Меню Рубрики

Определение гормонов методом радиоиммунного анализа риа

Этот метод очень широко используется в лабораторной диагностике. С помощью РИА в биологических жидкостях определяют концентрации гормонов, факторов роста, ферментов, аутоантител, маркеров злокачественных новообразований и других веществ (например, лекарственных средств и наркотиков).

I. Принцип. В основе РИА лежит феномен конкуренции: связывание антител с антигеном, меченным радиоактивным изотопом, подавляется в присутствии немеченного антигена. Методика РИА проста и включает следующие основные этапы:

А. К раствору антител добавляют меченный антиген и пробу (содержащую неизвестное количество немеченного антигена). Концентрацию антител в реакционной смеси подбирают так, чтобы число мест связывания было намного меньше общего числа антигенов. Концентрация меченного антигена должна превышать максимальную возможную концентрацию антигена в пробе.

Б. Реакционную смесь инкубируют при определенной температуре. Меченный и немеченный антигены конкурентно связываются с антителами, при этом образуются иммунные комплексы, содержащие либо меченный, либо немеченный антиген. Таким образом, к концу инкубации в реакционной смеси присутствуют меченные и немеченные иммунные комплексы, а также свободные меченные и немеченные антигены. Количество меченных иммунных комплексов обратно пропорционально количеству немеченного антигена в пробе.

В. Чтобы оценить количество меченных иммунных комплексов, их надо отделить от свободного меченного антигена. Наиболее распространены два способа разделения:

1. К реакционной смеси добавляют вещество, повышающее ее плотность, например полиэтиленгликоль.

2. К реакционной смеси добавляют вещество с большой молекулярной массой, которое специфически связывается с антителами в составе иммунных комплексов. Для этого используют вторые антитела либо стафилококковый белок A.

В обоих случаях иммунные комплексы, имеющие большую молекулярную массу, чем свободные антигены, осаждают центрифугированием и измеряют радиоактивность осадка.

Г. Определяют концентрацию антигена в пробе по калибровочной кривой. Для ее построения используют несколько стандартных калибровочных растворов с известными концентрациями немеченного антигена.

Разработано множество вариантов РИА . Методика, описанная выше, называется жидкофазным РИА (все реагенты находятся в растворенном состоянии). Существует и твердофазный РИА , в котором антитела иммобилизируются на водонерастворимом носителе, например на полистироле. Особая разновидность метода — иммунорадиометрический анализ, в котором используются меченные антитела, а не меченный антиген.

Принцип РИА распространяется и на другие иммунохимические и неиммунохимические методы анализа. Например, в ИФА вместо радиоактивного изотопа в качестве метки используют ферменты, а в иммунофлюориметрическом анализе — флуоресцирующие вещества. В неиммунохимических методах роль антител выполняют реагенты, специфически связывающие определяемое вещество. Этими реагентами могут быть рецепторы гормонов или связывающие белки плазмы. Так, в радиорецепторном анализе тиреостимулирующих и тиреоблокирующих аутоантител используются очищенные рецепторы ТТГ , а для измерения уровня свободного T4 иногда применяется тироксинсвязывающий глобулин.

Все эти методы анализа называют методами конкурентного связывания.

II. Оценка результатов. В отличие от биологических методов анализа, РИА является количественным иммунохимическим методом и дает возможность точно измерить содержание вещества (антигена) в пробе. Результат РИА зависит только от соотношения компонентов реакции антиген—антитело.

А. Условия надежности результата РИА

1. При разведении пробы измеренная концентрация вещества должна уменьшаться пропорционально степени разведения.

2. Кривая зависимости уровня связывания антител с меченным антигеном от концентрации антигена в пробе должна совпадать с калибровочной кривой.

Если эти условия не выполняются, можно предположить, что на иммунохимическую реакцию влияют факторы, перечисленные ниже. Надо отметить, что правильно интерпретированный результат РИА может иметь диагностическое значение, даже если он не удовлетворяет формальным критериям надежности (например, из-за иммунохимических различий между стандартом и пробой).

Б. Факторы, неспецифически влияющие на иммунохимическую реакцию

1. pH . Скорость реакции антиген—антитело и стабильность иммунных комплексов обычно не зависят от pH в интервале 7,0—8,5. Как правило, в очень кислой или очень щелочной среде иммунные комплексы диссоциируют, хотя некоторые белки с основными свойствами лучше всего взаимодействуют с антителами при pH 4,0—6,0. Поэтому для каждой системы РИА подбирают оптимальный pH .

2. Состав реакционной смеси также влияет на реакцию антиген—антитело. Энергия взаимодействия антигена с антителом уменьшается при высокой концентрации солей в пробе или в реакционной смеси. Некоторые лекарственные средства (гепарин) и бактерицидные препараты (тиомерсал) подавляют иммунохимическую реакцию. Поэтому для разведения стандартов и проб используют один и тот же буферный раствор и учитывают возможные эффекты компонентов реакционной смеси.

В. Перекрестная иммунореактивность веществ со сходным строением

1. Гетерогенность молекулярных форм пептидных гормонов

а. Пептидные гормоны синтезируются в виде белков-предшественников, которые перед выбросом в кровь подвергаются процессингу. При этом образуется одна или несколько форм гормона, обладающих или не обладающих биологической активностью. Например, при процессинге секретина и ВИП образуется только по одной биологически активной форме каждого гормона. Напротив, гастрин, синтезируемый клетками антрального отдела привратника, поступает в кровь как в виде зрелого гормона, состоящего из 17 аминокислот, так и в виде биологически активного предшественника, содержащего 34 аминокислоты. Оба пептида определяются в одной и той же системе РИА .

б. На результаты РИА влияют биологически неактивные молекулярные фрагменты гормонов, такие, как C-концевой фрагмент ПТГ . Концентрация этого фрагмента в сыворотке в норме превышает концентрацию зрелого ПТГ ( ПТГ1—84 ), а при болезнях почек существенно увеличивается (даже у больных без вторичного гиперпаратиреоза). Поскольку для определения ПТГ обычно используют антитела к C-концевому фрагменту, правильная интерпретация результата требует оценки функции почек. Концентрацию ПТГ1—84 в плазме можно определить с помощью высокочувствительного иммунорадиометрического метода, основанного на использовании двух разных антител: к C- и N-концевому фрагментам ПТГ . Антитела к C-концевому фрагменту иммобилизируют на полимерном носителе. Затем добавляют пробы или стандарты (растворы ПТГ1—84 в сыворотке, предварительно очищенной от ПТГ и его фрагментов) и меченные 125 I антитела к N-концевому фрагменту ПТГ . Антитела, иммобилизированные на носителе, связывают как C-концевой фрагмент, так и ПТГ1—84 , но антитела к N-концевому фрагменту связываются только с ПТГ1—84 . Такой подход используют и в других случаях, когда в пробе присутствуют молекулярные фрагменты гормона.

в. У животных разных видов первичные структуры одного и того же пептидного гормона могут быть идентичными, но чаще различаются по одной или нескольким аминокислотам. Аминокислотные замены возникают в результате мутаций и, как правило, локализуются в участках молекулы гормона, не играющих первостепенной роли в его биологической активности. Различия в первичной структуре определяют иммунореактивность гормона.

2. Гетерогенность других соединений

а. Лекарственные средства и наркотики. Вещества, структурно сходные с препаратом, и его метаболиты могут связываться или не связываться с антителами. Если измеряют содержание токсичного препарата, то необходимо знать, выявляет ли данная методика только активную форму препарата. Напротив, если требуется доказать употребление наркотика, то различия в иммунореактивности между самим наркотиком и его метаболитами можно не учитывать. Таким образом, требования к специфичности РИА зависят от цели анализа.

б. Ферменты. РИА позволяет измерять содержание фермента, но не его активность. Ингибиторы и активаторы фермента и присутствие субстрата не влияют на результат. В одной и той же системе можно определять как сам фермент, так и профермент и другие неактивные формы фермента. В зависимости от задач исследования эти особенности метода могут играть положительную или отрицательную роль, поскольку многие ферменты обладают видовой специфичностью, а биологическая активность фермента необязательно коррелирует с его иммунохимической реактивностью. Поэтому РИА следует рассматривать как дополнение к методам анализа ферментов, основанным на определении их активности, а не как замену этих методов.

III. Чувствительность и специфичность РИА

А. Чувствительность РИА очень высока. Некоторые методики выявляют очень низкие концентрации веществ, такие, как 10 –14 моль/л. Чувствительность особенно важна при измерении базальных концентраций пептидных гормонов (эти концентрации обычно находятся в пределах от 10 –13 до 10 –10 моль/л), а также при определении гормонов непептидной природы, наркотиков и лекарственных средств, ферментов, бактериальных и вирусных антигенов.

Б. Специфичность РИА определяется специфичностью антител и может быть чрезвычайно высокой. Получены антитела и разработаны методики РИА , позволяющие дифференцировать антигены с малейшими структурными различиями, в том числе:

1. T3 и T4 (различаются одним атомом йода).

2. Кортизол и кортикостерон (различаются одним гидроксильным радикалом).

3. Инсулины человека и свиньи (различаются концевой аминокислотой B-цепи).

4. Инсулины свиньи, кашалота и собаки (имеют одинаковую последовательность аминокислот, но разную конформацию).

IV. Особенности применения РИА в клинике. В основе определения многих сотен эндогенных и экзогенных веществ лежит общий принцип, но требования к чувствительности метода и диагностическое значение результатов различаются.

А. Концентрации некоторых пептидных гормонов у одного человека меняются в очень широких пределах: под влиянием стимуляторов или ингибиторов секреции и в зависимости от времени суток уровень гормона может изменяться на 1—2 порядка. В таких случаях результаты РИА сами по себе не имеют первостепенного значения для диагноза. Пример: базальная концентрация гастрина в плазме у здоровых людей обычно В/в введение секретина вызывает выброс гастрина из опухоли, но не из нормальных клеток привратника. Напротив, пищевая нагрузка стимулирует секрецию гастрина в клетках привратника, но не в клетках гастриномы. Стимуляционные и супрессивные пробы могут потребоваться и в других подобных случаях.

Б. Концентрацию гормона следует сопоставлять с концентрациями веществ, метаболизм которых регулируется данным гормоном, и веществ, регулирующих его секрецию. Например, продукция инсулина усиливается при повышении концентрации глюкозы и некоторых аминокислот в крови и снижается при гипогликемии. Уровень СТГ возрастает при стрессе и гипогликемии и снижается при гипергликемии. Высокий уровень АКТГ в плазме на фоне сниженного уровня кортикостероидов свидетельствует о первичной надпочечниковой недостаточности; если же содержание кортикостероидов повышено, следует заподозрить гипофизарный синдром Кушинга. Для уточнения результатов РИА нередко требуются стимуляционные и супрессивные пробы.

В. При определении непептидных гормонов (в частности, стероидных и тиреоидных) чувствительность метода очень важна, поскольку в норме концентрации этих гормонов очень низкие.

Г. При определении концентраций лекарственных средств, особенно препаратов с узким терапевтическим диапазоном, также требуется высокая чувствительность РИА .

Д. При определении антигенов вирусов и микроорганизмов (таких, как антиген вируса гепатита B или туберкулопротеид) надо учитывать, что их абсолютная концентрация в какой-либо биологической жидкости зависит не только от тяжести инфекции, но и от других факторов, например — от способа получения материала.

Е. Биологическая активность гормона, его фрагмента или аналога далеко не всегда соответствует его иммунохимической реактивности. Чтобы по результатам РИА судить о биологической активности гормона, нужно знать, в каких молекулярных формах существует гормон и какие из них можно определить с помощью данной методики РИА . Например, гастрин присутствует в сыворотке в виде зрелого гормона, состоящего из 17 аминокислот (Г17), и в виде биологически активного предшественника, содержащего 34 аминокислоты (Г34). Поскольку Г17 метаболизируется значительно быстрее, чем Г34, в плазме преобладает Г34. Обе формы гастрина стимулируют секрецию соляной кислоты в желудке, причем относительная активность Г17 в 3—5 раз превышает активность Г34. После в/в введения собакам эквимолярных количеств Г17 и Г34 общий объем выделившейся кислоты одинаков, хотя уровень Г34 в плазме в 3—5 раз выше уровня Г17. Таким образом, результат определения биологической активности гастрина зависит от методики анализа.

V. Заключение. Роль РИА и других иммунохимических методов анализа в диагностике болезней и в фундаментальных медико-биологических исследованиях трудно переоценить. Тем не менее при планировании и оценке результатов иммунохимических исследований надо принимать во внимание все их особенности и тонкости и ставить диагностические задачи с учетом реальных возможностей метода.

1. Nussbaum SR, et al. Highly sensitive two-site immunoradiometric assay of parathyrin, and its clinical utility in evaluating patients with hypercalcemia. Clin Chem 33:1364, 1987.

2. Yalow RS. Radioimmunoassay. Annu Rev Biophys Bioeng 9:327, 1980.

3. Yalow RS. Heterogeneity of peptide hormones: Its relevance in clinical radioimmunoassay. Adv Clin Chem 20:1, 1978.

4. Yalow RS. Heterogeneity of peptide hormones. Recent Prog Horm Res 30:597, 1974.

5. Yalow RS. Radioimmunoassay: Practices and pitfalls. Circ Res 32, 33(Suppl 1):1, 1973.

6. Yalow RS, Berson SA. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man. J Clin Invest 39:1157, 1960.

источник

Современная медицина обладает методами специфического диагностирования, которые дают возможность устанавливать этиологию заболеваний у людей на основании определения возбудителя, генетически чужеродных веществ, что стимулируют иммунную реакцию, нуклеиновых кислот, а также сдвигов аллергического и иммунного характера, которые происходят из-за его действия. Сегодня в иммунологии и вирусологии широко применяется РИА, то есть радиоиммунный анализ, цели постановки, компоненты, ход, учет которого, мы рассмотрим в данной статье. Этот анализ способен определять антигены в результате их взаимодействия с антителами.

РИА представляет собой такой метод диагностирования биологически активных веществ в жидкостях, в основе которого лежат реакции антигенов с антителами при применении меченых радионуклидами аналогичных им веществ, которые имеют особые системы связывания. После их взаимодействия образуется иммунный комплекс, который отделяют и изучают его радиоактивность. Известно, что радиоиммунный анализ проводится при помощи стандартных наборов реагентов.

Каждый реагент способен определить концентрацию одного конкретного вещества. Биологическая жидкость, взятая у человека, смешивается с реагентом, по прошествии периода инкубации происходит разделение свободного и связанного радиоактивного вещества, далее проводится радиометрия и расчет результатов. Для метки веществ применяют изотоп йода. Его метят и добавляют в определенном количестве.

Радиоиммунный анализ применение имеет широкое в медицине и микробиологии. С его помощью проводится диагностика сердечных и сосудистых заболеваний, болезней эндокринной и иных систем организма. Также часто РИА используются для выявления причины бесплодия, патологии развития плода. В онкологии этот анализ проводят с целью определения маркеров новообразований, чтобы иметь возможность контролировать эффективность лечения. В иммунологии РИА применяется для исследования в крови наличия иммуноглобулинов, ферментов, белков и так далее. Сегодня данный анализ позволяет выявлять концентрацию различных гормонов до миллионной части одного грамма. Таким образом, радиоиммунный анализ крови широко применяется в кардиологии, онкологии, эндокринологии, гинекологии и вирусологии.

Принято различать несколько методов анализа, в зависимости от характера реакции:

  1. Неконкурентный метод характеризуется такими компонентами реакции, как стандартный и определяемый антигены, буферный раствор, антитела, что помечены изотопом, определенные антитела, что связываются на сорбенте. К антителам добавляют антиген, который исследуется. После инкубации появляются комплексы антиген-антитело, сорбент омывают, добавляют помеченные антитела, что вступают в связь с антигеном в составе комплекса. Радиоактивность зависит от концентрации антигена, что исследуется.
  2. Конкурентный радиоиммунный анализ обуславливается конкуренцией антигена. Здесь имеются такие компоненты реакции, как контрольный и определяемый антигены, буферный раствор, определенные антитела, что связываются на сорбенте, а также антиген, помеченный изотопом. Диагностирование начинается с ввода антигена, что исследуется. На сорбенте образуется комплекс антиген-антитело. Дальше омывается сорбент, и вводят помеченный антиген. При этом он вступает в связь с антителом. При помощи счетчиков измеряют реакцию и величину радиоактивности. Она будет в обратной пропорции относительно количества антигена в пробе.
  3. Непрямой метод является самым распространенным. В этом случае радиоиммунный анализ компоненты реакции имеет такие, как контрольная и исследуемая сыворотка, антигены или антитела, которые связаны на сорбенте, антитела, помеченные изотопами, растворы буферов. Антитела или антигены, что диагностируются, вступают в реакцию с антигенами или антителами, которые связаны на сорбенте. Потом удаляют инкубат, вводят помеченные антитела, что вступают в связь с комплексами антиген-антитело.
Читайте также:  Эутирокс перед сдачей анализов на гормоны

Так, радиоиммунный анализ проводится при помощи особых реагентов. Наборы стандартные, поэтому какие-либо погрешности или нарушения не допускаются. Результаты диагностики получаются достоверными. Анализ проводят утром, для этого берут у человека венозную кровь. В лаборатории от крови отделяют сыворотку, которая будет применяться для РИА. Эту сыворотку смешивают с реагентами. Полученная смесь проходит инкубацию при заданной температуре в термостате.

В полученной смеси разделяют свободные и связанные изотопы. После этого полученный материал исследуется, и просчитываются результаты. Механизм радиоиммунного анализа имеет несколько вариантов. Методика, что описана выше, является РИА жидкофазным, так как все компоненты имеют жидкое состояние. Есть РИА и твердофазный, где антитела кладут в носитель, который не растворяется в жидкости.

Использование этого метода диагностики в медицине с каждым годом становится все популярнее. В последнее время радиоиммунный анализ становится стандартным методом диагностики, который может быть назначен врачом при постановке окончательного диагноза. Долгое время этот вид анализа проводился только в лабораториях, сегодня он стал обычным методом исследования. Но РИА требует применения дорогостоящего оборудования (гамма-счетчиков), а наборы реагентов имеют короткий эксплуатационный срок. Все это является основным недостатком такого анализа, что определяют его дорогую стоимость.

Кроме того, в последнее время РИА стали вытеснять более современные методы исследования, которые не требуют взаимодействия с изотопами. К таким относится иммуноферментный анализ. Таким образом, РИА является желанным во многих клиниках. В больших городах и центрах диагностики он давно используется, но в обычных больницах маленьких городов этот анализ практически не применяется из-за своей дороговизны.

Радиоиммунный анализ имеет множество достоинств. Он достаточно специфичен и имеет высокую чувствительность, что позволяет определить наличие биологически активных веществ в невероятно малых количествах. Проводится этот анализ очень просто, от человека требуется только сдать венозную кровь. Результаты теста получаются точными на все 100% и готовы уже на следующий день. Также РИА с легкостью можно автоматизировать. Таким образом, этот анализ позволяет выявлять белки, которые представляют собой продукты жизнедеятельности инфекционных бактерий, что свидетельствует о наличии инфекции в организме.

Самым перспективным РИА является для вирусологии, поскольку позволяет в короткие сроки выявить вирусных возбудителей. Связано это с тем, что в последнее время растет число заболеваемости различными инфекциями, которые распространяются с большой скоростью, вызывая смертность среди людей. Особенно это касается стран, которые не имеют высокого социального и экономического развития (страны Дальнего Востока), здесь просто незаменим радиоиммунный анализ. Микробиология также применяет этот метод диагностики для выявления инфекционных болезней, которые вызывают патогенные бактерии. Например, РИА широко используют для выявления брюшного тифа. В первые дни недуга до назначения лечения необходимо проведение исследования кала и рвотных масс. Однако результаты диагностирования будут получены через длительное время. Здесь на помощь приходит РИА, анализ позволяет в короткий срок выявить возбудителя заболевания. Человек сдает кровь, на следующий день уже готовы результаты исследования. Этот анализ помогает в постановке точного диагноза.

Радиоиммунный анализ является на данный момент одним из самых чувствительных методов диагностирования. Он используется для анализа любого вещества, против которого можно получить антитела. Этот метод дает возможность сделать множество проб в самом маленьком объеме исследуемой жидкости, а также в кратчайшие сроки провести учет результатов, так как он может быть полностью автоматизирован. Этот анализ был разработан в пятидесятых годах прошлого столетия Соломоном Берсоном. Через тридцать лет он получил широкое распространение. На сегодняшний день РИА нет стопроцентной альтернативы, так как анализ имеет высокую чувствительность. РИА используют в различных отраслях медицины, а также в микробиологии и вирусологии.

Использование метода в вирусологии очень актуально сегодня, так как дает возможность исследовать распространение инфекций, поставить точный диагноз и назначить специфическое лечение. Особенно эта проблема актуальна для стран, которые имеют низкий уровень экономики и социального развития. Также этот анализ позволяет выявлять количество гормонов и ферментов в организме человека. Для того чтобы получить достоверные результаты, исследуемому необходимо только сдать кровь на анализ. Медицина не стоит на месте, наряду с радиоиммунным анализом появляются новые методы исследования, но РИА продолжает оставаться одним из ведущих в медицинской диагностике.

источник

Радиоиммунный анализ — РИА – или изотопный иммунологический анализ — это один из современных количественных методов исследования БАЖ с определением в них количеств БАВ. К таким веществам относятся гормоны и некоторые ферменты. Метод отличается исключительной точностью и высокой чувствительностью. Об этом говорят нано — и пикограммовые количества исследуемого вещества.

Особенно применяет РИА микробиология для выявления положительной реакции на антитела, причем, исследовать можно любой заразный биоматериал, если он предварительно обезврежен. К такому относятся: кровь, суспензии органов животных, объекты внешней среды, материал после обогащения на питательных средах и т. д. Реакция считается положительной, если реагенты взаимодействуют с антителами в крови пациента. Анализировать можно и любые химические вещества, против которого можно получить специфические антитела. Метод количественно определяет любой антиген.

При помощи РИА можно исследовать большое количество проб в минимальном объеме и быстро (за несколько часов), производить количественный учет результатов, полностью или частично автоматизировать их.

Суть реакций в том, что искомые стабильные и аналогичные им меченные радионуклидом вещества связываются со специфическими связывающими системами, и затем считываются на специальных счётчиках — радиоспектрометрах.

Данная метода была разработана в 50-х годах прошлого века Соломоном Берсоном и Розалин Сасмен Ялоу. Они изучали тогда клиренс инсулина. В 1977г. Р. Ялоу получила за это Нобелевскую премию.

Все исследования выполняют in vitro, что означает «в пробирке». Для РИА созданы и выпущены стандартные наборы реагентов, которые предназначены для определения концентрации только одного определенного вещества.

Для каждого вида исследуемого материала и выявляемого БАВ или антитела исследуемого микроорганизма применяют специфические стандартизированные наборы реагентов. В силу такой стандартизации погрешностей в результатах практически не бывает.

Забор крови напоминает анализ крови на биохимию — утром натощак проводят забор венозной крови. Затем в лаборатории отделяют сыворотку, необходимую для РИА.

Работа состоит из нескольких этапов: биоматериал смешивается с нужным реагентом; меченый антиген добавляется в определенном количестве, чтобы можно было установить часть вещества, которая связалась с антителами и другую часть, которая останется несвязанной.

  1. Эту смесь инкубируют в течение нескольких часов в термостате при определенной температуре.
  2. Свободное и связанное радиоактивное вещество разделяются после этого.
  3. И только потом проводят само исследование — проводится радиометрия проб при помощи счетчиков.
  4. Результаты подсчитываются и строится специальная кривая.

Вариантов исследования существует несколько.

Описанная вариация применяется для жидкофазного РИА, когда все реагенты жидкие.

Есть и твердофазная реакция. Тогда антитела помещают в нерастворимый в жидкости носитель, например полистирол.

Еще разновидность — иммунорадиометрическое исследование. При нем изотопами метят антитела, а не антигены. Антитела и антигены чаще всего помечают изотопом йода 125I или 131, с периодом полураспада в 60 дней и высокой радиоактивностью. Эти изотопы – гамма-излучающие. Выявляется комплекс АГ-АТ, где 1 из составляющих метится изотопом. Реакцию учитывают по любому изменению радиоактивности с помощью b- или g- счетчиков.

Хотя радиоиммунный анализ чувствителен и точен, он постепенно сегодня начинает вытесняться более безопасными методами – ИФА, например, где нет опасности работы с радиоактивными изотопами. Но при выявлении ЛС, гормонов – стероидных или пептидных в роли антигенов, РИА используют широко.

АТ могут сорбировать и на твердую фазу (например, полистироловые шарики). В комплекс добавляют исследуемый материал с его концентрацией изучаемого АГ. Меченый АГ при этом вытесняется в прямой пропорции.

Этот вытесненный АГ с его радиоактивностью и измеряется. По нему определяют и концентрацию неизвестного АГ.

К ним относятся 2 метода – РБТЛ и РПМЛ. Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) – основана на том, что при контакте с чужеродным антигеном лимфоцит трансформируется из малых форм в бласты, которые делятся и дифференцируются.

Один бласт может давать клон из 16-64 клеток. Морфология при этом меняется: идет синтез белков, меняется обмен фосфолипидов, мембрана становится повышено проницаемой для ионов и пр. Вот эту функциональную активность синтеза ДНК и измеряет этот метод.

Реакция подавления миграции лейкоцитов (РПМЛ) – выявляет сенсибилизированные к предполагаемому антигену лимфоциты.

Применяется для выявления аллергии на ЛС. Эти лимфоциты выделяют медиаторы цитокины, которые подавляют подвижность других лейкоцитов.

Для определения аллергии к антигенам-аллергенам вводят его перорально, ингаляционно, скарификатором через кожу и через 30 минут проверяют немедленные аллергические реакции (ПЧНТ), а через 1-2 суток – замедленные (ПЧЗТ).

Немедленные возникают чаще на пищу, пыльцу, лекарства – в виде покраснения и припухлости. Замедленные – на бактерии.

Пробу Манту ставят для определения сенсибилизации к МБТ. Оценивается вакцинация и инфицированность. Туберкулин РРD вводят внутрикожно и при + реакции через 1-2 суток появляется покраснение. Это указывает на сенсибилизацию организма. Если краснота более 1 см или ее нет вовсе – это говорит о ТБ.

Кожные пробы используются для выявления иммунодефицитов и резистентности к определенной инфекции, потому что человек в течение жизни сталкивается с антигенами распространенных условно-патогенных бактерий и к ним сенсибилизирован.

Пробы ставят с аллергенами стафило- и стрептококков, кишечной палочки и др. Положительная реакция должна быть хотя бы на один. Если ее нет – это указывает на иммунодефицит.

Поле деятельности для использования РИА довольно широкое. Часто именно этот метод становится «истиной в последней инстанции», потому что для него нет затруднений определения гормонов даже в млн. частях миллионной части грамма. При его помощи можно определять любые практически гормоны:

  1. Поджелудочной железы, ЖКТ, ЩЖ, гипофиза; для измерения не гормонов: ферментов, иммуноглобулинов, лекарственных веществ, опухолевых антигенов, белков сыворотки крови и др.
  2. В кардиологии при тяжелых состояниях больного;
  3. При опухолях – им выявляют маркеры опухоли, и контролируют качество лечения.
  4. В эндокринологии – методом можно определять колебания и содержание гормонов в крови и моче.
  5. Гинекология – выявляют причины бесплодия у мужчин и женщин; прогнозируют возможные нарушения плода еще в эмбриогенезе, когда они еще не видимы для других методов; определяют содержание гормонов в динамике в разные фазы МЦ.
  6. Инфекционистам РИА позволяет уточнять диагноз при ОКИ, тифах и пр.

Такой метод всегда востребован в любой клинике, но камнем преткновения становится дороговизна его. Высокоточная аппаратура радиоиммунологического метода дорого стоит. Имеются в виду его гамма- и бета-счетчики, компьютеры и камеры глубокого охлаждения.

Также дорого стоят расходные материалы и реактивы. Из-за короткого времени распада радиоактивных компонентов срок их использования короток, следовательно, его надо быстро обновлять.

Повсеместное внедрение РИА затруднено еще и потому, что трудно получать стандартные меченые высоко специфические сыворотки и антигены, реактивы с высокой степенью чистоты стандартов. Нужно соблюдать правила безопасности при работе с радиоактивными изотопами.

Себестоимость от этого всего еще больше повышается.Несмотря на все преимущества РИА, он исподволь заменяется более современными и безопасными в работе методами.

Например, для количественного определения Ig РИА сегодня не используют. Его заменили модификации ИФА, которые имеют так же высокую чувствительность, но нет работы с источниками радиации.

Перспектива есть и касается она широкой области определения вирусов. Проблема эта касается стран «третьего мира», где самый высокий уровень смертности среди населения.

Здесь вирусы могут распространяться молниеносно. Поэтому экспресс-методы, которым является РИА, значительно помогли бы снизить эту смертность и улучшить уровень жизни этих стран. Поэтому еще рано задвигать РИА в дальний ящик, пока он просто переходит на другой качественный уровень своего развития.

источник

Радиоиммунный анализ (РИА) — высокоточный и один из самых чувствительных методов.

РИА как количественный метод, в отличие от многих традиционных, применим для анализа любого химического вещества, против которого могут быть получены специфические антитела. Чувствительность РИА — нано — и пикограммовые количества исследуемого вещества. Метод позволяет исследовать большое количество проб в минимальном объеме и в относительно короткие сроки (несколько часов), производить количественный учет результатов, он легко подвергается полной или частичной автоматизации.

С помощью РИА можно исследовать любой заразный материал, который предварительно обезврежен: суспензии органов животных, кровь, объекты внешней среды, материал после обогащения на питательных средах и т. д.

Принцип РИА. Метод РИА обычно проводят по конкурентному типу с использованием меченного иодом-125 ( 125 I) белкового антигена и сыворотки к этому антигену в качестве связывающего агента.

Один из вариантов конкурентного РИА — так называемый метод «позднего добавления меченого антигена». Он заключается в том, что сначала антитела вступают во взаимодействие только с немеченым (измеряемым) антигеном. После определенного времени инкубации в пробу добавляют меченый антиген и проводят повторную инкубацию. Этот прием позволяет повысить чувствительность конкурентного РИА, однако основная биологическая суть его при этом не меняется.

Подобрав подходящую систему для отделения свободной (Аг*) и связанной радиоактивности (Аг* — Аг) и произведя сравнение радиоактивности в пробах, содержащих конкурирующий антиген и не содержащих его, можно обнаружить наличие искомого антигена в неизвестном образце. Для отделения связанной и несвязанной радиоактивности используется принцип преципитации комплекса Аг* — Аг суспензией клеток стафилококка, содержащего протеин А. Чем меньше радиоактивность связанной фракции в неизвестных образцах по сравнению с отрицательным контролем (проба без конкурирующего антигена), тем больше искомого антигена присутствует в пробе. Количественное содержание антигена в пробе определяют по калибровочной кривой путем обычной экстраполяции. Для построения калибровочной кривой одновременно с неизвестными образцами исследуют пробы, содержащие известные количества стандартного немеченого антигена.

Читайте также:  Эстроген в результатах анализа на гормоны

Материалы и оборудование. 1. Иодид натрия (без носителя) продукт «Б» в щелочном растворе с радиоактивным изотопом 125 I с объемной активностью не менее 100 мк/мл (производство С.-Петербургского объединения «Изотоп», ТУ 957070—74). 2. Хлорамин Т (Serva, Германия). 3. Метабисульфит натрия. 4. Хлорид натрия (ГОСТ 4233—66). 5. Фосфат натрия двузамещенный (ГОСТ 11773—66). 6. Фосфат натрия однозамещенный (ГОСТ 245—66). 7. Иодид калия. 8. Азид натрия (Serva, Германия). 9. Формалин 37%-й технический (ГОСТ 16225—61). 10. Спирт-ректификат. 11. Вода дистиллированная и бидистиллированная. 12. Бычий сывороточный альбумин (Serva, Германия). 13. Сефадекс G-200 (Pharmacia, Швеция). 14. Тритон Х-100 (Merk, Германия). 15. Пробирки из кварцевого стекла. 16. Пипетки стеклянные на 1, 2, 5 и 10 мл. 17. Автоматические пипетки на 5, 10, 20, 100 мкл с регулируемым объемом и на 1000 мкл со сменными наконечниками одноразового пользования. 18. Пластиковые пробирки с пробками одноразового пользования. 19. Приспособление для отсасывания жидкости (водоструйный насос с ловушкой для сбора жидкости). 20. Холодильник бытовой. 21. Спектрофотометр. 22. Термостат (37 °С). 23. рН-метр. 24. Хроматографическая стеклянная колонка 0,9 х 60 см. 25. Коллектор для сбора фракций любой модели. 26. Низкоскоростная центрифуга с частотой вращения 5000 мин -1 с ротором, позволяющим одновременно центрифугировать большое количество проб. 27. Счетчик радиоактивности для измерения гамма-излучения РИА-ГАММА (LKB, Швеция) или любой другой модели. 28. Высокоочшценный антиген, например капсульный антиген чумного микроба Ф1, полученный (Baker et al., 1952) путем четырехкратного переосаждения сульфатом аммония, стандартизированный спектрофотометрически и лиофильно высушенный. Антиген Ф1 должен образовывать одну линию преципитации в РИД с гипериммунной противочумной сывороткой. При иммунизации этим антигеном кроликов должны образовываться только специфические антитела. 29. Моноспецифическая кроличья сыворотка против Ф1; не должна образовывать зону преципитации в РИД с бесфракционными штаммами Y. pestis. 30. Стафилококковый реагент, содержащий протеин А, или убитая взвесь клеток стафилококка штамма Cowan-1.

Примечание. 1. Всю посуду, колонки, наконечники для пипеток, используемые в работе, обязательно обрабатывают 1%-м раствором БСА не менее 30 мин на холоде с последующей тщательной отмывкой дистиллированной водой для устранения неспецифической сорбции антигенов и антител.

2. Для реакционной смеси при иодировании антигена используют специально предназначенные для РИД пробирки из кварцевого стекла или тонкие стеклянные пробирки с силиконовым покрытием. Все остальные реакции проводят в пластиковых пробирках одноразового пользования.

3. Антиген Ф1 используют как для метки 125 I, так и в качестве стандартов при построении калибровочных кривых.

4. Иммунные сыворотки могут быть получены по любой схеме, включающей внутрикожные инъекции антигена с адъювантом.

5. Необходимо строго придерживаться критериев чистоты антигенов и антител, приведенных выше, так как от этого зависит специфичность анализа.

6. Суспензию стафилококков перед анализом следует отмыть в 0,5…1%-м растворе БСА для снижения неспецифической сорбции.

7. Для метки антигена используют 0,15 и 0,5 М фосфатный буферный раствор (pH 7,4…7,5), приготовленный на бидистиллированной воде. Для очистки меченого антигена и постановки РИА можно применять ФБР на дистиллированной воде.

Иодирование антигена Ф1. Перед меткой антигена предварительно готовят колонку (0,9 х 60 см) с сефадексом G-200, уравновешенную 0,15 М ФБР (pH 7,5).

На колонку наносят 0,2 мл 10%-го раствора БСА, после чего ее промывают тем же буфером с 0,02 % азида натрия.

В стеклянную пробирку из кварцевого стекла вносят следующие реагенты: 10 мкл 0,5 М ФБР (pH 7,5); 2 мкл исходного раствора Na 125 I в объеме 10…15 мкл; 1,25 мкл раствора антигена Ф1 в объеме 10 мкл; 10 мкл свежеприготовленного раствора хлорамина-Т из разведения 2 мг/мл. Смесь интенсивно перемешивают пипеткой в течение 30 с и добавляют 10 мкл свежеприготовленного раствора метабисульфита натрия из разведения 5 мг/мл. Затем опять интенсивно перемешивают пипеткой в течение 60 с и вносят 350 мкл раствора иодида калия из разведения 0,5 мг/мл. Далее смесь перемешивают и наносят на колонку. В пробирки для сбора фракций предварительно закапывают по 100 мкл 1%-го раствора БСА на 0,15 М ФБР (pH 7,5) с 0,02 % азида натрия.

Элюирование проводят тем же буфером и со скоростью 5…6 капель в 1 мин; собирают фракции по 1 мл. Из каждой фракции отбирают аликвоту, т. е. точно отмеренное количество образца, по 10 мл для подсчета радиоактивности. Радиоактивность измеряют на гамма-счетчике в режиме счета 125 1 и 3…4 фракции первого пика, содержащие меченый антиген с уровнем радиоактивности не ниже 200 000 имп./мин в 10 мкл аликвоты, объединяют и используют в работе.

Меченый антиген разводят элюирующим буфером с 0,1 % БСА до 10 000 имп./мин, разливают по 0,5 мл в пластиковые пробирки с крышками и хранят в морозильной камере бытового холодильника до использования.

Построение кривой разведения сыворотки. Определяют рабочее разведение сыворотки в РИА по 50%-му связыванию меченого антигена. Кривую разведения сыворотки строят по данным инкубации фиксированного количества меченого антигена с различными количествами антител, представляющими собой серийные разведения сыворотки. После инкубации измеряют распределение между свободной и связанной фракциями.

Для построения калибровочной кривой подбирают рабочее разведение сыворотки, при котором связывается приблизительно 50 % метки, что обеспечивает максимальную чувствительность анализа. На этом этапе определяют также иммунологическую активность меченого антигена по максимальному связыванию в избытке антител.

Для постановки РИА используют 0,1 М ФБР (pH 7,4…7,5) с 0,5 % БСА, 0,2 % тритона Х-100 и 0,02 % азида натрия (разводящий буфер).

Анализ включает следующие операции.

1. Готовят серию из 10 стандартных разведений сыворотки против антигена Ф1 в 1 мл разводящего буфера от 1:20 000 до 1 : 20 000 000.

2. В двойной ряд пластиковых пробирок разливают по 100 мкл разводящего буфера. Затем вносят по 100 мкл материала, который предполагается исследовать в РИА, но заведомо не содержащего антигена Ф1 и антител к нему. Например, суспензию внутренних органов незараженных животных, желательно того же вида, что и исследуемые на присутствие антигена Ф1, или же нормальную сыворотку, если предполагается исследовать сыворотку от больных.

3. В каждую пробирку добавляют по 20 мкл раствора меченого антигена Ф1, разбавленного разводящим буфером из такого расчета, чтобы общее количество импульсов на пробу за 1 мин было в пределах 15 000…20 000. Для определения общей радиоактивности одну пару пробирок заполняют только раствором, содержащим меченый антиген (контроль ТОТА).

4. В пробирки добавляют по 10 мкл иммунной сыворотки каждого разведения; одна пара пробирок содержит буфер без иммунной сыворотки и служит в качестве холостой пробы, представляющей собой контроль на неспецифические связывания (контроль BLAN).

5. Пробирки инкубируют в течение 18 ч при 4 °С.

6. Во все пробирки (за исключением ТОТА) добавляют по 100 мкл 20%-й суспензии стафилококка. Выдерживают в течение 10 мин при комнатной температуре при периодическом осторожном встряхивании.

7. Добавляют по 1 мл разводящего буфера.

8. Центрифугируют в течение 5 мин при частоте вращения 4000…5000 мин -1 .

9. Надосадочную жидкость осторожно сливают или удаляют, стараясь не повредить осадок стафилококков. Лучше удалять жидкость пастеровской пипеткой, соединенной с водоструйным насосом.

10. Пробирки просчитывают в гамма-счетчике в течение 60…120 с.

11. Вычисляют среднее значение счетности из каждых двух параллельных проб.

12. Из средней величины счетности проб с серийными разведениями сыворотки вычитают среднюю величину счетности контроля BLAN.

13. Вычисляют иммунологическую активность меченого антигена. Для этого величину счетности пробы с наибольшим связыванием делят на величину счетности общей добавленной радиоактивности (ТОТА). Этот показатель должен находиться в пределах 0,4…0,7, что свидетельствует о хорошем качестве меченого антигена.

14. Строят график, откладывая на оси ординат процент связанной метки, а по оси абсцисс — логарифм разведенной иммунной сыворотки. При этом за 100 % принимают счетность пробы с наибольшим связыванием в присутствии избытка антител.

15. Определяют графическим способом то разведение иммунной сыворотки, которое связывает 50 % меченого антигена.

Примечание. При использовании гамма-счетчика, управляемого микропроцессором типа РИА-ГАММА (LKB-Wallak, Швеция), все операции, начиная с просчета проб до построения кривой разведения сыворотки, проводятся автоматически по заданной программе расчета согласно руководству по эксплуатации счетчика.

Определение неизвестного количества антигена Ф1 в пробах по калибровочной кривой. Для построения калибровочной кривой проводят инкубацию фиксированных количеств меченого антигена Ф1 и иммунной сыворотки в рабочем разведении с различными концентрациями чистого немеченого антигена. Кривая, построенная в координатах процент связанной метки — логарифм серийных разведений антигена, имеет сигмовидный характер. Верхняя часть кривой соответствует таким малым количествам немеченого антигена, которые вызывают относительно небольшие сдвиги в распределении метки между свободной и связанной фазами. В нижнем участке кривой соотношение между суммарными концентрациями антигена и антител таково, что большая часть антигена находится в свободной форме.

Между этими двумя экстремальными ситуациями имеется интервал концентраций антигена, в пределах которого относительно небольшие изменения вызывают значительные сдвиги и в распределении антигена между свободной и связанной фазами.

Построение калибровочной кривой — основное условие количественного определения антигена Ф1 в исследуемом образце.

Если вместо стандарта взять исследуемый образец и использовать те же фиксированные концентрации антител и метки, то найденное распределение метки между связанной и свободной фазами будет соответствовать некой величине на горизонтальной оси калибровочной кривой. Эту величину определяют путем простой экстраполяции.

Подготовка исследуемого материала. Кусочки паренхиматозных органов животных размером 0,5 х 1 см переносят в стерильную ступку со стерильным кварцевым песком, тщательно растирают, добавляя до 10 мл буфера для РИА или 0,9%-го раствора хлорида натрия, содержащего 1 % формалина.

После отстаивания суспензии надосадочную жидкость отбирают через ватный тампон в стерильные пробирки. После трехкратного замораживания при —10 °С с оттаиванием исследуемый материал инактивируют при 56 °С в течение 30 мин. После этого делают контрольный высев на стерильность; при отрицательных результатах суспензию исследуют в РИА.

Аналогичным образом готовят пробы от павших животных, суспензии из эктопаразитов, пробы из объектов внешней среды и т. д. Кровь или сыворотку разводят буфером для РИА из расчета 1 : 10.

Пробы со стандартными разведениями немеченого антигена Ф1 должны содержать материал, аналогичный по химическому и биологическому составу исследуемому, но без примесей определяемого антигена и антител к нему. Например, при исследовании суспензий органов зараженных животных нужно приготовить суспензии органов интактных животных того же вида, при исследовании сыворотки от зараженных животных необходимо располагать нормальной сывороткой, свободной от антигена Ф1.

Такие контрольные пробы должны быть приготовлены так же, как описано выше.

Следует учитывать, что чем больше контрольные пробы будут соответствовать по своему химическому составу опытным, тем более точным и достоверным будет результат.

Проведение РИА. Все реагенты разводят буфером для РИА.

Анализ включает следующие операции.

1. Готовят серии из 10 стандартных разведений немеченого антигена Ф1 в 1 мл разводящего буфера от 20 пг/мл до 20 нг/мл.

2. В двойной ряд пластиковых пробирок разливают по 100 мкл стандартных растворов немеченого антигена каждого разведения.

3. Вносят по 100 мкл субстрата, который предполагается исследовать в РИА, но заведомо не содержащего антигена Ф1 и антител к нему. Кроме того, готовят двойной ряд пробирок, содержащих свободный от антигена Ф1 субстрат без стандартного антигена Ф1; одна пара этих пробирок служит в качестве «холостой пробы» (BLAN), а другая — в качестве «нулевого стандарта» пробы с максимальным связыванием меченого антигена (REFR), а в остальные дублированные пробирки разливают по 100 мкл исследуемого материала.

4. В каждую пробирку приливают по 100 мкл иммунной сыворотки к антигену Ф1 в рабочем разведении. В «холостые пробы» (BLAN) вместо иммунной сыворотки добавляют по 100 мкл буфера.

5. Пробирки инкубируют в течение 18 ч при 4 °С (1-я инкубация).

6. В каждую пробирку добавляют по 20 мкл раствора меченого антигена Ф1, разбавленного разводящим буфером точно так же, как при построении кривой разведения сыворотки. Для определения общей радиоактивности одну пару пробирок заполняют только раствором, содержащим меченый антиген (ТОТА).

7. Инкубируют в течение 6 ч при 37 °С (2-я инкубация).

8. Во все пробирки (за исключением ТОТА) добавляют по 100 мкл 20%-й суспензии стафилококков и проводят дальнейшую обработку (см. построение кривой разведения сыворотки).

9. Просчитывают радиоактивность осадка во всех пробах за 60…120 с.

10. Вычисляют среднее значение счетности из каждых двух параллельных проб.

11. Из средней величины счетности проб со стандартными разведениями немеченого антигена REFR и проб с исследуемыми образцами высчитывают среднюю величину счетности контроля BLAN.

12. Вычисляют иммунологическую активность меченого антигена аналогично методу, описанному ранее. Для этого величину счетности делят на величину счетности ТОТА. Если эта величина приближается к величине стандартной калибровочной, то это свидетельствует о правильности проведения анализа.

13. По результатам, полученным при исследовании стандартов, строят график, откладывая по оси ординат процент связанной метки, а по оси абсцисс — логарифм концентрации стандартного антигена. При этом за 100 % принимают пробы с наибольшим связыванием (REFR).

14. Рассчитывают количество антигена Ф1 в исследуемых образцах.

Результаты исследования неизвестного образца сравнивают со стандартной калибровочной кривой и путем экстраполяции вычисляют количество искомого антигена, содержащегося в пробе.

Количество (%) связавшейся радиоактивности в стандартных и исследуемых пробах вычисляют по формуле

Связавшаяся радиоактивность = (B — BLAN):(REFR — BLAN)∙100 %,

где B — счетность исследуемой пробы или стандарта; BLAN — счетность пробы с неспецифическим связыванием; REFR — счетность пробы с максимальным связыванием без конкурирующего антигена Ф1.

Примечание. При использовании гамма-счетчика, управляемого микропроцессором, подсчет проб, построение калибровочной кривой, определение концентрации антигена Ф1 в исследуемом образце проводится автоматически и результаты выдаются в распечатанном виде. Программирование проводят согласно руководству по эксплуатации счетчика.

Аналитическая характеристика материала. 1. Время проведения анализа составляет 25…26 ч в зависимости от количества исследуемых проб. Опыт можно сократить до 6…7 ч, если 1-ю и 2-ю инкубации проводить в течение 2 ч при 37 °С. Однако чувствительность метода снижается в несколько раз.

2. Если нет необходимости в быстром получении результата, то 2-ю инкубацию можно проводить в течение 18 ч при 4 °С без потери чувствительности анализа.

3. При высоком содержании антигена Ф1 в пробах (больше 20 нг/мл) будет низкая счетность, выходящая за пределы калибровочной кривой. В этом случае для точного количественного определения антигена исследуемые образцы необходимо разбавить в 10 или 100 раз и повторить исследование заново.

4. Среди результатов анализа возможны ложноположительные. Если позитивный результат дает одна из двух проб данного образца, ответ следует считать отрицательным.

Читайте также:  Фиброаденома молочной железы анализы на гормоны

Причины следующие: загрязнение проб материалом позитивных образцов или стандартов; потеря части осадка стафилококков при удалении над осадочной жидкости.

5. Все отрицательные результаты свидетельствуют о том, что в исследуемом образце нет антигена Ф1 либо содержание его ниже порога чувствительности метода.

6. При правильно проведенном исследовании минимальная выявленная с помощью РИА концентрация антигена Ф1 составляет 20 пг/мл исследуемой пробы (1500 м. т./мл).

7. Коэффициент вариации для 10 параллельных определений антигена Ф1 в одном и том же образце не должен превышать 15 % при квалифицированном проведении анализа.

8. Если перерыв между исследованиями неизвестных образцов превышает 7 сут, то при подготовке к очередному анализу следует вновь определить рабочее разведение иммунной сыворотки.

9. Меченый антиген Ф1 может быть использован в течение 2 мес при условии хранения в замороженном виде.

Меры предосторожности при метке антигена и проведении РИА.

1. Na 125 I и антиген, меченный 125 I, являются источником мягкого гамма-излучения. Период полураспада 125 I составляет 60 сут.

2. При работе с 125 I следует соблюдать правила работы с радиоактивными веществами (РВ) по 3-му классу.

3. Химическая посуда и оборудование, использованные при работе с РВ, должны быть соответствующим образом маркированы и храниться отдельно.

4. При работе с РВ на рабочем месте должны отсутствовать посторонние предметы и личные вещи.

5. Категорически запрещается прием пищи, использование косметических средств, курение в помещениях, предназначенных для работы с РВ.

6. Необходимо при работе с РВ использовать резиновые перчатки, а после работы тщательно мыть руки.

7. Жидкие и твердые радиоактивные отходы должны быть помещены в контейнеры с последующим захоронением.

Практическое использование. РИА нашел широкое применение в тех областях биологии и медицины, где важно определить следовые количества веществ: эндокринология, фармакология, токсикология, а также микробиология и вирусология.

Исключительную важность использования РИА для контроля за эффективностью оздоровления природных очагов иллюстрирует следующий пример.

В РИА был исследован полевой материал (суспензии органов диких грызунов, птиц, трупов грызунов), добытый с территории оздоровленного Саглинского мезоочага чумы (Тыва). Обработка ДДТ территории очага привела к резкому снижению численности эктопаразитов и прекращению эпизоотического процесса. Результаты контрольных исследований носителей и переносчиков с оздоровленной территории, проведенные стандартными методиками, были неизменно отрицательными. Всего радиоиммунологическому анализу подвергнуто с этой территории 125 объединенных проб от 642 грызунов, 10 птиц и 2 трупов павших грызунов. Специфический чумной антиген был обнаружен в 28 % проб. Обследование грызунов в РИА с контрольной неэнзоостийной в прошлом территории дало негативные результаты. Оздоровление Саглинского мезоочага чумы следовало считать условным. На следующий год это было подтверждено шестью серопозитивными пробами РИГА — РНАг с указанной территории. Таким образом, РИА как наиболее чувствительный метод превосходит возможности стандартных серологических тестов, что позволило обнаружить следовые количества чумного микроба у грызунов.

То обстоятельство, что серологические методы нового поколения (РИА, ХЛИА, ИФА) значительно превосходят по чувствительности РИГА и ее модификации, а также бактериологический метод — факт широко известный и всеми признаваемый. Поэтому их следует рекомендовать наряду со стандартными тестами для контроля за эффективностью оздоровительных мероприятий в природных очагах чумы. Полностью подтвердили преимущество РИА обследования основного носителя — горного суслика в Центрально-Кавказском природном очаге чумы; антиген был выявлен в большем числе случаев. У экспериментально зараженных горных сусликов специфический антиген обнаруживали в течение 279 сут.

РИА с успехом применяется в ветеринарии для обнаружения бруцелл (М. Serrano et al., 1987), вируса африканской чумы свиней (Е. Tabares et al., 1987) и других микроорганизмов.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

источник

Принцип радиоиммунологического анализа (РИА) основан на выявлении комплекса АГ-АТ, в котором один из иммунореагентов был мечен радиоактивным изотопом. Обычно используют изотопы йода ( 125 I или 131 I). Учет реакции проводят по убыванию или по возрастанию радиоактивности (в зависимости от методики РИА) с помощью специальных счетчиков- или-излучения. Метод высокочувствителен, но постепенно вытесняется иммуноферментным анализом, учитывая небезопасность работы с радиоактивными изотопами и необходимость в сложном регистрирующем оборудовании.

Однако там, где в качестве АГ выступает низкомолекулярный гаптен (например, лекарственные препараты, стероидные и пептидные гормоны и др.) РИА используется весьма широко. Существуют его гетерогенные варианты, аналогичные ИФА, а также конкурентные варианты.

В последнем случае на твердую фазу (например, полистироловые шарики) сорбируют известные АТ в комплексе с радиоактивно меченым АГ (например, лекарственным препаратом) в известной концентрации. К этому комплексу добавляют исследуемый материал, содержащий неизвестную концентрацию изучаемого лекарственного препарата-АГ. Он вытесняет из комплекса меченый АГ пропорционально своей концентрации. Радиоактивность вытесненного АГ измеряют с помощью счетчика и определяют концентрацию неизвестного АГ.

Клеточные методы оценки иммунитета

Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ).

Переход малых лимфоцитов в бластные формы, способные к пролиферации и дальнейшей дифференцировке называется бласттрансформацией и сопровождается морфологическими изменениями лимфоцитов. Бласты – крупные, округлой формы клетки имеют большое ядро, занимающее большую часть цитоплазмы. В ядре содержится несколько крупных базофильных ядрышек, цитоплазма бластов зернистая. Одна бластная клетка может дать клон из 16-32 и даже 64 клеток, обладающих более высокой иммунокомпетентностью, чем исходный лимфоцит. Бласттрансформация лимфоцитов может быть вызвана специфическими антигенами и неспецифическими стимуляторами (митогенами). К бактериальным митогенам относятся полисахариды грамотрицательных бактерий, туберкулин микобактерий и др.

Способностью вызывать бласттрансформацию лимфоцитов обладают отдельные продукты животного (иммуноглобулин, выделенный из гетерологичной иммунной сыворотки) и растительного (фитогемагглютинин – ФГА) происхождения.

При постановке РБТЛ кровь или выделенные из нее лейкоциты вносят в среду RPMIили Игла, затем добавляют антиген или митоген. Учет реакции после внесения митогенов проводят через 2-4 суток, а после стимуляции антигенами через 3-5 суток. Неспецифический митоген ФГА трансформирует в бласты 30-50%, а ЛПС – до 30% лимфоцитов крови человека. Под влиянием специфических антигенов в бласты трансформируются не более 5-10% малых лимфоцитов.

Результаты РБТЛ можно учитывать морфологически – прямым подсчетом бластов на окрашенных препаратах под микроскопом или радиометрическим методом, измеряя уровень включения в ДНК лимфоцитов тимидина, меченного тритием.

Реакция подавления миграции лейкоцитов (РПМЛ).

Сущность ее в том, что в присутствии антигенов лимфоциты выделяют цитокины (лимфокины), в частности, фактор, подавляющий миграцию нейтрофилов и макрофагов. К взвеси лейкоцитов добавляют антиген и заполняют ею капиллярные трубочки (контроль – без антигена или посторонний антиген). Эти капилляры помещают в камеры или лунки, заполненные питательной средой. После инкубации при 37 0 С 18 часов измеряют зону миграции клеток из капилляров или подсчитывают их количество в лунке. Если есть иммунные клетки (т.е. организм сенсибилизирован к антигену), то миграция лейкоцитов подавляется.

Кожные пробы и другие провокационные тесты

Для определения гиперчувствительности (аллергии) к антигенам-аллергенам у людей проводят провокационные тесты.Суть их в том, что соответствующий аллерген вводят в организм перорально, ингаляционно, наносят на кожу при ее скарификации или вводят внутрикожно. Обычно, спустя 30 минут оценивают немедленные аллергические реакции (ПЧНТ), а через 24-48 час – замедленные (ПЧЗТ).

На пыльцевые, пищевые, лекарственные аллергены чаще наблюдаются немедленные кожные реакции в виде покраснения и припухлости. Замедленные реакции развиваются на бактериальные антигены. Пробу Манту ставят для выявления сенсибилизации к микобактериям туберкулеза (оценка вакцинации и инфицированности). Туберкулин РРDвводят внутрикожно и при положительной реакции через 24-48 час в месте инъекции возникает воспалительная реакция. Она указывает на наличие сенсибилизации к этому антигену. Сильная реакция, или, наоборот, ее отсутствие (анергия) может быть при туберкулезе.

Кожные пробы могут использоваться для выявления иммунодефицитов и оценки резистентности к конкретной инфекции. Большинство людей встречались в течение жизни с антигенами распространенных условно-патогенных бактерий и в норме имеют к ним сенсибилизацию. При постановке внутрикожных проб с аллергенами стафилококка, стрептококка, кишечной палочки, протея, микобактерий туберкулеза (туберкулин) и другими, реакция должна быть положительной хотя бы на один из них. Отсутствие реакции может указывать на иммунодефицит.

источник

Радиоиммунный анализ — это одна из современных методик исследования биологически активных жидкостей, позволяющая с большой достоверностью определять количественное содержание в них биологически активных веществ. Этим методом можно выявлять количественное содержание гормонов или определенных ферментов.

Кроме того, методика применяется и при микробиологических исследованиях. В данном случае используются меченные радионуклидами антигены, а реакция будет считаться положительной при взаимодействии их с присутствующими в сыворотке крови пациента специфическими антителами.

Для каждого вида исследуемого материала и выявляемого биологически активного вещества или антитела определенного микроорганизма существуют специфические наборы реагентов. Они стандартизованы, следовательно, нарушения методики свыше допустимой погрешности практически невозможны. В итоге получают достаточно достоверные результаты исследования.

Как проводится анализ? В утреннее время производится забор венозной крови. Методика забора достаточно стандартна и не отличается от способа взятия пробы крови для биохимического исследования. Далее в лабораторных условиях проходит отделение сыворотки, которая и используется для постановки РИА.

Ее смешивают с заданными реагентами.Далее смесь инкубируется в термостате при определенной температуре. В готовой к анализу смеси производят разделение на свободные и связанные радиоактивные изотопы. Только после этого и осуществляется само исследование с расчетом полученных результатов.

Данный вид исследования достаточно вариабелен. В настоящее время разработаны его различные варианты. Так, вышеописанная методика относится к жидкофазному РИА, то есть все реагенты в данном случае находятся в жидком состоянии. Однако существует и твердофазная реакция. В этом случае антитела помещаются в нерастворимый в жидкости носитель, например полистирол. Другая разновидность данного метода -иммунорадиометрическое исследование. Тут будет своя специфика: вместо антигена изотопами метят антитела.

Принципы, на которых построен радиоиммунный анализ, широко применяются и при других методах лабораторных исследований. Примером может служить иммунофлюоресцентный анализ, который более известен по аббревиатуре — ИФА. Однако в этом случае вместо радиоактивного изотопа применяется особый состав, способный давать свечение при взаимодействии с исследуемым материалом в темном поле.

Если речь идет о реакциях, не относящихся к иммунологическим видам исследования, то в этом случае вместо антител применяются особые реагенты, которые связываются с исследуемым веществом.

Например, в эндокринологии при определении содержания в крови гормонов для радиорецепторного вида исследования в случае выявления тиреостимулирующих и тиреоблокирующих антител используют реагент, содержащий очищенные рецепторы ТТГ, а для определения уровня несвязанного Т4 используют тироксинсвязывающий глобулин.

Врачи выделяют ряд патологических нарушений в организме, при которых рекомендуется проводить данный тип анализа:

  1. В кардиологии при диагностике различных тяжелых состояний.
  2. При опухолевых процессах данный метод поможет выявить маркеры опухоли, а также даст возможность проконтролировать качество проводимой терапии.
  3. Эндокринология использует данный способ диагностики достаточно широко. Он позволяет с высокой долей достоверности определить суточные колебания содержания инсулина у больных диабетом. Кроме того, этим способом можно выявить содержание гормонов даже в достаточно малых концентрациях в крови и моче.
  4. Гинекологи, используя радиоиммунологический анализ, могут продиагностировать причины бесплодия или спрогнозировать возможные нарушения формирования плода еще в материнской утробе, или определить динамическое содержание гормонов в течение всего периода менструального цикла.
  5. Инфекционистам данное исследование поможет поставить точный диагноз, например при кишечных инфекциях, тифах и так далее.

Широкие возможности данного метода исследования делают его достаточно желанным во многих клинических учреждениях. В крупных городах и диагностических центрах эта методика достаточно давно применяется. Однако в обычных больницах небольших городов она не получила широкого применения. В чем же причина?

РИА предусматривает наличие высокоточной, следовательно, достаточно дорогостоящей специальной аппаратуры — гамма-счетчиков. Кроме того, расходные материалы и применяемые реактивы стоят тоже дорого, а допустимый срок их использования достаточно короткий из-за краткого времени распада радиоактивных компонентов. Именно этот недостаток считается основным, так как еще более повышает себестоимость данного лабораторного исследования.

Кроме того, некоторые лечебные центры предпочитают не использовать в своей деятельности радиоактивные изотопы. Поэтому радиоиммунный вид исследования заменяют аналоговыми модификациями иммуноферментного анализа, например в иммунологии. Реакция тоже высокочувствительная, а взаимодействие с радиоактивными веществами полностью отсутствует.

Наиболее перспективным данное исследование является для вирусологии, именно в направлении определения вирусных возбудителей в наиболее кратчайшие сроки выполняются самые перспективные разработки методик РИА.

Это связано с ростом заболеваемости вирусными инфекциями, их высокая контагиозность, скорость распространения и высокая смертность среди заболевших пациентов.

Особенно такая тенденция характерна для стран, стоящих на низком уровне экономического и социального развития. Так например, в странах Дальнего Востока широко применяется данное исследование для диагностики гриппа в период эпидемического осложнения. Это позволило значительно снизить смертность среди населения обследуемых контингентов.

Микробиология очень широко использует методики данного вида исследования для ранней диагностики инфекционных заболеваний, вызванных патогенными или условно патогенными бактериями. Примером может служить применение РИА для диагностирования брюшного тифа.

Данный возбудитель относится к серологическим штаммам сальмонеллезной группы инфекций. Заболевание характеризуется тяжело протекающей интоксикацией, возникающей при попадании в кровеносное русло больного человека продуктов жизнедеятельности возбудителя. Максимального пика клиническая картина достигает к 5 дню болезни. В этот период симптоматика кишечного расстройства сменяется запором и клинической картиной обезвоживания. Кроме того происходит увеличение объема внутренних органов. Больной ослаблен, вял.

Для подтверждения диагноза с первых дней заболевания еще до назначения терапии проводится бактериологическое исследование каловых и рвотных масс. Однако оно не всегда дает положительный и достоверный результат. Это связанно с особенностями возбудителя. Он имеет несколько серологических типов, сложных в диагностике.

Да и сроки его выполнения достаточно продолжительные. Врач получит результат не ранее, чем через четыре или пять дней после проведенного исследования, что будет в некоторых случаях поздно, а больному необходимо назначить правильное лечение в достаточно короткие сроки. Как можно ускорить диагностические мероприятия?

В данном случае радиоиммунные методики диагностики являются незаменимыми. В качестве исследуемого материала используется кровь больного человека. В ней могут искать как антитела, так и антигены к предполагаемому возбудителю. Достоверный ответ можно получить уже на следующий день после проведенного исследования.

В данном случае РИА поможет точно поставить диагноз. Правда выявить чувствительность возбудителя к антибиотикам невозможно, однако врач-инфекционист может с большей уверенностью провести дифференциальную диагностику брюшного тифа с пневмонией бактериального генеза, малярией, сепсисом и др. То есть с теми патологическими состояниями, которые имеют схожую клиническую картину, и это позволит назначить правильную терапию.

источник