Аминокислотный анализ первичной структуры белка

ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ

Все белки различаются по своей первичной структуре. Установление первичной структуры белка служит основой для определения вторичной и третичной структур, выяснения расположения функциональных групп в его активном центре и открывает путь к познанию механизма его функционирования.

Первичную структуру белков можно определять путем непосредственного анализа аминокислотной последовательности или путем расшифровки нуклеотидной последовательности соответствующих генов с помощью генетического кода.

При записи последовательности аминокислот в полипептидных цепях используется однобуквенное или трехбуквенное сокращение и предполагается, что a -аминогруппа находится слева, а a -карбоксильная группа — справа от символа, т. е. полипептидная цепь начинается с остатка, имеющего свободную a -аминогруппу, и заканчивается остатком, имеющим свободную карбоксильную группу. Аминокислотные остатки—называются соответственно N-концевым и С-концевым остатком.

В качестве примера использования сокращенной символики и для демонстрации ее преимуществ приведены структуры гормона вазопрессина, который производится гипофизом и регулирует кровяное давление, сужая капилляры и усиливая ресорбцию воды в почках.

Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH₂ или C YFQNCPR G-NH₂

Рис. 1. Молекула вазопрессина:

а)—записанная с помощью трехбуквенной символики; б)— записанная с помощью однобуквенной символики. Линия, соединяющая символы остатков цистеина в формуле, означает наличие между ними дисульфидного мостика; С-концевая карбоксильная группа аминокислоты амидирована

Исследование первичной структуры белка начинается с определения его молекулярной массы, аминокислотного состава, N — и С-концевых аминокислотных остатков. Поскольку пока не существует метода, позволяющего установить полную первичную структуру белка на целой молекуле, полипептидную цепь подвергают специфичному расщеплению химическими реагентами или протеолитическими ферментами. Смесь образовавшихся пептидных фрагментов разделяют, и для каждого из них определяют аминокислотный состав и аминокислотную последовательность. После того как структура всех фрагментов установлена, необходимо выяснить порядок их расположения в исходной полипептидной цепи. Для этого белок подвергают расщеплению при помощи другого агента и получают второй, отличный от первого набор пептидных фрагментов, которые разделяют и анализируют аналогичным образом.

Предположим, что исследуемый модельный полипептид имеет последовательность представленную на рис.2. При действии на него трипсином гидролизуются связи: Lys — Val и Arg — Ser , а при обработке бромцианом ( BrCN ) расщепляются связи: Met — Tyr и Met — Ala .

Полная аминокислотная последовательность модельного полипептида

Сопоставление аминокислотных последовательностей бромциановых и триптических пептидов позволяет однозначно выяснить их расположение вдоль полипептидной цепи белка. Обычно для определения полной структуры белка двух гидролизатов оказывается недостаточно, причем чем длиннее полипептидная цепь белковой молекулы, тем большее число различных типов расщеплений белка приходится использовать.

На завершающей стадии исследования первичной структуры белка проводится определение положения дисульфидных мостиков, если таковые имеются. Образование дисульфидных мостиков происходит при окислении двух остатков цистеина в составе уже сформированных пептидных цепей. В результате из двух остатков цистеина образуется остаток диаминодикарбоновой кислоты цистина:

При этом возникает сшивка либо внутри одной полипептидной цепи, либо между двумя различными цепями. В качестве примера небольшого белка, имеющего две полипептидные цепи (А- и В-цепь), скрепленные дисульфидными мостиками, а также сшивки внутри отдельных цепей, можно привести молекулу инсулина (рис. 3) — гормона, вырабатываемого поджелудочной железой и ответственного за усвоение углеводов, в первую очередь глюкозы. Нарушения в синтезе инсулина вызывают тяжелое и, к сожалению, весьма распространенное заболевание—сахарный диабет, при развитых формах которого необходимо ежедневно вводить в организм этот гормон.

FYNQHLC GSHLVEALY L V C GERGFFYTPKA ( В — цепь )

Рис. 3. Схема строения молекулы инсулина человека в однобуквенной символике.

Скобкой обозначен внутрицепочечный, а вертикальными линиями — межцепочечные дисульфидные связи

Развитие методов анализа последовательности ДНК сделало возможным на основе генетического кода выводить соответствующие аминокислотные последовательности, исходя из установленных нуклеотидных. При реализации такого подхода следует, однако, иметь в виду целый ряд ограничений и возможные источники ошибок. Во-первых, выведенная из нуклеотидной аминокислотная последовательность может не соответствовать реальной, вследствие процессинга, который часто происходит как на уровне информационной РНК, так и при превращении белка-предшественника в конечный белок. Во-вторых, лишь одна ошибка в определении последовательности ДНК (пропуск или вставка) приводит к выведению совершенно неправильной аминокислотной последовательности белка. Таким образом, установление первичной структуры ДНК не всегда может заменить непосредственное исследование аминокислотной последовательности кодируемого ею белка. В то же время параллельное изучение первичных структур белка и ДНК чрезвычайно эффективно. Установление нуклеотидной последовательности дает возможность расположить изученные пептидные фрагменты в непрерывную полипептидную цепь, позволяя решать, таким образом, наиболее сложную задачу структурного анализа белка. С другой стороны, данные по аминокислотной последовательности пептидов упрощают и уточняют анализ нуклеотидной последовательности.

В последние годы анализ первичной структуры белков на основе исследования нуклеотидной последовательности соответствующих генов принимает все большие масштабы. Первоначально такие исследования касались белков прокариотических организмов, в основном E . coli , генетика которых хорошо изучена, и получение структурных генов не представляло большого труда. По мере развития методов генетической инженерии появилась возможность выделять также структурные гены белков эукариот.

Во многих ведущих лабораториях мира созданы так называемые «банки» или «библиотеки» генов многих высших животных и человека. В этих банках гены разнообразных белков хранятся в составе специальных векторов — плазмид или фагов. Для выделения соответствующего гена из банка используются гибридизационные зонда — небольшие нуклеотидные фрагменты, синтезированные на основе установленной аминокислотной последовательности пептидов исследуемого белка. Из-за «вырожденности» генетического кода могут использоваться не любые последовательности.. Подходящими являются пептиды, содержащие в своем составе аминокислоты, представленные одним или двумя кодонами, поскольку в этом случае минимально число различных вариантов олигонуклеотидов, способных кодировать данный пептид. Оптимальными являются пептиды, содержащие остатки метионина и триптофана, кодируемые уникальными кодонами. Поэтому особое значение приобретают исследования по выделению и изучению таких пептидов. Имеются и другие методические подходы для выделения структурных генов белков, связанные, в частности, с их способностью в определенных условиях экспрессироваться.. Синтезируемый в результате экспрессии белок может быть идентифицирован, например, с помощью иммунохимических методов.

Определение аминокислотного состава.

Анализ аминокислотного состава включает полный кислотный гидролиз исследуемого белка или пептида с помощью 5,7н соляной кислоты и количественное определение всех аминокислот в гидролизате. Гидролиз образца проводится в запаянных ампулах в вакууме при 110 0 в течение 24 часов. При этом полностью разрушается триптофан и частично серии, треонин, цистин и цистеин, а глутамин и аспарагин превращаются в глутаминовую и аспарагиновую кислоты соответственно. В то же время пептидные связи, образованные аминокислотными остатками с разветвленной боковой цепью (Val, Ile, Leu), из-за стерических препятствий гидролизуются частично. Особенно стабильны связи Val-Val, Ile-Ile, Val-Ile, Ile-Val и т . п .

С целью более надежного определения аминокислотного состава белка проводится параллельный гидролиз в течение 24, 48 и 96 часов, и все пробы далее количественно анализируются. Для валина, лейцина и изолейцина берутся максимальные значения, а для серина и треонина полученные значения экстраполируются к нулевому времени. При анализе содержания в белке триптофана вместо соляной кислоты для гидролиза используется 4н метансульфоновая кислота (СН₃-SО₃). Триптофан можно идентифицировать спектрофотометрически или с помощью цветных реакций.

Обычно при определении аминокислотного состава белка ограничиваются анализом суммарного содержания глутамина и глутаминовой кислоты, аспарагина и аспарагиновой кислоты, а их дифференциация проводится в процессе установления первичной структуры. Цистеин и цистин анализируются в виде цистеиновой кислоты или карбоксиметилцистеина.

Количественное определение аминокислот в гидролизате белка или пептида проводится с помощью аминокислотного анализатора — прибора, разработанного в 1958 году С.Муром и У.Стенном. Смесь аминокислот разделяется методом ионообменной хроматографии на колонке, заполненной сульфированной полистирольной смолой. Колонка промывается буферными растворами с последовательным повышением их рН и молярности. Время удерживания каждой аминокислоты строго определенно и зависит от степени ее ионизации.

Постколоночная модификация. Выходящий с колонки элюат смешивается с раствором нингидрина и в специальной ячейке нагревается до 100°С. Интенсивность образущейся окраски измеряется сначала в одном калориметре при 570 нм. а затем в другом, где при 440 нм определяется концентрация пролина и оксипролина. В 1972 г. в качестве селективного флуорогенного реагента на первичные амины был предложен флуорескамин, а несколько позже он стал использоваться для модификации аминокислот после их выхода с колонки аминокнслотного анализатора. Получаемая при этом чувтвительность определения в 10-100 раз превышает возможности нингидринового метода. Широкому распространению флуорескамина помешали его нестабильность в водной среде и высокая стоимость. Этих недостатков лишен введенный в практику почти одновременно с флуорескамином о-фталевый альдегид (ОФА), но с его помощью нельзя определить пролин и вторичные амины.

Предколоночная модификация. Реакция фенилизотиоцианата (ФИТЦ) с аминокислотами изучена детально, поскольку она лежит в основе метода Эдмана (рис.5). Первая стадия этой реакции — образование фенилтиокарбамильных (ФТК) производных — используется для количественного определения аминокислот в гидролизате белка в PICO — TAG -анализаторе ( Waters ). ФТК-аминокислоты стабильны, легко синтезируются и успешно идентифицируются методом ВЭЖХ на обращенной фазе. В этих же целях можно использовать реакции аминокислот с ОФА и дансилхлоридом (рис.4). Однако, воспроизводимость результатов уступает достигаемой в постколоночном методе.

Определение чистоты препарата белка с помощью N-концевого анализа

Анализ концевых остатков играет важную роль в процессе определения аминокислотной последовательности белка. На первом этапе исследования он дает возможность судить о числе полипептидных цепей, составляющих молекулу белка, и о чистоте исследуемого препарата. На последующих этапах с помощью анализа N-концевых аминокислотных остатков осуществляется контроль за процессом разделения пептидных фрагментов.

Один из первых методов определения N-концевых аминокислотных остатков был предложен Ф. Сэнгером в 1945 году — динитрофенильный метод — заключающийся в реакции a -аминогруппы белка или пептида с 2,4-динитрофторбензолом. При этом образуется динитрофенильное производное (ДНФ) окрашенное в желтый цвет. Последующий кислотный гидролиз 5,7н соляной кислотой (НС l ) приводит к разрыву пептидных связей и образованию ДНФ-производного N-концевой аминокислоты, которое экстрагируется эфиром и идентифицируется методом тонкослойной хроматографии в присутствии стандартов.

В настоящее время наибольшее применение находит метод дансилирования, разработанный в 1962 году В. Греем и Б. Хартли. Метод основан на введении в a -аминогруппу белка «флуоресцентной метки», устойчивой в условиях полного расщепления белка до аминокислот при кислотном гидролизе.

Первая стадия: 1-диметиламинонафталин-5-сульфохлорид (дансилхлорид, ДНС-С1) реагирует с непротонированной
a -аминогруппой пептида (и с боковыми группами цистеина, тирозина, лизина и гистидина) с образованием дансильного производного пептида (ДНС-пептида). Эта реакция проводится в щелочной среде в смешанном водно-органическом растворителе (органический компонент для растворения ДНС-С1). В этих условиях конкурируют два процесса: дансилирование и гидролиз дансилхлорида до кислоты (ДНС-ОН), а степень модификации пептида определяется соотношением скоростей протекания этих процессов (рис.4). Присутствие следовых количеств солей аммония привносимых с соответствующими буферами приводит к образованию, в процессе реакции, дансиламида (ДНС- NH ₂).

Вторая стадия: кислотный гидролиз модифицированного ДНС-пептида приводит к разрыву пептидных связей и образованию ДНС-производного N-концевой аминокислоты. Гидролиз проводится в 5,7н соляной (НС1) кислоте в течение 4-16 час при 110 0 С или смесью 5.7 н НС l и концентрированной трифторуксусной (ТФУ) кислот в соотношении 1:2 — 50мин при 166 0 С. Из производных, образующихся по боковым группам после гидролиза сохраняются e -ДНС-лизин и о-ДНС-тирозин.

Производные ДНС-аминокислот обладают интенсивной флуоресценцией в ультрафиолетовой области спектра ( l 366 нм) и обычно для их идентификации используют как высокоэффективную двумерную тонкослойную хроматографию (ВЭТСХ) на силикагеле или полиамиде, так и ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой, при этом достаточно иметь 0,05-0,5 нмоль вещества. В условиях жесткого кислотного гидролиза полностью разрушаются ДНС-триптофан и происходит дезаминирование остатков дикарбоновых кислот, которые превращаются соответственно в ДНС-апарагиновую и ДНС-глутаминовую аминокислоту. Степень разрушения ДНС-пролина, ДНС-серина и ДНС-треонина возрастает по мере увеличения времени гидролиза.

В то же время связи, образованные остатками валина, лейцина и изолейцина обладают повышенной устойчивостью к гидролизу. Образующиеся при этом дансилдипептиды (ДНС- Ile — Ile , ДНС- Ile — Val , ДНС- Val — Leu и т.п.) на хроматограмме могут быть ошибочно приняты за дансиламинокислоты. Правильность идентификации может быть проверена с помощью более продолжительного гидролиза (24час).

Определение аминокислотной последовательности белков с помощью метода Эдмана

Основным методом определения аминокислотной последовательности является метод деградации полипептидной цепи белка с помощью фенилизотиоцианата (ФИТЦ), разработанный П. Эдманом в 1950-1956г.г. Метод Эдмана позволяет последовательно отщеплять N -концевые аминокислотные остатки в виде фенилтиогидантоинов аминокислот (ФТГ).

Каждый цикл деградации включает три стадии: (рис.6)

I стадия — конденсация , образование фенилтиокарбамил пептида (ФТК-пептид);

II стадия — циклизация, отщепление N -концевого остатка аминокислоты и его циклизация в 2-анилино-5-тиазолинон;

III стадия — изомеризация , 2-анилино-5-тиазолинон N -концевого остатка аминокислоты изомеризуется в фенилтиогидантоин, который в дальнейшем идентифицируется.

Первая стадия . На первой стадии реакции происходит присоединение фенилизотиоцианата (ФИТЦ) к a -аминогруппе пептида с образованием фенилтиокарбамильного производного пептида (ФТК-пептида). Реакция проводится в летучих буферных системах при рН 9,0-9,5, в качестве оснований используются тритичные и ароматические амины (триэтиламин, триметиламин, N -метилпипиридин, пиридин). Выход на этой стадии может существенно снижаться вследствие побочных реакций. Такими реакциями являются окислительное десульфирование ФТК-группы пептида под действием кислорода воздуха, блокирование a -аминогруппы пептида за счет образования оснований Шиффа со следовыми количествами альдегидов, присутствующих в реагентах и растворителях. Поэтому все стадии деградации пептидов проводятся в атмосфере инертного газа, а используемые реагенты предварительно тщательно очищаются. В щелочных условиях ФИТЦ гидролизуется с образованием моно- и дифенилтиомочевины и анилина. Избыток реагентов и побочных

продуктов удаляется экстракцией органическими растворителями (этилацетатом и хлорбунаном).

Вторая стадия . На второй стадии деградации в присутствии безводной сильной трифторуксусной кислоты отщепляется N-концевой остаток в виде 2-анилино-5-тиазолинона и образуется укороченный на одну аминокислоту пептид со свободной a -аминогруппой следующего остатка. Условия реакции обычно не вызывают неспецифического расщепления полипептидной цепи белка. Однако остаток глутамина, когда он становится N-концевым в пептиде, может превращаться в остаток пироглутаминовой кислоты, блокирующий дальнейшую деградацию. В случае последовательности Asn — Gly возможна перегруппировка, при которой образуется циклический имид ангидрида аспартилглицила (рис.6). Возможна также 0—N-ацильная миграция у остатков ацилсерина и ацилтреонина, которая приводит к блокированию процесса расщепления.

Третья стадия . Изомеризация — состоит из быстрого гидролиза тиазолинона в производное фенилтиокарбамил аминокислоты (ФТК-аминокислота), а затем циклизация последнего в фенилтиогидантоин N -концевого остатка аминокислоты (ФТГ-аминокислота).

Способ обнаружения ФТГ-производных аминокислот основан на их сильной абсорбции в УФ-области спектра с максимумом поглащения 265-270 нм (среднее значение молярного коэффициента экстинкции равно 16000).

Повторное, цикл за циклом, проведение реакции Эдмана с одновременной идентификацией ФТГ-производного отщепляемой аминокислоты («прямой» Эдман) позволяет устанавливать аминокислотную последовательность исходного белка или пептида.

В 1972 г. В.Греем было предложено использовать метод Эдмана в сочетании с реакцией дансилирования (ДНС-Эдман). С этой целью после каждого цикла отщепления по Эдману отбирается небольшая проба образца (аликвота) и анализируется N-концевой остаток укороченного пептида с помощью реакции дансилирования. Этот подход выгодно отличается от «прямого» Эдмана, так как при этом отсутствует стадия промывки (экстракции), удаляющая избыток реагентов и побочных продуктов, образовавшихся в процессе реакции конденсации, что позволяет исключить возможные потери пептидов (особенно неполярных) за счет их растворения в органическом расворителе. Постепенное уменьшение количества анализируемого материала (в результате отбора аликвот) компенсируется более высокой чувствительностью определения флуоресцирующих производных аминокислот.

Определения С-концевой последовательности белков с помощью карбоксипептидаз

Ферментативный метод основан на использовании карбоксипептидаз (экзопептидазы класса гидролаз), которые атакуют в молекуле белка связи, расположенные по соседству со свободными a -карбоксильными группами, и отщепляют последовательно по одному остатку аминокислоты с С-конца полипептидной цепи. Изучая кинетику отщепления аминокислот карбоксипептидазами, можно получить информацию о последовательности расположения их на С-концевом участке молекулы белка или пептида. При исследовании структуры белков используется несколько типов карбоксипептидаз (А, В, С, Р, Y ), которые различаются по скорости отщепления индивидуальных аминокислот. Карбоксипептидаза А (из поджелудочной железы крупного рогатого скота) отщепляет с наибольшей скоростью аминокислоты с ароматической и длинной алифатической боковой цепью: Phe , Tyr , Trp , Leu , Ile , Met , Val . С меньшими скоростями отщепляются Thr, Gln, His, Ala, HSer, Asn, Ser, Lys. Очень медленно высвобождаются Gly , Glu , Asp , Cys — SO ₃ H , KM — Cys и совсем не гидролизуются связи образованные С-концевыми Pro и Arg . Карбоксипептидаза В (из поджелудочной железы свиньи) быстрее всех других отщепляет основные аминокислоты — лизин, аргинин, орнитин и не отщепляет С-концевой Pro . Пептидная связь, образованная остатком аргинина, гидролизуется быстрее, чем связь, образованная остатком лизина. Оптимальным значением рН для карбоксипептидаз А и В являются рН 7,5-8,5. Оно меняется в зависимости от субстрата. Так при снижении рН до 5,0 возрастает скорость отщепления С-концевых дикарбоновых аминокислот, тогда как при рН более 9,0 возрастает скорость отщепления лизина и гистидина. Карбоксипептидаза С ( выделена из ряда растительных источников, включая цитрусовые ) Этот фермент соединяет в себе специфичность карбоксипептидаз А и В и в то же время может отщеплять С-концевой Pro . Скорости высвобождения приблизительно одинаковы для всех аминокислот, за исключением Gly, который выщепляется очень медленно . Карбоксипептидаза Р ( получена из Aspergillus и Penicillum ) Она активна при рН 2,5 и имеет специфичность, сходную с таковой для карбоксипептидазы С. Карбоксипептидаза Y (из пекарских дрожжей) отщепляет, практически все аминокислоты, включая Pro . Гидролиз проходит наиболее эффективно при рН 5,5 — 6 , 5. Оптимальное значение рН для отцепления лизина и аргинина = 7,0.

При работе с карбоксипептидазами следует учитывать следующие основные проблемы: 1) многие препараты панкреатических ферментов А и В содержат эндонуклеазы (трипсин, химотрипсин), которые следует инактивировать добавлением диизопропилфторфосфата( DIPF ); 2) следует учитывать различие в скоростях отщепления отдельных аминокислот, зависящее как от природы боковой цепи у отщепляемого остатка, так и от природы аминокислоты расположенной в соседнем положении. Отщепление С-концевой аминокислоты значительно ускоряется, если перед ней находится остаток с ароматической или алифатической боковой цепью. Напротив, если в соседнем положении находится глицин, пролин, глутаминовая кислота, то скорость гидролиза снижается; 3) возникают осложнения и в случае, когда в С-концевой последовательности стоят подряд несколько остатков одной и той же аминокислоты. Поэтому при использовании карбоксипептидаз, надежно, удается вывести последовательность не более чем трех-пяти аминокислотных остатков, расположенных в белке в С-концевом положении.

Количество анализируемого материала зависит от чувствительности используемого метода идентификации. Освобождающиеся аминокислоты определяют или методом дансилирования с последующей ВЭТСХ, или количественно на аминокислотном анализаторе. Результаты представляют в виде графика зависимости количества отщепившейся аминокислоты (моль/моль белка) от времени (рис.7). Скорость появления освобождающихся аминокислот во времени позволяет сделать вывод о С-концевой последовательности белка.

(рис. 7) Отщепление аминокислот альдолазы

мышцы кролика карбоксипсптидазой А

Перед проведением количесвенного анализа следует убедиться, что отщепление действительно происходит, подобрать оптимальное соотношение фермента и субстрата, подобрать продолжительность расщепления. Для белков обычно необходимы предварительная денатурация и перевод в растворенное состояние. Для плохо растворимых белков расщепление можно проводить в 6М мочевине или в 0,05М додецилсульфате натрия ( SDS ). В обычном эксперименте образец белка инкубируют с карбоксипептидазами в подходящем буферном растворе (0,2М N-этилморфолинацетатном, 0,1М Na -бикарбонатном, аммоний-бикарбонатном, 0,05М пиридин-ацетатном и т.п.). Если в ходе предварительного эксперимента обнаруживается высвобождение многих аминокислот, то следует использовать соотношение фермент:субстрат 1:100 или 1:200 (по весу) и/или проводить отщепление при комнатной температуре. Если аминокислоты высвобождаются медленно, то следует увеличить соотношение фермент:субстрат 1:20 или 1:10 (по весу) и температуру до 37 0 С.

Структура a -аминокислот, наиболее часто встречающихся в белках

источник

Первый этап в определении первичной структуры белков заключается в качественной и количественной оценке аминокислотного состава данного индивидуального белка.

Для определения аминокислотного состава необходимо провести разрушение всех пептидных связей в белке. Анализируемый белок гидролизуют в 6 мол/л НС1 при температуре около 110 °С в течение 24 ч. В результате разрушаются пептидные связи в белке, а в гидролизате присутствуют только свободные аминокислоты

Разделение аминокислот с помощью ионообменной хроматографииСмесь аминокислот, полученных кислотным гидролизом белков, разделяют в колонке с катионообменной смолой.

Количественный анализ полученных фракций.нагреваютотдельные фракции аминокислот с нингидрином, образующим соединение красно-фиолетового цвета. Интенсивность окраски в пробе пропорциональна количеству находящейся в ней аминокислоты.

Определение N-концевой аминокислоты в белке и последовательности аминокислот в олигопептидах

Изучение первичной структуры белков имеет важное общебиологическое и медицинское значение. Изучая порядок чередования аминокислотных остатков в индивидуальных, можно выявить общие фундаментальные закономерности формирования пространственной структуры белков.многие генетические болезни — результат нарушения в аминокислотной последовательности белков. Информация о первичной структуре нормального и мутантного белка может быть полезна для диагностики и прогнозирования развития заболевания.

Установление первичной структуры белков включает 2 основных этапа:

определение аминокислотного состава изучаемого белка;

аминокислотной последовательности в белке.

Например, при серповидноклеточной анемии в шестом положении β-цепи гемоглобина происходит замена глутаминовой кислоты на валин. Это приводит к синтезу гемоглобина S (HbS) – такого гемоглобина, который в дезоксиформеполимеризуется и образует кристаллы. В результате эритроциты деформируются, приобретают форму серпа, теряют эластичность и при прохождении через капилляры разрушаются. Это в итоге приводит к снижению оксигенации тканей и их некрозу.

Последовательность и соотношение аминокислот в первичной структуре определяет формирование вторичной, третичной и четвертичной структур.

8. Вторичная структура белка–пространственная структура, образующаяся в результате взаимодействий между функциональными группами, входящими в состав пептидного остова.регулярные структуры двух типов: а-спираль и б-структура.

Вторичная структура образуется только при участии водородных связеймежду пептидными группами: атом кислорода одной группы реагирует с атомом водорода второй, одновременно кислород второй пептидной группы связывается с водородом третьей и т.д.

пептидный остов закручивается в виде спирали за счёт образования водородных связей между атомами кислорода карбонильных групп и атомами азота аминогрупп. Водородные связи ориентированы вдоль оси спирали. На один виток а-спирали приходится 3,6 аминокислотных остатка.

В образовании водородных связей участвуют практически все атомы кислорода и водорода пептидных групп. В результате ?-спираль «стягивается» множеством водородных связей. связи относят к слабых, их количество обеспечивает максимально возможную стабильность ?-спирали. гидрофильность ?-спиралей уменьшается, а их гидрофобность увеличивается.

?-Спиральная структура — наиболее устойчивая конформация пептидного остова, отвечающая минимуму свободной энергии. В результате образования ?-спиралей полипептидная цепь укорачивается.

Радикалы аминокислот находятся на наружной стороне ?-спирали и направлены от пептидного остова в сторонынекоторые из них могут нарушать формирование ?-спирали. К ним относят:

пролин. Его атом азота входит в состав жёсткого кольца, что исключает возможность вращения вокруг -N-CH- связи. Кроме того, у атома азота пролита, образующего пептидную связь с другой аминокислотой, нет атома водорода. В результате пролин не способен образовать водородную связь в данном месте пептидного остова, и ?-спиральная структура нарушается. Обычно в этом месте пептидной цепи возникает петля или изгиб;

участки, где последовательно расположены несколько одинаково заряженных радикалов, между которыми возникают электростатические силы отталкивания;

участки с близко расположенными объёмными радикалами, механически нарушающими формирование ?-спирали, например метионин, триптофан

β-Складчатый слойСтруктура формируется за счёт образования множества водородных связей между атомами пептидных групп линейных областей одной полипептидной цепи, делающей изгибы, или между разными полипептидными цепями, ?-Структура образует фигуру, подобную листу, сложенному «гармошкой» Когда водородные связи образуются между атомами пептидного остова различных полипептидных цепей, их называют межцепочечными связями. Водородные связи, возникающие между линейными участками внутри одной полипептидной цепи, называют внутрицепочечными. В ?-структурах водородные связи расположены перпендикулярно полипептидной цепи.

Если связанные полипептидные цепи направлены противоположно, возникает антипараллельная ?-структура, если же N- и С-концы полипептидных цепей совпадают, образуется структура параллельного ?-складчатог

9. Третичная структура – это укладка полипептидной цепи в глобулу («клубок»). Четкой границы между вторичной и третичной структурами провести нельзя, в основе третичной структуры лежат стерические взаимосвязи между аминокислотами, отстоящими далеко друг от друга в цепи. Благодаря третичной структуре происходит еще более компактное формирование цепи. В стабилизации третичной структуры белка принимают участие:

ковалентные связи(между двумя остаткамицистеина—дисульфидные мостики);

ионные связимежду противоположно заряженными боковыми группами аминокислотных остатков;

гидрофильно-гидрофобныевзаимодействия. При взаимодействии с окружающими молекулами воды белковая молекула «стремится» свернуться так, чтобы неполярные боковые группы аминокислот оказались изолированы от водного раствора; на поверхности молекулы оказываются полярныегидрофильныебоковые группы.

Связь с первичной структурой. Третичная структура в значительной степени предопределенапервичной структурой. Усилия по предсказанию третичной структуры белка основываясь на первичной структуре известна как задачапредсказания структуры белка. Однако, окружающая среда, в которой белок сворачивается существенно определяет конечную форму, но обычно непосредственно не принимается во внимание текущими методами предсказания. Большинство таких методов полагаются на сравнения с уже известными структурами, и таким образом включают окружающую среду косвенно. Супервторичная структура белков. сравнение конформаций разных по структуре и функциям белков выявило наличие у них похожих сочетаний элементов вторичной структуры. Такой специфический порядок формирования вторичных структур называют супервторичной структурой белков.она формируется за счёт межрадикальных взаимодействий. Определённые характерные сочетания а-спиралей и б-структур часто обозначают как «структурные мотивы».

источник

Строение белков. Структуры белков: первичная, вторичная, третичная и четвертичная. Простые и сложные белки

Строение белков. Структуры белков: первичная, вторичная, третичная и четвертичная. Простые и сложные белки

Название «белки» происходит от способности многих из них при нагревании становиться белыми. Название «протеины» происходит от греческого слова «первый», что указывает на их важное значение в организме. Чем выше уровень организации живых существ, тем разнообразнее состав белков.

Белки образуются из аминокислот, которые соединяются между собой ковалентной – пептидной связью: между карбоксильной группой одной аминокислоты и аминогруппой другой. При взаимодействии двух аминокислот образуется дипептид (из остатков двух аминокислот, от греч. пептос – сваренный). Замена, исключение или перестановка аминокислот в полипептидной цепи вызывает возникновение новых белков. Например, при замене лишь одной аминокислоты (глутамина на валин) возникает тяжелая болезнь – серповидно-клеточная анемия, когда эритроциты имеют другую форму и не могут выполнять свои основные функции (перенос кислорода). При образовании пептидной связи отщепляется молекула воды. В зависимости от количества аминокислотных остатков выделяют:

– олигопептиды (ди-, три-, тетрапептиды и т. п.) – содержат до 20 аминокислотных остатков;

– полипептиды – от 20 до 50 аминокислотных остатков;

– белки – свыше 50, иногда тысячи аминокислотных остатков

По физико-химическим свойствам различают белки гидрофильные и гидрофобные.

Существуют четыре уровня организации белковой молекулы – равноценные пространственные структуры (конфигурации, конформации) белков: первичная, вторичная, третичная и четвертичная.

Первичная структура белков является простейшей. Имеет вид полипептидной цепи, где аминокислоты связаны между собой прочной пептидной связью. Определяется качественным и количественным составом аминокислот и их последовательностью.

Вторичная структура образована преимущественно водородными связями, которые образовались между атомами водорода NH-группы одного завитка спирали и кислорода СО-группы другого и направлены вдоль спирали или между параллельными складками молекулы белка. Белковая молекула частично или целиком скручена в α-спираль или образует β-складчатую структуру. Например, белки кератина образуют α-спираль. Они входят в состав копыт, рогов, волос, перьев, ногтей, когтей. β-складчатую имеют белки, которые входят в состав шелка. Извне спирали остаются аминокислотные радикалы (R-группы). Водородные связи значительно более слабые, чем ковалентные, но при значительном их количестве образуют довольно прочную структуру.

Функционирование в виде закрученной спирали характерно для некоторых фибриллярных белков – миозин, актин, фибриноген, коллаген и т. п.

Третичная структура белка. Эта структура постоянна и своеобразна для каждого белка. Она определяется размером, полярностью R-групп, формой и последовательностью аминокислотных остатков. Полипептидная спираль закручивается и укладывается определенным образом. Формирование третичной структуры белка приводит к образованию особой конфигурации белка – глобулы (от лат. globulus – шарик). Его образование обуславливается разными типами нековалентных взаимодействий: гидрофобные, водородные, ионные. Между остатками аминокислоты цистеина возникают дисульфидные мостики.

Гидрофобные связи – это слабые связи между неполярными боковыми цепями, которые возникают в результате взаимного отталкивания молекул растворителя. При этом белок скручивается так, что гидрофобные боковые цепи погружены вглубь молекулы и защищают ее от взаимодействия с водой, а снаружи расположены боковые гидрофильные цепи.

Третичную структуру имеет большинство белков – глобулины, альбумины и т. п.

Четвертичная структура белка. Образуется в результате объединения отдельных полипептидных цепей. В совокупности они составляют функциональную единицу. Типы связей разные: гидрофобные, водородные, электростатические, ионные.

Электростатические связи возникают между электроотрицательными и электроположительными радикалами аминокислотных остатков.

Для одних белков характерно глобулярное размещение субъединиц – это глобулярные белки. Глобулярные белки легко растворяются в воде или растворах солей. К глобулярным белкам принадлежит свыше 1000 известных ферментов. К глобулярным белкам относятся некоторые гормоны, антитела, транспортные белки. Например, сложная молекула гемоглобина (белка эритроцита крови) является глобулярным белком и состоит из четырех макромолекул глобинов: двух α-цепей и двух β-цепей, каждая из которых соединена с гемом, содержащим железо.

Для других белков характерно объединение в спиральные структуры – это фибриллярные (от лат. fibrilla – волоконце) белки. Несколько (от 3 до 7) α–спиралей свиваются вместе, подобно волокнам в кабеле. Фибриллярные белки нерастворимы в воде.

Белки делят на простые и сложные.

Простые белки (протеины) состоят только из остатков аминокислот. К простым белкам относят глобулины, альбумины, глутелины, проламины, протамины, пистоны. Альбумины (например, альбумин сыворотки крови) растворимы в воде, глобулины (например, антитела) нерастворимы в воде, но растворимы в водных растворах некоторых солей (хлорид натрия и т. п.).

Сложные белки (протеиды) включают в состав, кроме остатков аминокислот, соединения другой природы, которые называются простетическою группой. Например, металлопротеиды – это белки, содержащие негеминовое железо или связанные атомами металлов (большинство ферментов), нуклеопротеиды – белки, соединенные с нуклеиновыми кислотами (хромосомы и т. п.), фосфопротеиды –белки, в состав которых входят остатки фосфорной кислоты (белки яичного желтка и т. п.), гликопротеиды –белки в соединении с углеводами (некоторые гормоны, антитела и т. п.), хромопротеиды – белки, содержащий пигменты (миоглобин и т. п.), липопротеиды – белки, содержащие липиды (входят в состав мембран).

источник

Белки — высокомолекулярные органические соединения, состоящие из остатков α-аминокислот.

В состав белков входят углерод, водород, азот, кислород, сера. Часть белков образует комплексы с другими молекулами, содержащими фосфор, железо, цинк и медь.

Белки обладают большой молекулярной массой: яичный альбумин — 36 000, гемоглобин — 152 000, миозин — 500 000. Для сравнения: молекулярная масса спирта — 46, уксусной кислоты — 60, бензола — 78.

Белки — непериодические полимеры, мономерами которых являются α-аминокислоты. Обычно в качестве мономеров белков называют 20 видов α-аминокислот, хотя в клетках и тканях их обнаружено свыше 170.

В зависимости от того, могут ли аминокислоты синтезироваться в организме человека и других животных, различают: заменимые аминокислоты — могут синтезироваться; незаменимые аминокислоты — не могут синтезироваться. Незаменимые аминокислоты должны поступать в организм вместе с пищей. Растения синтезируют все виды аминокислот.

В зависимости от аминокислотного состава, белки бывают: полноценными — содержат весь набор аминокислот; неполноценными — какие-то аминокислоты в их составе отсутствуют. Если белки состоят только из аминокислот, их называют простыми. Если белки содержат помимо аминокислот еще и неаминокислотный компонент (простетическую группу), их называют сложными. Простетическая группа может быть представлена металлами (металлопротеины), углеводами (гликопротеины), липидами (липопротеины), нуклеиновыми кислотами (нуклеопротеины).

Все аминокислоты содержат: 1) карбоксильную группу (–СООН), 2) аминогруппу (–NH₂), 3) радикал или R-группу (остальная часть молекулы). Строение радикала у разных видов аминокислот — различное. В зависимости от количества аминогрупп и карбоксильных групп, входящих в состав аминокислот, различают: нейтральные аминокислоты, имеющие одну карбоксильную группу и одну аминогруппу; основные аминокислоты, имеющие более одной аминогруппы; кислые аминокислоты, имеющие более одной карбоксильной группы.

Аминокислоты являются амфотерными соединениями, так как в растворе они могут выступать как в роли кислот, так и оснований. В водных растворах аминокислоты существуют в разных ионных формах.

Пептиды — органические вещества, состоящие из остатков аминокислот, соединенных пептидной связью.

Образование пептидов происходит в результате реакции конденсации аминокислот. При взаимодействии аминогруппы одной аминокислоты с карбоксильной группой другой между ними возникает ковалентная азот-углеродная связь, которую и называют пептидной. В зависимости от количества аминокислотных остатков, входящих в состав пептида, различают дипептиды, трипептиды, тетрапептиды и т.д. Образование пептидной связи может повторяться многократно. Это приводит к образованию полипептидов. На одном конце пептида находится свободная аминогруппа (его называют N-концом), а на другом — свободная карбоксильная группа (его называют С-концом).

Выполнение белками определенных специфических функций зависит от пространственной конфигурации их молекул, кроме того, клетке энергетически невыгодно держать белки в развернутой форме, в виде цепочки, поэтому полипептидные цепи подвергаются укладке, приобретая определенную трехмерную структуру, или конформацию. Выделяют 4 уровня пространственной организации белков.

Первичная структура белка — последовательность расположения аминокислотных остатков в полипептидной цепи, составляющей молекулу белка. Связь между аминокислотами — пептидная.

Если молекула белка состоит всего из 10 аминокислотных остатков, то число теоретически возможных вариантов белковых молекул, отличающихся порядком чередования аминокислот, — 10 20 . Имея 20 аминокислот, можно составить из них еще большее количество разнообразных комбинаций. В организме человека обнаружено порядка десяти тысяч различных белков, которые отличаются как друг от друга, так и от белков других организмов.

Именно первичная структура белковой молекулы определяет свойства молекул белка и ее пространственную конфигурацию. Замена всего лишь одной аминокислоты на другую в полипептидной цепочке приводит к изменению свойств и функций белка. Например, замена в β-субъединице гемоглобина шестой глутаминовой аминокислоты на валин приводит к тому, что молекула гемоглобина в целом не может выполнять свою основную функцию — транспорт кислорода; в таких случаях у человека развивается заболевание — серповидноклеточная анемия.

Вторичная структура — упорядоченное свертывание полипептидной цепи в спираль (имеет вид растянутой пружины). Витки спирали укрепляются водородными связями, возникающими между карбоксильными группами и аминогруппами. Практически все СО- и NН-группы принимают участие в образовании водородных связей. Они слабее пептидных, но, повторяясь многократно, придают данной конфигурации устойчивость и жесткость. На уровне вторичной структуры существуют белки: фиброин (шелк, паутина), кератин (волосы, ногти), коллаген (сухожилия).

Третичная структура — укладка полипептидных цепей в глобулы, возникающая в результате возникновения химических связей (водородных, ионных, дисульфидных) и установления гидрофобных взаимодействий между радикалами аминокислотных остатков. Основную роль в образовании третичной структуры играют гидрофильно-гидрофобные взаимодействия. В водных растворах гидрофобные радикалы стремятся спрятаться от воды, группируясь внутри глобулы, в то время как гидрофильные радикалы в результате гидратации (взаимодействия с диполями воды) стремятся оказаться на поверхности молекулы. У некоторых белков третичная структура стабилизируется дисульфидными ковалентными связями, возникающими между атомами серы двух остатков цистеина. На уровне третичной структуры существуют ферменты, антитела, некоторые гормоны.

Четвертичная структура характерна для сложных белков, молекулы которых образованы двумя и более глобулами. Субъединицы удерживаются в молекуле благодаря ионным, гидрофобным и электростатическим взаимодействиям. Иногда при образовании четвертичной структуры между субъединицами возникают дисульфидные связи. Наиболее изученным белком, имеющим четвертичную структуру, является гемоглобин. Он образован двумя α-субъединицами (141 аминокислотный остаток) и двумя β-субъединицами (146 аминокислотных остатков). С каждой субъединицей связана молекула гема, содержащая железо.

Если по каким-либо причинам пространственная конформация белков отклоняется от нормальной, белок не может выполнять свои функции. Например, причиной «коровьего бешенства» (губкообразной энцефалопатии) является аномальная конформация прионов — поверхностных белков нервных клеток.

Купить проверочные работы
по биологии

Аминокислотный состав, структура белковой молекулы определяют его свойства. Белки сочетают в себе основные и кислотные свойства, определяемые радикалами аминокислот: чем больше кислых аминокислот в белке, тем ярче выражены его кислотные свойства. Способность отдавать и присоединять Н + определяют буферные свойства белков; один из самых мощных буферов — гемоглобин в эритроцитах, поддерживающий рН крови на постоянном уровне. Есть белки растворимые (фибриноген), есть нерастворимые, выполняющие механические функции (фиброин, кератин, коллаген). Есть белки активные в химическом отношении (ферменты), есть химически неактивные, устойчивые к воздействию различных условий внешней среды и крайне неустойчивые.

Внешние факторы (нагревание, ультрафиолетовое излучение, тяжелые металлы и их соли, изменения рН, радиация, обезвоживание)

могут вызывать нарушение структурной организации молекулы белка. Процесс утраты трехмерной конформации, присущей данной молекуле белка, называют денатурацией. Причиной денатурации является разрыв связей, стабилизирующих определенную структуру белка. Первоначально рвутся наиболее слабые связи, а при ужесточении условий и более сильные. Поэтому сначала утрачивается четвертичная, затем третичная и вторичная структуры. Изменение пространственной конфигурации приводит к изменению свойств белка и, как следствие, делает невозможным выполнение белком свойственных ему биологических функций. Если денатурация не сопровождается разрушением первичной структуры, то она может быть обратимой, в этом случае происходит самовосстановление свойственной белку конформации. Такой денатурации подвергаются, например, рецепторные белки мембраны. Процесс восстановления структуры белка после денатурации называется ренатурацией. Если восстановление пространственной конфигурации белка невозможно, то денатурация называется необратимой.

Ферменты, или энзимы, — особый класс белков, являющихся биологическими катализаторами. Благодаря ферментам биохимические реакции протекают с огромной скоростью. Скорость ферментативных реакций в десятки тысяч раз (а иногда и в миллионы) выше скорости реакций, идущих с участием неорганических катализаторов. Вещество, на которое оказывает свое действие фермент, называют субстратом.

Ферменты — глобулярные белки, по особенностям строения ферменты можно разделить на две группы: простые и сложные. Простые ферменты являются простыми белками, т.е. состоят только из аминокислот. Сложные ферменты являются сложными белками, т.е. в их состав помимо белковой части входит группа небелковой природы — кофактор. У некоторых ферментов в качестве кофакторов выступают витамины. В молекуле фермента выделяют особую часть, называемую активным центром. Активный центр — небольшой участок фермента (от трех до двенадцати аминокислотных остатков), где и происходит связывание субстрата или субстратов с образованием фермент-субстратного комплекса. По завершении реакции фермент-субстратный комплекс распадается на фермент и продукт (продукты) реакции. Некоторые ферменты имеют (кроме активного) аллостерические центры — участки, к которым присоединяются регуляторы скорости работы фермента (аллостерические ферменты).

Для реакций ферментативного катализа характерны: 1) высокая эффективность, 2) строгая избирательность и направленность действия, 3) субстратная специфичность, 4) тонкая и точная регуляция. Субстратную и реакционную специфичность реакций ферментативного катализа объясняют гипотезы Э. Фишера (1890 г.) и Д. Кошланда (1959 г.).

Э. Фишер (гипотеза «ключ-замок») предположил, что пространственные конфигурации активного центра фермента и субстрата должны точно соответствовать друг другу. Субстрат сравнивается с «ключом», фермент — с «замком».

Д. Кошланд (гипотеза «рука-перчатка») предположил, что пространственное соответствие структуры субстрата и активного центра фермента создается лишь в момент их взаимодействия друг с другом. Эту гипотезу еще называют гипотезой индуцированного соответствия.

Скорость ферментативных реакций зависит от: 1) температуры, 2) концентрации фермента, 3) концентрации субстрата, 4) рН. Следует подчеркнуть, что поскольку ферменты являются белками, то их активность наиболее высока при физиологически нормальных условиях.

Большинство ферментов может работать только при температуре от 0 до 40 °С. В этих пределах скорость реакции повышается примерно в 2 раза при повышении температуры на каждые 10 °С. При температуре выше 40 °С белок подвергается денатурации и активность фермента падает. При температуре, близкой к точке замерзания, ферменты инактивируются.

При увеличении количества субстрата скорость ферментативной реакции растет до тех пор, пока количество молекул субстрата не станет равным количеству молекул фермента. При дальнейшем увеличении количества субстрата скорость увеличиваться не будет, так как происходит насыщение активных центров фермента. Увеличение концентрации фермента приводит к усилению каталитической активности, так как в единицу времени преобразованиям подвергается большее количество молекул субстрата.

Для каждого фермента существует оптимальное значение рН, при котором он проявляет максимальную активность (пепсин — 2,0, амилаза слюны — 6,8, липаза поджелудочной железы — 9,0). При более высоких или низких значениях рН активность фермента снижается. При резких сдвигах рН фермент денатурирует.

Скорость работы аллостерических ферментов регулируется веществами, присоединяющимися к аллостерическим центрам. Если эти вещества ускоряют реакцию, они называются активаторами, если тормозят — ингибиторами.

По типу катализируемых химических превращений ферменты разделены на 6 классов:

1. оксиредуктазы (перенос атомов водорода, кислорода или электронов от одного вещества к другому — дегидрогеназа),
2. трансферазы (перенос метильной, ацильной, фосфатной или аминогруппы от одного вещества к другому — трансаминаза),
3. гидролазы (реакции гидролиза, при которых из субстрата образуются два продукта — амилаза, липаза),
4. лиазы (негидролитическое присоединение к субстрату или отщепление от него группы атомов, при этом могут разрываться связи С–С, С–N, С–О, С–S — декарбоксилаза),
5. изомеразы (внутримолекулярная перестройка — изомераза),
6. лигазы (соединение двух молекул в результате образования связей С–С, С–N, С–О, С–S — синтетаза).

Классы в свою очередь подразделены на подклассы и подподклассы. В действующей международной классификации каждый фермент имеет определенный шифр, состоящий из четырех чисел, разделенных точками. Первое число — класс, второе — подкласс, третье — подподкласс, четвертое — порядковый номер фермента в данном подподклассе, например, шифр аргиназы — 3.5.3.1.

Перейти к лекции №2 «Строение и функции углеводов и липидов»

Перейти к лекции №4 «Строение и функции нуклеиновых кислот АТФ»

Смотреть оглавление (лекции №1-25)

источник

Можно выделить следующие этапы выяснения первичной структуры белков и пептидов:

1. Выделение белка в чистом виде и определение его молекулярной массы

2. Определение аминокислотного состава

3. Определение N-концевой аминокислоты

4. Определение С-концевой аминокислоты

5. Определение аминокислотной последовательности

Выделение белка в чистом виде. Как правило, исходный материал содержит много различных белков. В связи с этим возникает проблема выделения из этой смеси интересующего белка в чистом виде. При очистке белков используются методы, которые основаны на разнице:

1.Поверхностного заряда белков

2.Молекулярного размера белков (зависящего от их молекулярной массы)

3.Биологической активности вследствие связывания с субстратами или ингибиторами

Разделение белков по разнице величины поверхностного заряда. Суммарный поверхностный электрический заряд белка при данном значении рН может быть отрицательным, нейтральным или положительным. Для разделения белков с различным зарядом, подобно тому, как это было в случае аминокислот, может быть использован метод ионообменной хроматографии (см. выше). Концентрацию белка в пробирках с элюатом определяют с помощью спектрофотометра по интенсивности поглощения ультрафиолетового света и строят графическую зависимость её от объема вытекшей из хроматографической колонки жидкости.

Разделение белков по молекулярной массе. Если представить молекулы белков в виде шариков различной величины, размер которых зависит от их молекулярной массы, то окажется, что у больших шариков будет большей молекулярная масса или размер молекул. Это означает, что белки можно разделить подобно частичкам в сите — молекулярном сите, образованном гелем. Такой способ часто называют гель-фильтрацией или хроматографией исключения размером. Ниже приводится иллюстрация того, как с помощью гель-фильтрации удается разделить смесь белков различного размера (рис.1.12).

Хроматографическую колонку заполняют набухшим гелем. Частицы геля приготовлены из связанного поперечными сшивками полисахаридного материала и содержат большое количество микропор. Размер микропор подбирают таким образом, чтобы в них проникали меньшие из разделяемых молекул, в то время как большие этого сделать не могли. Смесь разделяемых белков наносят на верхнюю часть колонки и элюируют буферным раствором. Увлекаемые током нисходящей жидкости большие молекулы, не имея возможности проникнуть в поры гелевых частиц, будут двигаться быстрее. Меньшие молекулы проникают в поры и задерживаются там. Если собирать вытекающий из колонки раствор равными порциями в пробирки, то окажется, что в более ранних порциях вытекающей жидкости будут содержаться белки больших размеров, а в более поздних — меньших размеров. Путем подбора размера пор можно добиться разделения самых разных смесей белков.

Рис.1.12. Схематическое изображение разделения белков методом гель-фильтрации

Если учесть, что размер молекулы зависит от молекулярной массы, то оказывается, что разделяя белки методом гель-фильтрации, одновременно можно установить его молекулярную массу.

Рис.1.13. График зависимости молекулярной массы белков от объема выхода их из хроматографической колонки в ходе гель-фильтрации

Объем вытекающего из колонки элюата обратнопропорционален логарифму молекулярной массы белка. Таким образом, достаточно знать объем жидкости, в котором вышел из колонки интересующий белок, чтобы, пользуясь подобным графиком, можно было установить его молекулярную массу (рис.1.13).

Ещё одним методом, который позволяет разделить белки в зависимости от их молекулярной массы, является гель-электрофорез (см. выше).

Ультрацентрифугирование. Если встряхнуть сосуд, заполненный песком с водой, а затем поставить его на ровную поверхность, то песок быстро осядет на дно благодаря силе земного притяжения. С высокомолекулярными веществами, находящимися в растворе, этого не произойдет, так как тепловое (броуновское) движение сохраняет их равномерное распределение в растворе. Оседание макромолекул, подобно песчинкам, произойдет, только если их подвергнуть значительному ускорению.

В 1923 году шведский биохимик Т. Сведберг впервые использовал ультрацентрифугирование. При скорости вращения ротора 80000 об/мин ему удалось показать, что многие белки состоят из субъединиц. Позже ультрацентрифугирование стало незаменимым методом для разделения белков, нуклеиновых кислот и субклеточных частиц.

Рис.1.14. Схематическое изображение зонального ультрацентрифугирования.

Образец наслаивают на градиент сахарозы (слева). После центрифугирования (середина) каждая частица осаждается на уровне, зависящем от его массы. После остановки ротора центрифужную пробирку прокалывают и разделенные частицы (зоны) собирают в пробирки (справа).

Осаждение проводят в растворе химически инертного вещества (сахарозы или CsCl), концентрация которого и, следовательно, плотность увеличивается в направлении от поверхности до дна центрифужной пробирки. Использование таких градиентов плотности значительно усиливает разрешающую способность ультрацентрифуги. Различают зональное препаративное ультрацентрифугирование (рис.1.14) и ультрацентрифугирование в равновесном градиенте плотности (изократное ультрацентрифугирование) (рис.1.15).

Разделение белков по разнице биологической активности вследствие связывания с лигандами. Характерной особенностью белков является их способность прочно связываться с различными молекулами, но нековалентными связями. На этом основан метод разделения белков аффинной хроматографией (рис.1.16).

Рис.1.16. Схематическое изображение принципа иммуноаффинной хроматографии

Антиген — лиганд для выделяемого белка. Антитело — выделяемый белок.

Молекулы веществ, с которыми специфически связываются определенные белки, ковалентно соединяют с частицами инертного матрикса. Тогда они выполняют роль своеобразных «рыболовных крючков», задерживающих необходимый белок. Все остальные белки транзитом проходят через колонку. Задержанный белок затем можно вымыть из колонки с помощью буферного раствора, содержащего в свободном состоянии такие же молекулы, которые выполняли роль «рыболовных крючков», или с помощью какого-нибудь другого реактива, способного нарушить это взаимодействие. Одним из вариантов этого метода является иммуноаффинная хроматография. Тогда антитела к определенному белку присоединяют к частицам сорбента. Они обеспечивают с очень высокой специфичностью задержку в колонке этого белка (рис.1.16).

Определение аминокислотного состава белка.До определения аминокислотной последовательности выделенного белка желательно иметь представление о его аминокислотном составе, то есть знать, какие аминокислоты и в каком количестве входят в состав его молекулы. Для этого проводят полный гидролиз белка с последующим количественным анализом высвободившихся аминокислот. Чаще используют кислотный гидролиз. Полипептид растворяют в 6N НCl в отсутствие кислорода, чтобы предотвратить окисление серусодержащих аминокислот. Смесь нагревают до 100-120 0 С и выдерживают при этой температуре в течение 10-100ч. К сожалению при этом способе гидролиза некоторые аминокислоты (Сер, Три, Тир, Глн, Асн) разрушаются.

Аминокислотный состав полипептидного гидролизата определяют с помощью автоматического аминокислотного анализатора. Прибор разделяет аминокислоты посредством ионообменной хроматографии (см. выше). Их идентифицируют по элюционному объему и количественно учитывают по интенсивности флюоресценции после проведения реакции с дансилхлоридом. Современные аминокислотные анализаторы проводят анализ гидролизата белка в течение 1ч с чувствительностью, которая позволяет определить до 1 пикомоля аминокислоты.

Определение N-концевой аминокислоты.Имеется несколько эффективных подходов, с помощью которых можно идентифицировать N-концевую аминокислоту. 1-Диметиламинонафталин-5-сульфонилхлорид (дансил хлорид) взаимодействует с первичными аминами с образованием дансилированного полипептида. Последующее проведение кислотного гидролиза позволяет высвободить из полипептидной цепи N-концевую аминокислоту в виде дансил-аминокислоты, обладающей интенсивной желтой флюоресценцией (рис.1.17).

Рис.1.17. Этапы определения N-концевой аминокислоты методом дансилирования

Благодаря этому дансил-производное аминокислоты можно идентифицировать хроматографически.

Ещё более популярным методом идентификации N-концевой аминокислоты является разрушение по Эдману (Pehr Edman — автор метода). Фенилизотиоцианат (ФИТЦ, реактив Эдмана) взаимодействует с N-концевой аминогруппой белков в слабо щелочной среде (рис.1.18). В результате образуется фенилтиокарбамильный продукт. Его обрабатывают безводной сильной кислотой, такой как трифторуксусная кислота. При этом тиазолиновое производное N-концевой аминокислоты отщепляется, в то время как остальные пептидные связи не подвергаются гидролизу. Тем самым разрушение по Эдману заключается в отщеплении остатка только N-концевой аминокислоты и сохранении оставшейся части полипептидной цепи.

Тиазолиновое производное аминокислоты избирательно экстрагируют органическим растворителем и превращают в более стабильное фенилтиогидантоиновое производное. Последнее можно идентифицировать сравнением с известными стандартами при проведении тонкослойной хроматографии, электрофореза, высокоэффективной жидкостной хроматографии или газо-жидкостной хроматографии.Наиболее важным преимуществом расщепления по Эдману по сравнению с другими методами определения N-концевой аминокислоты является то, что, проводя повторно с одним и тем же пептидом эту процедуру, каждый раз можно идентифицировать новую N-концевую фенилгидантоин-аминокислоту, выясняя таким образом аминокислотную последовательность.

Идентификация С-концевой аминокислоты. Один из подходов заключается в использовании ферментов — карбоксипептидаз (катализирует отщепление от пептида С-концевой аминокислоты). Карбоксипептидазы, подобно другим ферментам, обладают субстратной специфичностью, то есть они катализируют отщепление определенных аминокислот. Вместе с тем, наличие рядом с С-концевой аминокислотой остатка Про делает невозможной её отщепление под влиянием карбоксипептидазы. В этом случае наиболее надежным считается метод гидразинолиза. Полипептид обрабатывают безводным гидразином при температуре 90 0 С в течение 20-100ч в присутствии ионообменного сорбента (в качестве катализатора). При этом разрушаются все пептидные связи, а из высвобождающихся аминокислот образуются гидразиды. Но С-концевая аминокислота высвобождается как свободная и поэтому её можно идентифицировать хроматографически.

Определение аминокислотной последовательности. Установление концевых аминокислот в исследуемом пептиде позволяет в дальнейшем определить всю его аминокислотную последовательность. Для этого обычно проводят повторное разрушение по Эдману (см. выше) в автоматическом приборе — секвенаторе, который был предложен П. Эдманом и Г. Бэгом. Современный такой прибор определяет 1 аминокислотный остаток в час. Таким способом можно установить последовательность расположения 40-60 остатков аминокислот. Затем накапливаются незавершенные реакции, продукты побочных реакций. Наряду с потерей самого пептида они делают малоинформативной и ненадежной дальнейшую идентификацию аминокислот. Чтобы установить последовательность их расположения в больших полипептидных молекулах, их подвергают расщеплению ферментативным или химическим путем на фрагменты с размерами, достаточными для проведения секвенирования (рис.1.19).

Рис.1.19. Аминокислотную последовательность полипептидной цепи определяют, совмещая перекрывающиеся последовательности фрагментов пептида. В данном случае после расщепления исследуемого пептида трипсином (катализирует разрыв пептидных связей, в образовании которых участвует карбоксильные группы Арг и Лиз), а в другом случае — бромцианом (CNBr) (катализирует разрыв пептидных связей, в образовании которых участвует Мет) были получены два набора пептидных фрагментов. Порядок связывания первых двух фрагментов, образовавшихся в результате действия трипсина, устанавливается на основании того наблюдения, что фрагмент Гли-Ала-Лиз-Лей-Про-Мет (результат расщепления CNBr) имеет последовательность аминокислот на N и С — концах, включающую N и С — концы двух трипсиновых фрагментов. Иными словами, обнаружение накладывающихся участков позволяет установить последовательность расположения пептидных фрагментов, то есть аминокислотную последовательность всего исследуемого пептида.

Исследование последовательности нуклеотидов ДНК — рутинная операция в молекулярной биологии.Этот метод в последнее время вытеснил другие методы исследования первичной структуры белков. Зная последовательность нуклеотидов, можно легко установить последовательность аминокислот (более подробное описание этого метода см. в главе 13).

Метод пептидных карт.Процесс определения аминокислотной последовательности в белке — процедура достаточно длительная. Её можно существенно ускорить в случае выяснения аминокислотной последовательности гомологичного белка[2], если у сравниваемого белка она уже известна. Метод носит название «метод пептидных карт» или «метод отпечатков пальцев». Он включает в себя сочетание хроматографии и электрофореза на бумаге продуктов неполного гидролиза сравниваемых белков. При этом пептидные фрагменты, отличающиеся аминокислотной последовательностью, будут обладать разной подвижностью по сравнению с таковыми у исходного белка (рис.1.21).

Рис.1.21. Сравнение «отпечатков пальцев» (окраска нингидрином) продуктов расщепления трипсином (а) гемоглобина А и (б) гемоглобина S. Пептиды, отличающиеся по подвижности, обведены квадратом. Они включают в себя 98 аминокислот, расположенных на N-конце b-субъединицы гемоглобина. Различие заключается в замене 6-ой аминокислоты (Глю) в составе Hb A на Вал в составе Hb S.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник