибиотиков при пневмококковых болезнях, рассмотрим их взаимодействие (резистентность).
Врачи отмечают не очень благоприятную тенденцию к лечению пневмококковой инфекции. Так, из года в год, по всему миру, замечена устойчивость (резистентность) пневмококков к антибактериальным препаратам пенициллинового и тетрациклинового ряда, а также макролидам, причем невосприимчивость к антибиотикам постепенно возрастает. Наиболее резистентными пневмококки находятся в Америке, в Западной Европе, Азии, наименее в Германии, Нидерландам. Если говорить о поверхностных причинах, то этому во многом поспособствовала доступность антибиотиков любому человеку, даже без рецептов. Дело в том, что неправильно-подобранные антибиотики, или же курс терапии данной группой препаратов, способствуют выработке инфекцией определенной невосприимчивости к этим препаратам в дальнейшем, бактерии мутируют, развиваются их новые штаммы. В некоторых странах, в той же Германии, как раз нельзя приобрести антибиотики без рецепта врача, и потому, многие инфекционные заболевания бактериальной природы более легко поддаются лечению, а количество осложнений, и соответственно смертельных исходов гораздо меньше.
Наиболее высокая резистентность пневмококков на территориях России и Украины наблюдается по отношению к тетрациклину (40%) и ко-тримоксазолу (50%).
Важно! Перед применением антибиотиков обязательно проконсультируйтесь с лечащим врачом.
В скобках, после наименования антибиотика, указан процент устойчивости бактерии к препарату (на территории России, по состоянию на 2002—2012 г).
Антибиотики против пневмококков для внутреннего применения: «Амоксициллин» и «Амоксициллин-Клавуланат» (0,5 %), «Ванкомицин» (1%), «Левофлоксацин» (1%), «Рифампицин» (1%), «Клиндамицин» (2%), «Цефотаксим» (2%), «Цефепим» (2%), «Ципрофлоксацин» (2%), макролиды (от 7 до 26% — «Азитромицин», «Кларитомицин», «Мидекамицин», «Спирамицин», «Эритромицин»), Хлорамфеникол (5%), «Пенициллин» (29%), «Тетрациклин» (40%), «Ко-тримоксазол» (50%).
Курс антибактериальной терапии назначается индивидуально, лечащим врачом. Обычно он составляет 5-10 дней.
Антибиотики против пневмококков для местного применения: «Биопарокс», «Гексорал».
Важно! Часто врач для лечения заболевания подбирает комбинацию из 2 антибактериальных препаратов, которые необходимо принимать одновременно.
Для укрепления иммунитета и стимулирования его работы, в комплексе с антибиотиками назначают прием – иммунностимуляторы: «Иммунал», «ИРС-19», «Имудон».
Природным иммуностимулятором является витамин С (аскорбиновая кислота), который в большом количестве присутствует в составе шиповника, лимона, клюквы, калины и облепихи.
Во время приема антибактериальных препаратов, они также попадая внутрь кишечника, уничтожают полезную микрофлору, способствующую нормальному усваиванию пищи и участвующей в других важных процессах жизнедеятельности организма. Поэтому, при приеме антибактериальных препаратов, в последнее время все большую популярность приобретает прием и пробиотиков, которые восстанавливают нормальную микрофлору кишечника.
Среди пробиотиков можно выделить: «Аципол», «Бифиформ», «Линекс».
Пневмококковая инфекция, во время пребывания внутри организма, отравляет его продуктами своей жизнедеятельности. Интоксикация инфекционными ферментами способствует ухудшению течения заболевания, вызывая такие симптомы, как – тошнота, рвота, потеря сил, галлюцинации и бредение.
Для выведения продуктов жизнедеятельности инфекции из организма, назначается детоксикационная терапия, которая включает в себя:
- обильное питье (до 3 л жидкости в сутки, желательно с добавлением витамина С);
- полоскание носа и ротоглотки слабо-соляным раствором или раствором фурациллина;
- приеме детоксикационных препаратов: «Атоксил», «Альбумин», «Энтеросгель».
Антигистаминные препараты назначаются в случае, если при приеме антибиотиков у человека проявляется аллергическая реакция – зуд кожи, сыпь, покраснения и другие проявления.
Среди антигистаминных препаратов можно выделить: «Кларитин», «Супрастин», «Цетрин».
Для купирования симптоматики пневмококковых болезней и облегчения их течения, назначается симптоматическая терапия.
При тошноте и рвоте: «Мотилиум», «Пипольфен», «Церукал».
При высокой температуре тела: прохладные компрессы на лоб, шею, запястья, подмышки. Среди препаратов можно выделить — «Ибупрофен», «Парацетамол».
При заложенности носа — сосудосуживающие препараты: «Нокспрей», «Фармазолин».
Важно! Перед применением народных средств обязательно проконсультируйтесь с врачом.
Изюм. Залейте 100 г измельченного изюма 200 мл воды и поставьте средство на огонь, доведите средство до кипения, проварите на медленном огне его еще минут 10, после чего процедите, отожмите изюм через марлю и принимайте в течение дня.
Овес. Тщательно промойте 200 г овса с шелухой, после чего залейте его 1 л молока и поставьте на огонь. Доведите средство до кипения, далее проварите его на медленном огне еще 30 минут, после процедите, добавьте в него 5 ст. ложек мёда и 2 ст. ложки сливочного масла. Пейте отвар перед сном, по 1 стакану.
Травяной сбор 1. Сделайте сбор из равных частей следующих растений – корень алтея, корень дягиля, корень девясила, корень синюхи, цветки коровяка, лист или почки берёзы, трава зверобоя, трава пустырника, трава череды, трава донника, трава лабазника, лист эвкалипта и семена укропа. Все тщательно измельчите и смешайте, после чего 2 ст. ложки сбора залейте 500 мл кипятка и поставьте средство на огонь, доведите его до кипения, проварите на медленном огне 10 минут, снимите с огня и отставьте для настаивания, часа на 2. После средство процедите и принимайте по 1/3-¼ стакана 3 раза в день.
Травяной сбор 2. Сделайте сбор из равных частей следующих растений – корень солодки, корень одуванчика, корень первоцвета, кора калины, плоды шиповника, лист мать-и-мачехи, лист мяты, лист подорожника, лист кипрея, лист манжетки, трава душицы и трава медуницы. Все тщательно измельчите и смешайте, после чего 2 ст. ложки сбора залейте 500 мл кипятка и поставьте средство на огонь, доведите его до кипения, проварите на медленном огне 10 минут, снимите с огня и отставьте для настаивания ,часа на 2. После средство процедите и принимайте по 1/3-¼ стакана 3 раза в день.
Чабрец. Залейте 2 ст. ложки травы чабреца стаканом кипятка, накройте средство, дайте ему настояться около 4 часов, после чего процедите и принимайте по 1 ст. ложке 3 раза в день.
Профилактика пневмококка включает в себя следующие рекомендации:
— Соблюдайте правила личной гигиены – не забывайте чаще мыть руки, чистить зубы;
— Во время эпидемий ОРЗ, после улицы промывайте нос и ротоглотку слабосоленым раствором;
— Старайтесь питаться продуктами, обогащенными витаминами и микроэлементами;
— В холодную погоду одевайтесь тепло, не допуская переохлаждения организма;
— Делайте дома влажную уборку 2-3 раза в неделю, чаще проветривайте помещение;
— Больше двигайтесь, закаляйтесь (если нет противопоказаний);
— Не забывайте полноценно отдыхать, высыпайтесь;
— Не оставляйте на самотек возможные очаги инфекции – воспаленные миндалины, кариес зубов;
— В период ОРЗ избегайте мест большого скопления людей, особенно в закрытых помещениях;
— Если дома или на работе есть заболевшие люди, не используйте с ними одну посуду, предметы личной гигиены.
— Лицам, входящие в группу риска заболеть пневмококковой инфекцией и детям рекомендуют делать вакцину против пневмококка – ПКВ (PCV — pneumococcal conjugate vaccine).
источник
Пневмококковая инфекция обусловлена патогенным микроорганизмом Streptococcus pneumoniae. Этот возбудитель является главной причиной острых внебольничных пневмоний, занимает ведущее место в этиологии бактериальных менингитов, острых средних отитов, синуситов, вызывает первичный сепсис, заболевания кожи, суставов и другие инфекции, пневмококки являются этиологической причиной пневмонии в 20–75% случаев. Риносинусит имеет пневмококковую этиологию в 20–43% случаев, средний отит – 30–50%.
Ежегодно в США диагностируется около 4 млн. случаев внебольничной пневмонии и более 3 млн. в странах Европейского союза. В России число таких больных превышает 1,5 млн. человек в год, а заболеваемость составляет 14–15 случаев на 1000 населения. По данным Министерства обороны РФ у военных срочной службы в течение 2000–2003 гг. заболеваемость пневмонией превышала показатель 40 случаев на 1000 военнослужащих.
Заболеваемость пневмококковым менингитом в США определяется на уровне 1–2 случая на 100 тыс. населения с уровнем летальности 19–46% в различных возрастных группах. В России, по данным Референс-центра по надзору за гнойными бактериальными менингитами за 2010 г., общий уровень заболеваемости составил 0,19 на 100 тыс. населения (с колебаниями по Федеральным округам от 0,11 до 0,30 на 100 тыс. населения), с летальностью 13%.
В тоже время, пневмококк относится к нормальным обитателям ротоглотки и частота здорового носительства в популяции может достигать 40–70%. При этом возможно как одновременное носительство различных серотипов пневмококка, так и смена одного серотипа другим в течение непродолжительного времени. Заболевание пневмонией, отитом, синуситом, как правило, возникает при попадании микроба в нижние или верхние дыхательные пути на фоне нарушения защитных механизмов организма человека (снижение уровня общего и местного иммунитета, нарушение мукоцилиарного клиренса и др.). При генерализации процесса развивается сепсис, менингит, абсцессы внутренних органов, поражения сердца (эндокардит), почек, суставов.
Резервуаром пневмококковой инфекции является человек. Вместе с тем, пневмококковая патология встречается у диких и домашних копытных животных (овец, коз, телят и т. д.), преимущественно в виде пневмонии или сепсиса. Выделенный возбудитель от животных не отличается по свойствам от пневмококка, вызывающего заболевание у людей.
Основной путь передачи инфекции – воздушно-капельный, иногда контактный. Отмечены случаи внутриутробного заражения. Пик заболеваемости приходится на холодные сезоны года и носит спорадический характер. Среди заболевших преобладают мужчины. Наиболее уязвимыми возрастными контингентами являются дети до 5 лет и лица пожилого возраста (старше 65 лет). Пневмококковая инфекция наиболее тяжело, с генерализацией инфекционного процесса, протекает у лиц старших возрастов, особенно при наличии сопутствующих хронических патологий (хроническая обструктивная болезнь легких, злокачественные новообразования, алкоголизм, сахарный диабет, заболевания сердечно-сосудистой системы, почек и печени и др.), а также иммунодефицитов различного генеза.
Показания к обследованию. Пациенты при подозрении на крупозную пневмонию, острый бронхит; отит, синусит; менингит, менингоэнцефалит; септическое состояние; поражения кожи, подкожной клетчатки, соединительной ткани (редкая локализация инфекции); конъюнктивит (редкая локализация инфекции).
Дифференциальная диагностика проводится с микробными агентами:
- при подозрении на внебольничную пневмонию: Haemophilus influenzae, Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Legionella pneumophila, Staphylococcus aureus, семейством Enterobacteriaceae, вирусами гриппа;
- при отитах, синуситах – Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Moraxella catarrhalis, Streptococcus pyogenes, дрожжевыми грибами рода Candida;
- при менингите – Neisseria meningitides, Haemophilus influenzae тип b, Staphylococcus aureus, семействомEnterobacteriaceae;
- при поражениях кожи, подкожной клетчатки, соединительной ткани – Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa.
Материал для исследования
- Мокрота, БАЛ, пунктаты (при подозрении на пневмонию); гнойное отделяемое, пунктаты (средний отит, синусит); СМЖ, кровь (менингит, менингоэнцефалит); кровь (септические состояния); отделяемое из раны (кожные поражения); секционный материал – культуральные исследования, выявление ДНК микроорганизма;
- СМЖ – определение АГ;
- сыворотка крови – определение АГ, АТ.
Этиологическая лабораторная диагностика включает выявление пневмококков методом микроскопии, посев исследуемого материала с дальнейшей культуральной и биохимической идентификацией возбудителя, определением антибиотикочувствительности; обнаружение специфических генетических фрагментов пневмококка и его АГ, обнаружение специфических АТ.
Сравнительная характеристика методов лабораторной диагностики и особенности интерпретации их результатов. Микроскопические исследования используют для выявления пневмококков в разных видах биологического материала: мокроте, плевральной жидкости, отделяемом из уха, придаточных пазух, СМЖ, крови. Диагностическая ценность обнаружения в мазке мокроты диплококков «сходных с пневмококками» до сих пор остается дискуссионной. Большинство исследователей считают, что это исследование может использоваться только при соблюдении ряда жестких условий:
- взятие материала должно проводиться до начала антибиотикотерапии;
- контроль правильности отбора, доставки и обработки материала:
-
- задержка приготовления препарата на 2–5 ч от момента взятия материала может привести к ошибочным результатам;
- подтверждением взятия образца мокроты из нижних отделов дыхательных путей служит выявление менее 10 эпителиальных клеток в поле зрения при малом увеличении микроскопа;
- материал считается пригодным для бактериологического посева при обнаружении в мокроте большого количества нейтрофилов (более 25 в поле зрения), небольшого количества эпителиальных клеток (менее 10 в поле зрения) и преобладании монофлоры, по морфологии сходной с пневмококком.
Для посева с дальнейшей культуральной и биохимической идентификацией возбудителя, определением антибиотикочувствительности используют различные виды материала: мокрота, бронхоальвеолярный лаваж, отделяемое из уха и придаточных пазух, кровь, ликвор, плевральная жидкость.
При наличии роста на чашках проводится обязательная количественная оценка бактериального роста и выделение чистой культуры предполагаемого возбудителя для дальнейшей идентификации.
Принадлежность к виду Streptococcus pneumoniae подтверждается:
- характерным видом колоний на средах, содержащих кровь (колонии по форме напоминают игральные шашки или блюдца, мелкие, прозрачные, окружены зоной зеленоватого гемолиза);
- чувствительностью микроорганизма к оптохину;
- чувствительностью к желчным кислотам;
- положительной реакцией набухания капсулы с антипневмококковой omniсывороткой;
- биохимической характеристикой возбудителя с использованием соответствующих наборов реагентов.
Оценка результатов культурального исследования. Для нестерильных локусов:
- выявление при посеве в мокроте или лаважной жидкости более чем 10 3 КОЕ/мл пневмококков является диагностическим критерием постановки диагноза пневмония;
- выявление в гнойном экссудате при остром бактериальном синусите более 10 5 КОЕ/мл пневмококков является диагностическим критерием постановки диагноза синусит;
- выявление в гнойном отделяемом при остром среднем отите более 10 4 КОЕ/мл пневмококков, является диагностическим критерием постановки диагноза отит.
- любое выявление возбудителя в стерильных жидкостях организма служит основанием для постановки диагноза пневмококковой инфекции.
Для определения чувствительности к антибиотикам используются несколько методов.
- Метод серийных разведений в бульоне или агаре. Принцип метода основан на оценке чувствительности возбудителя к серии последовательных разведений тестируемого антибиотика. При этом определяется точное значение минимальной подавляющей концентрации (МПК) препарата для микроорганизма. Однако изза значительной трудоемкости, метод используется преимущественно в научных лабораториях. Более широкое применение получил модифицированный метод серийных разведений, основанный на использовании пограничных концентраций антибиотика, который не дает точного определения МПК препарата для возбудителя, но позволяет оценить его принадлежность к чувствительным (S), промежуточно устойчивым (I) или резистентным (R) штаммам. Большинство готовых наборов реагентов используют именно этот принцип.
- Диско-диффузионный метод – основан на оценке диаметра зоны подавления роста вокруг бумажного диска с антибиотиком, наложенного на растущую на плотной питательной среде культуру исследуемого микроорганизма. Образование зоны ингибирования роста происходит за счет диффузии антибактериального препарата из носителя (диска) в питательную среду, при которой величина диаметра ингибирования роста жестко связана с величиной МПК. Метод не определяет точное значение минимальной подавляющей концентрации антибиотика для микроорганизма, а только позволяет отнести его к одной из категорий чувствительности (S, I, R).
- Метод эпсилометрии (Е-тест) – в качестве носителя используется полоска полимера, пропитанная различными концентрациями антибиотика, с нанесенными на нее значениями таких концентраций. Интерпретации результатов выполняют в соответствии с инструкцией к набору реагентов.
Наиболее важным при тяжелых пневмококковых инфекциях является определение чувствительности пневмококков к пенициллину и другим бета-лактамным антибиотикам (аминопенициллинам, карбапинемам, цефалоспоринам) – основным препаратам выбора. В качестве скринингового теста для определения чувствительности к этим препаратам используется диско-диффузионный метод.
В исследование обязательно включают изучение чувствительности к макролидам, линкозамидам, стрептограминам. Данные препараты часто используются для лечения внегоспитальной пневмококковой пневмонии и заболеваний верхних дыхательных путей. Пневмококки могут быть устойчивыми только к 14- и 15-членным макролидам, при сохранении чувствительности к 16-членным макролидам и линкозамидам, а могут быть устойчивыми ко всем представителям этих классов.
Определение устойчивости к хинолонам, хлорамфениколу, тетрациклину, котримоксазолу, рифампицину, ванкомицину, позволяет более полно характеризовать фенотип возбудителя. При этом необходимо учитывать, что ранние хинолоны (офлоксацин), которые применяются в отношении пневмококков, резистентных к пенициллину, в последнее время показывают рост устойчивости к этому препарату. Для преодоления устойчивости используют новые фторхинолоны с повышенной антипневмококковой активностью: спарфлоксацин, моксифлоксацин и др.
Примерно от 5 до 15% культур пневмококков в России демонстрируют полирезистентные свойств, т. е. одновременной устойчивостью к 3 и более классам препаратов.
Для обнаружение АГ пневмококка в пробах биологических жидкостей пациента применяют методы латекс-агглютинации и ИХА. Наборы реагентов, основанные на реакции латекс-агглютинации или коагглютинации, предназначены для работы с материалом, полученным из стерильных локусов (кровь, ликвор), при работе с нестерильными локусами эти наборы могут давать ложноположительный результат. Чувствительность и специфичность наборов разных производителей составляет 94–100% и 85–98%, соответственно. Набор реагентов с использованием ИХА позволяет определить наличие указанного АГ у больных пневмонией (в моче) и менингитом (в СМЖ). Этот тест рекомендован как дополнительный метод диагностики пневмоний. При исследовании проб пациентов с высоким уровнем назофарингеального носительства возможны ложноположительные результаты.
Для обнаружения специфических генетических фрагментов пневмококка применяют ПЦР, в качестве мишеней используют специфические фрагменты генов, кодирующих факторы патогенности: пневмолизин (Ply), аутолизин (LytA), пневмококковый поверхностный АГ (PsaA), пневмококковый поверхностный протеин А (PspA), марганец-зависимая супероксид-дисмутаза (sodA), поверхностный пенициллин-связывающий белок 2b (Pbp2b), Spn9802, Spn9828. Для повышения специфичности исследования применяется мультиплексная ПЦР, при которой проводится одновременная индикация нескольких генов патогенности с сохранением высокой чувствительности реакции.
Остается проблемой установление диагностически значимых количественных показателей, позволяющих дифференцировать заболевание от носительства при исследовании материала из нестерильных локусов.
Метод исследования продуктов АНК при мультилокусном секвенировании-типировании для генетического типирования пневмококков основан на секвенировании внутренних фрагментов семи генов «домашнего хозяйства» (housekeeping genes), специфичных для возбудителя. Метод чаще используется для генетического типирования пневмококка, чем для идентификации.
Использование метода секвенирования участка 16S рибосомальной РНК для идентификации пневмококков затруднено сходством с некоторыми видами стрептококков, входящих в группу Mitis. Гомология ДНК-ДНК между стрептококками, входящими в группу Mitis, составляет 40–60%, тогда как сходство сиквенсов 16S рРНК генов между S.mitis, S.oralis и S.pneumoniae может достигать более чем 99%. Сравнение участков 16S рРНК между штаммами S.pseudopneumoniae и S.pneumoniae (суммарный размер 1 468 пар нуклеотидов) показало 99,7% совпадение сиквенса, различие отмечено только в 5 парах нуклеотидов.
Для исследования используют также методы РНК-ДНК и ДНК-ДНК гибридизации, в основе которых лежит способность нуклеиновых кислот к гибридизации (TaqMan принцип). Готовый набор реагентов для идентификации «AccuProbe Streptococcus pneumoniae culture identification test» (Gen-Probe, USA) построен на этом принципе с использованием в качестве мишени участка гена 16S рРНК. Для детекции участков рибосомальной РНК исследуемого штамма употребляется одноцепочечная ДНК в качестве зонда, которая комплиментарна выбранной специфичной для пневмококка мишени 16S рРНК и содержит хемолюминесцентную метку. При совпадении нуклеотидов мишени рРНК с нуклеотидами ДНК-зонда образуется устойчивое образование в форме ДНК-РНК гибрида. После добавления селектирующего реагента, дифференцирующего гибридизированные и негиброидизированные пробы, меченые гибриды ДНК-РНК могут быть выявлены с помощью люминометра. Если использовать AccuProbe в качестве референтного стандарта, чувствительность и специфичность бактериологических методов идентификации составляет: для желчного теста 98,8% и 82,6%, для реакции набухания капсулы с Omni сывороткой 99,2 и 74,4%; 87,9 и 59,3% для теста с оптохином.
Обнаружение АТ редко используются при проведении лабораторной диагностики пневмококковой инфекции. Это связано с отсутствием надежных доступных методик, имеющих достаточную чувствительность и специфичность и ролью временного фактора, поскольку для выявления роста титров АТ необходимо значительное время от начала заболевания. В настоящий момент используются определения АТ против четырех АГ пневмококка (С-антигена, капсульных полисахаридов, фосфорилхолина и пневмолизина). Чувствительность метода для С-антигена и капсульных полисахаридов составляет 89% и 97% соответственно. Наиболее распространенные методы определения – ИФА и РИФ (МФА). При применении МФА в качестве АГ рекомендуется использовать аутоштамм пневмококка, выделенный от данного больного. В случае отсутствия аутоштамма применяют смесь штаммов из наиболее часто встречающихся на данной территории серотипов. Выявление минимального диагностического титра АТ к пневмококку у детей до 3 лет 1:320 и 1:640 у взрослых свидетельствует о пневмококковой этиологии перенесенного заболевания.
источник
Посев отделяемого верхних дыхательных путей на микрофлору и определение чувствительности к антимикробным препаратам (Upper Respiratory Culture, Routine. Aerobic Bacteria Identification and Antibiotic Susceptibility testing) (одна локализация)
Внимание! Стоимость исследования указана для одной локализации.
Микробная характеристика инфекции и обоснование выбора антибиотиков.
Поражение носа (ринит, синусит), слизистой оболочки глотки (фарингит) нередко обусловлены бактериальной инфекцией: стрептококк, пневмококк, стафилококк (ринит), гемолитический стрептококк (фарингит).
Диагностика и рациональная терапия основана на идентификации возбудителя и определения его чувствительности к антибиотикам. Это предупреждает переход острого процесса в хронический.
Выделяемые возбудители: основные возбудители заболеваний, выявляемые в данном тесте, условно-патогенные микроорганизмы: S. pneumoniae и H. influenzae, M. catarrhalis, S. pyogenes, S. aureus, реже грамотрицательные бактерии семейства энтеробактерий и грибы рода кандида. Представители нормальной флоры зеленящие стрептококки (S. viridans group), стафилококки (S. еpidermidis), непатогенные нейссерии (Neisseria sp.), непатогенные дифтероиды (Corynebacterium sp.), Candida sp. и некоторые другие.
Обращаем внимание на необходимость приобретения транспортной среды, используемой для взятия мазков, которую необходимо заранее приобрести в любом медицинском офисе ИНВИТРО под залог. Возврат залоговых средств осуществляется при сдаче анализа и при условии наличия чека за внесение залога.
- Приказ МЗ СССР от 22 апреля 1985 г. № 535 Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений.
- Энциклопедия клинических лабораторных тестов под ред. Н.У. Тица. Издательство «Лабинформ» — М. — 1997 — 942 с.
- Nightingale C. et al./ Antimicrobial Pharmacodynamics in Theory And Clinical Practice/2006/ M.Dekker inc./ 550 ps.
Интерпретация результатов исследований содержит информацию для лечащего врача и не является диагнозом. Информацию из этого раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. Точный диагноз ставит врач, используя как результаты данного обследования, так и нужную информацию из других источников: анамнеза, результатов других обследований и т.д.
- об отсутствии или наличии роста;
- о количестве выросших в посеве условно-патогенных микроорганизмов и дрожжеподобных грибов;
- о роде и виде представителей условно-патогенной флоры;
- о чувствительности возбудителей к антибиотикам в каждом случае обнаружения патогенных или условно-патогенных микроорганизмов (если количество более 10 4 кое/тампон). Список АМП определяется видом выявленных возбудителей, со списками можно ознакомиться здесь>>
Важно! Определение вида грибов и постановка чувствительности к антимикотическим средствам в этот анализ не входит (при подозрении на грибковую инфекцию назначается тест № 442).
Интерпретация: в норме выделяются сапрофитные бактерии или условно-патогенные в низком титре ( 4 кое/тамп). При заболевании выделяются этиологически значимые бактерии в диагностическом титре (> 10 4 кое/тампон). При отсутствии роста исследование рекомендовано повторить, т. к. материал может быть неадекватно собран.
Внимание! При обнаружении роста нормальной, сопутствующей и условно-патогенной флоры в низком титре и не имеющей диагностического значения определение чувствительности к антибиотикам не проводится.
Дозаказ определения чувствительности к расширенному спектру АМП и бактериофагам невозможен, для этой цели назначают тесты 467КЧА-Р , 467КЧА-Ф .
источник
Нейссерия менингитидис
Neisseria — грамотрицательные диплококки, под микроскопом напоминают кофейные зёрна. Род включает много патогенов для человека, например: Neisseria меningitidis (менингококк), который является одним из возбудителей бактериального менингита и причиной менингококкового сепсиса.
Основной путь передачи: воздушно-капельный.
Источник инфекции: носители и больные с признаками генерализованных поражений.
Наибольший процент заболевших составляют дети до 5-ти лет.
Инкубационный период: 2-6 дней.
Клинически выделяют следующие формы:
1.Локализованные формы (менингококконосительство и острый назофарингит)
2.Генерализованные формы (менингит, менингоэнцефалит и менингококцемия)
3.Редкие формы (эндокардит, пневмония, полиартрит).
При локализованной форме отмечается субфибрилитет, головная боль, катаральные проявления в виде кашля, насморка со слизисто-гнойными выделениями, гиперемией зева. Заболевание может нарастать и переходить в генерализованную форму, либо длиться 5-7 дней и заканчиваться выздоровлением. Генерализованная форма характеризуется высокой температурой тела (до 40 градусов), головной болью, рвотой. При тяжелых формах — нарушение сознания, симптомы раздражения мозговых оболочек, присоединение геморрагических проявлений (в виде сыпи, кровоизлияний в слизистые оболочки и внутренние органы). Крайне тяжелое течение менингококковой инфекции обусловлено возникновением осложнений в результате нарушений жизненноважных функций организма. В ряде случаев возможен летальный исход заболевания.
Одним из методов диагностики менингококковой инфекции является ПЦР.
Показания к исследованию:
-подозрение на менингокковую инфекцию
-обследования в эпидемиологических очагах и группах риска по развитию заболевания
-выявление бактерионосительства
Биологический материал: кровь (ЭДТА), мазок с задней стенки глотки.
Подготовка к исследованию: забор материала для исследования из ротоглотки производится натощак, либо через 2 часа после еды. Анализ проводится до начала антибиотикотерапии или не ранее чем через 2 недели после её окончания.
Гемофилус инфлюенца (Haemophilus influenza) – гемофильная палочка, возбудитель острой антропонозной ифекции. Болеют преимущественно дети до 5 лет, с поражением легких и ЦНС. Эпидемиология.
Источник инфекции: носители гемофильной палочки и больные. Уровень носительства среди взрослых здоровых лиц достигает 90%.
Пути передачи: воздушно — капельный.
Восприимчивость определяется возрастными и генетическими факторами. Так, риск заражения для детей в возрасте от 6-ти месяцев до 3-х лет в 6 000 раз выше, чем в других возрастных группах.
Клиническая картина.
Гемофильная инфекция может протекать в разных формах:
-В форме ОРЗ (ринофарингит) — не имеет специфических особенностей.
-Пневмония — встречается у детей до 2-х лет, начинается с катаральных явлений, выраженной интоксикации и высокой лихорадки. Физикальные данные такие же, как и при других бактериальных пневмониях. Процесс чаще локализуется в прикорневых отделах лёгких, возможно абсцедирование. Картина крови не носит выраженного воспалительного характера.
-Менингит характеризуется длительной лихорадкой, частым увеличением печени и селезёнки, катаральными явлениями (ринофарингит). Менингиальные симптомы появляются на 2-4 день болезни. Возможно затяжное волнообразное течение менингита с развитием гидроцефалии. Церебральная жидкость гнойная, цитоз умеренный, в пределах 2-3тыс./мкл. Воспалительные изменения в крови выражены слабо.
-Эпиглотит – воспаление надгортанника с развитием асфиксии.
-Возможны также целлюлит – воспаление жировой ткани, гнойный артрит, остеомиелит, отит, сепсис. Диагностика возможна только с использованием бактериологического метода и ПЦР. ПЦР (полимеразно — цепная реакция) – это метод, который позволяет найти в исследуемом материале небольшой участок генетической информации (ДНК) любого организма среди огромного количества других участков и многократно размножить его. Метод ПЦР основан на принципе репликации ДНК.
Биологический материал: кровь(ЭДТА), мазок из зева (задняя стенка глотки).
Подготовка к исследованию: забор материала из зева проводится натощак, либо через 2 часа после еды. Анализ проводится до начала антибиотикотерапии или не ранее чем через 14 дней после её окончания.
Стрептококкус пневмонии.
Streptococcus pneumonia – является возбудителем заболеваний, объединенных в группу пневмококковых инфекций. Возбудитель представляет собой грамположительные кокки, при обитании в организме образуют капсулу. Паразит дыхательных путей человека. Вызывает острые пневмонии, бронхит, отит, гайморит у взрослых и детей.
Пути передачи:
1.Бронхогенный и этому способствуют аспирация, вдыхание микробов из окружающей среды.
-медицинские манипуляции: бронхоскопия, интубация трахеи
-переселение патогенной флоры из верхних отделов дыхательной системы в нижние отделы.
-ингаляция лекарственных веществ из обсеменённых ингаляторов
2.Гематогенный путь – распространение инфекции с током крови. Встречается реже.
-при внутриутробном заражении.
-септических процессах.
3.Лимфогенный путь. Встречается очень редко.
Факторы, предрасполагающие к развитию пневмонии.
Для раннего возраста:
-внутриутробная гипоксия и асфиксия
-родовая травма
-пневмопатии новорождённых
-гипотрофии
-гиповитаминозы
Для школьного возраста:
-хронические очаги инфекции в носоглотке
-рецидивирующие бронхиты
-иммунодефицитные состояния
Взрослые:
-курение и хронический бронхит
-хронические болезни легких
-эндокринные заболевания
-сердечная недостаточность
-иммунодефицитные состояния
-хирургические операции
-длительное пребывание в горизонтальном положении
Клиническая картина. Пневмония характеризуется резким подъёмом температуры, кашлем с обильным выделением гнойной мокроты, в некоторых случаях плевральной болью. При физикальном обследовании отмечается укорочение перкуторного звука, усиление голосового дрожания, жесткое дыхание, сначала сухие затем влажные крепетирующие хрипы, затемнение на ренгенограмме.
Одним из лабораторных методов диагностики пневмококковой инфекции является — ПЦР.
Подготовка к исследованию: забор мазка из зева берется натощак или через 2 часа после приема пищи. Анализ проводится до начала антибиотикотерапии или не ранее чем через 2 недели после её окончания.
источник
Пневмококковая инфекция, вызванная пневмококком Streptococcus pneumoniae, преимущественно распространяется на детей, содействуя развитию менингита, пневмонии или сепсиса. Все эти заболевания опасны не только для здоровья, но и для жизни. В лучшем случае больной станет инвалидом на всю оставшуюся жизнь.
Пневмококковая инфекция масштабно распространена по всей планете, в постсоветских странах ее регистрация затрудняется ввиду отсутствия диагностики пациентов, обратившихся с острым респираторным заболеванием. Так, например, выявление пневмококкового менингита возможно в 10 из 100 000 случаев. Сепсис диагностируется у 100 пациентов из 100 тысяч. Пневмококковая инфекция, как оказывается, удивительно частое явление, нежели считают люди. Тяжелые формы ее течения являются причиной длительного срока восстановления здоровья, и, что еще хуже, последующей инвалидизации.
Пневмококк, поступая в нормальную микрофлору верхних дыхательных путей, благодаря антифагину (ферменту полисахаридной оболочки) легко ускользает от иммунной системы, в особенности еще слаборазвитой у детей от рождения и до двух лет. Это основная причина массовой заболеваемости среди детей младшего возраста в сравнении с количеством взрослых больных. Иммунитет взрослого при выявлении «незваного гостя» начинает активно работать над нейтрализацией пневмококка.
Разработка вакцины для специфической профилактики основана на изучении основных типов пневмококков, встречающихся у детей раннего возраста. К сожалению, ряд антибиотиков не способны побороть бактерию. Радует хотя бы ее слабая устойчивость к факторам внешней среды, что позволяет бороться с заразой с использованием обычных дезинфицирующих средств.
Источниками заболевания являются больные с выраженной формой и носители пневмококков. Передача бактерии осуществляется воздушно-капельным путем через носоглоточную слизь, мокроту бронхиального дерева.
Больному достаточно одного чиха, чтобы заразить близь находящего человека и других лиц в радиусе 1,5 метра. Ввиду высокой восприимчивости человеческого организма к пневмококковым инфекциям, вероятность семейных и коллективных вспышек в детсадах высока.
Наиболее подверженные группы лиц:
1) Малолетние дети, чья иммунная система не способна побороть действие возбудителя. В период кормления грудью, мать предает грудничку часть антител, тем самым снижая риск заболевания. Но спустя пол года их число резко снижается, а вместе возрастают шансы подцепить инфекцию.
2) Люди разного возраста, страдающие иммунодефицитом.
3) Лица в возрасте от 65 лет и старше.
Слизистая оболочка ротоглотки и дыхательных путей – входные ворота для бактерии. Здесь она может находиться долгое время, не проявляя никаких признаков своего присутствия. Человека достаточно переохладиться, перенести стресс, как сопротивляемость организма резко снижается, и инфекция активно наступает. Бактерия, попав в кровь, может спровоцировать сепсис, может стать причиной воспаления легких, разнестись по всем органам.
2) Частые респираторные инфекции.
3) Хроническое переутомление.
Признаки инфекции: пневмония, менингит, отит, сепсис.
При пневмонии повышается температура тела до 38-39°, беспокоит озноб, слабость, боли в мышцах, появляется одышка, учащается сердцебиение, при кашле выходит мокрота с зеленым оттенком.
При менингите температура достигает отметки в 40°, больного рвет, у него сильно болит шея, раздражают окружающие звуки, он входит в стопор, позже кому.
Начинается с температуры, появляется слабость, головная боль, незаметно для больного поражаются селезенка, легкие, сердце, кишечник, затем почки и мозговые оболочки.
Острая дыхательная и сердечная недостаточность характерна всем проявлениям пневмококковой инфекции. Менингит грозит остановкой сердца, прекращением работы легких ввиду сильного отека мозга. Сепсис является причиной половины из 100% случаев смертей.
источник
Пневмококк(Streptococcus pneumoniae) – возбудитель, вызывающий ряд инфекционных заболеваний, которые представляют собой одну из серьезнейших проблем здравоохранения. По статистике, до 70% всех пневмоний, около 25% средних отитов, 5-15% гнойных менингитов, около 3% эндокардитов вызываются этим возбудителем. Основной механизм заражения – аэрогенный, а путь передачи – воздушно-капельный. Инфицирование происходит при чихании, кашле, разговоре с источником инфекции. Наиболее подвержены заражению лица, находящиеся в непосредственном контакте с источником инфекции. Восприимчивость человека к пневмококковым инфекциям высокая.
Особенность этого возбудителя в том, что у него повсеместное распространение, широкая циркуляция, значительная неоднородность в популяции, высокая патогенность и изменчивость. Кроме того, пневмококк способен формировать антибиотикоустойчивость.
Группы риска.
Повышенная заболеваемость регистрируется у детей в возрасте до 5 лет и пожилых (старше 65 лет). Именно в этих возрастных группах пневмонии занимают первое место как причина смерти среди всех инфекций и 5-е место среди всех причин смерти.
Кроме вышеуказанных, группами риска по заболеваемости пневмококковой инфекцией также являются:
— лица с хроническими заболеваниями легких (хронические обструктивные заболевания легких, эмфизема легких и др.) и сердечнососудистой системы (ИБС, сердечная недостаточность, кардиомиопатия и др.);
— лица с хроническими заболеваниями печени (в т.ч. циррозом);
— больные сахарным диабетом и др.
— дети, перенесшие острый средний отит, менингит, пневмонию;
— длительно и часто болеющие дети;
— больные бронхиальной астмой;
— дети и взрослые с иммунодефицитными состояниями, в т.ч. ВИЧ, онкологическими заболеваниями, получающие иммуносупрессивную терапию.
Симптомы основных заболеваний, вызываемых пневмококком.
Пневмония.Заболевание начинается остро, нередко с озноба и болей, усиливающихся при глубоком дыхании. С первых часов появляются короткий болезненный кашель с небольшим количеством вязкой стекловидной мокроты, гиперемия щек, раздувание крыльев носа, учащенное поверхностное дыхание, герпетические высыпания на губах и крыльях носа, иногда цианоз губ и кончиков пальцев, головная боль, слабость, разбитость, высокая лихорадка (до 39- 40 °С).
Гнойный менингит. Заболевание начинается с резкого ухудшения общего состояния, повышения температуры, чувства озноба. При тяжелых формах могут быть потеря сознания, бред, судороги, многократная рвота. Резко выражены менингеальные симптомы. Течение менингита, как правило, острое.
Средний отит. Боль в ухе различной интенсивности, которая может быть постоянной или пульсирующей; тянущей или стреляющей; может отдавать в зубы, висок, затылок. Ощущение заложенности уха, снижение слуха, шум в ухе. Могут быть выделения из уха. Симптомы могут наблюдаться со стороны одного (односторонний отит) или обоих (двусторонний отит) ушей. Острый средний отит часто сопровождается симптомами интоксикации – общей слабостью, повышением температуры тела и другими. При остром среднем отите часто наблюдаются симптомы со стороны других ЛОР-органов: заложенность носа, выделения из носа, боль или першение в горле.
Профилактика.
Самым эффективным методом борьбы с пневмококковой инфекцией является вакцинация.
С 2014 года прививка против пневмококковой инфекции введена в Национальный календарь профилактических прививок РФ.
В соответствии с Национальным календарем профилактических прививок первая вакцинация детей проводится по достижению 2-х месячного возраста. Вторая прививка проводится по достижению возраста 4,5 мес. жизни. Ревакцинация против пневмококковой инфекции проводится детям в возрасте 15 месяцев.
Иммунизация осуществляется с помощью специфической вакцины, прошедшей клинические и эпидемиологические испытания и позволившей существенно повлиять на эпидемический процесс этой инфекции.
По данным Всемирной организации здравоохранения мировой опыт показал, что массовая вакцинация более чем на 80% снижает частоту пневмококковых менингитов и тяжелых пневмоний у детей, и более чем на треть — заболеваемость всеми пневмониями и отитами.
По прогнозам Всемирной организации здравоохранения глобальное использование вакцинации от пневмококковой инфекции позволит предотвратить 5,4 — 7,7 миллионов детских смертей к 2030 году.
Вакцинация против пневмококковой инфекции поможет значительно снизить заболеваемость внебольничными пневмониями у детей, сохранить их здоровье.
В настоящее время в Московской области доступна вакцина для иммунизации детей, а также взрослых из групп риска. Для проведения вакцинации обращайтесь в прикрепленную поликлинику.
© Управление Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Московской области, 2006-2017 г.
Если Вы не нашли необходимую информацию, попробуйте зайти на старую версию сайта
источник
Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему: Иммунохимическая диагностика пневмококковой инфекции
Автореферат диссертации по медицине на тему Иммунохимическая диагностика пневмококковой инфекции
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВАКЦИН И СЫВОРОТОК ИМЕНИ И.И.МЕЧНИКОВА
ПАДЮКОВ Леонид Николаевич
ИММУНОХИМИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ПНЕВМОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ
14.00.36 — Аллергология и иммунология
Диссертация в »лае научного доклада на соискание ученой степени доктора медицинских наук
Работа выполнена ■ Научно-исследовательском институте вакцин к сывороток имени И.И.Мечникова Российской Академии медицинских наук.
доктор медицинских наук, профессор
доктор медицинских наук, профессор
доктор биологических наук, профессор
Ведущая организация — Институт экспериментальной медицины РАМН. г.Санхт-Петербург.
Защита диссертации состоится 26 октября 1994 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д074.09.01 при Институте иммунологам Мшцдрадмсдпроыа РФ по Адресу: 115478 г.Москва, Каширское шоссе, д. 24, кора-2
С диссертацией можно ознакомиться а библиотеке Института иммунология Минздравмедпрома РФ.
Диссертация разослана -^’О сентября 1994 г.
Ученый секретарь диссертационного совета.
АКТуаЛЬНОСТЬ Проблемы. Streptococcus pneumoniae -пневмококк — является широко распространенным условнопатогешшм микроорганизмом, вызывавшим различные формы заболеваний у ллдей: острую пневмонию, бронхит, отит, гнойный менингит и др. Благодаря работам отечественных и зарубежных исследователей установлено, что пневмококк является ведущим этиологическим агентом при этих заболеваниях (Випнякова Л.л.и др., 1981, Катосова Л.К., 1987, В.Gray, Н.Dllion, 1986, P.Geslln et al., 1994). В ПОСЛвДНее
десятилетие наблюдается резкое увеличение удельного веса антабиотакоустойчивых штаммов пневмококка (Катосова JI.K., 1990, p.Berche et ai.,i994). в связи с этим актуальной является разработка адекватных методов специфической этиологической диагностики при респираторных заболеваниях,- направленных не своевременное и надежное выявление пневмококковой инфекции с целью проведения соответствующей терапии.
Для диагностики пневмококковой инфекции используют некоторые методы иммунохимичэского анализа, т.е. анализа, основанного на взаимодействии антител с антигенами. При бактериологическом обследований с помощью антисывороткл возможна идентификация пневмококков методом набухания капсулы (E.Lund, j.iienrlckBen, 1978), а также методом прямой или непрямой пммунофлуоресценции (Л.А.Вишнякова и др. 1981). Кроме этого известен способ идентификации капсульных форм пневмококков и соотвотствущих антигеноэ с помощью коагглютинации и латекс-агглютинации (Р.Oleen, 1973, К.Leinenen, 1980), ОДНЭКО BC6 ЭТИ методы основаны на р акции антител только с капсульнымя полисахаридами пневмококка. Имееются также сведения о методах обнаружения антител к пневмококку, . которые основаны на специфически капсульных полисахаридах, входящих в состав пневмококковой вакцины (H.Russei et ai, 1980). При использовании дпагностикумов такого пша не могут быть выявлены бескапсульные (шероховатые) формы пнемококка, которые, по данным ряда авторов, играют значительную роль в патогенезе пневмококковой инфекции (Л.А.Вишнякова и др. 1981). Кроме того, полученные ранее сведения об го.мупном ответе на капсулышв полисахариды пневмококке свидетельствуют о незначительных серологических сдвигах в ходе инфекции или вакцинации в отношении таких антигенов. Эти данные не позволяют однозначно оценить Интенсивности иммунного ответа к пневмококку.
Капсульные полисахарида пневмококка, представленные у этого микроорганизма 90 серотипаыи (л.непг!.схавп, 1993), являются основой единственной известной иммунохимической классификации 8того вида. Усовершенствование методов, идентификации пневмококков по свойствам их капсулы такга остается актуальным. Вместе с тем, в современной отечественной и заруйеашой литературе отсутствуют сведения о разработке систем диагностики, позволяющих охарактеризовать развитие пневмококковой инфекции на разных уровнях взаимодействия макро- и микроорганизма: путай выявления как ююток пневмококка и его антигенов, так и антител к нему. Постоянные поиски взаимосвязи между серотипом и вирулентностью штаммов пневмококка до сих пор но дали однозначного ответа, хотя известны некоторые закономерности, связанные с выделением у Сольных наиболее часто встречающихся серогшюв пневмококка. В связи с этим актуальной является разработка системы субтипирования по антигенным маркерам, отличным от капсульных антигенов, а такко иоиск альтернативной системы типовой или субтиповой классификации пневмококков, позволяющей не только произвести субтипированке известных капсульных форм, но и осуществлять мониторинг за Свскапсулышми формами этого микроба.
Цель работа — выявление иммунохимически активных белков пневмококка и создание на основе различных антигенов этого микроорганизма диагностических средств, позволяющих осуществлять сммунохимическую диагностик пневмококковой инфекции.
1. Цровэсти анализ антигенной гетерогенности штаммов пневмококка, как основы для их ладовой иммунохимической идентификации. Проанализировать возмокность построения классификационной схемы на основа вновь выявленных штаммовых признаков пневмококке.
2. Оценить иммунологические свойства искусственных антигенов, синтезированных по аналогии с природным полисахаридом пневмококка серотипа 3, для использования га в диагностических целях.
3. Разработать едекватные методы иммунохимической диагностики для идентификации бактериальных клеток пневмококка, его онтигеноа н антител к ним.
4. Разработать метод быстрой диагностики для выявления ьнтигенов пневмококка независимо от серотале.
5. Определить диагностические возможности кммунофермонтшх систем на основе белковых и полисахаридных антигенов оне?мококка,
На основе сочетания основных иммунохимически активных белков пневмококка предлокена система субтитрования, позволяющая классифзцировать штаммы пневмококка независимо от га серотипа.
Доказана иммунологическая активность искусственных антигенов, синтезированных химическим путем по аналогии с капсульшм полисахаридом пневмококка серотипа 3.
Нау’то обоснован и разработан способ иммунохкмическоЯ идентификации пневмококков независимо от наличия капсулы, который позволяет одновременно выявлять нетипируемые и оОычше капсулькые ПТ8МШ.
Установлено, что у пневмококка имеется несколько видов белковых антигенов, к которым происходит выработка антител при ютевмококовой инфекции у животных и человека. Динемиха появления антител индивидуальна и может зависить от исходного уровня антител в крови.
Обнарунено, что у взрослы! здоровых людей уровень антител к белковым антигенам пневмокока и его тейхоевым кислотам в средней вше, чем у здоровых детей и близок к уровни антител у детей спнеамококковой инфекцей.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ Предложено использование препаратов белковых антигенов для иммунохимической диагностики пяевмококовой инфекции и показаны возможности системы для определения антител к пневмококку с помощью иммуноферментного анализа.
Разработана универсальная методика приготовления латексных диагностикумов для определения различных антигенов на основа эпоксидированных латексов.
Разрэботашше диагностикумы» домунофермэнтная система для определения антител к пневмококку (Фармакопейная статья 42-380ВС-91, Производственный регламент Я 359-92) набор ПНЕВМО-ТЕСТ для коагглютинации (Лабораторный регламент утверждай Ученым Советом НИИ ВС 14.11.1991 г.)- внедрены в производство и используются в различных учреждениях Российской Федерации п Республики Украина. Эти технологические решс.шя защищены патентами на «Способ диагностики пневмококковой инфекции» (положительное
решение о выдаче патента от 23.01.92 на заявку н 4937427/14-41611 от 1?.05.91.) и на «Способ приготовления диагностикума для определения антигенов в реакции коагглютинащш» N 1762242.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОХЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
1. Разработана система имыунохимической диагностики пневмококковой инфекции, вклячаодвя препараты для выявления векториальных клеток пневмококка или его антигенов и антител к нём, н поэволяшая выявлять антигены и антитела независимо от серотипа пневмококка-возбудителя.
2. Белки пневмококка с м.ы. 50 , 74 . 60 и 94 ко являются иымунологически активными, так как антитела к ниы образуются у детей и взрослых при возникновении пневмококковой инфекции, 8 также у взрослых здоровых ладей.
3. Полностью искусственный антиген, содержащий олигомеры, идентичные участкам природного полисахарида пневмококка серотипа Э, обладает активностью природного полисахарида и может быть использован для качественной и количественной оценки активности ентительншс и антигенных препаратов пневмококка в реакциях, основанных на РПГА и ИФА.
4. К особенностям гуморального иммунологического ответа цри пневмококковой инфекции у человека и животных относится возможность различных типов реагирования: постепенного нарастания количества антител, сохранение относительно низких концентраций и сохранение относительно высоких концентраций антител. В единичных случаях наблюдается снижение первоначально высокого уровня антител К пневмококку.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Материалы диссертации обсуждались на научной конференции отдела иммунохиинческой диагностики НИИ ВС, заседании Ученого Совета НИИ вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова (Протокол N 5 от 19.05.94), на 16-ой конференции Федерации европейских Оюишических обществ (Москва, 1964), и-ой Всесоюзной конференции ■Актуальные вопросы клинической микробиологии в неинфекционной клинике» (Москва. 1968), региональной научной конференции «Актуальные проблемы педиатрии в Сибире и на Дальнем Востоке» (Хабаровск, 1988). хи-ом Всесоюзном съезде детских врачей (Москва, 1988), Всесоюзных конференциях «Современные направления создания медицинских диагиостикумов» (Москва, 1988 и 1990 К
Всесоюзной конференции «Генная и клеточная инженерия в решении фундаментальных проблем биотехнологии» (Тарту, 1989), Научно-практической конференции «Актуальные вопросы реабилитация больных с патологией органов дыхания» (Барнаул, 1989), xv-om Международном симпозиуме по проблеме детской пульмонологии (Киев,
1989),’ XVII—ом Съезде Всесоюзного общества микробиологов и паразитологов им.И.И.Мечникова (Алма-Ата, 1989), х-ом Всесоюзном иммунологическом Съезда (Дагомыс, 1989). х-ом Всесоюзном Конгрессе по болезням органов дыхания (Киев, 1990), Всесоюзной научной конференции «Проблемы медицинской биотехнологии» (Ленинград,
1990), 6-ом Меядународном Конгрессе по быстрым методам п автоматизации в микробиологии и иммунологии (Хельсинки, 1990), 14-ом заседании немецкого Общества педиатров- пульмонологов (Ганновер, 1992), 7-ом международном Конгрессе по местному Ешунптету (Прага, 1992), xxiv-om ежегодном заседании скандинавского Общества иммунологов (Орхус, 1993), хи-ом Международном симпозиуме по стрептококкам и стрептококковой рфекции (Санкт-Петербург, 1993), 28-ом Всемирном Конгрессе по легким (Майнц, 1994),xv Меядународном Конгрессе по аллергологии и клинической иммунологии (Стокгольм, 1994), Международном симпозиума «Педиатрическая неделя Голландии» (Роттердам, 1994).
Основные положения диссертационной работа опубликованы в 68 научных работах, из которых 2 — главы в монографиях, 2 — в зарубевных яурналах, 20 — в центральных изданиях, 2 патента.
Источником для выделения антигенов пневмококка служили эталонные итаммы Streptococcus pneumoniae ИЗ КОЛЛеКЦИИ НИИ ВС ем.И.И.Мечникова. Штаммы пневмококка лэба и спс получены от j.Henricksen, (Институт сывороток, Дания). Штаммы выращивали в стационарных условиях с использованием питательных сред bhi («Difco», США) или среды «25 вариант» с добавлением 10» инактпвироваЕной бычей сыворотки. Культивирование и контроль бактериологической чистоты проводили сотрудники лаборатории микробиологии условнопатогенных бактерий НИЬ ВС им.Мечникова.
Выделение капгул^нчх полисахаридов пневмококка проводив
путай ацетонового осавдения (Н.В.Цветкова и др., 1981). Препарат ■шйхоавых кислот пневмококка выделяли на основе методики v.eor«n»«n and j.Htinricicsen (1984) в нашей модификации.
Били использованы антисыворотки к различным серотипам, серргруппам, тейхоевым кислотам пневмококка, поливалентные и омни-сыворотка, полученные в лаборатории микробиологии условнопатогенных бактерий НИИ ВС им.И.И.Мечникова. Антисыворотка к пневмолизину любезно предоставлена M.Lainonen (Институт здравоохранения, Фшшшдия).
Кроличья внтисыворотка к белковым антигенам пневмококка была получена пятикратной иммунизацией кроликов антигенным препаратом с полный адъювантом фрайнда в дозах от 0,5 до 3 мг общего белка при введении в несколько точек подко! ю. Кровь забирали из ушной вены ц отделяли сыворотку общепринятым методом. Активность ентисывсротки предварительно определяли в реакции двойной иммунодиффузии. В результате иммунизации антигеном, выделенным цвтавлоновой экстракцией, были получены антисыворотки с титром на ниже Is16.
Донорские сыворотки анализировали предварительно в ИФА с препаратом белковых антигенов пневмококка. Сыворотки, дававшие ярко положительные реакции в диагностическом титре (более 0,6 ед. оптической плотности в разведении I¡1600), объединяли для создания контрольной пуловой сыворотки. Полученная сыворотка была использована далее как препарат положительной контрольной шьоротки в ИФА и для исследований в иммуноблоте белковых антигенных препаратов пневмококка.
Препараты моноклональных антител получены из НИИ 0Ш1 (г.Тарту, Эстония).
Суспензии полистироловых латексов получены в НИИ синтетического каучука (г.Санкт-Петербург). Электрофоретнческую подвижность частиц латекса измеряли с помощью прибора z«ta>izer («Malvern», Великобритания) и выражали в значениях с-потенциала. Средний размер частиц определяли на приборе Autoai*« (Malvern, Великобритания) (работа проведена совместно с кафедрой высокомолекулярных соединений Химфака ИГУ).
Очистку иммуноглобулинов осаждением сульфатом ашония и аффинной хроматографией на протеин А-сефарозе проводили по методике, рекомендуемой фирмой-производителем.
Хроиатографическую очистку антигенов проводили методом гель-фильтрации низкого давления на гелях Сефарозы А препаратов, содержащих дисахарида, трисахариды и тетрасахарид, позволяет предположить, что для проявления указанных антигенных свойств достаточно дкмерной части нативного полисахарида, однако выраженность реакции с антисывороткой у полимера с теграсахарадом выше в приближается к выраженности решшн с натавным полисахаридом (Табл.1). Относительная
активность реакции пативного полисахарида с сыворотками из разных источников различается, что, на нал взгляд, свидетельствует о различии в концентрации и аффинности антител в этих сыворотках. Однако некоторое несовпадение реакций искусственных полимеров на основе да-, три- и тетрасахаридов с двумя типами использованных антисывороток к пневмококку серотшоз 3 и 8 указывает на различие п специфичности этих антительных препаратов, которое новозмопно было бы идентифицировать с помощью препарата натлвного полисахарида.
Папе исследование показало, что полностью искусственный антиген обладает активпостью природного полисахарида и мотах Опть попользован для качественной и количественной оценки активности антительних н антигенных препаратов пневмококка в реакциях, основанных па РПГА и ИФА. Более интенсивное развитие химической основы для синтеза полисахаридов пневмококка другой специфичности, возможно, позволит перейти к практическому использованию таких антигенов для иммунохимической Диагностики. Большим достоинством использования искусственных антигенов с полиакриламидом в качестве носителя является практически полное отсутствие неспецлфических (Фоновых) реакций с сыворотками’.
Особое внимашю ш уделили разработке метода выделения белковых антигенов пневмококка. Кроме единственной публикации R.Austrian и с.м.MacLeod (1949) мы не нзпгли в доступной литературе данных о белковых антигенах различных штаммов пневмококка. Прн исследовании этих антигенов было вакно получить препараты, свободные от капсулышх полисахаридов. Поскольку в контрольных сыворотках против цельных клеток пневмококка такие доминируют антитела к кзпеульным полисахаридам, было важно полностью очистить белковые препараты от примеси капсулыюго антигена. Для этого нами был разработан оригинальный метод, основанный на экстракции белков положительно заряженным детергентом — цатавлоном. При действии этого агента происходит солюбализация белковых структур, тогда как отрицательно заряженные капсульшо полисахариды и нуклеиновые кислоты агрегируются и выпадам1 в осадок. Дальнейшее разделение экстракта методом гель-фильтрации позволяет освободиться от примэсп тейхоевых кислот, обладзщих положительным зарядом, п самого детергента. Препараты, полученные „аким методом, были п дальнейшем использовать для создания пммуноф?рментной системы д.тя
определения антител к пневмококку.
Наин бил проведен алектрофоретиче екай анализ белковых препаратов, выделенных из 35 пташов пневмококка из коллекции НИИ вакцин и сывороток имени И.И.Мечникова. Получение белковых препаратов проводили двумя способами: цетавлоновой экстракцией или методом замораживания — оттаивания. Мы сравнили состав препаратов, выделенных из нескольких штаммов обоими методами, в электрофорезе в ш активности в ИФА. Оказалось, что метод замораживания -оттаивания дает сходный по белковому составу продукт в сравнении с продуктом, полученным методом цетавлоновой экстракции, но ве позволяет освободиться от примеси специфического капсульяого полисахарида. Препараты, подученные по нашей методике, содержали Солее 20 компонентов, выявляема в электрофорезе в полиакрилаыидном геле с додецилсульфатои натрия. Для выявления юидунохимически активных компонентов ш использовали методику жодунопроявления антигенов, перенесенных на нитроцеллюлозную мембрану (вестерн-Олот) в двух вариантах: с проявлением кроличьей антисывороткой в с проявлением пудовой человеческой сывороткой, содержащей, по данным ИФА, антитела к пневмококку.
При анализе сложных белковых смесей методом электрофореза большое значение имеет точность и воспроизводимость методики. Наличие существенных смещений напряженности электромагнитного шля Б пределах одной пластины с гелем может привести к ошибке при определении молекулярной массы до 30%, что весьма существенно, особенно для высокомолекулярных соединений (и-Рвхитав, р.бпвп^ 1»7»). Сравнение не результатов, полученных в независимых акешриментах. может увеличить ошибку измерения еще на 10-20%. Использование процедуры переноса антигенов на нитроцеллюлозкый ©Шитр, их иымунопроявленне, а затем — денситометрирование результатов реакции также вносит дополнительную ошибку измерения. Поскольку нами было проведено денситометрирование с позитивной фотограммаской пластины, разброс данных йог быть еще более высокш. фактически невозможно взбежать существенных искажений результатов ашктрофореэа» выявляемых таким многоступенчатым шторм, так как езшбка. измерения на каждом этапе суммируется. В связи» с атм* ми использовали методику с введением на каждую пластину, так называемого, «внутреннего стандарта», близкого по свойствам-к исследуедам- образцам. Внутренним стандартным образцом был избран прапэрат иа штампа 11/56 серотина 3, который, по данным предварительшш экспериментов, давал относительно четкие, хорошо
Рисунок 2. Иммуноблот и денситограмма белкового антигенного препарата, выделенного из я.pneumoniae, штамм 11/56
Рисунок 3. Иммуноблот белковых антигенов, выделенные из различных щтамдав пневмококка: Пштамм 77/64(серотип 22А), 2)штамм 51/57 (серотип 34). 3)птамм 44/62 (серотип I8C), 4)штамм 75/64 (серотип IIC), 5)штамм 11/56 (серотип 3), 6)штэмм 12/56 (серотип I4A), 7)ит8мм 36/57 (серотип 27), 8)штамм 76/64 (серотип I9C), 9)птамч 32/57 (серотип 24А )
Табл.2 Наличие имыунохимическн активных балков в иташах пневмококка с различными сероетшама по результатам иммунопроявлешш
(Молекулярная масса белков (кялодальтон) ‘ 110 102 94 80 74 66 63 50 серотип | | I I I I I I штамм
12F 44 +4 + 44 44 4 — 44 10/56
19С 4 4 44 44 44 — — 4 76/64
40 — 44 ‘ — 44 44 44 — 4 1162/41
Обозначения: — линия отсутствует;
«+» — линия от 1до 10 усл.ед.; «++» — более 10 усл.од.
вдонифщнруб’ше полоса во Есех потенциально информативных интервалах молекулярной шссы’ (рис.2). Для этого препарата ш щюезли опрадэлгшю молекулярной ь;ассы основных коглхонентов, вшшлязшх в к-ууноблоте. Такии путем ш нивелировали ошибку катода до уровня разброса данных в прздзлах одной пластины и
Анализ полученных данных (табл.2, рис.3) показал, что наиболее характерными иммунохимнчески активными компонентами белковых препаратов пневмококка являются белки с м.м. 74, 80 и 94 килодальтон. Относительная частота встречаемости этих компонентов среди проанализированных штаммов составила 71,4%, 100* и 74,3*, соответственно. Следует особо отметать характерный для всех исследованных штаммов компонент с м.м. около 80 килодальтон, который составляет центр перечисленной выше триады — группы белковых полос, близких по своей электрофоретической подвижности (рас.2). Два других компонента практически во всех исследованных штаммах представлены ярко выраженными пиками, причем лишь у грех штаммов (8,6*) эти два компонента отсутствуют одновременно. Эта штаммы относятся к относительно редко встречающимся серотипам пневмококка 16, 33В и 38 (штаммы 14/56, 50/57 и 1874/39, соответственно).
В препаратах, полученных из разных штаммов, выявлены также компоненты с м.м. 50 и 66 килодальтон, которые характерны для 42,9% н 37,1% изученных штаммов, соответственно. Компонент с м.м. 66 килодальтон у 5 из 13 штаммов, которые его содержали, . был представлен в виде ярко выраженного характерного пика. Шли выявлены и антигены с менее высокой частотой встречаемости. К ним можно отнести белок с м.м. около 63 килодальтон, встречавшийся у 17,4% исследованных штаммов. По данным ь.мсоап!е1 с соавт. (1986) выделенный им белок Рврг, обладающий высокой степенью полиморфизма, дает при электрофорезе полосы с м.м. 76 и 84′ килодальтон. Эти данные хорошо согласуются с нашими, так как указывают на присутствие в других штаммах пневмококка сходных по молекулярной массе иммунохимически активных компонентов. Вероятно, этот белок часто, если не всегда, представлен у пневмококка. Подобные антигены, представляющие собой общие для вида компоненты, могут служить основой для диагностики, а также быть перспективными препаратами для иммунопрофилактики инфекционного заболевания.
Нами было проведено также прямое иммунохимическое определение пнввмолизина, как одного из возможных иммунохимически активных белков пневмококка (рис.4). Пммунопроявление белков из препарата, полученного экстракцией цетавлоном, с помощью ангисывороткп к пневмолизину показало лишь незначительную примесь пневмолизина в препарате.
Ри.унок 4. Иммуноблот препарата белковых антигенов, пневмолизина и неирамшшдазы пневмококка с проявлением антисывороткой к пневмолизину: I) белковый препарата из штамма 11/56; 2) и 3) пневмодизин I мг/мл и 0,2 мг/мл; 4) и 5) нейраминвдаза I мг/мл и 0,2 мг/мл
Обнаружение стабильных, повторяющихся признаков, сочетание которых характерно для различных штаммов пневмококка, является, на наш взгляд, объективной основой для белкового субтипирования пневмококка. До сих пор такой системы не существовало, поэтому мы в настоящей работе мы предлагаем следующие признаки для проведения субтипирования, как основы для нового типа внутривидовой дифференциации пневмококка, отличной и независимой от классического полисахарвдного типирования. Этими признаками являются сочетание в составе препарата белковых антигенов (полученного методом экстракции детергентом или замораживанием -оттаиванием) высокомолекулярных белковых антигенов с м.м. 50, 63, 66, 74, и 94 килодальтон. Сочетание такого числа признаков потенциально дает 120 вариантов субтипов (ш при п-5). Однако реально мы столкнулись с достаточно высокой степенью совпадения некоторых из этих признаков, что приводит к 29 различным субтшам. При использовании для даКерекцировкн пташов четырех белков было выявлено II сочетаний, а при учете только трех белков — 6 субтипов. Вероятно из практических соображений необходимо учитывать 3 шш 4 из выявленных белков, сократив прогозируемое число субяшов до 6 или 24 (31 и «i, соответственно).
Полученные данные, которые мы рассматриваем как основу новой серотнповой классификации пневмококке являются практически важными s двух аспектах. Во-первых, в результате сравнительного анализа белковых компонентов мы выявили белковый антиген пневмококка с
м.м. 80 килодальтон, который может оказаться общим для всего вида, так как встречается во всех исследованных штаммах. Дальнейший анализ этого белка с помощью моноклональных антител или путем секвенирования и сравнение с белками микроорганизмов рода streptococcus могут решить вопрос о его видовой специфичности. Во-вторых, определение субтипов по иммунохимически активным белкам пневмококка даст возможность дифференцировать между собой некапсульные штаммы пневмококка и определить их эпидемиологическую значимость.
Анализ сочетания обнаруженных нами признаков и серотипов соответствущих штаммов (табл.2) показал следующие закономерности. Как правило, штаммы, пренадлежаше к одной серогруппе, но розным серотипэм и различающиеся по полисахаридннм парциальным факторам, различаются также и по составу белковых антигенов. В то же время нз?ли обнаружено, что оба проанализированных штамма серогруппы 35 (штамм 55/57 с/т 35С и штамм 52/57 с/т 35г) обладают идентичным составом белковых антигенов. С другой стороны, такие далекие по антигенной структуре штаммы, как 77/64 (с/т 22А) и 39/57 (с/т 29) идентичны по составу указанных белковых компонентов. Штаммы 2/56 (с/т 5), 37/57 (с/т 28А) и 47/57 (с/т 32г) одновременно имеют компоненты с м.м. 50 , 80 и 94 килодальтон, но различаются по присутствию компонентов с м.м. 63, 66 и 102 килодальтон.
Из сказанного можно сделать вывод об особой роля белков пневмококка с м.м. 50, 80 и 94 килодальтон, которые обладают серологической активностью и требуют дальнейшего изучения. Следует также отметить необходимость дальнейшего исследования общих для различных штаммов пневмококка белков с м.м. 63 и 74 килодальтон. При анализе активности сывороток больных с пневмококковой инфекцией (см. раздел 3.3.) мы показали наличие антител к некоторым из выявленных белковых антигенов, прежде всего — к компонентам с м.м. 50, 80 и 94 килодальтон.
Таким образом, наш был получен и исследован ряд белковых антигенов пневмококка, обладающих, выраженной иммунохимической активностью. Мы доказали иммунохимическую активность полностью искусственного антигена со специфичностью капсульного полисахарида пневмококка ceponma 3. В нашей работе впервые выявлена икмунохпмическая активность нескольких пневмококковых белковых аптигенов п показана возможность разработки на их основе новой серологической классификации этого микроорп..шзмз, не зависящей от серотипа штамма и выработки кппсульных антигенов.
2. Разработка методов иммунохимической диагностики пневмококковой инфекции Набор методов, направленных на этиологическую диагностику пневмококковой инфекции, на наш взгляд, должен включать методы трех уровней:
-методы выявления микробных клеток; -методы определения антигенов; -методы определения антител. Возможности иммунохимического .анализа позволяют найти методическое решение для кавдого из этих уровней. В связи с этим, в ходе выполнения настоящего исследования нами были разработаны следующие препараты для диагностики пневмококковой инфекции:
-коаггллтинационные диагностику ма для выявления микробных клеток пневмококка и определения его антигенов: капсулышх полисахаридов различных серотипов и С-полисахарида;
-латексагглх)Т1шационный диагностикум .¡уш определения антигенов пневмококка (кавсульных полисахаридов различных серотипов);
-иммуноферментная система для определения антител к капсульным полисахаридам пневмококка;
-иммуноферментная система дяа определения антител к тейхоевым кислотам пневмококка;
. -иммуноферментная система для определения антител к белковым антигенам пкевыококко;
-иммуноферментная система для определения 1«*-антатед к пневмококку.
2.1. Коагглютанационные диагностикумы Использование ревкции коагглютанацаи до сих пор не получило долкного распространения при диагностике пневмококковой инфекции. Основной проблемой, снижающей диагностическую ценность метода, является невозможность выявления с его помощью вташов пневмококка со слабой или неразвитой капсулой.
Цри разработке коагглютинациокных диагностикумов нами Сило решено три методические задачи:
1. Повышение чувствительности диагностикума в сравнении с известными аналогами с помощью обработка исходных клеток носителя.
2. Повшвние специ$ичности диагностикума за счет использования препарата очищенных антител.
3. Увеличение диагностических вогмзжностей путем применения
двух типов диагностикумов — к капсулышм и некапсульным антигенам.
Наш Оыл воспроизведен известный метод приготовления коагглютшационных _ диапюстнкумов на шдели поливалентной антиснворотки к пневмококку. Полученные серии диагностикума сравшшали по чувствительности с коммерческим диагностикумом аналогичной спещфгшостп, ПРОИЗВОДИ!.™ фирмой Pharmacia-LKB (ШВОЦЦЯ) ПОД торговой маркой Phadebact-Pneuraococcua Test. Оказалось, что первоначально приготовленные нами серия диагностикумов уступали по чувствительности коммерческим в 5-10 раз.
В целях совершенствования коагглютинационных диагностикумов ш модернизировали известный метод сенсибилизации фиксированных клеток стафилококка. Комбинацией воздействия ультразвука и буферной система растворителя нам удалось значительно повысить чувствительность диагностикума, так что в конечном счете он работал в 10-15 раз чувствительнее, чем рефзренс-днагностикум
Phadebact-Pneunococcue Test. ЭфЗЕвКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВаННОГО МеТОДО
была показана наш такке и на других моделях: н.influenzae, в.pertussis, H.neningitidia. На способ приготовления диагностикума получен патент РФ н 1762242.
Следующим этапом усовершенствования диагностикума была очистка исходного антительного препарата. За счет повышения абсолютной и относительной концентрация антител в нем нам удалось увеличить специфичность диагностикума. Дополнительное повышение качества диагностикума было достигнуто путем получения препарата антител, еффяшо очищенных от других белков сыворотки крови с помощью протеин-А-Сефарозы. Аффшная хроматография с использованием сорбента на основе белков бычей сыворотки позволила получить препарат антител, который по данным йммуноэлектрофореза не содержал антител к сывороточным белкам.
Специфичность полученных диагносашумов была проверена в реакции с различными пневмотропными бактериями или с их антигенными препаратами: бактериальными клетками рода
Streptococcus, K.pnaunoniae, В.pertussis; аНТИГвНЗМИ З.аигоиа, II.influenzae, В.pertussis.
Возникновение некапсульных форд (R-фсрм) пневмококка является хорошо известным фактом (R.Austrian, 1953). Особенно это характерно при хроническом течении пневмококковой инфекции. Такие штаммы практически невозможно иденпфлировать с помощью препаратов, специфичных в отношении кзпсульяых антигенов, иначе
ТиОл.З Использование двух типов коагглютинационшх диагностикумиь для идентификации штаммов — клинических изолятов пневмококка
Капсульные свойства Кол-во Положительные реакции коагглютинационшд. щтеымов штаммов даагшстикумов с специфичность»!
полисахаридный ТХК контроль сумма
Капсульные штаммы 29 25 4 0 29
Бескаисульше штаммы 34 ю 24 0 34
как после длительной процедуры пассирования через животных, которое приводит, к восстановлению способности микроба продуцировать капсульный материал. Мы разработали метод получения диагвостикушБ, способных выявлять все штаммы пневмококка, независимо от наличия и размера капсулы. Для атих целей ш использовали антисывдротку к тейхоевцм кислотам пневмококка, которые являются видовым антигеном этого микроба и локализованы в его клеточной стенке (s.sorensen et ai, 1984). Параллельный анализ с помощью двух диагностикумов (против капсульных полисахаридов и против тейхоевых кислот) более 60 штаммов, выделенных от больных, поквзал, что 100* исследованных штаммов идентифицируются как пневмококк при использовании одновременно двух диагностикумов (табл.3). При этом 56* давали положительную реакцию с диагностикумом против капсульных антигенов и 44* — с диагностикумом против тейхоевых кислот пневмококка. Поскольку пневмококк, как микроорганизм, характеризуется присутствием на поверхности клетки хотя бы одного из указанных антигенов, из этого мы сделали вывод о том, что комбинация двух диагностикумов позволяет идентифицировать все штаммы без исключения. Такого рода методический подход был применен впервые нами.
Применение разработанных нами коагглютинациошш диагностикумов нового типа позволит не только увеличить число правильно идентифицированных штаммов пневмококка, но и более точно оценить вклад некапсульных штаммов этого микроорганизма в структуру заболеваний, в сравнении с капсулъными. Аналогичный подход, на наш взгляд, можно использовать при разработке средств диагностики других заболеваний, вызываемых инкапсулированными
2.2. Диагностикумы для латексагглютинации
Использование частиц латекса для создания диагностикумов несет некоторые существенные преимущества, связанные с Апологической инертностью полистиролыюго досителя. Латексные диагностикумы обладают более низким уровнем неспецифических реакций, особенно при анализе патологического материала, взятого ОТ больного — сыворотки ИЛИ плазмы крови, СМЖ и Т.П. (М.Ьа1попеп,
Наш был разработан латексный диагностикум, основа!шый на препарате монодисперсных полистироловых микросфер, обладающих особыми свойствами поверхности. Мы установили, что описанный в литературе метод сенсибилизации полимерной поверхности латексных частиц (и.веувг1п, 1972), или схожий с ним метод активации полимерного носителя для ИФА (т.е. процесс адсорбции белков на поверхности полистирола) не во всех случаях позволяет получать диагностикумы с высокой чувствительностью. Исходя из теории устойчивости суспензионных систем, суспензия частиц латекса (обычно это частицы с размерами 0,5-1,0 гакрон) кроме оптимальных сорбцпонных условий должна находиться в среде, стабилизирующей ее как коллоидную систему. Для подбора оптимальных условий приготовления диагностикумов первоначально нами была исследована модельная система сорбщш иммуноглобулинов на частицы полистиролового латекса (эта часть работы была проделана совместно с кафедрой высокомолекулярных соединений Химического факультета МГУ им.Ы.В.Ломоносова). В качестве модельного препарата иммуноглобулинов мы использовали препарат моноклональных антител к шоглобипу. Нами были исследованы следующие параметры, характеризующие частицы латекса и состояние коллоидной системы» средний размер частиц до сенсибилизации (адсорбции), после сенсибилизации и после добавления антигена; ^-потенциал частиц до и после сенсибилизации. Главным_ параметром, характеризующим сорбцпопше свойства латексных частиц, являлась для нас величина концентрации белка, соответствующая предельному уровню адсорбции его из раствора. Ее можно приблизительно принять за минимальную концентрацию белка, необходимую для создания мономолекулярного белкового слоя на поверхности полистироловых частиц. Анализ сорбционных свойств латексных частиц проводился по оценке концентрации несорбированного белка (методом определения его
собственной флуоресценции). Было проанализировано влияние изменения концентрации модельного белкового препарата, значения рН и ионного состава сроды (Рис 5). При переходе к системе с поликлоналышми кроличьими антителами наш была использована методика, разработанная для модельной системы, с учетом сеойств поликлональншс иммуноглобулинов. Варьируя концвнтрацш) антител в свойства буферного раствора ш определила, что оатшашюв сочетание этих параметров лежит в узкой зона Евлачиа, созволящих поддерживать приготовленный диагносшсуц в виде матастабальдай суспензии, обладание» свойством быстро- флокулировать в’присутствии антигена. Этот процесс по аналогии с другими ишудологическиш методами традиционно называется! агглютинацией.
Вместе с тем, проанализировав процессы, которые могут происходить в латексной суспензии, мы сделали вывод, что флокуляция суспензии происходит, вероятно, на за счет многоточечного, взаимодействия ыеадщ антигеном е ейскодыозй частицами, а за счет изменения поверхностных свойств часиЩ даагностикуыа, прежде всего — нейтрализации поверхностаого зарадй частицы, с-потенциал сенсибилизированных частиц латекса настолько близок к нули (Рис.6), что дальнейшее его умшщцзяие аа счаз нейтрализации антигеном, может привести с выходу систеш к» равновесия и флокуляции (агглютинации)..
Методические аспекты этой работа & настоящее, время оформляются в вида заявка на иазеш.
Использование высокоочивешла аатителыш препаратов для приготовления латексШл днагностикуыаа позволяет взбежать параллельной адсорбции балластных сиворотачшг белков,, свшшщвх специфическую активность диагностикуыа. Особенно- важно выпоишь вто условие дяя поливалентных сывороток, в частности — при использовании поливалентной пуловой антисыворотки против всех серотипов пневмококка. На основе оригинальной методики, разработанной наш, были получены моно- и полиспецифические в отношении капсульных антигенов пневмококка диагностикуыы.
Имевшиеся в нашем распоряжении частицы латексов исходно обладали отрицательный поверхностным зарядом, что предполагалось, всходя из -химических свойств поверхности модифицированных латексншс частиц, и было ваш показано путем измерения их влактрофоре гиче ской подвижности (рис.6). В процессе сорбции антител различного происхождения общий заряд частиц становится близок к нейтральному. При этом мы наблюдали изменение равновесия
Рисунок 5. Изотермы адсорбции эпоксидированных латексов при различных значениях рН среды.
Рисунок 6. Изменение поверхностного заряда эпоксидированшх частиц латекса в процессе сорбции препарата антител при увеличении концентрации бёлка в растворе
коллоидной системы и как следствие — неслещфичьокую фюкуляцши частиц в условиях сорбции из раствора с высокой концентрацией белка. Кроме того, устойчивость системы зависила и от ионного состава использованного буферного раствора, что вполне согласуется с известными представлениями в этой области. Наш! были определены вид, концентрация и значение рН буферного раствора, позволявшие сохранять нативные частицы латекса в стабильном состоянии с небольшим суммарным отрицательным зарядом частиц. Поскольку процесс сорбции белков (иммуноглобулинов) снижал этот заряд, то для поддержания стабильности системы ш проводили сорбцию в условиях очень низкой концентрации белка. Анализируя изотермы вдсороции моно- и поликловалышх антител на поверхность частиц латекса в таких условиях, мы обнаружили (рис.5), что одновременно эффективный и устойчивый диагкостикум можно получить только в условиях, соответствующих образованию мономолекулярного слоя не поверхности полимера. Чувствительность диагностикумов, полученных этим методом, в зависимости от типа антител и антигена варьировала в интервале от 30 до 240 нг/мл. Эти значения соответствуют уровню циркуляции капсульных антигенов при пневмококковой инфекции.
Таким образом, на основе анализа физико-химических факторов устойчивости коллоидной системы, состоящей из частиц латекса, нами разработан способ приготовления латексных диагностикумов, несущих на поверхности частиц антитела. Полученные этим методом диагностикума предназначены для иммунохимической детекции капсульных антигенов пневмококка. Следует отметить, что, хотя эмпирическое использование латексагглютинационных диагностикумов известно уже давно’, до олх пор не было проделано систематического исследования процесса сорбции антител на поверхности латексных чэстиц и стабильности получаемой коллоидной системы со специфической активностью по отношению к соответствующему антигену. Такого рода исследование нами было проделано впервые.
Реакция пассивной гемагглютинации является широко распространенным методом иммунохимической диагностики. Для отделения . антител к полисахаридам пневмококка нами был уьарлйотан эритроцитарный диагностикум на модели полисахарида серсткт 3. Однако даке при реакции с кроличьими антисыворотками этот диагностику« давал относительно невысокие титры (не более 1:1024*). измеыедая условий сенсибилизации эритроцитов или условий
проведения реакции не дали существенного увеличат!« чувствительности диагнос-тикума, что свидетельствует о низкой эффективности использования РЩ’А на модели пневмококковой инфекции. Анализ сывороток крови больных людей с помощью такого диагностикума давал еще более низкие титры, срэгшмыэ с титрами реакции с контрольным диьгностикумом. Вероятно, в сравнении с МОЛ, активность взэимодействия антител с капсульныш полисехаридамп не MOSBT быть адекватно отражена в результатах реакции, т.к. в РИГА положительную реакцию дочг только антитела класса 1дм и некоторые формы агрегированных иммуноглобулинов.
В связи с полученными данными, ко тоще также косвенно подтверждаются сведениям! из извзстной литературы, мы не рекомендуем использовать РИГА как основу для иммунохимической диагностики пневмококковой инфекции.
2.4. Системы иммуноферментного анализа для опрэделения антител к полясзхаридтшм антигенам
Иммунофэрмсн’тннй анализ используется з медицине около 20 лет, однако до сих пор не было известно ни одной коммерческой системы для опрэделения антител к пневмококку с помощью ИОЛ. Были опубликованы данные некоторых исследователей о применении ИФА на основе капсулькых полисахаридов пневмококка для оценки уровня антитольного ответа при вакцинации полшалентной гиевмококковой
БаКЦИНОЙ (H.Rugrel et al, 1980, М.Helville-Smith, F.Shaffild,
19зо). Имеются е>лшгпшо наблюдения об уровне антител к капсульшм полисахаридам при острой пневмонии, вызванной пневмококком (е.Berntsson et al, 197а). в последние голы появились сообщения об использовании пновмолизлнз, как антигенной основч ИФА в эксперименте (2.Jalonen, 1990). Ми решили задачу создания иммуно$врмоиТ1Шх систем для диагностики пневмококковой инфекции на основе трех и шов антигенов — капсульных полисахаридов, тейхоевых кислот л белковых антигенов пневмококка.
Одной из основных проблем, решенных нами при приготовлении ишуиофзрментшх систем на основе полис ах аридных препаратов, являлось повышение уровня сорбции очищенных полисахаридов на поверхности полистирола. Как известно,’этот феномен связан с более выраженным проявлением гидрофильных свойств полисахаридов при очистке пх от гидрофобных белковых молекул. Кы применили известный метод конъюпфования полисахаридов с имму.-охимически неактивным П0ЛИП9ПТПД0М — полп-ь-лизином (B.Gray et al, 1982). Использование
3- антисыворотка с/г 9 сть определения разных типов антигенов в крови в процессе рззеятпя ппэекококкот’оЯ инфекции. С другой стороны, на прггдзро забодекш^З, Еызхгззвки другими инкапсулированными бактериям, нзвзстпо, что антитела к капсульным полисахаридам пырсбатываятся в. огласительно невысоких титрах. Предложенный нами подход в- определении антител к белковым антигенам пневмококка позволяет преодолеть эту трудность в ишунохимической диагностике пиеЕмококхоЕой инфекщп.
Для шшзатрации возможностей разработанных нами методов пялунохпмической диагностики мы представляем данные, полученные при исследовании экспериментального материала и сывороток больных и здоровых людей разного возраста, полученные из различных клиник Российской Федерации и Республики Украина. Кроме этого мы провали иодельные эксперименты по исследованию уровня сывороточных антител у штатных с пневмококковой инфекцией.
3.2. Определение серологических сдвигов при пневмококковой инфекции у морских свинок
Воспроизведение пневмококовой инфекции у животных представляет собой неразрешенную до сегодняшнего дня проблему. Шмщиеся данные о течении инфекции у некоторых видов животных (мыш, крысы, пшшпшы, морские свинки), как правило, не несут прямой связи с особенностями течения инфекции у людей. Есть сведения о возмонности воспроизведения пневмококковой инфекции у
источник