Иммуногистохимическое исследование рецепторной чувствительности к эстрогенам и прогестерону в эндометрии (2 антитела ER+PR)
Иммуногистохимическое исследование рецепторной чувствительности к эстрогенам и прогестерону в эндометрии (2 антитела ER+PR)) – исследование биоптата ткани, меченой антителами, под микроскопом. Анализ выполняется для выяснения причин бесплодия, а также для оценки злокачественности процессов в тканях матки.
ИГХ-исследования проводят после выполнения гистологического исследования.
Иммуногистохимические исследования
Иммуногистохимические исследования – вид морфологического исследования тканей, полученных в ходе биопсии, и меченых специфическими антителами. В основе метода лежит принцип взаимодействия «антиген-антитело». Ткань, в которой происходит патологический процесс, экспрессирует антигены. При нанесении на образец ткани антител, образуется комплекс антиген-антитело. Благодаря меткам, он становится доступным для визуализации. Врач-патоморфолог изучает количество клеток, окрашенных маркером. Он определяет в исследуемой ткани локализацию клеток, гормонов и их рецепторов.
Иммуногистохимическое исследование полученного материала включает:
- Определение рецепторов к эстрогену (ER) и прогестерону (PR);
Рецепторы к эстрогену (ER) и прогестерону (PR)
Эстроген и прогестерон — основные женские половые гормоны. Они вырабатываются яичниками и являются основными регуляторами деятельности репродуктивной системы женщины.
Рецепторы присутствуют в различных тканях, в том числе в молочных железах и матке.
Рецепторы к эстрогену (ER) и прогестерону (PR) являются веществами белковой природы, которые локализованы на поверхности опухолевой клетки. Под влиянием женских половых гормонов, рецепторы формируют комплекс, который стимулирует появление новых опухолевых клеток. Разрушение этого механизма лежит в основе гормонотерапии.
Иммуногистохимическое определение ER и PR способно повести дифференциальную диагностику характера опухоли, выявить чувствительность опухоли к гормонам. Анализ позволяет скорректировать и уточнить лечение, а также оценить эффективность.
Опухоли с высоким содержанием рецепторов к эстрогенам и прогестерону являются высокодифференцированными. Они обладают низкой пролиферативной активностью и характеризуются не агрессивным течением. Опухоли с такими показателями хорошо отвечают на гормональную терапию и имеют хороший прогноз. Эффективность гормональной терапии составляет около 50% при опухолях, экспрессирующих рецепторы к эстрогенам, и 75% при опухолях, экспрессирующих рецепторы к обоим гормонам.
Если опухолевые клетки имеют низкое число рецепторов к эстрогенам, гормональная терапия обычно неэффективна. Исключение составляют случаи, когда опухолевые клетки экспрессируют рецепторы только к прогестерону. При таком варианте гормональная терапия эффективна у 10% таких больных.
Показания к проведению ИГХ-исследования
- рак молочной железы;
- нарушение репродуктивной функции у женщин;
- женское бесплодие;
- гиперплазия эндометрия,
- злокачественные заболевания тела матки.
Подготовка
Материалом для исследования являются парафиновый блок и предметные стекла. В случае если материалом является образец ткани в растворе формалина, дополнительно должна быть выполнена услуга изготовления стекол.
При проведении гистологического исследования в сторонней лаборатории необходимо обязательно предоставить протокол гистологического исследования.
Интерпретация результатов
Ответ выдается в виде описания микропретарата, применяемых красителей и заключения. В заключении указано в процентном соотношении число клеток, где определяется экспрессия антител к эстрогену и прогестерону. Заключение может интерпретировать только врач, направивший на проведение исследования.
источник
Автореферат и диссертация по медицине (14.00.01) на тему: Роль сенсибилизации к прогестерону в клинике привычного невынашивания беременности
Автореферат диссертации по медицине на тему Роль сенсибилизации к прогестерону в клинике привычного невынашивания беременности
На правах рукописи ГЛАДКОВА КРИСТИНА АЛЕКСАНДРОВНА
РОЛЬ СЕНСИБИЛИЗАЦИИ К ПРОГЕСТЕРОНУ В КЛИНИКЕ ПРИВЫЧНОГО НЕВЫНАШИВАНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ
14 00 01 — акушерство и гинекология
диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Работа выполнена в Федеральном Государственном Учреждении «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» в отделении профилактики и лечения невынашивания беременности Научные руководители: доктор медицинских наук,
профессор Вера Михайловна Сидельникова
академик РАМН, профессор Геннадий Тихонович Сухих
профессор Людмила Евгеньевна Мурашко
Ведущее учреждение: Российский Университет Дружбы Народов. Защита диссертации состоится «11» ноября 2008г в 13 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208 125 01 при ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им В И Кулакова Росмедтехнологий» по адресу 117997, г Москва, ул Академика Опарина, д 4
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им В И Кулакова Росмедтехнологий»
Автореферат разослан «_»_2008г
Ученый секретарь диссертационного совета
(ФГУ «НЦ АГиП им В И Кулакова Росмедтехнологий»)
доктор медицинских наук, профессор
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Согласно современным представлениям до 80% ранних репродуктивных потерь неясной этиологии обусловлено иммунологическими нарушениями, которые принято подразделять на аллоиммунные и аутоиммунные
Данное исследование посвящено изучению аутоиммунных механизмов прерывания беременности и в частности антителообразования к прогестерону Согласно данным американской школы акушеров, занимающихся иммунологией репродукции [Beer А Е , Kwak J Y Н, 1999], аутоантителл к прогестерону играют негативную роль в генезе привычного невынашивания беременности
Иммунологическая реакция во время беременности необходима для распознавания материнским организмом чужеродных ему антигенов плода В результате на системном и локальном уровнях развиваются механизмы иммуносупрессии, необходимые для иммунолоштеской защиты фстоплацентарного комплекса в течение беременности Одновременно с этим индуцируются механизмы плацентарного иммунотрофизма, способствующие развитию трофобласта и затем плаценты Причиной репродуктивных потерь иммунологического генеза может явиться нарушение в деятельности одного или нескольких перечисленных компонентов
В последние годы наибольшее внимание исследовагелей привлечено к аутоиммунным аспектам репродуктивных потерь
С общепринятых позиций, под аутоиммунными состояниями понимают ряд симптомов и заболеваний, возникающих вследствие неконтролируемой активности иммунных реакций, направленных против собственных структур организма В нормальных условиях существует иммунологическая толерантность к собственным клеткам, тк в пре- и постнатальном периоде клеточные клоны, возникающие против собственных структур, блокируются
или разрушаются Однако при определенных условиях эта толерантность может нарушаться, что ведет к развитию патологического процесса
Наличие аутоантител является нормальным физиологическим и жизненно-необходимым компонентом, обеспечивающим существование организма Аутоиммунная катастрофа возникает в тех ситуациях, когда количество, эпитопная специфичность и аффинность аутоантител превышают допустимые границы
Аутоантитела обнаруживаются при многих заболеваниях скорее как реальность, чем как причина, тем не менее, при таких заболеваниях как антифосфолипидный синдром, аутоиммунный тиреоидит и др аутоантитела играют основную патогенетическую роль Вероятно, понимание механизмов иммунологического взаимодействия во время беременности позволит определить место и роль антителообразования к гормонам в генезе репродуктивных потерь Считается, что на долю аутоиммунизации приходится до 22% привычного невынашивания беременности иммунною генеза [Mahnowski А, Szpakowski М , Zeman К, 1997]
Научные исследования роли антител к. стероидам проводились с начала 30 годов XX века, когда была сформулирована концепция аллергии на гормоны яичников [Bosze Р, 1988] В дальнейшем, в 70-80 годы прошлого столетия разрабатывались контрацептивные средства на основе моноклональных антипрогестероновых антител [Dalgleish A G, Kennedy R С ,1988, Йен С С К, Джаффе РБ, 1998] Тем не менее, несмотря на многолетние исследования в этой области успехи создания вакцин на основе прогестерона нельзя признать обнадеживающими
Более того, появились публикации о роли аутоантител к прогестерону в генезе предменструального синдрома, дисменореи, аутоиммунного дерматита [Rasi А, Khatami А , 2004, Baptist А Р , Baldwin J L, 2004] Исследования роли патологической сенсибилизации к про1естерону при привычном невынашивании беременности стали проводиться только в последние годы [Beer АЕ, 1999] При высоком уровне антител к прогестерону могут
нарушаться механизмы, обеспечивающие процессы имплантации, формирования трофобласта, развития беременности
Н Оогеат и соавт (1997) впервые выделили антипрогестероновые антитела ^М и подробно исследовали их структуру II И. ЯоЬу и соавт (2006) определяя с помощью иммуноферментного анализа антитела к прогестерону и эстрадиолу 1цО, ^М и ^Е, установили высокую частоту наличия ауюантител у пациенток с астмой, мигренями, дерматитом и дисменореей
В работе АМ Шекэоп и соавт (2007) на основании трансдермальных тсстов, проведенных во II фазу менструального цикла, женщинам с самопроизвольными репродуктивными потерями в анамнезе выявлена сенсибилизация к прогестерону в 69% случаев По мнению авторов, причинами аутосенсибилизации явились предшествующие репродуктивные потери, а также прием препаратов гестагенового ряда в анамнезе
Таким образом, возможность как спонтанного, так и индуцированною появления аутоантител к прогестерону делает актуальной изучение проблемы влияния патологической аутосенсибилизации к этому гормону на репродуктивную функцию женщины
Целью настоящею исследования является оптимизация тактики нредгестационной подготовки и ведения беременности у женщин с привычными репродуктивными потерями аутоиммунного генеза с учетом сенсибилизации к прогестерону
1 Определить частоту встречаемости аутосенсибилизации к прогестерону у пациенток с привычным невынашиванием беременности
2 Изучить предрасполагающие факторы, приводящие к развитию сенсибилизации к прогестерону
3 Провести анализ гинекологической заболеваемости, состояния репродуктивной системы, иммунного статуса у женщин с аутосенсибилизацией к прогестерону и привычным невынашиванием беременности
4 Разработать и оценить влияние комплексной предгестационной подготовки на иммунологические, ультразвуковые показатели у женщин с сенсибилизацией к прогестерону
5 Изучить особенности течения беременности у женщин с сенсибилизацией к прогестерону
6 На основании полученных результатов разработать тактику ведения беременности у женщин привычны невынашиванием беременности и сенсибилизацией к прогестерону
Впервые проведено комплексное обследование пациенток с привычным невынашиванием беременности на наличие аутоантител к прогестерону
Установлено, что развитию аутосенсибилизации к прогестерону у женщин с привычным невынашиванием беременности способствуют самопроизвольные и искусственные прерывания беременности в анамнезе, аутоиммунные заболевания, использование в лечении препаратов прогестеронового ряда при предыдущих беременностях
Выявлены клинические проявления аутосенсибилизации к прогестерону у женщин с привычным невынашиванием беременности Вне беременности синдром аутосенсибилизации к прогестерону характеризуется дисменореей, гипоплазиеи эндометрия, повышением относительного содержания лимфоцитов с фенотипом СБ 19+5+ в периферической крови
Наиболее частыми осложнениями течения беременности являются гипоплазия хориона (33%) и плацентарная недостаточность (19,2%)
Полученные данные позволяют более глубоко понять генез прерывания беременности у сенсибилизированных женщин и оптимизировать комплекс мероприятий по подготовке к беременности
Устинов тена целесообразность включения в алгоритм обследования у женщин с потерями беременности в анамнезе определения аутосенсибилизации к прогестерону
На основании тщательною иммунологического обследования оптимизированы схемы лечения с учетом выявленных нарушений у каждой конкретной больной
Разработана оптимальная предгестационная подготовка и тактика ведения беременности пациенток с аутосенсибшшзацией к прогестерону, включающая использование препаратов иммуноглобулина, метилпреднизолона и дидрогестерона
Определены критерии эффективности проведенного лечебного воздействия вне и вовремя беременности, включающие нормализацию иммунного, интерферонового статуса, состояния эндометрия, снижения активности аутоантител к прогестерону
Положения, выносимые на защиту:
1 Аутосенсибилизация к прогестерону выявлена у 42% женщин с привычными репродуктивными потерями и, возможно, является одним из факторов, приводящих к привычному невынашиванию беременности
2 Наличие антител к прогестерону клинически проявляется дисменореей, гипоплазией эндометрия во II фазе менструального цикла при нормальном уровне прогестерона в крови Отмечена эффективность проведения комплексного лечения с использованием препаратов иммуноглобулина, метилпреднизолона, дидрогестерона и иммуномодулирующей терапии в качестве подготовки к зачатию
3 У пациенток с аутосенеибилизацией к прогестерону отмечается развитие гипоплазии хориона в I триместре беременности и в ряде случаев плацентарной недостаточности с внутриутробной задержкой развития плода Адекватная терапия в процессе беременности, с использованием препаратов иммуноглобулина, метилпреднизолона и дидрогестерона, своевременные профилактика и лечение плацентарной недостаточности позволяют добиться рождения жизнеспособных детей в 92,1% случаев
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на конференции отделения профилактики и лечения невынашивания беременности совместно с лабораторией клинической иммунологии 17 12 2007г и на заседании апробационной комиссии ФГУ «НЦ АГиП им В И Кулакова Росмедтехнологий» 24 12 2007г
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты исследования и основные рекомендации, вытекающие из них, используются в отделении профилактики и лечения невынашивания беременности ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им В И Кулакова Росмедтехнологий» при обследовании и лечении супружеских пар с привычными потерями беременности, использованы в подготовке образовательных программ для врачей, проходящих обучение на базе Центра, а также семинаров по вопросам привычного невынашивания беременности По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, 6 глав, выводов, практических рекомендаций, изложена на 117 страницах машинописного текста (включая список литературы), работа иллюстрирована 34 табтицами, 2 диаграммами и 3
рисунками Библиографический указатель включает 183 источников, из них 16 отечественных, 167 иностранных авторов
Для реализации поставленных задач, с целью проведения скрининга на наличие аутосенсибилизации к прогестерону, нами было проведено обследование 260 женщин, обратившихся за консультацией в научно-поликлиническое отделение ФГУ «НЦ АГиП им В И Кулакова Росмедтехнологий» в течение 2004-2007 гг по поводу привычной потери беременности Средний возраст пациенток, включенных в исследование, составил 31,2+4,2 лет Проанализированы анамнестические данные у 205 (78,9%) женщин имело место привычное невынашивание беременности ранних сроков (2-7 самопроизвольных выкидыша и/или неразвивающихся беременностей в сроках 5-12 недель гестации), у 32 (12,3%) женщин — поздние гестационные потери при сроках 16-24 недель беременности, у 23 (8,8%) -антенатальная гибель плода в анамнезе в сроках 24-38 недель гестации
Результаты проведенного скрининга сенсибилизация к прогестерону выявлена у 42% (109) женщин В 58% (151) случаев аутоантитела к прогестерону не выявлялись
Результаты скрининга на наличие аутосенсибилизации к прогестерону
Отсутствие сенсибилизации к прогестерону 151 (58%)
Сенсибилизация к прогестерону 109 (42%)
После проведенного обследования из 260 женщин были отобраны 89 пациенток в две группы исследования
Критериями отбора в группы исследования явились репродуктивный возраст, наличие или отсутствие аутоантител к прогестерону, отсутствие по данным клинико-лабораторного обследования активации бактериально-вирусной инфекции, отсутствие пороков развития матки, отсутствие аномалий кариотипа, возможность проведения обследования и ведения беременности в условиях ФГУ НЦ АГиП
В соответствии с критериями включения основную группу составили 52 женщины с наличием аутоантител к прогестерону Группу сравнения составили 37 женщин с привычным невынашиванием беременности в анамнезе и отсутствием аутосенсибилизации к прогестерону
Средний возраст пациенток, включенных в исследование, составил в I группе 31,1+4,3 лет, во II группе — 31,3+4,2 лет
Все женщины прошли тщательное клиническое и лабораторно-инструментальное обследование, включающие генетические,
иммунологические, вирусологические, гемостазиологические,
микробиологические и биохимические методы исследования
Определение антител к прогестерону проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА), разработанным в лаборатории клинической иммунологии ФГУ «НЦ АГиП им В И Кулакова Росмедтехнологий «
На полистирольные микропланшеты (Nunc, Дания) иммобилизовали конъюгат прогестерон- lla-БСА (Michigan Diagnostics, LLC, США) из фосфатно-солевого буферного раствора (ФСБР) при 20±2°С в течение 18±2 часов Перед проведением ИФА образцы сывороток крови разводили 1 100 раствором для разведения (ФСБР, содержащий 0,5% желатина и 0,5% твина-20) и вносили по 100 мкп в лунки планшета с иммобилизированным на поверхности полистирола прогестероном Инкубировали на встряхивателе при 20±2°С в течение 60 минут, отмывали 4 раза ФСБР, содержащим 0,5% твина-20
Затем вносили мышиные моноклональные антитела против иммуноглобулинов М и G человека, конъюгированные с пероксидазой хрена (Sigma, США) После инкубации при 20±2°С в течение 60 минут лунки отмывали и добавляли по 100 мкл субстратно-хромогенного раствора, содержащего тетраметилбензидин и перекись водорода Планшеты инкубировали в течение 15-20 минут, ферментативную реакцию останавливали внесением в лунки по 100 мкл 0,5М H2SO4 При постановке исследования использовались положительный и отрицательный контроли Учет результатов анализа проводили инструментально путем измерения оптической плотности на фотометре «Multiskan» (Labsystem, Финляндия) при длине волны 450 нм
Результаты исследования оценивали полуколичественным способом Пограничное значение (cut-off) определяли как сумму среднего значения оптической плотности отрицательного контроля и трех среднеквадратичных отклонений Проба считалась слабоположительной при средней оптической плотности, превышающей cut-off до 1,5-2 раз, положительной — при превышении cut-off в 2 раза, резкоположительной — в 3 и более раз
Антитела к хорионическому гонадотропину человека и антифосфолипидные антитела (к кардиолипину, фосфатидилсерину, фосфатидилхолину, фосфатидилэтаноламину) (IgM, IgG) определялись по методикам иммуноферментного анализа, разработанным в лаборатории клинической иммунологии НЦ АГиП
Исследование клеточного звена иммунитета проводилось выделением лейкоцитов из периферической крови методом градиентного центрифугирования, производилась характеристика субпопуляционно! о состава лейкоцитов периферической крови методом проточной цитофлуометрии и определение иммуноглобулинов класса G, М, А методом радиальной иммунодиффузии по Манчини Для определения интерферонового статуса биологическим методом (Григорян С С, Ершова Ф И 1989) использовали препараты цельной крови
Ультразвуковое исследование, допплерометрия выполнялись с использованием трансабдоминальных и трансвагинальных мультичастотных датчиков с частотой 8-6-4 МГц
Статистическая обработка полученных данных выполнена на компьютере с помощью электронных таблиц «Microsoft Excel» и пакета прикладного программного обеспечения «Statistics for Windows», версия 7, StatSoft Inc (США)
Клиническая часть работы выполнена в отделении профилактики и лечения невынашивания беременности (руководитель — профессор В M Сидельникова), научно-поликлиническом отделении Центра (руководитель -профессор В H Прилепская) Родоразрешение больных проводилось в I-акушерском отделении Центра (руководитель — профессор Е А Чернуха)
Лабораторные методы исследования осуществлялись в следующих подразде тениях ФГУ «НЦ АГиП им В И Кулакова Росмедтехнологий» лаборатория клинической иммунологии (руководитель — академик РАМН, профессор Г Т Сухих), лаборатория функциональной диагностики (руководитель — профессор В H Демидов), лаборатория генетики (руководитель — профессор В А Бахарев), лаборатория микробиологии (руководитель -профессор А С Анкирская)
Результаты исследования и их обсуждение
В соответствии с поставленными задачами нами был проведен анализ анамнестических данных, результатов клинического, лабораторно-инструментально1 о обследования, течения и исходов беременностей у 89 женщин с привычным невынашиванием беременности
На основании проведенного сравнительного анализа анамнестических данных нами выявлено, что предшествующие искусственные и самопроизвольные репродуктивные потери, сопровождающиеся иммуногормональным стрессом, Moiyr способствовать синтезу аутоантител, что согласуется с результатами исследования A M Itsekson и соавт (2007)
источник
В настоящее время известно, что около 80% всех ранее необъяснимых случаев повторных потерь беременности (после исключения генетических, анатомических, гормональных причин) связано с иммунологическими нарушениями.
· При аутоиммунных процессах развивается агрессия иммунной системы к собственным тканям матери, т.е. иммунный ответ направлен против собственных Аг. В этой ситуации плод страдает вторично в результате повреждения материнских тканей.
· При аллоиммунных нарушениях иммунный ответ беременной направлен против Аг эмбриона (плода), полученных от отца и потенциально чужеродных для организма матери.
К аутоиммунным нарушениям, наиболее часто обнаруживаемым у больных с привычным выкидышем, относят наличие в крови беременной антифосфолипидных, антитиреоидных, антинуклеарных аутоантител. Установлено, что у 31% женщин с привычным невынашиванием вне беременности выявляют аутоантитела к тироглобулину, пероксидазе щитовидной железы. В этих случаях риск самопроизвольного выкидыша в I триместре беременности возрастает до 20%. При привычном невынашивании беременности в случае наличия антинуклеарных и антитиреоидных АТ показано дальнейшее обследование для выявления аутоиммунного процесса и верификации диагноза.
Общепризнанным аутоиммунным состоянием, ведущим к гибели эмбриона/плода, в настоящее время служит АФС.
По данным американских авторов, частота АФС в популяции достигает 5%, а среди пациенток с привычным невынашиванием беременности она составляет 27–42%, причём без проведения лечения гибель эмбриона (плода) происходит у 85–90% женщин, имеющих аутоантитела к фосфолипидам.
Основным осложнением АФС бывают тромбозы: у 22% женщин с АФС в анамнезе отмечают тромбоз, в том числе у 6,9% — тромбоз мозговых сосудов. Опасность тромботических осложнений возрастает с течением беременности и в послеродовом периоде. Их доля среди всех тромботических осложнений, обусловленных повышением коагуляционного потенциала крови на фоне гиперволемии, достигает 24%.
Классификация, клинические проявления и методы диагностике АФС подробно представлены в главе «Антифосфолипидный синдром».
У больных с АФС обследование и медикаментозную подготовку необходимо проводить до наступления беременности. При положительной пробе на волчаночный антикоагулянт и наличии антифосфолипидных АТ исследование необходимо повторить с через 6–8 нед. В течение этого времени проводят комплексное
обследование и лечение других возможных осложнений при привычной потере беременности. При повторных позитивных тестах на волчаночный антикоагулянт и изменений в параметрах гемостазиограммы лечение необходимо начинать вне беременности.
Терапию АФС подбирают индивидуально в зависимости от выраженности активности аутоиммунного процесса.
Назначают антиагреганты, антикоагулянты, небольшие дозы глюкокортикоидов, при необходимости — плазмаферез.
Без проведения терапии рождение жизнеспособных детей отмечают лишь в 6% случаев.
В последние годы зарубежными авторами предприняты попытки разделения больных с АФС на группы на основании анамнестических данных с последующим назначением различных схем лечения.
· У женщин с «классическим» АФС с тромбозами в анамнезе обязательно назначают гепаринотерапию, с ранних сроков беременности (с момента визуализации плодного яйца) под контролем коагуляционных тестов, а также ацетилсалициловую кислоту в дозе 81–100 мг/сут, препараты кальций и витамина D.
· При наличии в анамнезе преэклампсии в дополнение к антикоагулянтной, антиагрегантной терапии показан иммуноглобулин в дозе 400 мг/кг массы тела в течение 5 сут каждого месяца.
· В случае потерь плода без сосудистых тромбозов назначают антикоагулянтные и антиагрегантные лекартсвенные средства в низких, поддерживающих дозах (ацетилсалициловая кислота в дозе до 100 мг/сут, гепарин по 10 000 МЕ в сутки, низкомолекулярные гепарины в профилактических дозах).
· При циркуляции b2-гликопротеин-зависимых АТ к кардиолипину даже в высоких титрах без тромбозов и невынашивания беременности в анамнезе не рекомендована медикаментозная терапия, а показано только наблюдение.
Основные антикоагулянтные препараты, используемые в акушерской практике, приведены ниже.
· Эноксапарин натрий в профилактической дозе 20–40 мг/сут, в лечебной дозе 1 мг/кг массы тела (с распределением
суточной дозы на 1 или 2 подкожных введения).
· Далтепарин натрий по 2500–5000 МЕ 1–2 раза в сутки или по 50 МЕ/кг массы тела.
· Надропарин кальций в дозе 0,3–0,6 мл (2850–5700 ME) 1–2 раза в сутки, в лечебной дозе 0,01 мл (95 МЕ)/кг массы тела 2 раза в сутки.
Вместе с тем необходимо отметить, что назначение антикоагулянтов с целью антитромботической профилактики досрочного прерывания беременности у женщин с тромбофилиями и осложнённой беременностью не находит единодушного признания ведущих специалистов мира (S. Middeldorp. Antitrombotic prophylaxis for women with thrombophilia and pre- nancy complications-No // Journal of tombosis and haemostasis. — 2003. — Vol. 1(10). — P. 2073– 2074.). Отсутствие единой точки зрения на возможность профилактики осложнений беременности у женщин с приобретёнными тромбофилиями не позволяет однозначно рекомендовать их длительное введение.
Благодаря ряду специфических эффектов (детоксикация, реокоррекция, иммунокоррекция, повышение чувствительности к эндогенным и медикаментозным веществам) плазмафереза при его проведении вне беременности можно снизить активность аутоиммунного процесса, нормализовать гемостазиологические нарушения перед периодом гестации.
Показания к проведению плазмафереза во время беременности приведены ниже.
· Высокая активность аутоиммунного процесса.
· Гиперкоагуляция как проявление хронического ДВС-синдрома, не соответствующая сроку беременности и не поддающаяся коррекции медикаментозными средствами.
· Аллергические реакции на введение антикоагулянтов и антиагрегантов.
· Активация инфекции (хориоамнионит) во время беременности при назначении глюкокортикоидов.
· Обострение хронического гастрита и/или язвенной болезни желудка, двенадцатиперстной кишки, при котором необходимо снизить дозу глюкокортикоидов или прекратить иммуносупрессивную терапию.
Методика проведения плазмафереза включает эксфузию за 1 сеанс 30% объёма циркулирующей плазмы (600– 900 мл). Плазмозамещение проводят коллоидными и кристаллоидными растворами. Вне беременности объём удаляемой плазмы равен объёму плазмозамещающих растворов, а во время беременности последний больше объёма удаляемой плазмы в 1,2 раза (с использованием 10% раствора альбумина в количестве 100 мл).
Ведение беременности у женщин с АФС представлено ниже.
· С ранних сроков гестации необходим контроль за активностью аутоиммунного процесса, включающий определение волчаночного антикоагулянта, титра антифосфолипидных, антикардиолипиновых АТ, гемостазиологический контроль с индивидуальным подбором антикоагулянтной, антиагрегантной и глюкокортикоидной терапии.
· При антикоагулянтной терапии в первые 3 нед еженедельно проводят мониторинг общего анализа крови с подсчётом уровней тромбоцитов для своевременной диагностики тромбоцитопении. В дальнейшем необходим мониторинг уровня тромбоцитов не реже 2 раз в месяц.
· По данным ультразвуковой фетометрии можно следить за адекватностью роста и развития плода. С 16 нед беременности фетометрию проводят с интервалом 3–4 нед для контроля темпов роста плода, количества ОВ.
· Во II и III триместрах показано исследование функций печени и почек: определение протеинурии, концентрации креатинина, мочевины, активности ферментов (АЛТ, АСТ) в крови.
· УЗИ в допплеровском режиме для своевременной диагностики и лечения плацентарной недостаточности, а также для оценки эффективности проводимой терапии.
· КТГ с 33–34 нед беременности для оценки состояния плода и выбора сроков и метода родоразрешения.
· В родах необходим тщательный кардиомониторный контроль в связи с наличием хронической гипоксии плода различной степени выраженности, а также повышенного риска ПОНРП, развития острой гипоксии плода на фоне хронической.
· Необходим контроль гемостазиограммы непосредственно перед родами и в родах.
· Показано наблюдение за состоянием родильниц, поскольку именно в послеродовом периоде возрастает риск тромбоэмболических осложнений. Глюкокортикоидную терапию продолжают в течение 2 нед после родоразрешения с постепенной отменой лекарственных средств.
· Контроль системы гемостаза показан через 3 и 5 сут после родов. При выраженной гиперкоагуляции необходимо назначение короткого курса низкомолекулярных гепаринов или нефракционированного гепарина в течение 10 сут по 10 000–15 000 ЕД/сут подкожно, ацетилсалициловой кислоты в дозе до 100 мг/сут в течение 1 мес. У пациенток, получающих антиагреганты и антикоагулянты (для профилактики тромбоза при выраженной и длительной гиперкоагуляции), лактацию подавляют. При кратковременных изменениях в системе гемостаза после родов, поддающихся медикаментозной терапии, кормление грудью может быть отсрочено на время лечения при сохранении лактации.
Если у пациентки диагностирован АФС, то она должна быть проинформирована о необходимости лечения во время беременности и мониторинга состояния плода, а также срочного обращения к врачу при появлении признаков венозного тромбоза сосудов ног (покраснения, отёк, болезненность по ходу вен).
При АФС, сопровождающемся сосудистыми тромбозами, после завершения беременности необходим гемостазиологический контроль и наблюдение у гематологов, сосудистых хирургов и ревматологов.
У 10% женщин с привычным невынашиванием вне беременности в крови выявляют аутоантитела к прогестерону.
При наличии аутоантител к прогестерону, как правило, определяют недостаточность лютеиновой фазы, концентрация прогестерона бывает равна нижней границе нормы, отмечают «тонкий» эндометрий в сроки «окна имплантации». При беременности нередко формируется первичная плацентарная недостаточность.
При выявлении АТ к прогестерону в лечение включают микронизированный прогестерон или дидрогестерон, а при высоком уровне аутоантител целесообразно назначение преднизолона в дозе 5–10 мг/сут со 2-й фазы менструального цикла.
К аллоиммунным факторам привычного выкидыша относят наличие АТ к ХГЧ.
В крови 26,7% женщин, страдающих привычным невынашиванием беременности, обнаруживают АТ к ХГЧ, которые, обладая высокой аффинностью, блокируют биологический эффект, и в некоторых случаях приводят к снижению концентрации ХГЧ. Механизм действия АТ, вероятно, состоит не только в предупреждении связывания ХГЧ с рецепторами жёлтого тела яичников, но и в прямом повреждающем влиянии на клетки эмбриональной трофэктодермы. У 95% женщин с высокими титрами АТ к ХГЧ отмечают угрозу прерывания беременности в I триместре. АТ к ХГЧ при проведении ИФА перекрестно реагируют с ЛГ и ФСГ, что связано с наличием общих антигенных детерминант. Подобные гормональные и аллоиммунные нарушения ведут к раннему развитию ДВС- синдрома (с 3–8 нед беременности) и, как следствие, к угнетению гормонопродуцирующей и трофической функции трофобласта.
Лечение пациенток с сенсибилизацией к ХГЧ состоит в коррекции тромбофилии с помощью низкомолекулярных гепаринов под контролем гемостазиограммы и назначения глюкокортикоидов в дозе 5–15 мг/сут в расчёте на преднизолон. Лечение следует начинать в I триместре беременности, так как пик выработки ХГЧ и, как следствие, АТ развивается в первые недели беременности.
К другим аллоиммунным процессам, ведущим к отторжению плода, относят наличие у супругов повышенного количества (более 3) общих Аг системы главного комплекса гистосовместимости (часто бывает при родственных браках), низкий уровень блокирующих факторов в крови матери, повышенное содержание NK-клеток (CD56+16+) в эндометрии и крови матери как вне, так и во время беременности, высокие уровни в эндометрии и крови беременной ряда цитокинов, в частности — -интерферона, фактора некроза опухолиa, ИЛ-1, ИЛ-2. В настоящее время данные аллоиммунные факторы, ведущие к ранним потерям беременности, и пути коррекции вышеуказанных состояний находятся в стадии изучения. Нет единого мнения о методах терапии. По данным одних исследователей активная иммунизация лимфоцитами донора не даёт значимого эффекта, другие авторы описывают значимый положительный эффект при использовании лимфоцитоиммунотерапии и терапии иммуноглобулинами.
В настоящее время одним из иммуномодулирующих средств на ранних этапах беременности служит прогестерон. В исследованиях доказана роль дидрогестерона в суточной дозе 20 мг у женщин с привычным выкидышем в I триместре беременности при повышенном уровне CD56+16+ клеток в эндометрии.
Женщинам, в анамнезе у которых были 2 и более выкидышей или преждевременные роды, необходимо рекомендовать обследование до наступления следующей беременности для выявления причин, коррекции нарушений и предупреждения последующих осложнений. Методы профилактики зависят от причин, лежащих в основе привычного невынашивания беременности.
По данным многоцентровых рандомизированных исследований в соответствии в принципами доказательной медицины, в настоящее время нет достоверных данных о повышении числа рождённых детей у женщин с привычным невынашиванием при назначении предгравидарной подготовки, длительного постельного режима, прогестерона и его аналогов, дексаметазона, низкомолекулярного гепарина и др. Даже без лечения частота рождения ребенка достигает 86%. Однако отказывться от широко распространённой методики лечения нецелесообразно. При выявлении причин, коррекции нарушений вне беременности, мониторинге во время беременности рождение жизнеспособных детей у пар с привычным невынашиванием беременности достигает 95–97%.
источник
Добрый день. Нуждаюсь в ваших рекомендациях, так как устала и от неудач, и от обследований, в надобности которых не уверена.
24 года, цикл регулярнейший, 26 дней, овуляция на 14 день. Мужу 39 лет. Ни у кого детей нет. Экология в городе не самая лучшая, но на вредном производстве не работаем, не пьем, не курим, за здоровьем следим.
В прошлом году был самопроизвольный аборт на 4 неделе (можно сказать, что бхб), а в следующем цикле новая беременность, но она замерла на 8 неделе, если судить по КТР. В ту беременность я ужасно себя чувствовала, и после сдачи анализов на гормоны щитовидной стала принимать тироксин. После неудачи снова забеременела как только разрешили врачи. Беременность протекала прекрасно, но тоже внезапно замерла на 8 неделе, если верить КТР.
В обе беременности не было кровомазаний и болей (были кровянистые выделения после ПА со второй замершей из-за шейки матки, за пару дней всё прекратилось, по УЗИ тогда всё было отлично, шла 5 неделя + 6 дней, а по размерам поставили 6 недель и 4 дня, СБ+).
Что мне делать? Обследоваться ли дальше или забить и пытаться снова и снова?
По мужу: В роду у мужа были замершие беременности, но все рожденные дети здоровы. По спермограмме — всё хорошо, но не учтена морфология (почему-то вообще нет ее описания). Сдавал бакпосев на уреаплазму, микоплазму, хламидии, гонококки и трихомонады — чисто. Недавно сдавал ОАК, биохимию крови, анализ мочи — никаких отклонений, лейкоциты в норме, в моче только немного слизи. Муж к врачу-то пошел из-за утренней отечности лица.
По мне: ТОРЧ — отрицательные (хотя муж носитель цмв и герпеса), к краснухе антитела, бакпосев на зппп чистый, пцр из ц/канала на хламидии и патогенную микоплазму — отрицательный. Гомоцистеин на фоне отсутствия приема фолатов — 5 или 6, то есть норма. Гормоны щитовидной скорректированы — на тироксине 50. Прогестерон во второй фазе 53 нмоль/л, а при беременности на 5 неделе был 94 нмоль/л.
При беременности пила тироксин, йодомарин и фолиевую 1 мг. До всех беременностей была на КОК Диане 35 в течение 5 лет, самочувствие было отличное.
Нет возможности сделать кариотипирование абортуса или нас — в городе просто этого не делают, поэтому насчет ХА стоит только гадать. По гистологии первый раз общая картина воспаление (в принципе логично, так как я поступила уже с недельной, а то и больше замершей). После первой замершей долго кровила, кололи и перед чисткой дицинон и гордокс, затем новый цикл пришел через 22 дня, обнаружили кисту фолликулярную и плацентарный полип. Новый цикл начался через 26 дней и такая частота сохраняется до сих пор, с новым циклом выдавила из себя этот полип. Менструации стали адекватные.
Заключения УЗИ замерших, если имеет смысл:
1 зб — толщина хориона 0,66 см, ктр 1,6 см, пя 3,9 см, сб -, локация по передней стенке с переходом на зев — проведено по акушерским 8 нед + 2 дня
2 зб — толщина хориона 0,9 см, ктр гипоэхогенный 1,79 см, пя 4 см, сб -, локация по задней стенке — проведено по акушерским 8 нед + 3 дня
1. Вопросы по синт.прогестерону, показан ли он мне при наступлении беременности?
2. Вопрос по мутациям гемостаза, имеет ли смысл?
3. проверяться ли на афс, волчаночный антикоагулянт?
4. Чистку второй беременности ещё не провели, завтра иду сдавать коагулограмму — если она в относительной норме , есть смысл искать мутации гемостаза?
5. Увеличить ли мне доизровку при беременности фолатов? Может, достаточно будет фемибиона, к примеру? Или группы В в целом, базовой дозы? При фолиевой 1 мг трескается уголок рта, при добавлении других витаминов группы В всё приходит в норму.
6. Может, еще что-то подскажите, спасибо заранее. Если нужны сканы каких-либо исследований — приложу.
источник
Способ определения аутоантител к прогестерону в сыворотке и плазме крови человека методом иммуноферментного анализа
Владельцы патента RU 2567724:
Изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности иммунологии, и предназначено для определения аутоантител к прогестерону в сыворотке и плазме крови человека. Изобретение раскрывает способ непрямого твердофазного иммуноферментного анализа, в котором в качестве антигена на поверхность полистирола иммобилизуют конъюгат прогестерона с гемоцианином: гемоцианин-11α-гидроксипрогестерон, гемоцианин-3α-гидроксипрогестерон. Предлагаемый способ технически прост, информативен, обладает высокой чувствительностью и специфичностью при определении антител к прогестерону в сыворотке и плазме крови больных с привычным невынашиванием беременности и бесплодием, его применение позволяет получить достоверные результаты при хранении готовых планшетов до 1 года. Изобретение может быть применено для обследования больных с различной акушерско-гинекологической патологией. 7 табл., 7 пр.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу определения антител к прогестерону, и может быть использовано в биологии и медицине для определения аутоантител к прогестерону в сыворотке и плазме крови человека при акушерско-гинекологической патологии, а именно при привычном невынашивании беременности, бесплодии, у больных с гипоплазией эндометрия, неудачами в программах экстракорпорального оплодотворения, с акушерскими осложнениями (гипоплазия хориона, угроза прерывания беременности, хроническая плацентарная недостаточность), с предменструальным синдромом, после применения гормональных контрацептивов и препаратов, содержащих прогестерон.
Известен способ определения антител к прогестерону [1], заключающийся в том, что на поверхность лунок полистирольного микропланшета иммобилизуют конъюгат прогестерона с БСА из 0,1 М карбонат-бикарбонатного буферного раствора (рН 9,5) в концентрации 10 мкг/мл при 4°С в течение ночи; планшет промывают трисовым солевым буферным раствором (рН 7,4), содержащим 0,05% твина-20; планшет обрабатывают смесью 1,5% БСА и 1,5% желатина в трисовом солевом буферном растворе при комнатной температуре в течение 2 часов и затем при 4°С в течение ночи; сыворотки крови для определения IgM и IgG исследуют в разведении 1:100 по объему и инкубируют при комнатной температуре в течение 2 часов, для определения IgE сыворотки исследуют в разведении 1:2 по объему и инкубируют в течение ночи; антитела козы, меченные щелочной фосфатазой, к IgM, IgG или IgE человека инкубируют при комнатной температуре в течение 2 часов; инкубацию с субстратно-хромогенной смесью, содержащей паранитрофенилфосфат, проводят в течение 45 минут. К недостаткам следует отнести сложность и многоэтапностъ методики, включение длительных инкубации, в том числе в течение ночи. Многокомпонентность системы, использование длительных инкубаций, конъюгата поликлональных антител с ферментом для детекции антител к прогестерону приводят к недостаточно высокой чувствительности, специфичности, точности и воспроизводимости определения.
Наиболее близким к заявляемому по технической сущности является способ определения антител к прогестерону [2], заключающийся в том, что конъюгат прогестерона с БСА (БСА-11α-гидроксипрогестерон) иммобилизуют на полистирольную поверхность лунок микропланшета из фосфатно-солевого буферного раствора при 20±2°С в течение 18±2 часов; сыворотки крови разводят 1:100 в фосфатно-солевом буферном растворе, содержащем 0,5% желатина и 0,5% твина-20, и инкубируют на встряхивателе при 20±2°С в течение 1 часа; планшет промывают фосфатно-солевым буферным раствором, содержащим 0,5% твина-20; планшет инкубируют с мышиными моноклональными антителами к IgM, IgG человека, меченными пероксидазой хрена, при 20±2°С в течение 1 часа; планшет инкубируют с субстратно-хромогенным раствором, содержащим 3,3′,5,5′-тетраметилбензидин и перекись водорода. Использование в качестве антигена конъюгата прогестерона с БСА, в котором содержание прогестерона ограничивается 12-16 молекулами прогестерона на 1 молекулу БСА, отсутствие дополнительной обработки поверхности твердой фазы блокирующим раствором, содержащим инертные белки, использование высокой концентрации поверхностно-активного вещества в буфере для промывки и разведения сывороток и конъюгата приводят к ограничению чувствительности, специфичности и точности определения.
Технической задачей изобретения является создание чувствительного, специфичного и простого в исполнении способа определения аутоантител к прогестерону в сыворотке и плазме крови человека методом ИФА. Эта задача решается описываемым способом определения антител к прогестерону, заключающимся в использовании в качестве антигена конъюгата прогестерона с гемоцианином с высоким содержанием прогестерона от 120 до 150 молекул на 1 молекулу гемоцианина, иммобилизации антигена на поверхность полистирола из водного буферного раствора (рН 7,2±0,2), обработке поверхности водным буферным раствором, содержащим 5-20 мг/мл инертного белка (БСА, желатина), инкубации сывороток крови, разведенных в соотношении 1:10-1:100 по объему в водном буферном растворе, содержащем 5-10 мг/мл инертного белка (БСА, желатина) и 0,05-0,1% по объему твина-20, промывании поверхности до и после инкубации водным буферным раствором, содержащим 0,05-0,1% твина-20, использовании для детекции антител к прогестерону конъюгата моноклональных антител к иммуноглобулинам человека класса М, G, А, Е, с ферментом.
Практически способ осуществляется следующим образом.
Конъюгат прогестерона с гемоцианином из лимфы улитки Megathura crenulata (гемоцианин-11α-гидроксипрогестерон, гемоцианин-3α-гидроксипрогестерон) в водном буферном растворе (фосфатно-солевом, трисовом) с рН 7,2±0,2, содержащем 0,05-0,1% проклина 300, в концентрации 1-5 мкг/мл иммобилизуют на поверхность полистирола при 20±2°С в течение 18±2 часов, поверхность промывают указанным водным буферным раствором, поверхность обрабатывают водным буферным раствором, содержащим 5-20 мг/мл инертного белка (БСА, желатина) при 20±2°С в течение 60-90 минут, промывают водным буферным раствором, содержащим 0,05-0,1% по объему твина-20. Образцы сыворотки, плазмы крови, разведенные в соотношении 1:10-1:100 по объему в водном буферном растворе, содержащем 5-10 мг/мл инертного белка и 0,05-0,1% по объему твина-20, инкубируют при 20±2°С на орбитальном шейкере при 200-300 об/мин в течение 60-120 минут, поверхность твердой фазы до и после инкубации промывают водным буферным раствором, содержащим 0,05-0,1% твина-20, и инкубируют с конъюгатом мышиных моноклональных антител к иммуноглобулинам человека класса М, G, А, Е, с пероксидазой хрена в разведении в соотношении 1:2000-1:60000 по объему в водном буферном растворе, содержащем 5-10 мг/мл инертного белка и 0,05-0,1% твина-20, при 20±2°С на орбитальном шейкере при 200-300 об/мин в течение 60±10 минут. После промывания водным буферным раствором, содержащим 0,05-0,1% твина-20, инкубируют с субстратно-хромогенной смесью, содержащей 3,3′,5,5′-тетраметилбензидин и перекись водорода, при 20±2°С в течение 15-20 минут, ферментативную реакцию останавливают 0,5М H2SO4 результат анализа оценивают инструментально путем измерения оптической плотности (ОП) на фотометре при длине волны 450 нм.
Отличительной особенностью предлагаемого способа является то, что в качестве антигена используют конъюгат прогестерона с гемоцианином, адсорбцию антигена на поверхность полистирола проводят из водного буферного раствора с рН 7,2±0,2 при 20±2°С в течение 18±2 часов, поверхность промывают водным буферным раствором и обрабатывают раствором инертного белка (БСА, желатина) с концентрацией 5-20 мг/мл при 20±2°С в течение 60-90 минут, образцы сыворотки, плазмы крови разводят в водном буферном растворе, содержащем 5-10 мг/мл инертного белка и 0,05-0,1% по объему твина-20, в соотношении 1:10-1:100 по объему и инкубируют при 20±2°С на орбитальном шейкере при 200-300 об/мин в течение 60-120 минут, поверхность полистирола до и после инкубации промывают водным буферным раствором, содержащим 0,05-0,1% твина-20, инкубируют с конъюгатом мышиных моноклональных антител к иммуноглобулинам человека класса М, G, А, Е, с пероксидазой хрена в водном буферном растворе, содержащим 5-10 мг/мл инертного белка и 0,05%-0,1% твина-20.
Пример 1. Для подтверждения возможности получения технического результата с помощью заявленного способа определения аутоантител к прогестерону используют образцы сыворотки, плазмы крови здоровых доноров и пациенток с привычным невынашиванием беременности и бесплодием.
Конъюгат гемоцианин-11α-гидроксипрогестерон (Michigan Diagnostics, США) в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБР) с рН 7,2±0,2, содержащем 0,05% проклина 300, в концентрации 1 мкг/мл вносят по 100 мкл в лунки полистирольного микропланшета (Nunc MaxiSorp, Thermo Fisher Scientific, Дания) и инкубируют при 20±2°С в течение 18±2 часов. Планшет промывают 4 раза ФСБР. В лунки планшета вносят по 200 мкл ФСБР, содержащего 10 мг/мл БСА, и инкубируют при 20±2°С в течение 90±10 минут. После 4-кратного промывания планшета ФСБР, содержащим 0,05% по объему твина-20, в лунки вносят по 100 мкл образцов сыворотки, плазмы крови, предварительно разведенных в ФСБР, содержащем 5 мг/мл БСА и 0,05% по объему твина-20, в соотношении 1:100 по объему, инкубируют при 20±2°С на орбитальном шейкере при 200 об/мин в течение 60±10 минут. После 4-кратного промывания планшета ФСБР, содержащим 0,05% твина-20, в лунки вносят конъюгат мышиных моноклональных антител с пероксидазой хрена к IgM человека в разведении в соотношении 1:30000 по объему, к IgG человека в разведении в соотношении 1:50000 по объему в ФСБР, содержащем 5 мг/мл БСА и 0,05% твина-20, по 100 мкл в лунку, инкубируют при 20±2°С на орбитальном шейкере при 200 об/мин в течение 60±10 минут. После 4-кратного промывания планшетов ФСБР, содержащим 0,05% твина-20, в лунки вносят по 100 мкл субстратно-хромогенного раствора, содержащего 3,3′,5,5′-тетраметилбензидин и перекись водорода, инкубируют при 20±2°С в течение 15-20 минут, реакцию останавливают добавлением в лунки по 100 мкл 0,5 М H2SO4. Оценку результатов проводят инструментально путем измерения ОП на фотометре при длине волны 450 нм.
Пример 2. Анализ проводят аналогично способу, описанному в примере 1, за исключением того, что в качестве антигена для иммобилизации на твердую фазу используют гемоцианин-3α-гидроксипрогестерон (Michigan Diagnostics, США).
Пример 3. Анализ проводят аналогично способу, описанному в примере 1, за исключением того, что в качестве антигена для иммобилизации на твердую фазу используют БСА-11α-гидроксипрогестерон (Michigan Diagnostics, США).
Пример 4. Анализ проводят аналогично способу, описанному в примере 1, за исключением того, что выполняют 2-кратное титрование образцов сыворотки крови больных с привычным невынашиванием беременности (1:100-1:6400).
Пример 5. Анализ проводят аналогично способу, описанному в примере 1, за исключением того, что в качестве антигена на поверхность твердой фазы иммобилизуют гемоцианин из лимфы улитки Megathura crenulata (Sigma-Aldrich, США).
Пример 6. Анализ проводят аналогично способу, описанному в примере 1, за исключением того, что в качестве антигена на поверхность твердой фазы иммобилизуют БСА (Sigma-Aldrich, США).
Пример 7. Анализ проводят аналогично способу, описанному в примере 2, за исключением того, что используют планшет, который после иммобилизации антигена и обработки раствором инертного белка, хранят в вакуумной упаковке при +4°С в течение 1 года.
Способ определения аутоантител к прогестерону в сыворотке и плазме крови человека методом иммуноферментного анализа, включающий адсорбцию конъюгата прогестерона с белком-носителем на поверхность полистирола, обработку поверхности водным раствором инертного белка, инкубацию с разведенной сывороткой, плазмой крови, инкубацию с конъюгатом антител к иммуноглобулинам человека с ферментом, инкубацию с субстратно-хромогенным раствором, отличающийся тем, что на полистирольную поверхность адсорбируют конъюгат прогестерона с гемоцианином (гемоцианин-11α-гидроксипрогестерон, гемоцианин-3α-гидроксипрогестерон) в водном буферном растворе (фосфатно-солевом, трисовом) с pH 7,2±0,2, содержащем 0,05-0,1% проклина 300, при 20±2°С в течение 18±2 часов, поверхность промывают указанным буферным раствором и обрабатывают буферным раствором, содержащим инертный белок (БСА, желатин) в концентрации 5-20 мг/мл, инкубируют с образцами сыворотки, плазмы крови, разведенными в соотношении 1:10-1:100 по объему в буферном растворе, содержащем инертный белок в концентрации 5-10 мг/мл и 0,05-0,1% по объему твина-20, поверхность до и после инкубации промывают буферным раствором, содержащим 0,05-0,1% по объему твина-20, инкубируют с мышиными моноклональными антителами к иммуноглобулинам человека класса М, G, А, Е, конъюгированными с пероксидазой хрена, используют субстратно-хромогенный раствор, содержащий 3,3′,5,5′-тетраметилбензидин и перекись водорода измеряют оптическую плотность при длине волны 450 нм.
источник
После проведенного обследования из 260 женщин были отобраны 89 пациенток в две группы исследования.
Критериями отбора в группы исследования явились: репродуктивный возраст; наличие или отсутствие аутоантител к прогестерону; отсутствие по данным клинико-лабораторного обследования активации бактериально-вирусной инфекции; отсутствие пороков развития матки; отсутствие аномалий кариотипа; возможность проведения обследования и ведения беременности в условиях ФГУ НЦ АГиП.
В соответствии с критериями включения основную группу составили 52 женщины с наличием аутоантител к прогестерону. Группу сравнения составили 37 женщин с привычным невынашиванием беременности в анамнезе и отсутствием аутосенсибилизации к прогестерону.
Средний возраст пациенток, включенных в исследование, составил в I группе 31,1+4,3 лет, во II группе – 31,3+4,2 лет.
Все женщины прошли тщательное клиническое и лабораторно-инструментальное обследование, включающие: генетические, иммунологические, вирусологические, гемостазиологические, микробиологические и биохимические методы исследования.
Определение антител к прогестерону проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА), разработанным в лаборатории клинической иммунологии ФГУ “НЦ АГиП им. В.И. Кулакова Росмедтехнологий.”
На полистирольные микропланшеты (Nunc, Дания) иммобилизовали конъюгат прогестерон-11-БСА (Michigan Diagnostics, LLC, США) из фосфатно-солевого буферного раствора (ФСБР) при 20±20С в течение 18±2 часов. Перед проведением ИФА образцы сывороток крови разводили 1:100 раствором для разведения (ФСБР, содержащий 0,5% желатина и 0,5% твина-20) и вносили по 100 мкл в лунки планшета с иммобилизированным на поверхности полистирола прогестероном. Инкубировали на встряхивателе при 20±20С в течение 60 минут, отмывали 4 раза ФСБР, содержащим 0,5% твина-20. Затем вносили мышиные моноклональные антитела против иммуноглобулинов М и G человека, конъюгированные с пероксидазой хрена (Sigma, США). После инкубации при 20±20С в течение 60 минут лунки отмывали и добавляли по 100 мкл субстратно-хромогенного раствора, содержащего тетраметилбензидин и перекись водорода. Планшеты инкубировали в течение 15-20 минут, ферментативную реакцию останавливали внесением в лунки по 100 мкл 0,5М H2SO4. При постановке исследования использовались положительный и отрицательный контроли. Учет результатов анализа проводили инструментально путем измерения оптической плотности на фотометре “Мultiskan” (Labsystem, Финляндия) при длине волны 450 нм.
Результаты исследования оценивали полуколичественным способом. Пограничное значение (cut-off) определяли как сумму среднего значения оптической плотности отрицательного контроля и трех среднеквадратичных отклонений. Проба считалась слабоположительной при средней оптической плотности, превышающей cut-off до 1,5 – 2 раз, положительной – при превышении cut-off в 2 раза, резкоположительной – в 3 и более раз.
Антитела к хорионическому гонадотропину человека и антифосфолипидные антитела (к кардиолипину, фосфатидилсерину, фосфатидилхолину, фосфатидилэтаноламину) (IgM, IgG) определялись по методикам иммуноферментного анализа, разработанным в лаборатории клинической иммунологии НЦ АГиП.
Исследование клеточного звена иммунитета проводилось выделением лейкоцитов из периферической крови методом градиентного центрифугирования, производилась характеристика субпопуляционного состава лейкоцитов периферической крови методом проточной цитофлуометрии и определение иммуноглобулинов класса G, M, A методом радиальной иммунодиффузии по Манчини. Для определения интерферонового статуса биологическим методом (Григорян С.С., Ершова Ф.И. 1989) использовали препараты цельной крови.
Ультразвуковое исследование, допплерометрия выполнялись с использованием трансабдоминальных и трансвагинальных мультичастотных датчиков с частотой 8-6-4 МГц.
Статистическая обработка полученных данных выполнена на компьютере с помощью электронных таблиц «Microsoft Excel» и пакета прикладного программного обеспечения «Statistics for Windows», версия 7, StatSoft Inc. (США).
Клиническая часть работы выполнена в отделении профилактики и лечения невынашивания беременности (руководитель – профессор В.М. Сидельникова), научно-поликлиническом отделении Центра (руководитель – профессор В.Н. Прилепская). Родоразрешение больных проводилось в I-акушерском отделении Центра (руководитель – профессор Е.А. Чернуха).
Лабораторные методы исследования осуществлялись в следующих подразделениях ФГУ “НЦ АГиП им. В.И. Кулакова Росмедтехнологий”: лаборатория клинической иммунологии (руководитель – академик РАМН, профессор Г.Т. Сухих); лаборатория функциональной диагностики (руководитель – профессор В.Н. Демидов); лаборатория генетики (руководитель – профессор В.А. Бахарев); лаборатория микробиологии (руководитель – профессор А.С. Анкирская).
Результаты исследования и их обсуждение
В соответствии с поставленными задачами нами был проведен анализ анамнестических данных, результатов клинического, лабораторно-инструментального обследования, течения и исходов беременностей у 89 женщин с привычным невынашиванием беременности.
На основании проведенного сравнительного анализа анамнестических данных нами выявлено, что предшествующие искусственные и самопроизвольные репродуктивные потери, сопровождающиеся иммуногормональным стрессом, могут способствовать синтезу аутоантител, что согласуется с результатами исследования A.M. Itsekson и соавт. (2007).
При анализе соматической заболеваемости пациенток с сенсибилизацией к прогестерону установлено, что аутоиммунизация к прогестерону чаще всего наблюдается у женщин с аутоиммунными заболеваниями, такими как аутоиммунный тиреоидит, АФС, аутоиммунный васкулит. Аутоиммунные заболевания достоверно чаще диагностированы у женщин I группы в 25% случаев по сравнению с 2,7% во II группе (р Pages: | 1 |
источник
В онлайн-лаборатории Lab4U мы хотим, чтобы каждый из вас мог заботиться о своем здоровье. Для этого мы просто и понятно рассказываем о показателях организма.
В онлайн-лаборатории Lab4U делаются серологические исследования для обнаружения антигенов возбудителя и специфических антител к ним — это самый точный метод диагностики инфекционных заболеваний. «Зачем надо сдавать анализ на антитела для диагностики инфекций?». Такой вопрос может возникнуть после направления врача в лабораторию. Попробуем на него ответить.
Антитела — это белки, которые иммунная система вырабатывает в ответ на проникновение инфекции. В лабораторной диагностике именно антитела служат маркером проникновения инфекции. Общим правилом подготовки к анализу на антитела является сдавать кровь из вены натощак (после приема пищи должно пройти не менее четырех часов). В современной лаборатории сыворотку крови исследуют на автоматическом анализаторе с использованием соответствующих реагентов. Иногда серологический анализ на антитела является единственным способом диагностики инфекционных заболеваний.
Анализы на инфекции могут быть качественными (дают ответ, есть ли инфекция в крови) и количественными (показывают уровень содержания антител в крови). Норма антител для каждой инфекции своя (для некоторых их не должно быть совсем). Референсные значения (показатели нормы) антител можно получить с результатом анализа.
В онлайн-лаборатории Lab4U можно сдатькомплекс анализов на все TORCH-инфекции за один раз и со скидкой 50%!
Иммуноферментный анализ определяет антитела инфекций относящиеся к различным классам Ig (G, A, M). Антитела к вирусу, при наличии инфекции, определяются на очень ранней стадии, что обеспечивает эффективную диагностику и контроль течения заболеваний. Самые распространенные методы диагностики инфекций — это тесты на антитела класса IgM (острая фаза течения инфекции) и антитела класса IgG (устойчивый иммунитет к инфекции). Эти антитела определяют для большинства инфекций.
Однако, один из самых распространенных анализов — госпитальный скрининг (анализы на ВИЧ, сифилис и гепатиты B и С) не дифференцирует тип антител, поскольку наличие антител к вирусам данных инфекций автоматически предполагает хроническое течение заболеваний и является противопоказанием, например, для серьезных хирургических вмешательств. Поэтому важно опровергнуть или подтвердить диагноз.
Детальную диагностику типа и количества антител при диагностированном заболевании можно сделать, сдав анализ на каждую конкретную инфекцию и тип антител. Первичная инфекция выявляется при обнаружении диагностически значимого уровня антител IgM в образце крови или значимым ростом числа антител IgA или IgG в парных сыворотках, взятых с интервалом 1-4 недели.
Реинфекция, или повторная инфекция, выявляется быстрым подъемом уровня антител IgA или IgG. Антитела IgA имеют более высокую концентрацию у пациентов старшего возраста и более точно диагностируют текущую инфекцию у взрослых.
Перенесенная инфекция в крови определяется как повышенные антитела IgG без роста их концентрации в парных образцах, взятых с интервалом 2 недели. При этом отсутствуют антитела классов IgM и А.
Их концентрация повышается вскоре после заболевания. Антитела IgM определяются уже через 5 дней после его начала и достигают пика в промежутке от одной до четырех недель, затем снижаются до диагностически незначительных уровней в течение нескольких месяцев даже без проведенного лечения. Однако, для полной диагностики недостаточно определения только антител класса М: отсутствие этого класса антител еще не говорит об отсутствии заболевания. Острой формы заболевания нет, но может быть хроническая.
Антитела IgM имеют большое значение в диагностике гепатита А и детских инфекций (краснуха, коклюш, ветрянка), легко передающихся воздушно-капельным путем, так как важно как можно раньше выявить заболевание и изолировать заболевшего.
Основная роль антител IgG — это длительная защита организма от большинства бактерий и вирусов — хотя их выработка происходит более медленно, но ответ на антигенный раздражитель сохраняется более устойчивым, чем у антител класса IgM.
Уровни антител IgG повышаются медленнее (через 15-20 дней после начала заболевания), чем IgM, но остаются повышенными дольше, поэтому могут показывать давно текущую инфекцию при отсутствии IgM АТ. IgG могут находиться на низком уровне в течение многих лет, но, при повторном воздействии того же антигена, уровень антител IgG быстро повышается.
Для полной диагностической картины необходимо определить антитела IgA и IgG одновременно. При неясном результате IgA, подтверждение осуществляется определением IgM. В случае положительного результата и для точной диагностики второй анализ, сделанный через 8-14 дней после первого, должен быть проверен параллельно для определения роста концентрации IgG. Результаты анализа должны интерпретироваться в комплексе с информацией, полученной в других диагностических процедурах.
Антитела IgG, в частности, используются для диагностики Helicobacter pylori — одной из причин язвы и гастрита.
В сыворотке появляются через 10-14 дней после начала заболевания, и вначале их даже можно обнаружить в семенной и вагинальной жидкостях. Уровень антител IgA обычно снижается к 2-4 месяцу после инфицирования в случае успешного лечения. При повторном инфицировании уровень антител IgA вновь возрастает. Если уровень IgA не падает после проведенного лечения, то это — признак хронической формы инфекции.
Аббревиатура TORCH появилась в 70-х годах прошлого столетия, и состоит из заглавных букв латинских названий группы инфекций, отличительной особенностью которых является то, что при относительной безопасности для детей и взрослых, TORCH инфекции при беременности представляют чрезвычайную опасность.
Анализ крови на TORCH инфекции является комплексным исследованием, в его состав входит 8 тестов:
Нередко, заражение женщины инфекциями TORCH-комплекса во время беременности (наличие в крови только антител IgM) является показанием для ее прерывания.
Иногда, обнаружив в результатах анализа антитела IgG, например, токсоплазмоза или герпеса, пациенты приходят в панику, не посмотрев на то, что антитела IgM, которые показывают наличие текущей инфекции, могут отсутствовать вовсе. В этом случае анализ говорит о перенесенной ранее инфекции, к которой выработался иммунитет.
В любом случае, интерпретацию результатов анализа лучше доверить врачу, и с ним же в случае необходимости определиться с тактикой лечения. А сдать анализы вы можете доверить нам.
Вам не нужно долго ждать в регистратуре
Все оформление и оплата заказа происходит онлайн за 2 минуты.
Путь до медцентра не займет более 20 минут
Наша сеть вторая по величине в Москве, а еще мы есть в 23 городах России.
Сумма чека не шокирует вас
Постоянная скидка в 50% действует на большинство наших анализов.
Вам не придется приходить минута-в-минуту или ждать в очереди
Сдача анализа происходит по записи в удобный промежуток времени, например с 19 до 20.
Вам не придется долго ждать результатов или ходить за ними в лабораторию
Мы пришлем их на эл. почту в момент готовности.
источник