Известно, что все 20 разновидностей канонических α-аминокислот имеют однотипную структуру, с тремя вариантами функциональных групп (рис. 3.3). К сожалению, реакции на амино- и карбоксигруппы малоспецифичны, т.к. соответственно, свойственны всем аминам, ряду амидов и карбоновых кислот. То же относится и к большинству их радикалов = R, 10 из которых неполярны, то есть представлены алифатическими = углеводородными группами, большинство которых химически инертно. Относительно низка и специфичность большинства R полярных аминокислот, в которых встречаются спиртовые (Сер, Тре, Тир) амидные (Асн, Глн) и карбоксигруппы (Асп, Глу). Более активны аминогруппа (Лиз), имидазол Гис и гуанидиногруппа Арг, а максимальна активность тиогруппы Цис. Поэтому наибольшее практическое значение в качественном и количественном анализе α-аминокислот, в том числе и в аминокислотных анализаторах, получила универсальная нингидриновая реакция, специфичная для одновременного присутствия у α-С атома, как амино-, так и карбоксигруппы.
Рис. 3.3. Общие формулы структуры α-аминокислот и продукта их полимеризации. Пояснения в тексте.
Полимеризация α-аминокислот в структуру пептидов и белков (рис. 3.3) сохраняет все типы их R, но:
1. Нингидриновая реакция становится отрицательной, т.к. за исключением N- и C-концевых, α-амино- и α-карбоксигруппы расходуются на образование пептидных связей. Положительная нингидриновая реакция с белком, скорей свидетельствует о присутствии примесей аминокислот в препарате или посуде.
2. Для всех пептидов и белков специфична биуретовая реакция на пептидную группу, отсутствующую в мономерных аминокислотах.
3. Из более специфических реакций на R аминокислот, бывают полезны: ксантопротеиновая реакция с концентрированной азотной кислотой, на ароматические R Фен, Тир, Три; реакция с изатином на пятичленный цикл Про, а также реакции на имидазольный R Гис, тиогруппу Цис и гуанидиногруппу Арг. Важно учитывать, что часть этих R скрыта внутри белковых глобул и потому, качественные реакции на них ослаблены. Поэтому, перед их проведением, белки обычно денатурируют тем или иным способом.
4. В отличие от истинных растворов аминокислот, коллоидным растворам белков свойственны осадочные реакции, связанные с разрушением их гидратных оболочек и, вследствие этого, снижением их растворимости под действием водоотнимающих средств: нейтральных солей = высаливание, метанола = МеОН, этанола = EtОН, ацетона, мочевины и др. агентов.
Выполняя качественные реакции, следует:
1. Тщательно соблюдать правила пожарной безопасности и работ с концентрированными кислотами и щелочами = ЕЖ.
2. Промаркировать стеклографом или фломастером 2 ряда пробирок и поместить в один из них не более 0,5 мл (2-5 капель) 1 % раствора аминокислоты, а в другой – примерно тот же объем 1 % раствора белка.
3. В пару пробирок с растворами аминокислоты и белка, параллельно добавить по 3-5 капель соответствующих реактивов и, провести остальные процедуры, указанные для соответствующей реакции.
4. При необходимости нагрева пробирок – снять крышку тигля и поджечь спичкой сухое горючее. Затем, зажать пробирку в держатель, примитивная конструкция которого, очень ненадежна. Поэтому лучше обернуть пару пробирок сложенным в полоску листком бумаги и, придерживая их большим пальцем, равномерно пропускать нижние половины пробирок через пламя, избегая направления горлышек на соседей и бурного вскипания раствора. Выполнив операцию, своевременно погасить пламя крышкой тигля.
5. Результаты опытов, в соответствии с шаблоном, оформлять на развороте лабораторной тетради в виде таблицы:
6. Обдумав полученные результаты и, завершив оформление протокола, вместе со штативом пробирок, предъявить их преподавателю для защиты.
1. Нингидриновая реакция.Основана на дезаминировании и декарбоксилировании α-аминокислот спиртовым раствором нинги-дрина:
Возникший аммиак, реагируя с двумя молекулами нингидрина, образует окрашенное производное, с максимумом поглощения при 540 нм (для Про – 440 нм).
Ход работы: К исследуемым образцам добавить по 3-5 капель 0,5 % спиртового раствора нингидрина. Пробирки со смесями аккуратно прогреть на пламени и через 2-3 мин зарегистрировать появление окраски.
2. Ксантопротеиновая реакция. Как уже сказано выше, основана на образовании нитропроизводных аминокислот с ароматическим R: Фен, Тир, Три.
Ход работы: Включив тягу вытяжного шкафа, в пару пробирок с исследуемыми растворами осторожно добавить по нескольку капель концентрированной азотной кислоты (HNO3). Пробирки аккуратно прогреть на пламени, избегая направления горлышек на соседей, и зарегистрировать развитие окраски.
3. Нитропруссидная реакция.Основана на щелочном гидролизе серусодержащей аминокислоты цистеина, с выделением сульфида натрия (Na2S), дающего со свежеприготовленным раствором нитропруссида натрия, комплекс красного цвета.
Ход работы: В обе пробирки с 5-10 каплям исследуемых растворов добавить равный объём 20 % едкого натра и прокипятить не менее 3-5 мин. Добавить в пробирки по 3-5 капель раствора нитропруссида натрия и зафиксировать развитие окраски.
4. Биуретовая реакция. Основана на образовании в щелочной среде цветного комплекса пептидной связи с ионом Cu 2+ . Служит универсальным тестом для выявления пептидов и белков в растворах. Так как с ростом количества пептидных связей, интенсивность окраски раствора линейно нарастает, широко применяется для фотометрического определения концентраций белка.
Ход работы. В пробирки с 5-10 каплями исследуемых растворов добавить столько же 10 % раствора едкого натра. Хорошо перемешать и добавить по 2 капли 1 % раствора сульфата меди (CuSO4). Пробы перемешать и через несколько минут зарегистрировать развитие окраски.
5. Проба с кипячением.Основана на тепловой денатурации белков.
Ход работы. Обе пробирки с исследуемыми растворами подкислить, не более, чем одной каплей 1 % раствора уксусной кислоты (AcOH) и нагреть до кипения. Прокипятив растворы 2-3 мин, зарегистрировать результаты и объяснить механизм явления.
6. Осаждение солями тяжелых металлов(Ме).Их денатурирующие свойства основаны на способности катионов тяжелых Ме реагировать с функциональными группами R молекулы белка: тио-, амино-, карбокси-, ароматическими. Также, их сильные анионы вызывают перезарядку ионогенных групп в молекулах белков, разрушая в них тем самым, ионные связи.
Ход работы. В обе пробирки с исследуемыми растворами добавить по нескольку капель 5 % раствора сульфата меди (CuSO4). Зарегистрировать и объяснить полученные результаты.
7. Осаждение органическими кислотами.Основано на кислотной денатурации белков и образовании ковалентных производных тио-, амино- и ароматических групп R аминокислот с хлорорганикой.
Ход работы. В пробирки с исследуемыми растворами добавить по нескольку капель 10 % раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и, через несколько минут зарегистрировать результаты
Дата добавления: 2016-02-16 ; просмотров: 989 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ
источник
Один из способов определения структуры белка включает его гидролиз, а затем качественный и количественный анализ образовавшейся при этом смеси аминокислот. Ниже обсуждается несколько методов такого анализа.
Смесь известных аминокислот наносится в виде пятна на стеклянную пластину, покрытую тонким слоем оксида кремния или оксида алюминия (рис. 15-2). В качестве пластины можно также использовать специальную бумагу без всякого покрытия. Пластину помещают в стеклянную камеру, на дно которой налито небольшое количество растворителя. Благодаря действию капиллярных сил растворитель начинает постепенно подниматься по пластине, увлекая за собой компоненты нанесенной на пластину смеси. Различные вещества движутся по пластине с различными скоростями. Относительная скорость движения компонентов смеси определяется относительной полярностью вещества, покрывающего пластину (неподвижной фазы), и растворителя (подвижной фазы). Например, если подвижная фаза малополярна, то менее полярные аминокислоты будут
Рис. 15-2. (см. скан) Тонкослойная хроматография: 1 — стеклянная или алюминиевая пластина, покрытая тонким слоем неподвижной фазы или нанесенное на точку старта пятно анализируемой смеси; 3 — стеклянная камера; 4 — крышка; 5 — растворитель (подвижная фаза) растворитель медленно поднимаете и по пластинке; фиолетовые (после обработки нингидрином) пятна аминокислот: 7 — лизин; 8 — пролин; 9 — серин; 10 — тирозии; 11 — место, где должно было бы оказаться пятно аланина, которого в анализируемой смеси нет; 12 — точка старта
двигаться по пластине сравнительно быстро, тогда как более полярные аминокислоты будут сильнее удерживаться неподвижной фазой. Различие в скорости движения приводит к разделению смеси на компоненты. После того как фронт подвижной фазы достигнет верхнего края пластины, ее вынимают из камеры, высушивают и опрыскивают раствором специального вещества — нингидрина. При этом бесцветные (и потому невидимые) аминокислоты образуют фиолетовые комплексы с нингидрином, что позволяет увидеть пятна аминокислот на пластине. Зная заранее положение на хроматограмме пятен каждой из двадцати аминокислот (при использовании определенных подвижной и неподвижной фаз),
легко определить, какие именно аминокислоты содержатся в исследуемой смеси. На рис. 15-2 показана хроматограмма смеси тирозина, серина, пролина и лизина.
Тонкослойная хроматография (ТСХ) позволяет провести лишь качественный анализ белков или смесей аминокислот. Очень приблизительно относительное содержание аминокислот в смеси можно оценить по интенсивности окраски пятен. Чем темнее пятно, тем выше содержание аминокислоты в изучаемом образце.
Еще одним методом определения аминокислот служит электрофорез, который имеет значительное сходство с ТСХ. Анализируемую смесь аминокислот помещают в центр расположенного горизонтально бумажного листа, который смочен буферным раствором, обеспечивающим желаемое значение рН. Под действием внешнего электрического поля молекулы аминокислот, в зависимости от знака заряда, начинают двигаться либо к катоду, либо к аноду (рис. 15-3, табл. 15-3). Если значение рН буферного раствора выше данной аминокислоты, то аминокислота существует в виде аниона и в электрическом поле будет двигаться к аноду. Наоборот, если аминокислота находится в катионной форме и будет двигаться к катоду. Чем больше разница между тем быстрее (дальше) будет двигаться аминокислота. В табл. 15-3 приведены значения и относительные подвижности некоторых аминокислот при
На рис. 15-4 показана электрофореграмма, полученная после проявления нингидрином.
Электрофорез используется для анализа смесей аминокислот, полученных в результате гидролиза белков. В некоторых случаях электрофоретическое обнаружение необычных аминокислот в плазме крови позволяет поставить больному правильный диагноз.
Рис. 15-3- Схема установки для электрофореза: а — вид сбоку; б — вид сверху; 1 — бумажный лист; 2 — пятно исследуемой смеси; 3 — буферный раствор
Рис. 15-4, Электрофореграмма: 1 — точка старта; 2 — лейцин; 3 — фенил аланин; 4 — аспарагиновая кислота; 5 — лизин
На рис. 15-5 показана принципиальная схема аминокислотного анализатора, который позволяет устанавливать как качественный, так и количественный состав смесей аминокислот, полученных в результате гидролиза белка.
Белок, чей аминокислотный состав анализируется, смешивают с соляной кислотой. Нагревание смеси приводит к гидролизу белка до аминокислот. Затем смесь аминокислот пропускают через колонку, заполненную оксидом алюминия или ионообменной смолой. В колонке аминокислоты разделяются и выходят из нее с различной скоростью. Разделенные аминокислоты смешивают с нингидрином и снова нагревают для ускорения образования окрашенного комплекса. Затем раствор проходит через фотометр, который регистрирует наличие и интенсивность окраски и изображает график зависимости оптической плотности раствора от времени. Поскольку время удерживания каждой из двадцати аминокислот в колонке известно, можно установить, какие именно аминокислоты входят в состав исследуемого белка. Площадь пика пропорциональна количеству данной аминокислоты, что позволяет установить относительное содержание аминокислот в белке.
Аминокислотный состав белка может быть установлен несколькими способами. После гидролиза белка до аминокислот смесь последних можно анализировать с помощью тонкослойной хроматографии или электрофореза. Оба эти метода дают только качественный состав смеси аминокислот. С помощью автоматического аминокислотного анализатора можно установить и качественными количественный аминокислотный состав белка.
Таблица 15-3. (см. скан) Относительные подвижности некоторых аминокислот в электрическом поле
источник
ПМ 03 «Проведение лабораторных биохимических исследований»
Тема: «Свойства белков. Качественные реакции на белки и аминокислоты»
Учебные вопросы для самоподготовки студентов
1. Классификация белков (простые и сложные белки).
2. Характеристика простых белков (альбумины и глобулины, проламины и глютелины, протамины и гистоны, протеиноиды).
3. Нуклеопротеины. Строение ДНК, локализация, биологическая роль. Строение РНК, типы РНК (м-РНК, т-РНК, р-РНК), биологическая роль.
4. Характеристика липопротеинов. Особенности строения свободных липопротеинов плазмы крови, схема строения липопротеидной частицы. Классификация липопротеинов плазмы крови, место образования, биологическая роль.
5. Характеристика гликопротеинов. Особенности строения протеогликанов; классификация гликозаминогликанов., распространение в организме, биологическая роль.
6. Хромопротеины, классификация. Строение гемоглобина (Hb). Производные гемоглобина (окси-, карбокси-, карб- и метгемоглобин). Типы гемоглобина (эмбриональные Нb, HbA, HbF, HbS и др.). Ферментные гемопротеины, особенности функционирования, биологическая роль каталазы, пероксидазы и цитохромов.
На занятии студенты пишут обучающий тест.
На занятии студенты выполняют лабораторную работу: 1) цветные реакции на белки и аминокислоты; 2) качественные реакции на индикан и фенилпировиноградную кислоту.
Формулы, необходимые для запоминания:
· Азотистые основания: аденин, гуанин, урацил, тимин, цитозин.
· Схема строения мононуклеотида.
· Дисахаридные единицы гиалуроновой кислоты и хондроитин-4-сульфата.
Литература: Пустовалова Л.М. Основы биохимии для медицинских колледжей. Изд. Феникс, 2003, с.44-62; Кухта В.К. и соав. Основы биохимии. — М., Медицина, 1999, с.69-86, 33-34, 209-215, 299-302; Кухта В.К. и соав. Основы биохимии. — М., Медицина, 2007, с. 75-94,37-39, 220-226, 310-311. Конспекты лекций по курсу биохимии и практический занятий по темам; «Химия углеводов» и «Химия липидов».
Cпециальность 0407 «Лабораторная диагностика».
ПМ 03 «Проведение лабораторных биохимических исследований»
ЗАНЯТИЕ № 4: «Свойства белков. Качественные реакции на белки и аминокислоты»
Методические указания для выполнения самостоятельной лабораторной работы студентами.
РАБОТА 1. Цветные реакции на белки и аминокислоты.
Теоретическая часть. Цветные реакции лежат в основе качественных проб, полуколичественных и количественных методов определения белков, аминокислот и продуктов их обмена в биологических жидкостях.
Практическая часть.Провести цветные реакции на белки и аминокислоты, оформить протокол:
4. Результаты записать в таблицу:
| № п/п | Название реакции | Что открывают | Реактивы и условия | Наблюдаемый результат |
1.1. Биуретовая реакция на белки и пептиды. Принцип: в щелочной среде раствор белка при добавлении разбавленного раствора сульфата меди окрашивается в сине-фиолетовый цвет; окраска обусловлена образованием комплексов ионов меди с пептидными группами белка; биуретовую реакцию дают все белки, а также олигопептиды, содержащие не менее двух пептидных связей. Ход работы.К 5 каплям 1%-го раствора яичного белка вносят 3 капли 10%-го раствора NaOH и 1 каплю 1%-го раствора CuSO4. Наблюдают образование сине-фиолетового окрашивания.
1.2. Нингидриновая реакция. Принцип:при нагревании нингидрин образует с NH3 , который выделяется при гидролизе из α-аминогрупп аминокислот, соединение сине-фиолетового цвета.Ход работы:к 5 каплям 1%-го раствора яичного белка добавляют 5 капель раствора 0,5%-го раствора нингидрина; помещают пробирку в кипящую водя-ную баню на 5 мин. Наблюдают за развитием розово-фиолетового окрашивания, переходящего со временем в сине-фиолетовое.
1.3. Ксантопротеиновая реакция на ароматические аминокислоты (тирозин, фенилаланин, триптофан). Принцип:при нагревании с концентрированной азотной кислотой растворы белка дают желтое окрашивание; реакция обусловлена наличием в белках ароматических аминокислот и основана на образовании нитропроизводных этих аминокислот.
Ход работы. К 5 каплям 1%-го раствора яичного белка добавляют 3 капли кон-центрированной HNO3 и нагревают (осторожно!) в горячей водяной бане; появ-ляется осадок желтого цвета, пробирку охлаждают и добавляют 10 капель 10% NaOH – появляется оранжевое окрашивание.
1.3. Реакция Адамкевича на триптофан.Принцип: триптофан в кислой среде вступает в реакцию с глиоксиловой кислотой (альдегидами), образуя при этом окрашенные в красно-фиолетовый цвет продукты конденсации. Ход работы. К 5 каплям 1%-го раствора яичного белка добавляют 5 капель ледяной уксусной кислоты, которая всегда содержит небольшое количество глиоксиловой кислоты. Полученную смесь вначале нагревают 1-2 мин на водяной бане, затем охлаждают и по стенке пробирки осторожно, по каплям, чтобы жидкости не смешивались, добавляют 10 капель концентрированной серной кислоты. Помещают пробирку в кипящую водяную баню. Наблюдают образование красно-фиолетового кольца на границе раздела двух слоев.
1.4. Реакция Фоля на цистеин. Принцип: цистеин, содержащий сульфгидрильную группу (-SH), при нагревании подвергается гидролизу с образованием сульфида свинца Nа2S. Ацетат свинца реагирует со щелочью с образованием плюмбита натрия:
(CH3COO)2Pb + 2NaOH → Pb(ONa)2 + 2CH3COOH
Сульфид натрия при взаимодействии с плюмбитом дает черный (или бурый) осадок сульфида свинца: Na2S + Pb(ONa)2 + 2Н2О → PbS↓ + 4NaOH.
Ход работы. К 5 каплям раствора яичного белка добавляют 5 капель 30%-ного раствора NaOH и 1 каплю 5% -ного раствора (CH3COO)2Pb. Помещают в кипящую водяную баню на 2-3 мин. Наблюдают появление черного или бурого осадка.
Практическое значение цветных реакций на белки и аминокислоты:
Ø Биуретовая реакция используется для качественного и количественного определения белка в биологических жидкостях.
Ø Нингидриновая реакция используется для качественного и количественного определения свободных аминокислот в биологических жидкостях.
Ø Цветные реакции на отдельные аминокислоты используются для изучения химического состава белков.
Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:
Лучшие изречения: Как то на паре, один преподаватель сказал, когда лекция заканчивалась — это был конец пары: «Что-то тут концом пахнет». 8101 — 
| 7770 — 
или читать все.
193.124.117.139 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.
Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)
очень нужно
источник
Аминокислоты можно обнаружить с помощью цветных реакций: нингидриновой, ксантопротеиновой, Фоля, Милона, биуретовой пробы и др. Эти реакции неспецифичны, т.к. основаны на обнаружении отдельных фрагментов в структуре аминокислот, которые могут встречаться и в других соединениях.
Нингидриновая реакция, цветная реакция, применяемая для качественного и количественного определения аминокислот, иминокислот и аминов. При нагревании в щелочной среде нингидрина (трикетогидринденгидрата, С9НбО4) с веществами, имеющими первичные аминогруппы (—NH2), образуется продукт, который имеет устойчивую интенсивную сине-фиолетовую окраску с максимальным поглощением около 570 нм. Т. к. поглощение при этой длине волны линейно зависит от числа свободных аминогрупп, нингидриновая реакция послужила основой для их количественного определения методами колориметрии или спектрофотометрии. Эта реакция используется также для определения вторичных аминогрупп (>NH) в иминокислотах — пролине и оксипролине; в этом случае образуется продукт ярко-жёлтого цвета. Чувствительность — до 0,01%. Современный автоматический аминокислотный анализ проводят, сочетая ионообменное разделение аминокислот и количественное определение их с помощью нингидриновой реакции. При разделении смесей аминокислот методом бумажной хроматографии позволяет определять каждую аминокислоту в количестве не менее 2—5 мкг.
По интенсивности окраски можно судить о количестве аминокислот.
Эта реакция положительна не только со свободными аминокислотами, но и пептидами, белками и др.
Ксантопротеиновая реакция позволяет обнаружить ароматические аминокислоты (фенилаланин, тирозин, гистидин, триптофан), основана на реакции электрофильного замещения в ароматическом ядре (нитрование).
При действии концентрированной азотной кислоты, например, на тирозин образуется продукт, окрашенный в желтый цвет.
Реакция Фоля. Это реакция на цистеин и цистин. При щелочном гидролизе «слабосвязанная сера» в цистеине и цистине достаточно легко отщепляется, в результате чего образуется сероводород, который, реагируя со щелочью, дает сульфиды натрия или калия. При добавлении ацетата свинца(II) образуется осадок сульфида свинца(II) серо-черного цвета.
Описание опыта. В пробирку наливают 1 мл раствора цистина, прибавляют 0,5 мл 20%-го раствора гидроксида натрия. Смесь нагревают до кипения, а затем добавляют 0,5 мл раствора ацетата свинца(II). Наблюдается выпадение серо-черного осадка сульфида свинца(II):
Реакция Циммермана. Это реакция на аминокислоту глицин.
Описание опыта. К 2 мл 0,1%-го раствора глицина, доведенного добавлением 10%-го раствора щелочи до рН = 8, приливают 0,5 мл водного раствора о-фталевого диальдегида. Реакционная смесь начинает медленно окрашиваться в ярко-зеленый цвет. Через несколько минут выпадает зеленый осадок.
Реакция на триптофан. Триптофан, реагируя в кислой среде с альдегидами, образует окрашенные продукты конденсации. Например, с глиоксиловой кислотой (являющейся примесью к концентрированной уксусной кислоте) реакция протекает по уравнению:
По аналогичной схеме протекает и реакция триптофана с формальдегидом.
Реакция Сакагучи. Эта реакция на аминокислоту аргинин основана на взаимодействии аргинина с α-нафтолом в присутствии окислителя. Ее механизм еще полностью не выяснен. По-видимому, реакция осуществляется по следующему уравнению:
Поскольку производные хинониминов (в данном случае нафтохинона), у которых водород иминогруппы –NH– замещен на алкильный или арильный радикал, всегда окрашены в желто-красные тона, то, по-видимому, оранжево-красный цвет раствора при проведении реакции Сакагучи объясняется возникновением именно производного нафтохинонимина. Не исключена, однако, вероятность образования еще более сложного соединения за счет дальнейшего окисления оставшихся NH-групп аргининового остатка и бензольного ядра α-нафтола:
Описание опыта. В пробирку наливают 2 мл 0,01%-го раствора аргинина, затем добавляют 2 мл 10%-го раствора едкого натра и несколько капель 0,2% спиртового раствора α-нафтола. Содержимое пробирки хорошо перемешивают, приливают 0,5 мл раствора гипобромита и вновь перемешивают. Немедленно добавляют 1 мл 40%-го раствора мочевины для стабилизации быстро развивающегося оранжево-красного окрашивания.
Биуретовая реакция – используется как цветная реакция на белки. В щелочной среде в присутствии солей меди(II) они дают фиолетовое окрашивание. Окраска обусловлена образованием комплексного соединения меди(II), за счет пептидной группы -СО-NH- , которая характерна для белков. Свое название эта реакция получила от производного мочевины — биурета, который образуется при нагревании мочевины с отщеплением аммиака:
Кроме белков и биурета такое же окрашивание дают и другие соединения, содержащие -эту группу: амиды, имиды карбоновых кислот, а также соединения, содержащие в молекуле группы -CS-NH- или =CH-NH-. Также реакцию дают белки, некоторые аминокислоты, пептиды, биурет и средние пептоны.
Цвет комплекса, получаемый при биуретовой реакции с различными пептидами, несколько отличается и зависит от длины пептидной цепи. Пептиды с длиной цепи от четырех аминокислотных остатков и выше образуют красный комплекс, трипептиды – фиолетовый, а дипептиды – синий.
кетонная форма полипептида
енольная форма полипептида
При взаимодействии полипептида с Cu (OH)2 образуется комплекс, строение которого можно показать так:
источник
Присутствие белков в пищевых объектах устанавливается с помощью качественных реакций, которые условно разделяют на две группы: а) цветные реакции; б) реакции осаждения.
Среди первой группы различают универсальные реакции (биуретовая на пептидные связи и нингидриновая на α-аминокислоты) и специфические, обусловленные присутствием в белках остатков определенных аминокислот. Так, ксантопротеиновая реакция свидетельствует о наличии в белках остатков ароматических аминокислот, реакция Паули – гистидина и тирозина, Адамкевича и Вуазене – триптофана, нитропруссидная – цистеина, а реакция Сакагучи – аргинина. По результатам специфических реакций ориентировочно можно судить о пищевой ценности белков.
Во второй группе реакций белки осаждают действием солей, органических растворителей, концентрированных кислот, щелочей, ионов тяжелых металлов, температуры и в изоэлектрической точке. Белки в растворенном состоянии крайне неустойчивы, поэтому при добавлении органических растворителей (спирт, ацетон), концентрированных растворов нейтральных солей щелочных металлов и воздействии физических факторов (нагревание, облучение, ультразвук) гидратная оболочка разрушается и они выпадают в осадок.
Так как белковые вещества сырья (муки, крупы, молока, мяса), включая ферменты, часто являются определяющими в обеспечении качества пищевых изделий, то для изучения физико-химических, биохимических и физиологических свойств этих соединений обязательным условием является получение белков в индивидуальном и, по возможности, неденатурированном состоянии. Белки обычно теряют природные (нативные) свойства (растворимость, гидратацию, ферментативную активность и т.д.), подвергаясь денатурации под влиянием различных факторов. Типичным примером необратимой денатурации белков является выпадение их в осадок под действием ТХУ. Длительный контакт со спиртом также приводит к необратимой денатурации белка. Денатурирующее действие различных факторов на белки можно смягчить, если проводить операции выделения их при температуре не выше +4°С.
Методы выделения и очистки белков. Общая схема операций по выделению белков сводится к измельчению биологического материала (гомогенизации), экстрагированию и собственно выделению, то есть очистке и получению белка в индивидуальном состоянии. При изучении метаболических процессов в живых организмах (в созревшем зерне, плодах, овощах) морфологическая и биохимическая целостность клеток и тканей сохраняется в максимальной степени, тогда как при исследовании состава сырья и готовых пищевых продуктов потеря целостности структуры несущественна. Гомогенизацию объектов следует рассматривать как начальную стадию выделения белков, но способ ее определяется постановкой задачи. Например, анализ ферментов из растительных материалов часто затруднен тем, что при гомогенизации экстрагируется большое количество фенолов, которые взаимодействуют с карбонильными группами пептидных групп при помощи водородных связей и вызывают денатурацию белка и потерю ферментами своей активности. Добавление в экстракт поливинилпирролидона, образующего с фенолами нерастворимые комплексы, предотвращает инактивацию ферментов.
Разрушение клеточной структуры осуществляется тщательным измельчением материала в гомогенизаторах, мельницах, попеременным замораживанием и оттаиванием, применением ультразвуковых высокочастотных колебаний, пресс-методов с использованием высоких давлений и метода «азотной бомбы». В последнем случае клетки насыщаются азотом под давлением, которое затем сбрасывается и клетки разрушаются. Эффективность гомогенизации зависит не только от способа разрушения клеточных структур, но и от вида анализируемого материала. Животные клетки разрушаются относительно легко, особенно в отсутствие сосудистой и соединительной ткани, тогда как растительные и микробные – из-за присутствия клеточных стенок – трудно. В таком случае применяют методы растирания материала с твердыми веществами (песок, абразивный порошок) или обработку клеточных стенок лизоцимом или ферментными препаратами, содержащими целлюлазу, хитиназу и липазу. Гомогенизацию рекомендуется проводить в холодных комнатах или с использованием льда.
Экстракция белков может быть совмещена с гомогенизацией клеток и тканей либо проведена отдельно, если продукт заранее измельчен. Для определения ферментативной активности белка достаточно одноразовой экстракции, тогда как для количественного определения белковых фракций зерна – трех- или пятикратной. Условия экстрагирования белков (время, гидромодуль, температура и т.д.) подбираются эмпирически, основываясь на методиках ведущих научных школ.
Большинство белков животных тканей хорошо растворимы в 5–10% растворах солей, тогда как для перевода в раствор белков зерновых культур применяют более широкий набор растворителей. Для этого используются буферные системы со значениями рН от кислых до слабощелочных (фосфатные, боратные, цитратные, трис-HCl), органические растворители и неионные детергенты, разрывающие белок-липидные или белок-белковые связи:
Растворители подбираются с учетом разрыва в белках определенных типов связей. Так, уксусная кислота ослабляет ионные связи, сообщая молекулам одноименные положительные заряды, мочевина – водородные и гидрофобные, салицилат натрия и ДДС-Na – гидрофобные и ионные, а водные растворы спиртов – водородные и гидрофобные взаимодействия. Органические растворители разрывают белок-липидные связи.
При изучении физико-химических свойств белков и их превращений в пищевых системах широко используют методы фракционирования и очистки от небелковых соединений. Они основаны на различиях таких свойств белков, как размер молекул, растворимость, заряд и сродство к специфическим химическим группам.
Осаждение белков из раствора под действием солей щелочных и щелочноземельных металлов называют высаливанием. Для высаливания чаще применяется сульфат аммония, под влиянием которого белки, как правило, сохраняют растворимость и ферментативную активность. Главную роль при высаливании играет не природа солей, а валентность ионов, действие которых оценивается по ионной силе (μ):
где С – концентрация каждого вида иона; V – валентность ионов.
Глобулины выпадают в осадок при 50% насыщении, альбумины – при 100% насыщении растворов солей, а при ступенчатом фракционировании (20–100% насыщения) выпадают белки и других классов (проламины, глютелины).
В практике выделения и очистки белков используются различные типы хроматографии: адсорбционная, распределительная, ионообменная и хроматография по сродству. Адсорбционная хроматография основана на различиях в полярности белков. В колонке вместе с буферным раствором упаковывают адсорбент, на который в небольшом объеме растворителя наносят исследуемый образец. Компоненты разделяемой смеси адсорбируются, затем элюируются с помощью буферного раствора с увеличивающейся концентрацией или полярностью. Фракции белка собирают с помощью автоматического коллектора фракций.
В распределительной хроматографии, в отличие от адсорбционной, в качестве неподвижной фазы выступает водный слой, удерживаемый твердой фазой (силикагель, бумага). Разделяемые вещества многократно распределяются между водным слоем и движущейся фазой растворителя и с разной скоростью перемещаются подлине колонки или бумаге. Распределительную хроматографию на бумаге часто используют для анализа пептидов и аминокислот. Адсорбентом служат нити целлюлозы, а растворителем – смесь органических растворителей, например: бутиловый спирт–уксусная кислота–вода. Хроматограмму проявляют, высушивают и анализируют местонахождение разделяемых компонентов тем или иным способом.
Методом ионообменной хроматографии белки или аминокислоты разделяют на основе различий в общем заряде молекул. Если белок в нейтральной среде (рН 7) имеет положительный заряд, то он связывается на колонке с ионообменником, содержащим фенольные, сульфо- и карбоксильные группы (катионообменник), если отрицательный, то – на колонке с ионообменником, представленным аминами или органическими основаниями (анионообменник). Чаще всего для фракционирования белков используют производные полистирола и целлюлозы:
Положительно заряженный белок снимается с колонки с помощью раствора хлористого натрия или изменением рН элюирующего буфера. При этом ионы натрия конкурируют с положительно заряженными группами белков. Белки с меньшим положительным зарядом вымываются с колонки первыми, с большим зарядом – последними.
Хроматография по сродству (аффинная хроматография,) основана на принципе избирательного связывания белков со специфическими веществами (лигандами), прикрепленными к носителю. Лиганд (глюкозу) ковалентно присоединяют к носителю (проводят иммобилизацию) и наносят на колонку исследуемую белковую смесь. Несвязавшиеся белки удаляют соответствующим буфером, а нужный белок элюируют раствором, содержащим лиганд в очень высокой концентрации. При этом присоединенные к колонке остатки глюкозы в молекуле белка замещаются на глюкозу, находящуюся в растворе (рис. 2.20).
ис. 2.20. Хроматография по сродству (афинная хроматография)
Рис. 2.21. Распределение молекул белка среди гранул сефадекса
Гель-фильтрация, или метод молекулярных сит заключается в пропускании белков через колонку с гелем сефадекса или других типов (агарозных, полистирольных). Применяются также пористые стеклянные шарики и пористый кварц (порасил). Наибольшее распространение получили декстрановые гели (сефадекс), являющиеся продуктом поперечного сшивания полисахаридных цепочек декстрана. Зерна сефадексов разных номеров содержат поры разных размеров, в которые могут проникать белки с определенной молекулярной массой. Низкомолекулярные белки распределяются в растворенном виде как внутри частиц полимера, так и между ними, а высокомолекулярные – только между частицами, поэтому вторые быстрее проходят через колонку и первыми вытекают из нее (рис. 2.21). В итоге белки распределяются по молекулярной массе и могут быть собраны в виде отдельных хроматографических фракций (рис. 2.22).
Рис. 2.22. Картина распределения смеси веществ, различающихся по молекулярным массам, при методе гель-фильтрации
Принцип методов электрофоретического разделения заключается в способности молекул пептидов и аминокислот, находясь в заряженной форме в виде катионов (+) или анионов (–), передвигаться в электрическом поле с определенной скоростью. Кроме того, молекулы с близкими зарядами, но разными размерами, отличаются отношением заряда к массе. Все эти различия и обуславливают высокую разрешающую способность электрофоретических методов. Скорость миграции белков в электрическом поле (V) зависит от напряжения электрического поля(ε), заряда белков (z) и сопротивления трения (О-Сопротивление трения определяется размерами, формой белка, значениями рН и концентрацией буфера. Указанные величины связаны между собой соотношением: V = ε · z / f.
Впервые метод электрофореза был разработан Тизелиусом с применением бумаги в качестве носителя и специальных оптических устройств, регистрирующих передвижение границы раздела раствора белка и растворителя по показателям преломления (фронтальный электрофорез). В настоящее время распространены методы зонального электрофореза, предусматривающие использование крахмальных и полиакриламидных гелей (ПААГ). Наиболее распространенным методом фракционирования белков является диск-электрофорез (от англ, discontinuous – прерывистый) в ПААГ, при котором используется пара буферных растворов с различными значениями рН в присутствии ДДС-Na и гели различной пористости (концентрирующие и разделяющие) (Laemmli, 1970). Для обнаружения белков гели обрабатывают красителями: амидовым черным 10В, кумасси синим R-250. Интенсивность окраски, а по ней количественное содержание белковых фракций, определяют сканированием на денситометре.
Для электрофоретического разделения белков и пептидов успешно применяется двумерный электрофорез в ПААГ. В соответствии с этим методом смесь компонентов разделяют сначала в столбиках геля электрофорезом в горизонтальном направлении, затем в гелевых пластинах – в вертикальном (рис. 2.23). При разделении белков, например гороха, этим методом удалось получить более 150 различных компонентов.
Очень высокую разрешающую способность имеет метод изоэлектрического фокусирования белков, в основе которого лежит фронтальный электрофорез, проводимый на колонке одновременно в градиенте рН и напряжения. Колонку предварительно заполняют носителями с синтетическими смесями полиаминополикарбоновых кислот (амфолитами), затем сверху в нее подают раствор сильной кислоты, снизу – сильнощелочной раствор для того, чтобы установить градиент рН с крайними значениями, соответствующими рН кислого и щелочного растворов. Амфолиты прекращают движение по колонке, когда их суммарный заряд становится равным нулю, и тем самым стабилизируют исходный градиент рН. В подготовленную колонку вносят образец исследуемой смеси, компоненты которой распределяются по зонам со значениями рН, характерными их изоэлектрическим точкам.
В химии пищевого белка применяют и другие разновидности электрофоретическогоразделения(иммуноэлектрофорез, изотахофорез), а также метод пептидных карт и ультрацентрифугирование. Метод пептидных карт (отпечатков пальцев) относится к методам двумерного разделения и наиболее часто используется для анализа пептидов. Пептиды получают избирательным гидролизом белков, затем на бумаге их разделяют в горизонтальном направлении электрофорезом, в вертикальном – распределительной хроматографией. Пептиды окрашивают нингидрином, элюируют и определяют аминокислотный состав.
В методе ультрафильтрации белки в градиенте плотности распределяются на разных уровнях центрифужной пробирки в процессе седиментации (осаждения) в виде отдельных зон. Для создания градиента используют соли тяжелых металлов и растворы сахарозы. Метод широко применяется для определения молекулярных масс белков по константе седиментации (S), которая зависит от массы и формы белковых частиц:
где v – скорость перемещения границы растворитель–белок, см/с; w– угловая скорость ротора, рад/с; г – расстояние от центра ротора до середины ячейки с раствором белка.
Величина S, равная 1 · 10 -13 с, принята за единицу и названа сведбергом (S) в честь Т. Сведберга, впервые сконструировавшего ультрацентрифугу. Очистка белков от низкомолекулярных соединений (солей, сахаров, аминокислот) осуществляется методами диализа, гель-фильтрации на сефадексе G-25, кристаллизации, ультрафильтрации и с помощью полых волокон. При диализе используют полупроницаемые мембраны (целлофан, коллодийная пленка), через которые белки не диффундируют и остаются внутри диализного мешочка. Более мелкие молекулы проходят через поры диализной мембраны и выходят в диализат. В методе ультрафильтрации, который применяется, например, в производстве сывороточных белков молока, соевых белковых изолятов, по обе стороны мембраны создается разность давлений за счет продавливания фильтруемого белкового раствора. В качестве мембран используются целлюлозные пленки и нецеллюлозные полиэлектролитные комплексы. Аналогично мембранам по принципу молекулярного сита действуют и полые волокна. Белковый раствор помещается с внешней стороны волокон, и создается разность давления за счет повышения его в растворе или понижения внутри их.
Гомогенность белка определяется на последнем этапе выделения и очистки с применением по меньшей мере двух методов, оценивающих то или иное физико-химическое свойство. Наиболее достоверными являются ультрацентрифугирование в градиенте плотности, диск-электрофорез в ПААГ, иммунохимические методы и растворимость. Если белок при электрофорезе представлен только одной полосой и обладает при этом максимальной биологической активностью, то он считается гомогенным. Для гомогенного белка на кривой растворимости (зависимости растворенного белка от общего его количества в постоянном объеме растворителя) имеется только один перегиб, тогда как для гетерогенного – столько, сколько в нем индивидуальных компонентов.
Содержание белка в пищевых объектах обычно определяют по количеству азота с использованием метода Кьельдаля. С целью упрощения и сокращения длительности анализа этот метод с момента его разработки (1983) неоднократно модифицировался с применением различных катализаторов и условий минерализации. На основе модифицированных методов созданы высокопроизводительные автоматические анализаторы типа «Кьельфос», стоимость определения содержания белка на которых и сегодня остается высокой. Существует и некоторая условность в методе Кьельдаля при расчете количества белка, заключающаяся в использовании переводного коэффициента. Однако, несмотря на недостатки, метод Кьельдаля является унифицированным, он включен в ГОСТы на многие пищевые продукты.
Для перевода количества азота в содержание белка используют коэффициент 6,25. Принят он потому, что большинство белков содержит 16% азота (100/6,25 = 16). Однако более правильным является использование коэффициентов, соответствующих фактическому содержанию сырого белка в каждом его виде. Так, для пшеницы получен коэффициент 5,7, так как ее белки содержат 17,5% азота. Для других белковых ресурсов коэффициенты перевода приняты следующими: 5,7 – рожь, ячмень, овес, семена подсолнечника; 5,8 – соя; 6,25 – кукуруза, мясо; 6,38 – молоко.
Имеются и другие методы определения азота, такие как метод Дюма, нейтронно-активационный и с фенолятгипохлоритом на приборе «Техникон». Принцип метода Дюма заключается в разложении органического соединения в атмосфере оксида углерода до газообразного состояния с последующим измерением объема азота (N2). В нейтронно-активационном методе атомы азота образца бомбардируются нейтронами в ядерном реакторе с получением изотопа 13 N. Содержание белка рассчитывают по количеству гамма-лучей. Определение азота на приборе «Техникон» осуществляется колориметрическим способом, в котором измеряется интенсивность сине-голубой окраски, образующейся по реакции взаимодействия сульфата аммония, выделяющегося в процессе минерализации образца, с щелочным раствором фенола и гипохлорита. Все описанные здесь методы по точности анализа не уступают методу Кьельдаля, однако они являются достаточно дорогими.
Широкое распространение получил метод инфракрасной спектроскопии, в основе которого лежит поглощение белками света с определенной длиной волны и измерение интенсивности его отражения в приборах-анализаторах. Приборы калибруют по образцам зерна (эталонам) с известным содержанием белка, определяемым по методу Кьельдаля.
Известны методы количественного определения белка, основанные на различной степени помутнения (нефелометрический метод), способности белков адсорбировать красители (кумасси синий R-250, амидочерный и др.) и преломлять лучи света (по показателю преломления). Они характеризуются высокой точностью и простотой определения, хотя имеют ряд ограничений. Наиболее удобными являются методы с кумасси синим, биуретовый и Лоури. В основе биуретового метода лежит биуретовая реакция, в основе метода Лоури – восстановление фосфомолибденовой кислоты тирозином и триптофаном с одновременным протеканием биуретовой реакции. По оптической плотности с использованием калибровочных графиков находят концентрацию белка в растворах.
источник
РЕАКЦИЯ ПИОТРОВСКОГО (БИУРЕТОВАЯ РЕАКЦИЯ)
В белках аминокислоты связаны друг с другом по типу полипептидов и дикетопиперазинов. Образование полипептидов из аминокислот происходит путем отщепления молекулы воды от аминогруппы одной молекулы аминокислоты и карбоксильной группы другой молекулы:
Образующаяся группа –С(О)–NН– называется пептидной группой, связь С–N, соединяющая остатки млекул аминокислот, – пептидной связью.
При взаимодействии дипептида с новой молекулой аминокислоты получается трипептид и т. д.
Дикетопиперазины образуются при взаимодействии двух молекул аминокислот с отщеплением двух молекул воды:
Дикетопиперазины были выделены из белков Н.Д.Зелинским и В.С.Садиковым в 1923 г.
Наличие в белке повторяющихся пептидных групп подтверждается тем, что белки дают фиолетовое окрашивание при действии небольшого количества раствора медного купороса в присутствии щелочи (биуретовая реакция).
Описание опыта. 2–3 мл раствора белка нагревают с 2–3 мл 20%-го раствора едкого кали или натра и несколькими каплями раствора медного купороса. Появляется фиолетовое окрашивание вследствие образования комплексных соединений меди с белками.
- РЕАКЦИЯ РУЭМАННА (НИНГИДРИНОВАЯ РЕАКЦИЯ (1911))
a -Аминокислоты реагируют с нингидрином, образуя сине-фиолетовый комплекс (пурпур Руэманна), интенсивность окраски которого пропорциональна количеству аминокислоты.
Реакция с нингидрином используется для визуального обнаружения a -аминокислот на хроматограммах (на бумаге, в тонком слое), а также для колориметрического определения концентрации аминокислот по интенсивности окраски продукта реакции.
Описание опыта. В пробирку наливают 1 мл 1%-го раствора глицина и 0,5 мл 1%-го раствора нингидрина. Содержимое пробирки осторожно нагревают до появления сине-фиолетового окрашивания.
- Реакция Сакагучи
Эта реакция на аминокислоту аргинин основана на взаимодействии аргинина с a -нафтолом в присутствии окислителя. Ее механизм еще полностью не выяснен. По-видимому, реакция осуществляется по следующему уравнению:
Поскольку производные хинониминов (в данном случае нафтохинона), у которых водород иминогруппы –NH– замещен на алкильный или арильный радикал, всегда окрашены в желто-красные тона, то, по-видимому, оранжево-красный цвет раствора при проведении реакции Сакагучи объясняется возникновением именно производного нафтохинонимина. Не исключена, однако, вероятность образования еще более сложного соединения за счет дальнейшего окисления оставшихся NH-групп аргининового остатка и бензольного ядра a -нафтола:
Описание опыта. В пробирку наливают 2 мл 0,01%-го раствора аргинина, затем добавляют 2 мл 10%-го раствора едкого натра и несколько капель 0,2% спиртового раствора a -нафтола. Содержимое пробирки хорошо перемешивают, приливают 0,5 мл раствора гипобромита и вновь перемешивают. Немедленно добавляют 1 мл 40%-го раствора мочевины для стабилизации быстро развивающегося оранжево-красного окрашивания.
- РЕАКЦИЯ ФОЛЯ
Это реакция на цистеин и цистин. При щелочном гидролизе «слабосвязанная сера» в цистеине и цистине достаточно легко отщепляется, в результате чего образуется сероводород, который, реагируя со щелочью, дает сульфиды натрия или калия. При добавлении ацетата свинца(II) образуется осадок сульфида свинца(II) серо-черного цвета.
Описание опыта. В пробирку наливают 1 мл раствора цистина, прибавляют 0,5 мл 20%-го раствора гидроксида натрия. Смесь нагревают до кипения, а затем добавляют 0,5 мл раствора ацетата свинца(II). Наблюдается выпадение серо-черного осадка сульфида свинца(II):
- РЕАКЦИЯ С ФОРМАЛЬДЕГИДОМ
При взаимодействии a -аминокислот с формальдегидом образуются относительно устойчивые карбиноламины – N-метилольные производные, содержащие свободную карбоксильную группу, которую затем титруют щелочью:
Эта реакция лежит в основе количественного определения a -аминокислот методом формального титрования (метод Сёренсена).
Описание опыта. В пробирку наливают 5 капель 1%-го раствора глицина и прибавляют 1 каплю индикатора метилового красного. Раствор окрашивается в желтый цвет (нейтральная среда). К полученной смеси добавляют равный объем 40%-го раствора формальдегида (формалин). Появляется красное окрашивание (кислая среда):
- РЕАКЦИЯ Циммермана
Это реакция на аминокислоту глицин.
Описание опыта. К 2 мл 0,1%-го раствора глицина, доведенного добавлением 10%-го раствора щелочи до рН = 8, приливают 0,5 мл водного раствора о-фталевого диальдегида. Реакционная смесь начинает медленно окрашиваться в ярко-зеленый цвет. Через несколько минут выпадает зеленый осадок.
- ОБРАЗОВАНИЕ КОМПЛЕКСОВ С МЕТАЛЛАМИ
a -Аминокислоты образуют с катионами тяжелых металлов внутрикомплексные соли. Со свежеприготовленным гидроксидом меди(II) все a -аминокислоты в мягких условиях дают хорошо кристаллизующиеся внутрикомплексные (хелатные) соли меди(II) синего цвета:
В таких солях ион меди координационными связями соединен с аминогруппами.
Описание опыта. В пробирку наливают 3 мл 3%-го раствора сульфата меди(II), добавляют несколько капель 10%-го раствора гидроксида натрия до образования голубого осадка. К полученному осадку гидроксида меди(II) приливают 0,5 мл концентрированного раствора глицина. При этом образуется темно-синий раствор глицината меди:
- КСАНТОПРОТЕИНОВАЯ РЕАКЦИЯ
Эта реакция используется для обнаружения a -аминокислот, содержащих ароматические радикалы. Тирозин, триптофан, фенилаланин при взаимодействии с концентрированной азотной кислотой образуют нитропроизводные, имеющие желтую окраску. В щелочной среде нитропроизводные этих a -аминокислот дают соли, окрашенные в оранжевый цвет.
Описание опыта. В пробирку наливают 1 мл раствора тирозина и добавляют 0,5 мл концентрированной азотной кислоты. Смесь нагревают до появления желтой окраски. После охлаждения добавляют 1–2 мл 20%-го раствора гидроксида натрия до появления оранжевой окраски раствора:
- ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКА СОЛЯМИ ТЯЖеЛЫХ МЕТАЛЛОВ
Описание опыта. В две пробирки наливают по 1–2 мл раствора белка и медленно, при встряхивании, добавляют по каплям в одну пробирку насыщенный раствор сульфата меди, а в другую – 20%-й раствор ацетата свинца. Образуются осадки труднорастворимых солеобразных соединений белка. Опыт иллюстрирует применение белка как противоядия при отравлении солями тяжелых металлов.
- Открытие аминного азота в белках
Описание опыта. В сухую пробирку помещают немного сухого белка, например желатины. Прибавляют пятикратное количество натронной извести (смесь едкого натра и гидроксида кальция), перемешивают встряхиванием и подогревают. Выделяется аммиак, вызывающий посинение розовой лакмусовой бумажки, смоченной водой. Одновременно ощущается запах жженого волоса, что всегда наблюдается при сжигании белковых веществ.
- Открытие серы в белках
Описание опыта. В пробирку наливают около
0,5 мл раствора уксуснокислого свинца и прибавляют раствор едкого кали до растворения образовавшегося осадка гидроксида свинца. В другую пробирку наливают
2–3 мл раствора белка и приливают такой же объем полученного раствора плюмбита. Нагревают смесь до кипения в течение 2–3 мин. Появление темного окрашивания указывает на образование сульфида свинца.
- РЕАКЦИЯ НА ПРИСУТСТВИЕ СЕРОСОДЕРЖАЩИХ a -АМИНОКИСЛОТ В БЕЛКЕ
Качественной реакцией на серосодержащие a -аминокислоты является реакция Фоля. Белки, содержащие остатки цистеина или цистина, также дают эту реакцию.
Описание опыта. В пробирку наливают 10 капель раствора яичного белка и вдвое больший объем 20%-го раствора гидроксида натрия. Содержимое пробирки нагревают до кипения (1–2 мин). К полученному щелочному раствору добавляют 5 капель раствора ацетата свинца(II) и вновь кипятят реакционную смесь. Наблюдается появление серо-черного осадка.
- РЕАКЦИЯ НА ТРИПТОФАН
Триптофан, реагируя в кислой среде с альдегидами, образует окрашенные продукты конденсации. Например, с глиоксиловой кислотой (являющейся примесью к концентрированной уксусной кислоте) реакция протекает по уравнению:
По аналогичной схеме протекает и реакция триптофана с формальдегидом.
В ходе проведенного исследования мы выявили по литературным источникам имеющуюся информацию о цветных качественных реакциях на белковые аминокислоты; выполнили ряд перечисленных реакций и составили базу данных. Эта база может быть использована в школьной практике как в теоретическом плане, так и в практическом, т. к. мы приводим краткие, но подробные описания выполнения всех опытов.
Из предложенных 18 качественных реакций каждая практически осуществима в школьном курсе химии и имеет важное практическое значение. Сопровождение реакций химическими уравнениями конкретизирует и углубляет знания по биологической и органической химии, особенно знания учащихся специализированных биологических и химических классов.
Использованная литература
Ермаков А.Н., Арасимович В.В., Смирнова-Иконникова М.И., Мирри И.К. Методы биохимического исследования растений. М.,1952, 520 с.
Полянская А.С., Шевелева А.О. Методическая разработка по лабораторным работам: «Аминокислоты» и «Белки». Л., 1976, 37 с.
Пустовалова Л.М. Практикум по биохимии. 1999, 541 с.
Руководство к практическим занятиям по органической химии. Под ред. В.М.Родионова. М., 1954, 111 с.
Соловьев Н.А. Лабораторные работы по биологической химии. Методическая разработка. СПб., 1996, 70 с.
Филиппович Ю.Б., Егорова Т.А., Севастьянова Г.А. Практикум по общей биохимии. М., 1982, 311 с.
З.Саитов, С.В.Телешов, Б.Харитонцев,
секция «Юный химик» РХО им. Д.И.Менделеева (г. Тобольск)
источник
Раздел 1. Строение, свойства и функции белков
Тема 1.1. Строение и классификация аминокислот. Структура белков 6
Тема 1.2. Структура и физико-химические свойства белков 11
Тема 1.3. Классификация белков. Строение и функции белков в организме. Сложные белки 16
Раздел 2. Строение, классификация и роль витаминов
Тема 2.1. Жирорастворимые витамины 22
Тема 2.2. Водорастворимые витамины 27
Тема 3.1. Строение и свойства ферментов. Регуляция активности ферментов 36
Тема 3.2. Классификация и номенклатура ферментов. Использование ферментов в медицине 45
Контрольные вопросы к итоговому занятию
Раздел 4. Биологическое окисление
Тема 4.1. Общие пути катаболизма: окислительное декарбоксилирование пирувата. Цикл трикарбоновых кислот. Ферменты дыхательной цепи. Окислительное фосфорилирование (семинар) 54
Раздел 5. Обмен аминокислот и белков
Тема 5.1. Внешний обмен белков 58
Тема 5.2. Внутриклеточный обмен аминокислот 67
Тема 5.3. Пути превращения аммиака и его обезвреживание 71
Тема 5.4. Особенности и нарушения обмена некоторых аминокислот 76
Раздел 6. Строение и обмен пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов
Тема 6.1. Строение и метаболизм пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов 84
Раздел 7. Матричные биосинтезы
Тема 7.1. Синтез нуклеиновых кислот и его регуляция 92
Тема 7.2. Биосинтез белка и его регуляция 95
Контрольные вопросы к итоговому занятию
Раздел 8. Строение и обмен углеводов
Тема 8.1. Строение и внешний обмен углеводов. Обмен гликогена 109
Тема 8.2. Окисление глюкозы в анаэробных условиях. Глюконеогенез 115
Тема 8.3. Аэробное окисление глюкозы. Пентозофосфатный путь 122
Контрольные вопросы к итоговому занятию
Раздел 9. Строение и обмен липидов
Тема 9.1. Строение и внешний обмен липидов 134
Тема 9.2. Внутриклеточный обмен жирных кислот и триацилглицеролов 140
Тема 9.3. Внутриклеточный обмен фосфолипидов и холестерола. Транспорт липидов в крови 147
Контрольные вопросы к итоговому занятию
Раздел 10. Гормональная регуляция обмена веществ и функций организма
Тема 10.1. Механизмы передачи гормонального сигнала. Классификация гормонов. Гормоны гипофиза. (семинар) 157
Тема 10.2. Гормоны гипоталамуса, гипофиза, щитовидной
поджелудочной и паращитовидной желез 159
Тема 10.3. Гормоны гипофиза, надпочечников и половых желез 164
Тема 11.1. Азотсодержащие вещества крови: белки, ферменты, фракции остаточного азота 170
Тема 11.2. Обмен железа. Гемопротеины. Синтез и распад гема 182
Тема 11.3. Неорганические вещества крови. Кислотно-основное
состояние 190
Раздел 12. Биохимия почек и печени
Тема 12.1. Водно-солевой обмен. Нормальные и патологические компоненты мочи 204
Тема 12.2. Участие печени в метаболизме веществ. Биотрансформация ксенобиотиков 214
Контрольные вопросы к итоговому занятию
Классификация и номенклатура ферментов 226
Индивидуальные белки плазмы крови 240
Нормальные величины изученных биохимических показателей 246
Эталоны ответов к тестовым заданиям 250
Эталоны ответов к ситуационным задачам 252
Раздел 1.
Строение, свойства и функции белков
Тема 1.1.
Строение и классификация аминокислот.
Структура белков
Актуальность
Аминокислоты являются материалом для строительства белков – пластического материала клеток живого организма. Особенностями аминокислотного состава обусловлено огромное разнообразие структуры и функций белковых молекул, благодаря чему белкам принадлежит ведущая роль во всех процессах жизнедеятельности. Аминокислоты участвуют в образовании биогенных аминов, азотистых оснований и мононуклеотидов, нейромедиаторов и т.д. Ряд из них используются в качестве лекарств.
Знакомство со строением, физико-химическими свойствами и классификацией аминокислот, входящих в состав белков организма человека.
Приобретение практических навыков по проведению качественного анализа биологических жидкостей на присутствие аминокислот, пептидов и белков при помощи цветных реакций.
Вопросы для самоподготовки
Принципы классификации аминокислот.
o по биологической роли (заменимые и незаменимые);
o по физико-химическим свойствам (нейтральные, кислые, основные; гидрофобные, гидрофильные);
o по химическому строению (с алифатическими радикалами, с дополнительной функциональной группой, с ароматическим и гетероциклическим радикалом, иминокислоты);
o по растворимости в воде (неполярные, полярные незаряженные, полярные отрицательно и положительно заряженные).
Структурные формулы протеиногенных аминокислот.
Физико-химические свойства аминокислот, роль их функциональных групп.
Изоэлектрическая точка аминокислот и пептидов. От чего она зависит?
Влияние изменения рН на заряд аминокислот.
Пептидная связь, реакция образования. Свойства пептидной связи.
Влияние изменения рН на заряд и растворимость пептидов.
Цветные качественные реакции на аминокислоты и белки. Принцип методов. Практическое применение реакций.
Обнаружение белка и свободных аминокислот в биологическом материале. Ключевые моменты анализа. Как удалить белок из биологической жидкости? Как обнаружить наличие свободных аминокислот в жидкости?
Лабораторная работа 1
Цветные качественные реакции на белок и аминокислоты
1) 1% р-р яичного белка, 2) 0,5% р-р нингидрина, 3) 30% р-р NaOH, 4) 10% р-р NaOH, 5) 5% р-р Pb(CH3COO)2, 6) 5% р-р нитропруссида натрия, 7) конц. HNO3, 8) 5% р-р CuSO4.
Материал исследования
При изучении цветных реакций в качестве объекта исследования используют 1% водный раствор яичного белка, содержащего полный набор аминокислот.
Реакция на пептидную связь
Для обнаружения пептидной связи в белках и пептидах используется универсальная биуретовая реакция. Биуретовую реакцию дают вещества, содержащие не менее двух пептидных группировок.
Пептидная группа образует в щелочной среде с ионами Сu 2+ комплексное соединение фиолетового цвета с красным или синим оттенком в зависимости от числа пептидных связей. Интенсивность окрашивания пропорциональна количеству пептидных групп.
Проведение анализа
В пробирку с 5 каплями 1% раствора белка вносят 3 капли 10% раствора NаОН и 1 каплю 5% раствора CuSО4.
Реакция для обнаружения a‑аминогрупп
Для обнаружения a‑аминогрупп, содержащихся в аминокислотах, и концевых a‑аминогрупп пептидов и белков используется нингидриновая реакция.
При нагревании аминокислот и пептидов с нингидрином происходят окислительное отщепление a‑аминогрупп и восстановление нингидрина. Восстановленный нингидрин реагирует с аммиаком и другой молекулой окисленного нингидрина с образованием комплекса сине-фиолетового цвета.
Проведение анализа
5 капель раствора белка смешивают с 5 каплями 0,5% раствора нингидрина. Пробирки нагревают и кипятят до появления сине-фиолетового окрашивания.
Реакция на ароматические аминокислоты
Для обнаружения ароматических аминокислот (фенилаланин, тирозин, триптофан) используется ксантопротеиновая реакция.
Ароматическое кольцо при взаимодействии с концентрированной азотной кислотой образует динитросоединение желтого цвета.
Проведение анализа
К 5 каплям 1% раствора белка добавляют 2 капли конц.HNO3 и осторожно нагревают. Наблюдают за появлением желтого окрашивания, при отсутствии желтого цвета еще добавляют 1-2 капли конц.HNO3. При добавлении избытка 30% раствора NаОН окраска переходит в оранжевую.
Реакции на серосодержащие аминокислоты
Сульфгидрильные группы в белке или пептиде подвергаются щелочному гидролизу, в результате чего происходит отщепление серы в виде сульфида натрия Na2S, который вступает в дальнейшие реакции:
o реакция Фоля – Na2S с ацетатом свинца Pb(CH3COO)2 дает черный или бурый осадок сульфида свинца;
o реакция с нитропруссидом – Na2S дает с нитропруссидом натрия соединение, окрашенное в красно-коричневый цвет.
Проведение анализа
5 капель 1% раствора белка и 5 капель 30% раствора NaOH кипятить 1‑2 минуты. Разделить содержимое на 2 части для реакций «а» и «б».
а) Реакция Фоля
К 5 каплям гидролизата добавляют 1 каплю раствора уксусно-кислого свинца и нагревают до кипения. Отмечают появление бурого или черного осадка.
б) Реакция с нитропруссидом
К 5 каплям гидролизата добавляют 2-3 капли раствора 5% натрия нитропруссида. Отмечают появление красно-коричневого окрашивания.
источник