Анализ воды на гепатит а

Гепатит — общее название диффузных, то есть захватывающих весь орган, воспалительных заболеваний печени. Гепатиты бывают аутоиммунными, токсическими и вирусными. Современная медицина различает 7 видов вирусных гепатитов — А, В, С, D, E, F, G, гепатиты как компоненты других вирусных заболеваний (СПИД, краснуха, желтая лихорадка) и бактериальные гепатиты, возникающие при сифилисе или лептоспирозе.

Вирусные гепатиты распространены наиболее широко, поскольку легко передаются бытовым способом, с кровью, от матери к плоду или при незащищенном половом контакте. В анализе крови инфицированного больного могут быть обнаружены антигены и антитела — маркёры заболевания, а также специфические внутриклеточные ферменты печени. В число необходимых анализов для полноценной диагностики гепатита входит биохимия крови.

Вирусные гепатиты в 90% случаев протекают бессимптомно и излечиваются самопроизвольно за счет действия иммунной системы человека. Если болезнь все-таки дала о себе знать, активная ее фаза делится на два периода: преджелтушный и желтушный. Сначала отмечаются такие общие для вирусных инфекций симптомы, как:

• общая слабость;
• кожный зуд;
• тошнота, рвота, диарея;
• температура тела до 38°С;
• головные, мышечные, суставные боли.

Затем наступает желтушный период, когда пораженная печень выбрасывает в кровь большое количество билирубина — желтого пигмента. Именно с этого момента становится очевидно, что у пациента проблемы с печенью, и назначается комплекс лабораторных исследований крови, мочи и кала.

Однако следует учитывать тот факт, что многие случаи заражения не проявляются в симптоматике. То есть после инкубационного периода, который может длиться от пары недель до месяцев, гепатиты не позволяют себя обнаружить по внешним клиническим признакам не только в продромальной (преджелтушной) стадии, но и в желтушной — по причине отсутствия ее как таковой. Например, в 2/3 всех случаев гепатит B проходит в атипичной (безжелтушной, или субклинической) форме. В такой ситуации следует задаться справедливым вопросом…

Периодическая проверка на гепатит необходима каждому, особенно если планируется беременность или сменился половой партнер, ухудшилась эпидемиологическая обстановка в окружающем вас коллективе, обнаружен вирус у кого-то из родственников, у вас нашли хронические формы каких-либо заболеваний, при любых симптомах, напоминающих пищевое отравление, или при патологической усталости и утомляемости. В профилактических целях золотым стандартом считается ежегодное вирусологическое исследование. Срочно следует провериться, если вы случайно порезались или укололись сомнительным предметом, которым могли пользоваться до вас — например, если в почтовом ящике вы нашли использованный одноразовый шприц и успели им пораниться.

Врач обязательно назначит вам анализ крови на гепатит, если вы пришли с жалобами на следующие симптомы:

• пожелтение кожи и белков глаз;
• тяжесть, распирание, боли в правом подреберье;
• непереносимость жирной пищи;
• моча бурого цвета, обесцвечивание стула.

Анализы на гепатит входят в список необходимых исследований при оформлении медицинских книжек для персонала лечебно-профилактических учреждений, роддомов, детских больниц и детских поликлиник, домов ребенка, школ-интернатов, учреждений особого режима. Доноры крови и лица, стоящие на учете в наркологических и кожно-венерологических диспансерах и кабинетах, в обязательном порядке проходят проверку.

Кровь на биохимический анализ сдается строго натощак, в утренние часы, с 8 до 11. Это обусловлено суточными ритмами, которые влияют на содержание гормонов в крови. Вирусологический анализ на гепатит (антигены и антитела) может быть сдан в любое время суток, но тоже натощак: важно не принимать пищу в течение 4–6 часов до забора крови. В обоих случаях используется венозная кровь, которая как биоматериал более качественна, чем капиллярная.

Накануне сдачи любых анализов крови рекомендуется избегать физических и эмоциональных нагрузок, приема алкоголя и тяжелой пищи. Питьевой режим должен быть обычным.

Гепатит А, передающийся бытовым путем, также называется болезнью Боткина. Чаще всего вспышки гепатита А отмечаются в условиях скученности людей, при низкой санитарии. Гепатит А не переходит в хроническую форму и дает наименьшие осложнения. Тем не менее, в острой форме он способен причинить инфицированному больному существенный дискомфорт.

Необходимые качественные анализы:

• Anti-HAV-IgG (антитела класса IgG к вирусу гепатита А) . Результат может быть положительным, если больной был вакцинирован против гепатита А, болеет им в настоящий момент или только что перенес заболевание. В этом случае у него вырабатывается иммунитет. Отрицательный результат означает отсутствие иммунитета к гепатиту А и возможность заражения.
• Anti-HAV-IgM (антитела класса IgM к вирусу гепатита А) . Варианты результатов — «положительно», «отрицательно», «сомнительно». В первом случае речь идет об остром или недавно перенесенном гепатите А, во втором — не выявлено иммунитета к вирусу и возможно заражение в ближайшее время при наличии очага инфекции дома или в коллективе. Сомнительным считается результат, близкий к пороговому значению. В этом случает необходимо следить за состоянием пациента в течение недели. Результаты исследования anti-HAV IgM используют обязательно в комплексе с другими маркёрами гепатита и данными о самочувствии пациента.
• Определение РНК (HAV-RNA) в сыворотке крови. Результат «обнаружено» означает, что в образце крови нашли фрагмент РНК, специфичный для вируса гепатита А, можно диагностировать заражение гепатитом А. Отрицательный результат говорит об отсутствии фрагментов вредоносной РНК или о том, что их концентрация ниже чувствительности теста.

Гепатит А считается в основном детской болезнью, но его последствия сказываются на здоровье всю жизнь. Поэтому при вспышке инфекции важно изолировать больных и следить за состоянием остальных людей, находившихся в очаге заражения.

Вирус гепатита В передается в быту, половым путем или с кровью. Является очень устойчивым и может сохраняться во внешней среде около недели, даже в засохшей крови, на лезвии бритвы или на конце иглы. Им инфицировано 350 000 000 людей во всем мире, и ежегодно от последствий гепатита В погибает 1 000 000 человек. Благодаря повсеместной вакцинации эти цифры имеют тенденцию к снижению. Для диагностики гепатита В нужны следующие анализы:

• Анализ на HBs-антиген, или австралийский антиген. Этот анализ на вирус гепатита может быть как качественным, так и количественным. Референсное значение — 0,5 МЕ/мл. Если получен меньший результат, тест отрицательный, если больший — положительный. Если антиген выявлен, это может свидетельствовать об остром или хроническом гепатите В, а также о носительстве вируса. Отрицательный результат может трактоваться как отсутствие гепатита В только при отрицательных результатах анализов на другие маркёры. Не исключается хронический гепатит В с низкой интенсивностью репликации. В редких случаях отрицательный результат получают при молниеносном, злокачественном течении болезни либо при гепатите В с дефектным HBs-антигеном.
• Исследование HBеAg (HBе-антиген вируса гепатита В). Качественный тест. При положительном результате диагностируется острый или хронический гепатит В с высокой интенсивностью репликации. Отрицательный результат означает отсутствие гепатита В только при отсутствии других маркёров. Может быть получен при остром или хроническом гепатите с низкой интенсивностью репликации, а также в период инкубации или выздоровления.
• Определение Anti-HBс-total (антитела классов IgM и IgG к HB-core антигену вируса гепатита) . Качественный тест, который при положительном результате позволяет диагностировать гепатит В, но не дает возможности уточнить, острый он или хронический и в какой фазе протекает. Отрицательный результат при отсутствии других маркёров может означать отсутствие гепатита В, его инкубационный период или хроническую форму.
• Анализ на Anti-HBс IgМ (антитела класса IgМ к HB-core-антигену вируса гепатита B) . Качественный анализ, с вариантами «отрицательно», «положительно», «сомнительно». При сомнительном результате рекомендуется повторить анализ через 10–14 дней. Положительный результат всегда выдается при остром гепатите и иногда — при хроническом. Отрицательный результат при отсутствии других маркёров может означать отсутствие гепатита В, его инкубационный период или хроническую форму.
• Определение Anti-HBе (антитела к HBе-антигену вируса гепатита B). Качественный тест. Положительный результат может означать фазу выздоровления после острого гепатита В, хронический гепатит В или хроническое бессимптомное носительство вируса. Отрицательный результат может быть получен как при отсутствии гепатита, так и при его хронической форме или в инкубационном периоде острой формы. Также нельзя исключить носительство HBs-антигена с низкой репликацией.
• Выявление Anti-HBs (антитела к HBs-антигену вируса гепатита B). Количественный тест. Референсное значение — 10 мЕд/мл. Если показатель выше, это может означать успешную вакцинация против гепатита В, выздоровление или хронический гепатит В с низкой инфекционностью. Если показатель ниже, это означает, что не был достигнут эффект вакцинации или заболевание не было перенесено ранее. Также возможно, что пациент переживает инкубационный или острый период острого гепатита В, хроническую форму болезни с высокой инфекционностью или является носителем HBs-антигена с низкой репликацией.
• Определение ДНК (HBV-DNA) в сыворотке крови. Положительный результат (более 40 МЕ/л) говорит об инфицировании вирусом гепатита В. Отрицательный (менее 40 МЕ/л) — об отсутствии инфицирования или концентрации возбудителя заболевания в образце крови ниже границы чувствительности теста.

Будучи наиболее распространенным, гепатит В может быть предотвращен только при высокой информированности населения и организации вакцинирования. Для лиц группы риска вакцинирование является основным методом защиты.

Этот вид гепатита передается с кровью и другими биологическими жидкостями. Он имеет шесть разновидностей, поэтому анализы необходимо проводить в комплексе. В группу риска входят люди, принимающие наркотики внутривенно, ведущие беспорядочную половую жизнь, медработники, а также пациенты, которым прописывались гемодиализ или переливания крови.

При подозрении на гепатит С и в профилактических целях сдаются следующие анализы:

• Анализ на аnti-HCV-total (антитела к антигенам вируса гепатита C). Качественный анализ, который при положительном результате означает инфицирование или период восстановления после него. Не позволяет различить форму и стадию гепатита С. При отрицательном результате возможен инкубационный период или вариант гепатита С, нечувствительный к данному анализу.
• Определение РНК (HCV-RNA) в сыворотке или плазме крови. Анализ может быть качественным и количественным. При качественном анализе результат «обнаружено» позволяет диагностировать заражение гепатитом C. Отрицательный результат говорит об отсутствии фрагментов вредоносной РНК или о том, что их концентрация ниже чувствительности теста.

При количественном анализе плазмы крови:

• «не обнаружено» : РНК гепатита С не выявлена или значение ниже предела чувствительности метода (15 МЕ/мл). Результат интерпретируют как «РНК гепатита С не выявлена»;
• 100 000 000 МЕ/мл : результат интерпретируется как: «РНК гепатита С выявлена в указанной концентрации, выходящей за пределы линейного диапазона, тест ставился в разведении 1:Х».

При количественном анализе сыворотки крови:

• «не обнаружено» : РНК гепатита С не выявлена или значение ниже предела чувствительности метода (60 МЕ/мл). Результат интерпретируют как «РНК гепатита С не выявлена»;
• 2 МЕ/мл : результат положительный с концентрацией РНК гепатита С менее 102 МЕ/мл;
• от 10 2 до 10 8 МЕ/мл : результат положительный. Полученное значение находится в пределах линейного диапазона;
• 10 8 МЕ/мл : результат положительный с концентрацией РНК гепатита С более 108 МЕ/мл.

Определение антител IgG (recomBlot HCV IgG). Качественный тест. Отрицательный результат говорит об отсутствии инфицирования. Исключения составляют инкубационный период и очень ранняя острая фаза, иммуносупрессированные пациенты, новорожденные с антителами матери. Положительный результат: пациент был инфицирован ранее. Сомнительный результат: возможно, была инфекция.

Гепатит С второй по распространенности после гепатита В, поэтому при подозрении на патологии печени чаще всего анализы делают именно на эти два вирусных заболевания. Однако менее «популярные» вирусы тоже могут причинить печени существенный вред.

Вирус гепатита D имеет в составе оболочки белок гепатита В, поэтому развивается только у инфицированных гепатитом В. Воздействие на организм сразу двух вирусов приводит к тяжелому и хроническому воспалению печени.

Вирус гепатита G встречается у 85% инъекционных наркоманов, также передается половым путем, часто сопутствует гепатитам В, С и D. Для диагностики гепатитов D и G используются следующие тесты:

• Определение РНК (HDV-RNA) в сыворотке крови . Результат «обнаружено» означает, что в образце крови нашли фрагмент РНК, специфичный для вируса, можно диагностировать заражение гепатитом D. Отрицательный результат говорит об отсутствии фрагментов вредоносной РНК или о том, что их концентрация ниже чувствительности теста.
• Определение РНК (HDV-RNA) гепатита G в сыворотке крови . Результат «обнаружено» означает, что в образце крови нашли фрагмент РНК, специфичный для вируса гепатита G, можно диагностировать заражение. Отрицательный результат говорит об отсутствии фрагментов вредоносной РНК или о том, что их концентрация ниже чувствительности теста.
• Анализ на наличие антител класса IgM (Hepatitis delta virus, IgM antibodies; anti-HDV IgM). Качественный анализ, при положительном результате говорящий об остром течении вирусного поражения гепатитом D. Положительный результат в редких случаях может дать неспецифическая интерференция сыворотки. Отрицательный ответ можно получить при отсутствии острой инфекции, в раннем инкубационном периоде и через один-два года после выздоровления.
• Суммарные антитела к гепатиту D (Hepatitis delta virus antibodies; anti-HDV total) . Качественный анализ. «Положительно» — острая или хроническая инфекция, текущая или имевшая место в прошлом. Положительный результат в редких случаях может дать неспецифическая интерференция сыворотки. Отрицательный результат получают при отсутствии острой инфекции, в раннем инкубационном периоде и через один–два года после выздоровления.

После окончания острого периода, антитела к гепатитам D и G могут сохраняться в крови до двух лет. Поэтому при положительном результате анализа обычно назначается повторное исследование.

Вирус гепатита Е передается бытовым путем — в основном через загрязненную питьевую воду — и протекает только в острой форме. После перенесенного гепатита Е формируется стойкий, но не пожизненный иммунитет. Сдается всего два качественных анализа:

• Определение аnti-HEV-IgM (антитела класса IgM к вирусу гепатита Е) . Положительный результат говорит об острой стадии гепатита Е, отрицательный — либо об отсутствии, либо о ранней стадии, либо о периоде выздоровления.
• Определение anti-HEV-IgG (антитела класса IgG к вирусу гепатита Е). Положительный результат может быть получен на острой стадии гепатита Е, а также при наличии вакцинации или экспозиции к вирусу гепатита Е в прошлом. Отрицательный результат возможен в отсутствие гепатита Е, на ранней стадии заболевания или во время выздоровления.

Расшифровать результаты анализов и поставить диагноз с учетом клинической и эпидемиологической картины под силу только специалисту. Заниматься самодиагностикой означает причинять вред своему здоровью и ставить под угрозу здоровье окружающих.

По итогам всех проведенных тестов, если не найдено никаких маркёров вирусного гепатита, можно говорить об отсутствии заболевания. Однако в некоторых случаях врачи рекомендуют сделать анализы повторно через две недели.

В случае положительной реакции обязательно проводится повторный уточняющий анализ через две недели, поскольку возможен вариант, когда пациент только что переболел острой формой вирусного гепатита и маркёры в крови пока еще сохраняются.

В целях профилактики вирусных гепатитов желательно пройти вакцинацию (актуально для гепатита В), а также соблюдать гигиену в быту, избегать случайных половых связей и употребления инъекционных наркотиков.

К ана­ли­зам на ви­ру­сы ге­па­ти­та мо­гут по­двиг­нуть не­бла­гоп­ри­ят­ные ре­зуль­та­ты био­хи­ми­чес­ко­го ис­сле­до­ва­ния на АлАт (ала­нин-ами­нот­ран­сфе­ра­зу) и АсАт (ас­пар­тат-ами­нот­ран­сфе­ра­зу), на пря­мой и об­щий би­ли­ру­бин, ГГТ (гам­ма-глу­та­мил-транс­пеп­ти­да­зу) и ще­лоч­ную фос­фа­та­зу. Но воз­мо­жен и об­рат­ный сце­на­рий: для уточ­не­ния кли­ни­чес­кой кар­ти­ны за­бо­ле­ва­ния врач на­зна­чит скри­нин­го­вое об­сле­до­ва­ние пе­че­ни по этим по­ка­за­те­лям. В лю­бом слу­чае ви­ру­со­ло­ги­чес­кие и био­хи­ми­чес­кие те­с­ты вза­им­но до­пол­ня­ют друг дру­га, по­сколь­ку име­ют раз­лич­ные объ­ек­ты ис­сле­до­ва­ния.

источник

Коварство вирусных заболеваний, таких как гепатиты, заключается в том, что заражение происходит вмиг, но больной долгое время может даже не догадываться о том, что он инфицирован. Точно диагностировать болезнь и подобрать необходимую терапию помогают вовремя сделанные анализы. Давайте поговорим о них более подробно.

Под гепатитом понимают воспалительное заболевание печени. Оно может иметь как острую, так и хроническую форму. Чаще всего встречаются болезни вирусного характера. На сегодняшний день известно семь основных разновидностей вирусов гепатитов – это группы A, B, C, D, E, F и G. Однако, независимо от типа вируса, на начальном этапе болезнь протекает схоже: неприятные ощущения в правом подреберье, температура, слабость, тошнота, ломота во всем теле, потемнение мочи, желтуха. Все эти симптомы являются поводом для сдачи анализа на гепатит.

Следует знать, что заболевание может передаваться разными способами: через зараженную воду и пищу, через кровь, слюну, половым путем, при использовании чужих средств гигиены, в том числе бритвы, полотенца, маникюрных ножниц. Поэтому если симптомы не проявляются (а инкубационный период может длиться до двух месяцев и даже более), но у вас имеются предположения, что вы можете быть заражены, то тест на гепатит нужно сделать как можно скорее.

Кроме того, регулярно сдавать подобные анализы необходимо медицинским работникам, сотрудникам служб безопасности, специалистам по маникюру и педикюру, стоматологам, словом – всем, чья повседневная работа связана с соприкосновением с биологическими материалами других людей. Также тест показан специалистам, чья профессиональная деятельность сопряжена с поездками в экзотические страны.

Вызывается РНК-вирусом семейства Picornaviridae. Вирус передается через бытовые предметы и продукты питания, поэтому заболевание также называют «болезнь грязных рук». Симптоматика типичная для любого вида гепатита: тошнота, температура, боль в суставах, слабость. Затем проявляется желтуха. Инкубационный период длится в среднем 15–30 дней. Различают острую (желтушную), подострую (безжелтушную) и субклиническую (бессимптомную) формы болезни.

Выявить гепатит А позволяет анализ Anti-HAV-IgG (антитела класса IgG к вирусу гепатита А). Также данный тест помогает определить наличие иммунитета к вирусу гепатита А после вакцинации, это исследование особенно необходимо во время эпидемий. При клинических признаках гепатита А, контактах с больным, холестазе (нарушение оттока желчи) назначают Anti-HAV-IgM (антитела класса IgM к вирусу гепатита А). При этих же показаниях делают тест на определение РНК-вируса в сыворотке крови методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в плазме крови.

Вызывается вирусом HBV из семейства гепаднавирусов. Возбудитель очень устойчив к высоким и низким температурам. Гепатит В представляет серьезную опасность: около 2 миллиардов людей в мире инфицированы этим вирусом, а более 350 миллионов – больны им.

Заболевание передается через колюще-режущие предметы, кровь, биологические жидкости, при половых контактах. Инкубационный период может длиться от 2 до 6 месяцев, если в этот период не выявить и не начать лечить заболевание, то оно из острой может перейти в хроническую стадию. Течение болезни проходит со всеми симптомами, характерными для гепатита. В отличии от гепатита А при гепатите В нарушение функций печени носит более выраженный характер. Чаще развиваются холестатический синдром, обострения, возможны затяжное течение, а также рецидивы болезни и развитие печеночной комы. Нарушение правил гигиены и незащищенные случайные половые контакты являются поводом для проведения теста.

Для выявления этого заболевания назначают количественный и качественный тесты на определение HBsAg (Hepatitis B surface antigen, HBs-антиген, поверхностный антиген вируса гепатита B, австралийский антиген). Интерпретация показаний количественного анализа такова: и = 0,05 МЕ/мл – положительно.

Вирусное заболевание(ранее назывался «гепатит ни А, ни В»), передающееся через зараженную кровь. Вирус гепатита С (ВГC) относится к флавивирусам. Он весьма устойчив во внешней среде. Три структурных белка вируса имеют сходные антигенные свойства и обусловливают выработку антител anti-HCV-core. Инкубационный период заболевания может длиться от двух недель до полугода. Болезнь очень распространена: в мире около 150 миллионов человек инфицированы вирусом гепатита С и подвергаются риску развития цирроза или рака печени. Ежегодно более 350 тысяч человек умирают от связанных с гепатитом С болезней печени.

Гепатит С коварен тем, что может скрываться под видами других болезней. Желтуха при данном виде гепатита проявляется редко, повышение температуры тоже наблюдается не всегда. Отмечались многочисленные случаи, когда единственными проявлениями болезни были хроническая усталость и психические расстройства. Известны также случаи, когда люди, являясь носителями и переносчиками вируса гепатита С, годами не испытывали никаких проявлений болезни.

Диагностировать заболевание можно с помощью качественного анализа Anti-HCV-total (антитела к антигенам вируса гепатита C). Количественное определение РНК-вируса делается методом ПЦР. Результат интерпретируется следующим образом:

• не обнаружено: РНК гепатита С не выявлена или значение ниже предела чувствительности метода (60 МЕ/мл);
• 108 МЕ/мл: результат положительный с концентрацией РНК гепатита С более 108 МЕ/мл.

В группу риска возникновения рака печени относят больных гепатитом В и С. До 80% случаев первичного рака печени во всем мире фиксируется у хронических носителей этих форм заболевания.

Развивается только при наличии вируса гепатита B. Способы заражения аналогичны гепатиту В. Инкубационный период может длиться от полутора месяцев до полугода. Заболевание часто сопровождается отеками и асцитом (брюшной водянкой).

Болезнь диагностируется с помощью анализа на определение РНК-вируса гепатита D в сыворотке крови методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией в режиме реального времени, а также анализом на антитела класса IgM (Hepatitis delta virus, IgM antibodies, anti-HDV IgM ). Положительный результат теста означает наличие острой инфекции. Отрицательный результат теста фиксирует ее отсутствие либо ранний инкубационный период заболевания или позднюю стадию. Тест показан пациентам, у которых выявлен гепатит В, а также колющимся наркоманам.

Вакцинация против гепатита В защищает от заражения гепатитом D.

Инфекция часто передается через продукты и воду. Вирус нередко обнаруживается у жителей жарких стран. Симптомы схожи с гепатитом А. В 70% случаев болезнь сопровождается болевым синдромом в правом подреберье. У больных расстраивается пищеварение, ухудшается общее самочувствие, затем начинается желтуха. При гепатите Е тяжелое течение болезни, приводящее к смерти, встречается чаще, чем при гепатитах А, В и С. Исследование рекомендуется делать после посещения стран, где распространен этот вирус (центральная Азия, Африка).

Заболевание выявляется при проведении теста Anti-HEV-IgG (антитела класса IgG к вирусу гепатита Е). Положительный результат означает наличие острой формы заболевания либо свидетельствует о недавно проведенной вакцинации. Отрицательный – об отсутствии гепатита Е или о выздоровлении.

Этот тип заболевания на данный момент мало изучен, а сведения, собранные о нем, противоречивы. Возбудителей болезни два, один можно обнаружить в крови, другой – в фекалиях человека, которому было сделано переливание зараженной крови. Клиническая картина – такая же, как и при заболевании другими типами гепатита. Лечение, которое было бы направлено непосредственно на сам вирус гепатита F, пока не разработано. Поэтому проводится симптоматическая терапия.

Помимо анализа крови, для выявления этой болезни исследуют мочу и кал.

Развивается только при наличие других вирусов этой болезни – В, С и D. Он встречается у 85% наркоманов, вводящих психотропные вещества непродезинфецированной иглой. Также возможно заражение при нанесении татуировок, прокалывании ушей, иглоукалывании. Передается заболевание и половым путем. Долгое время оно может протекать без выраженной симптоматики. Течение болезни во многом напоминает гепатит С. Исходами острой формы заболевания могут быть: выздоровление, формирование хронического гепатита или длительное носительство вируса. Сочетание с гепатитом С может привести к циррозу.

Выявить болезнь можно с помощью анализа на определение РНК (HGV-RNA) в сыворотке крови. Показанием для проведения теста являются зафиксированные ранее гепатиты С, В и D. Также тест необходимо пройти наркоманам и тем, кто с ними контактирует.

Для анализов на все виды гепатита берут кровь из вены. Забор крови производится утром натощак. Специальной подготовки процедура не требует, однако накануне следует воздержаться от физических и эмоциональных перегрузок, отказаться от курения и употребления алкоголя. Обычно результаты тестов бывают готовы через сутки после забора крови.

Анализы на выявление гепатитов могут быть качественными (они указывают на наличие или отсутствие вируса в крови) или количественными (устанавливают форму заболевания, помогают контролировать течение болезни и эффективность терапии). Интерпретировать анализ и ставить диагноз на основании теста может только врач-инфекционист. Однако давайте в общих чертах рассмотрим, какими бывают результаты тестов.

Подобный результат говорит о том, что вируса гепатита в крови не обнаружено – качественный анализ показал, что тестируемый здоров. Ошибки быть не может, так как антиген проявляется в крови уже во время инкубационного периода.

Говорить о хорошем результате количественного анализа можно в том случае, если количество антител в крови ниже пороговой величины.

В случае положительного результата через некоторое время (по усмотрению врача) проводится повторный анализ. Дело в том, что повышенное содержание антител может быть вызвано, например, тем, что пациент недавно перенес острую форму гепатита, и антитела в крови все еще присутствуют. В иных случаях положительный результат свидетельствует об инкубационном периоде, наличии острого или вирусного гепатита или подтверждает то, что пациент является носителем вируса.

Согласно российскому законодательству, информация о положительных результатах серологических исследований на маркёры парентеральных вирусных гепатитов передается в отделы учета и регистрации инфекционных заболеваний соответствующих центров Госсанэпиднадзора.

В случае если тест был проведен анонимно, его результаты не могут быть приняты для оказания медицинской помощи. При положительном результате теста следует обратиться к врачу-инфекционисту для назначения дальнейшего обследования и проведения необходимой терапии.

Гепатит не приговор, в большинстве случаев острая форма заболевания полностью излечивается, хронический гепатит, при соблюдении определенных правил, кардинально не меняет качества жизни. Главное – вовремя обнаружить вирус и начать борьбу с ним.

В частных клиниках Москвы можно сдать анализы на выявление и конкретизацию вируса гепатита. Так, качественный анализ на гепатит А стоит в среднем 700 рублей, столько же на гепатит В; а вот количественный тест на поверхностный антиген вируса гепатита B обойдется примерно в 1300 рублей. Определение вируса гепатита G – в 700 рублей. А вот более сложный анализ, количественное определение РНК вируса гепатита С методом ПЦР, стоит около 2900 рублей.

В настоящее время не существует затруднений в проведении диагностики гепатитов, тем более в центральных областях развитых стран. А вот чтобы избежать подобных болезней, не стоит пренебрегать правилами личной гигиены. Также следует помнить о том, что случайные сексуальные контакты могут стать причиной болезни. Лучшей защитой от возможных заболеваний станет вакцинация – против большинства вирусов гепатита она давно и успешно практикуется.

Исследование на гепатит можно пройти в государственных, ведомственных и частных клиниках. Преимущество последних заключается в том, что там не требуется направление лечащего врача, а результаты готовятся оперативнее. Рекомендуем обратить внимание на лаборатории «ИНВИТРО». Эта сеть медицинских клиник специализируется на диагностике и анализах, обладает собственными лабораториями. Она предлагает пройти исследование на наличие всех типов гепатитов по следующим ценам: Anti-HAV-IgG – 695 рублей; HBsAg, качественный тест – 365 рублей; HBsAg, количественный тест – 1290 рублей; Anti-HBs – 680 рублей; Anti-HCV-total – 525 рублей; количественное определение РНК вируса гепатита С методом ПЦР – 2850 рублей; HDV-RNA – 720 рублей; HGV-RNA – 720 рублей; Anti-HEV-IgM и Anti-HEV-IgG – по 799 рублей за каждый. Ответственность перед пациентами и высокий уровень профессионализма сотрудников – визитная карточка «ИНВИТРО».

источник

УТВЕРЖДАЮ Председатель Государственного Комитета по санитарно-эпидемиологическому надзору РФ E.H.Беляев 11 сентября 1992 года 01-19/12-13

Учреждение-разработчик

НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина РАМН к.м.н. Недачин А.Е., к.б.н. Дмитриева Р.А., к.м.н. Доскина Т.В., к.м.н. Корнилова Н.М., Лезновенко Э.А. — разделы 1, 2, 3; приложения 1, 2. тел. 245-04-46

Учреждения-соисполнители:

Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии профессор Алейник М.Д., к.м.н. Блохин К.В., к.м.н. Быстрова Т.Н., Бурков А.Н. — раздел 3, приложения 3, 5. тел. 33-86-09

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН — профессор Васильева В.И., к.м.н. Асратян А.А., Као-Минь Нга — раздел 2. тел.193-43-01

НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН — к.м.н. Счастный Э.И. — раздел 2. тел. 190-28-69

НИИ вирусологии Узбекской АН — к.м.н. Макарова Г.И. — раздел 2, приложение 4. тел. 62-52-24

Методические рекомендации предназначены для центров санэпиднадзора и научно-исследовательских институтов

В настоящее время проблема организации и осуществления контроля вирусного загрязнения водных объектов, а также воды в системе водообеспечения является одной из наиболее актуальных в связи с ростом заболеваемости населения кишечными вирусными инфекциями с фекально-оральным механизмом передачи, распространяемыми на основе реализации водного фактора, являющегося ведущим на ряде территорий страны.

В этих условиях особое значение приобретают вопросы контроля и оценки качества воды водных объектов в отношении возбудителей вирусного гепатита (ВГА) в связи с отсутствием тенденции к регулированию эпидемического процесса данной инфекции, а также вызываемого ею значительного экономического ущерба.

Отсутствие до настоящего времени мер эффективной профилактики в отношении вирусных гепатитов с фекально-оральным механизмом передачи диктует необходимость разработки ускоренных методов индикации их возбудителей во вредных объектах, что чрезвычайно важно для своевременного планирования и проведения комплексных санитарно-гигиенических и противоэпидемических мероприятий, направленных на ограничение циркуляции возбудителей вирусных гепатитов и других кишечных инфекций вирусной этиологии, распространяемых водным путем.

Вирусологический контроль водных объектов окружающей среды, включающий определение в воде колифагов, энтеровирусов и антигена вируса гепатита А, крайне необходим в настоящее время, что нашло отражение в приказе МЗ СССР N 543 от 08.07.88 «О мерах совершенствования и организации работы вирусологических лабораторий», в котором определены задачи практических лабораторий, предусмотрены положения и основные направления работы, а также номенклатура вирусологических исследований лабораториями санитарно-эпидемиологических станций, где наряду с адено- и энтеровирусами предусматривается определение в питьевой воде и воде открытых водоемов возбудителей вирусных гепатитов с фекально-оральным механизмом передачи. Эти задачи также определены Приказом МЗ СССР N 408 от 12.07.89 «О мерах по снижению заболеваемости вирусными гепатитами в стране» (п.2.4).

Однако в практике санитарно-эпидемиологической службы непосредственный вирусологический контроль водных объектов связан с рядом трудностей, таких как слабая оснащенность лабораторий, трудоемкость исследований, требующих специального и дорогостоящего оборудования, диагностикумов, культур тканей и, что является главным, недостаточной разработанностью методических приемов индикации важных вирусов: гепатита А, Е и др.

В связи с вышеизложенным текущий санитарно-вирусологический контроль объектов необходимо осуществлять и с использованием косвенных показателей, что является более экономичным и дает быстрый ответ о степени эпидемической опасности водных объектов в отношении вирусного загрязнения. В соответствии с результатами, полученными по косвенным показателям, проводится прямое определение вирусов, и в том числе антигена вируса гепатита А. Кратность этих исследований определяется врачом-эпидемиологом.

Определение колифагов проводится в бактериологических лабораториях центров санэпиднадзора всех уровней: районных, сельских, городских, областных, республиканских (приложение 1); определение энтеровирусов — в вирусологических лабораториях городских, областных и республиканских центров санэпиднадзора (приложения 2, 3); определение антигена ВГА — в вирусологических лабораториях областных, республиканских центров санэпиднадзора и лабораториях НИИ, имеющих соответствующее оборудование и диагностикумы.

2. Гигиенические и эпидемиологические показания к проведению санитарно-вирусологического контроля водных объектов

2.1. Санитарно-гигиенические показания

Проведение текущего санитарно-эпидемиологического надзора основывается на комплексной оценке санитарного состояния и коммунального благоустройства территории, а также конкретной эпидемической обстановки по заболеваемости населения кишечными инфекциями бактериальной и вирусной этиологии, включая вирусный гепатит А.

Так, при анализе санитарно-гигиенического состояния контролируемых населенных пунктов определяется, насколько соответствуют изучаемые показатели качества воды регламентируемым нормативам. Постоянное неудовлетворительное санитарное состояние изучаемой территории, низкая эффективность работы очистных сооружений, а также несоответствие качества воды различных видов водопользования гигиеническим нормативам свидетельствует о формировании на данной территории ситуации, при которой возникает потенциальная возможность влияния одного или нескольких факторов на интенсивность эпидемического процесса.

Подтверждением этого будут высокие и достоверно различные уровни заболеваемости гепатитом А на контролируемых территориях при наличии статистически достоверных различий между санитарно-гигиеническими показателями сравниваемых территорий.

Нарушение санитарного статуса территорий, представляющее потенциальную эпидемическую опасность или ведущее к возникновению вспышек заболеваний, связанных с водообеспечением населения, происходит в основном по следующим причинам:

— загрязнение воды в зонах санитарной охраны источников хозяйственно-питьевого водоснабжения (выражающееся в несоответствии источников водоснабжения ГОСТ 2761-84 «Источники централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения»), обусловленное нарушением санитарного режима, а также загрязнением сети водоснабжения, в том числе поверхностными стоками во время снеготаяния, проливных дождей, затапливания обширных территорий, а также экологических катастроф и т.д.;

— подача населению питьевой воды, не соответствующей требованиям ГОСТ 2874-82* «Вода питьевая» в результате применения технологии очистки и обеззараживания воды, не соответствующей качеству воды водоисточника или при нарушении процесса водоподготовки;
_______________
* На территории Российской Федерации документ не действует. Действует ГОСТ Р 51232-98. — Примечание изготовителя базы данных.

— неудовлетворительное санитарно-техническое состояние водоочистных сооружений и распределительной системы, нарушение правил их технологической эксплуатации;

— аварийные ситуации и ремонтные работы на очистных сооружениях, канализации, в распределительных сетях, станциях сточных вод; при этом особую опасность представляют аварии на водопроводных и канализационных сооружениях эпидемически значимых объектов, аварийный сброс хозяйственно-бытовых сточных вод;

— технические дефекты или неудовлетворительное санитарно-техническое состояние водозаборных колонок, колодцев (трубчатых, шахтных), нарушение правил их эксплуатации;

— использование в питьевых и хозяйственных целях воды технического водоснабжения и необработанной воды открытых водоемов (арыки, хаузы, каналы).

2.2. Эпидемиологические показания

В настоящее время известно, что значительная доля неидентифицированных острых кишечных инфекций (ОКИ), распространяющихся водным путем, имеют вирусное происхождение. Отмечено также, что росту заболеваемости ГА может предшествовать подъем ОКИ, что свидетельствует об активности факторов передачи, и в том числе водного, на основе которого реализуется развитие эпидемического процесса кишечных инфекций бактериальной и вирусной этиологии.

Поэтому одним из важных показателей, свидетельствующих о необходимости проведения вирусологического обследования питьевой воды и воды водоисточников, является подъем заболеваемости населения, и особенно детей, ОКИ, и в первую очередь, ОКИ неидентифицированной этиологии, особенно на территориях, постоянно неблагополучных по вирусным гепатитам.

Анализ вспышек ГА, связанных с водным фактором, свидетельствует о нескольких вариантах развития вспышечной заболеваемости. Описаны «колодезные», «бочковые», «арычные» вспышки, а также вспышки, связанные с авариями на водопроводе и канализации. Следует иметь в виду, что к вспышкам ГА приводила также контаминация пищевых продуктов водой, загрязненной ВГА. Наконец, зарегистрированы вспышки ГА, связанные с купанием в бассейнах и неконтролируемых водоемах. Острые водные вспышки следует разделять на вспышки с «веерообразной» передачей возбудителя сразу большому количеству людей. При одномоментном заражении весь период заболеваемости ГА ограничивается колебаниями длительности одного инкубационного периода. Такой характер вспышек наблюдается весьма редко. Гораздо чаще бывают вспышки «смешанного» типа, когда возможно взрывообразное (эксплозивное) начало с последующим эпидемическим «хвостом». В данном случае динамика заболеваемости напоминает кривую «нормального распределения» с максимумом в середине всего периода заболеваемости. Наибольшее количество случаев приходится на сроки среднего инкубационного периода, но достаточно много случаев ГА приходится на сроки, в два раза превышающие инкубационный период. При длительном действии фактора передачи определяется более растянутое течение вспышки (эпидемии), которое может намного превышать длительность 2-3 инкубационных периодов. Так как не требуется непосредственного контакта источника инфекции и заражающихся людей, то интенсивность развития и длительность вспышки определяются активностью действия фактора передачи. Поэтому возможны вяло протекающие вспышки ГА, связанные с контаминацией воды в течение достаточно длительного времени.

На территориях с большим количеством источников инфекции и неудовлетворительным состоянием коммунального благоустройства, что приводит к постоянному вирусному загрязнению воды различных видов водопользования, наблюдаются хронические водные эпидемии. Хронические водные эпидемии проявляются постоянно высоким уровнем заболеваемости ГА, сезонными флуктуациями.

Если острые водные вспышки достаточно легко дифференцируются, то длительное действие водного фактора, активизирующееся в определенные месяцы года, требует специальных лабораторных вирусологических исследований и, в частности, проведения исследований за 2-3 месяца до сезонного подъема заболеваемости.

Лабораторный бактериологический и вирусологический анализ воды проводят при следующих эпидемиологических показаниях:

1. Нарастание уровня заболеваемости ОКИ на данной территории и в конкретных группах населения в определенные месяцы года.

2. Активное вовлечение в эпидемический процесс ОКИ, ГА детских возрастных групп населения (1-2 года, 3-6 лет), независимо от частоты контактов с окружающими; нет преимущественного поражения детей, посещающих детские дошкольные учреждения.

3. Возрастание показателей заболеваемости ГА среди групп населения (15-19, 20-29 лет и старше) в связи с более высокими инфицирующими дозами ВГА, которые реализуются при действии водного фактора передачи. Данная тенденция особенно характерна для сельских жителей и лиц, временно находящихся на территориях, гиперэндемичных по ГА.

4. Высокая эксплозивность нарастания заболеваемости на микротерриториях и территориальная неравномерность, связанная с водопользованием из открытых водоемов или резервуаров.

5. Наличие тесной корреляции между заболеваемостью дошкольников и более старших возрастных групп населения, как правило, с некоторым опережением нарастания активности эпидемического процесса ГА у школьников и в возрастной группе 16-20 лет.

6. Особенностью водных вспышек на территориях, гиперэндемичных по ГА, в связи с высокой иммунной прослойкой среди детей и взрослых являются низкие показатели очаговости в семьях. Семейные очаги, где регистрируются 2 и более случаев ГА, составляют менее 30%.

7. Во множественных семейных очагах и детских дошкольных учреждениях при воздействии водного фактора передачи инфекции до 70-75% случаев ГА регистрируется с интервалом менее 15 дней, т.е. имеет место одномоментное инфицирование всех членов семьи или коллектива.

8. На территориях, относительно благополучных по ГА, в крупных городах развитие подъема заболеваемости в одном или нескольких районах (с общим источником водоснабжения) при сравнительно низком уровне в остальных районах.

9. Возникновение внесезонных подъемов заболеваемости ГА и «растянутость» сезонного подъема без тенденции к снижению в течение межэпидемического периода.

Наряду с эпидемиологическими показателями при определении роли водного фактора как вероятной причины высокой заболеваемости ГА, т.е. выявлением причинно-следственных связей, необходимо сопоставить:

— санитарно-технические характеристики территорий, контрастных по уровням заболеваемости в связи с характером водопользования (метод различия);

— отдельные коллективы или территории с высокими показателями заболеваемости при общем водопользовании (метод сходства).

Сопоставление территорий и групп риска для выявления причинно-следственных связей с водным фактором проводится на уровне среднемесячных, среднегодовых, среднемноголетних показателей заболеваемости ГА, качеством воды по микробиологическим показателям. При изучении статистической взаимосвязи между показателями санитарно-гигиенического статуса территории и заболеваемостью ГА необходимо учитывать длительность инкубационного периода ГА, для чего используется соответствующее смещение динамики ее показателей относительно санитарно-гигиенических на 2-3 месяца. Целесообразно отдельно анализировать корреляционные связи санитарно-гигиенического фона с показателями заболеваемости в начале вспышки, эпидемии или сезонного подъема (сроки не более 2-3 инкубационных периодов, т.е. приблизительно 2 месяца).

В течение года центрами санэпиднадзора страны проводится текущий и по эпидпоказаниям эпидемиологический и санитарно-вирусологический контроль (табл.3.1).

Эпидемиологический контроль динамики заболеваемости ГА должен включать:

— ретроспективный анализ годовой и месячной заболеваемости населения отдельных территорий;

— сравнительный анализ показателей заболеваемости ГА и состояния коммунального благоустройства и водообеспечения населения.

Установленные показатели позволят выделить территории и группы риска, роль водного фактора в передаче возбудителя ГА.

В целях определения уровней инфицированности населения ВГА целесообразно в период подъема и пика заболеваемости ГА проведение исследований по определению маркеров ВГА (антигена ВГА, антител к ВГА класса и ) у практически здорового населения (дети и взрослые) и у больных ГА.

Наиболее результативным методом этиологической расшифровки водных вспышек является обнаружение антигена ВГА и анти-ВГА класса у заболевших вирусным гепатитом.

Текущий санитарно-вирусологический контроль качества воды объектов по изучаемым показателям обеспечивает своевременное обнаружение сдвига фонового уровня микробного загрязнения прежде всего по колифагам, появление единичных частиц которых в питьевой воде будет свидетельствовать о потенциальной возможности прохождения вирусного загрязнения через барьер водоочистных сооружений. В этом случае необходимо провести повторные исследования воды из данного места на колифаги и при наличии последних отобрать 10 л воды для определения в ней энтеровирусов и антигена ВГА.

Как текущий, так и контроль в период «риска» (за 2-3 месяца до предполагаемого подъема заболеваемости) предусматривают обязательный анализ воды данных объектов на наличие энтеровирусов и антигена ВГА, что позволяет определить степень реальной вирусной контаминации этих объектов и судить о наличии или отсутствии потенциальной опасности возникновения эпидемической ситуации (табл.3.1).

Кратность отбора проб в месяц для санитарно-вирусологического контроля воды питьевой и водоисточников

на выходе с водопроводных станций и в тупиковых точках разводящей сети

источник

1.2. Методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор за качеством питьевой воды, состоянием водоемов в местах водопользования населения, использованием сточных вод в системах промышленного оборотного водоснабжения и для орошения сельскохозяйственных угодий.

1.3. Методические указания также могут использоваться организациями, эксплуатирующими системы централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения, системы канализования, и осуществляющими производственный контроль.

2. Гигиенические и эпидемиологические показания к проведению санитарно-вирусологического контроля качества водных объектов

В системе государственного санитарно-эпидемиологического надзора за загрязнением кишечными вирусами водных объектов используют следующие виды санитарно-вирусологического контроля:

Плановый санитарно-вирусологический контроль осуществляют в течение года в соответствии с разработанной программой для каждой системы водоснабжения на конкретной территории, согласованной с территориальными органами Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

В рабочую программу включают перечень контролируемых объектов, показателей, периодичность проведения исследований, перечень используемых методов, план точек отбора проб воды, количество контролируемых проб воды. При этом необходимо учитывать, что предварительную оценку возможного вирусного загрязнения водных объектов осуществляют с использованием косвенных показателей вирусного загрязнения — общей группы колифагов, а также обнаружением антигенов ротавирусов и (или) антигена ВГА методом ИФА.

При обнаружении колифагов либо вирусных антигенов (ВГА, ротавирусов) в исследуемых пробах необходимо исследовать воду на наличие энтеровирусов, а также РНК энтеровирусов, РВ и ВГА методом ОТ-ПЦР.

Внеплановый санитарно-вирусологический контроль предусматривает проведение исследований воды на наличие колифагов, антигенов ротавирусов и ВГА и энтеровирусов в случае внезапных или непредвиденных изменений санитарно-эпидемической ситуации на контролируемой территории:

• каких-либо аварий или нарушений в системах водоснабжения и канализации, в результате которых может произойти массивное микробное загрязнение поверхностных и подземных водоисточников, а также питьевой воды. В этот период все работы заинтересованных организаций, включая и санитарно-вирусологический контроль, координирует Чрезвычайная противоэпидемическая комиссия города, района, субъекта Российской Федерации;

• по санитарно-эпидемиологическим показаниям контроль осуществляют в случае наличия факторов-предшественников в санитарно- эпидемиологической ситуации на территории и последующего подъема заболеваемости населения кишечными вирусными инфекциями, которая превышает уровень круглогодичной заболеваемости, характерной для конкретной местности.

Санитарно-вирусологический контроль в период эпидемического риска предусматривает более частые исследования по сравнению с установленными в программе текущего контроля, его утверждает главный государственный санитарный врач города, района, субъекта Российской Федерации, либо его проводят по решению Чрезвычайной противоэпидемической комиссии города, района, субъекта Российской Федерации.

Производственный санитарно-вирусологический контроль проводят постоянно, он предусматривает исследования воды водных объектов в организациях водоснабжения: на этапах водоподготовки, выходе с водоочистных сооружений (после обеззараживания), в разводящей сети; в организациях по производству воды, расфасованной в емкости; при выборе водоисточника; при оценке эффективности работы обеззараживающих установок, режима их работы; при превышении нормативов уровня колифагов, либо при обнаружении антигенов ВГА и (или) ротавирусов.

Определение энтеровирусов и (или) РНК РВ и ВГА проводят в санитарно-вирусологических лабораториях, обеспечивающих деятельность государственного санитарно-эпидемиологического надзора, профильных учреждений и других организаций, имеющих разрешение на данный вид деятельности в установленном законодательством Российской Федерации порядке.

Объектами исследования является вода различных водных объектов:

• сточная на этапах очистки и обеззараживания;

• пресных и морских поверхностных водоемов, используемых в рекреационных целях, а также в качестве источников хозяйственно- питьевого водоснабжения;

• питьевая (водопроводная; вода, расфасованная в ёмкости и др.);

• из децентрализованных водоисточников.

Сточные воды, поступающие на очистные сооружения, исследуют с целью изучения спектра энтеровирусов, циркулирующих среди населения, и по эпидемическим показаниям.

Сточные воды на этапах очистки и обеззараживания исследуют для изучения эффективности работы очистных сооружений в отношении возбудителей кишечных вирусных инфекций в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами и нормативами СанПиН 2.1.5.980-00 «Гигиенические требования к охране поверхностных вод».

2.2.2. Вода поверхностных водоемов

Воду пресных водоемов исследуют на наличие вирусного загрязнения с целью изучения процессов самоочищения, при выборе поверхностных водоемов в качестве водоисточников для централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения, установления зон санитарной охраны, по эпидемическим показаниям.

Контроль воды морских и пресных водоемов за уровнем загрязнения осуществляют при использовании их в рекреационных целях в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами и нормативами СанПиН 2.1.5.980-00 «Гигиенические требования к охране поверхностных вод», по эпидемическим показаниям.

2.2.3. Вода подземных водоисточников

Воду подземных водоисточников исследуют на наличие вирусного загрязнения при выборе источника хозяйственно-питьевого водоснабжения, контроле ее качества в соответствии с ГОСТ 2761-84 «Источники централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения», по эпидемическим показаниям.

2.2.4. Вода плавательных бассейнов и аквапарков

Контроль за уровнем вирусного загрязнения воды плавательных бассейнов проводят в соответствии с требованиями санитарно-эпидемиологических правил и нормативов СанПиН 2.1.2.1188-03 «Плавательные бассейны. Гигиенические требования к устройству, эксплуатации и качеству воды. Контроль качества», СанПиН 2.1.2.1331-03 «Гигиенические требования к устройству, эксплуатации и качеству вод аквапарков», по эпидемическим показаниям.

Питьевую воду исследуют на наличие вирусного загрязнения в соответствии с требованиями санитарно-эпидемиологических правил и нормативов СанПиН 2.1.4.1074-01 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества», СанПиН 2.1.4.1116-02 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды, расфасованной в ёмкости. Контроль качества», в соответствии с программой исследования воды, утвержденной главным государственным санитарным врачом города, района, субъекта Российской Федерации, по эпидемическим показаниям.

2.2.6. Контроль воды децентрализованных источников

Исследование воды децентрализованных источников проводят в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами и нормативами СанПиН 2.1.4.1175-02 «Гигиенические требования к качеству воды нецентрализованного водоснабжения. Санитарная охрана водоисточников», по эпидемическим показаниям.

Санитарно-вирусологический контроль воды водных объектов предусматривает исследования по следующим показателям:

• кишечные вирусы (энтеровирусы и аденовирусы в культурах ткани);

• антигены ротавирусов и вируса гепатита А в качестве маркеров вирусного загрязнения;

• РНК вирусов гепатита А, ротавирусов, энтеровирусов и ДНК аденовирусов методом полимеразной цепной реакции со стадией обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) для РНК-содержащих вирусов;

• колифаги (исследования проводят бактериологические лаборатории) в качестве косвенных показателей вирусного загрязнения вод различного назначения в соответствии с нормативными и методическими документами.

Выбор показателей осуществляют в соответствии с нормативными и методическими документами или по рекомендациям эпидемиолога.

Вода водных объектов и питьевая вода подлежит обязательному санитарно-вирусологическому контролю.

Основным принципом регламентирования вирусного загрязнения воды на настоящем этапе является отсутствие возбудителей кишечных вирусных инфекций в нормируемом объеме воды водных объектов и питьевой воде.

Критерием эпидемической безопасности воды водных объектов является отсутствие спорадической и вспышечной заболеваемости населения, обусловленной кишечными вирусами, распространяющимися водным путем.

Санитарно-вирусологический контроль воды осуществляют в соответствии с положениями раздела 2 с использованием санитарно-показательных микроорганизмов — колифагов, косвенных показателей вирусного загрязнения, что является экономичным и дает быстрый ответ о потенциальной эпидемической опасности водных объектов в отношении вирусного загрязнения и риска заболевания населения вирусными кишечными антропонозами.

В соответствии с результатами исследований воды на колифаги проводят обязательное прямое определение энтеровирусов и аденовирусов с использованием «культуральных» методов.

Для выявления в пробах воды труднокультивируемых в клеточных культурах вирусов (вирус гепатита А, ротавирусы) проводят анализ воды на наличие их антигенов с использованием методов ИФА, или ОТ-ПЦР -на наличие РНК вирусов. Положительный результат анализа пробы воды в ИФА после обеззараживания хлором или озоном, содержащей только антиген или РНК определенного вируса, оценивают как ориентировочный, свидетельствующий о циркуляции данного возбудителя на изучаемой территории и возможного водного пути передачи в реализации эпидемического процесса данной инфекции.

Наличие в анализируемой пробе помимо антигена или РНК вируса других форм микроорганизмов (общее микробное число — ОМЧ, колиформных бактерий, колифагов) свидетельствует о вирусном загрязнении воды.

Подтверждением этому является развитие соответствующей эпидемической ситуации на изучаемой территории, а также гомологичность РНК вирусов, выделенных из воды и из материалов от больных.

Для получения информации о степени гомологии штаммов вирусов, выделенных из воды и из материалов от больных на исследуемой территории, проводят ПЦР-амплификацию вариабельного фрагмента генома вируса с последующим секвенированием. Полная гомология данных фрагментов генома свидетельствует в пользу водного пути распространения возбудителя, тогда как наличие генетических отличий исключает роль водного фактора в возникновении данной эпидемической вспышки (эти исследования выполняют в специализированных лабораториях, имеющих разрешение на данный вид деятельности в установленном законодательством Российской Федерации порядке).

Объем проб, условия и периодичность отбора проб воды водных объектов на вирусологический анализ

Объем исследуемой воды, показания к проведению и кратность анализа при контроле:

внеплановом — по экстренным показаниям

внеплановом — по санитарно-эпидемическим показаниям, по согласованию с ТУ Роспотребнадзора

производственном — в соответствии с рабочей программой

Мембранная. Фильтрация. Двухэтапный метод. Ловушечное устройство

по согласованию с ТУ Роспотребнадзора

Вода поверхностных водоемов: а) источник водоснабжения

Адсорбционный метод (МПС). Ионообменная смола. Мембранная. Фильтрация. Двухэтапный метод

1 раз в месяц с мая по сентябрь

Сточные воды после очистки и обеззараживания

1 л — 1 раз в месяц в контрольном створе

Двухфазный метод. Адсорбционный метод (МПС). Ионообменная смола

Автоклав (паровой стерилизатор)

Ламинарный шкаф для культуры клеток (класс I)

Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г

РН-метр любой марки с набором электродов с погрешностью измерений ±0,1

Термометры, 0-100 °С, цена деления 1 °С

Дистиллятор электрический ДЭ-4

Термостаты электрические суховоздушные с автоматическим терморегулятором до 50 °С, поддерживающие заданную температуру с погрешностью ±1 °С

Центрифуга лабораторная рефрижераторная, например, типа ЦЛР-1МР

Холодильники бытовые электрические с температурой в камере 4-6 °С

Холодильники бытовые электрические низкотемпературные с температурой в камере -20 °С

Морозильник с температурой в камере -70 °С

Аппарат фильтрационный, например, марки АФ-142 «Н» или марки АФ-142 «К»

Макропористое стекло, например, марки МПС 1 000 ВГХ

Набор для концентрирования с помощью пакетов с адсорбентом

Ионообменная смола (Анионит АВ 17-8; АВ-17-8чс)

Набор для сбора и концентрирования вирусов из питьевой воды в системе децентрализованного хозяйственно-питьевого водоснабжения, поверхностных и сточных вод

Мембрана микропористая капроновая (ММК — диаметр пор 0,2 мкм)

Мембрана для концентрирования вирусов из воды типа ФМНЦ — 0,2 мкм или ФМПА — 0,2 мкм

Стерилизующие насадки с фильтрами 0,22 мкм для стерилизации элюатов

Канистры полиэтиленовые на 5 и 10 л

Воронки конические делительные ВД-1 — 1 000 мл

Колбы плоскодонные конические разной вместимости

Пипетки разной вместимости 2 класса точности

Чашки Петри, диаметром 90-100 мм

Посуда для культур клеток – стерильные культуральные флаконы, планшеты, пробирки, пипетки и пр.

Твердотельный термостат для пробирок на 25- 100 °С, например, типа «эппендорф»

Вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой

Микроцентрифуга для пробирок до 16 000 g, например, типа «эппендорф»

ПЦР-бокс с бактерицидной лампой

Камера для горизонтального электрофореза

Ультрафиолетовый трансиллюминатор с кабинетом для просмотра гелей

Одноразовые пробирки объемом 1,5; 0,5; 0,2 мл, например, типа «эппендорф»

Автоматические пипетки объемом от 0,5 мкл до 1 мл

Сменные одноразовые наконечники с аэрозольными фильтрами и без

Прибор для промывки плашек

Автоматические пипетки-дозаторы различных объемов

Биф-экстракт (мясной экстракт)

Калий фосфорно-кислый однозамещенный, чда

Калий фосфорно-кислый двузамещенный, чда

Магний хлористый кристаллический, чда

Натрий фосфорно-кислый двузамещенный, чда

Спирт этиловый ректификационный

Фосфатно-солевой твинсодержащий буфер (РН 7,2)

Среда 199 на растворе Хенкса

Среда Игла MEM, рН 7,2 с двойным набором аминокислот

Стерильная эмбриональная сыворотка КРС

Перевиваемые линии клеток RD, НЕР-2, BGM, L20B

Набор диагностических сывороток для типирования полно- и энтеровирусов

Набор для выделения РНК, например, типа «Рибозоль», «Амплисенс» и др. 5х или 10х буфер для обратной транскрипции

Обратная транскриптаза (вируса птичьего миелобластоза или вируса лейкемии, мышей Молони), например, типа «Амплисенс» и др.

Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (ДНТФ), например, типа «Амплисенс» и др.

Олигонуклеотиды (прямой праймер не менее 3 ОЕ/мл)

Тест-система для определения РНК энтеровирусов

Тест-система для определения РНК вируса гепатита А

Тест-система для определения РНК ротавирусов

Тест-система для определения антигена вируса гепатита А

Тест-система для определения антигенов ротавирусов

Примечание . Могут использоваться материалы, оборудование, питательные среды, тест-системы с аналогичными характеристиками, разрешенные к применению для этих целей в Российской Федерации в установленном законодательством порядке.

Для отбора проб воды используют специально предназначенную для этих целей одноразовую посуду или стерильные емкости многократного применения, изготовленные из материалов, не оказывающих инактивирующего действия на вирусы. Емкости должны быть оснащены плотно закрывающимися пробками (силиконовыми, резиновыми или из других материалов) и защитным колпачком (из алюминиевой фольги, плотной бумаги). Емкость открывают непосредственно перед отбором, удаляя пробку вместе со стерильным колпачком. Во время отбора пробка и края емкости не должны чего-либо касаться. Ополаскивать посуду не допускается. При исследовании воды из распределительных сетей отбор проб из крана производят после его предварительной стерилизации обжиганием и последующего спуска воды не менее 10 мин при полностью открытом кране. При отборе пробы напор воды может быть уменьшен. Пробу отбирают непосредственно из крана без резиновых шлангов, водораспределительных сеток и других насадок. Если через пробоотборный кран вода течет постоянно, отбор проб производят без предварительного обжига, не изменяя напора воды и существующей конструкции (при наличии силиконовых или резиновых шлангов).

Если отбирают пробу после обеззараживания химическими реагентами, то для нейтрализации остаточного количества хлорсодержащих дезинфектантов в емкость, предназначенную для отбора проб, вносят до стерилизации натрий серноватисто-кислый в виде кристаллов или концентрированного раствора из расчета 10 мг на 500 мл воды. После наполнения емкость закрывают стерильной пробкой и колпачком. При отборе проб в одной и той же точке для различных целей, первыми отбирают пробы для бактериологических исследований.

Отобранную пробу маркируют и сопровождают актом отбора проб воды с указанием места, даты, времени отбора и другой необходимой информации.

К исследованию проб воды необходимо приступить сразу же после доставки проб в лабораторию.

В данном разделе представлены современные методы концентрирования вирусов из воды, предназначенные для качественной или количественной оценки вирусного загрязнения. Перечень методов и область применения представлены в табл. 1.

Выбор того или иного метода в практике контроля вирусного загрязнения определяют эпидемической ситуацией в регионе, задачами региональных планов по снижению заболеваемости кишечными вирусными инфекциями, уровнем оснащенности лабораторий.

Все работы, связанные с концентрированием и выделением вирусов, проводят с соблюдением правил эпидемиологической безопасно сти, в соответствии с нормативными документами: санитарно-эпидемиологическими правилами СП 1.3.1285-04 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)», санитарными правилами СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами».

Метод используют для концентрирования вирусов из питьевой воды различных видов (водопроводной, бутылированной, из родников и др.), воды подземных водоисточников, воды из бассейнов и других чистых вод. Объем исследуемой воды составляет 10 л. При необходимости объем воды может быть увеличен. Время концентрирования данным методом из 10л составляет в среднем 1,5-2,5 ч. Для концентрирования используют фильтрующие мембраны из нитроцеллюлозы типа ФМНЦ, ФМПА и мембраны микропористые капроновые (ММК) или другие, равные по эффективности.

5.1.2. Подготовка мембранных фильтров

Фильтрующие мембраны должны быть подготовлены к анализу в соответствии с указаниями организации-изготовителя (листовка-аннотация, сопровождающая фильтры). Перед исследованием фильтрующие мембраны смачивают стерильной водопроводной водой в стерильной емкости.

5.1.3. Подготовка фильтровального аппарата

Для фильтрования исследуемой воды используют установку, например, типа АФ-142 «К» или другую с аналогичными характеристиками, которая состоит из фильтродержателя, емкости на 10 и более литров для исследуемой воды и ее последующей фильтрации и устройства нагнетающего жидкость.

Перед фильтрацией фильтродержатель протирают ватным тампоном, смоченным спиртом ректификованным 70 %, и обжигают. После охлаждения на нижнюю часть фильтродержателя кладут стерильным пинцетом влажный мембранный фильтр, предварительно смоченный в стерильной водопроводной воде. Затем фильтр прижимают верхней частью фильтродержателя и закрепляют зажимами, равномерно завинчивая последние со всех сторон.

Исследуемый объем воды наливают в напорную емкость, крышку тщательно закрепляют зажимами, включают подачу давления (1,5 — 2,0 бара), после чего воду направляют в фильтродержатель со скоростью около 100 мл/мин и фильтруют через мембрану. При использовании для концентрирования мембран, например, типа ФМНЦ, в исследуемую воду добавляют хлористый магний до конечной концентрации 0,05 М или хлористый алюминий до конечной концентрации 0,0005 М для увеличения сорбционной способности мембраны. При использовании фильтров ММК хлористый магний не добавляют.

5.1.5. Элюция сконцентрированных вирусных частиц

Элюцию вирусов с мембран проводят 20 мл элюента с соблюдением всех правил эпидемической безопасности (перчатки, маска, спецодежда и т. д.) в ламинарном боксе. После окончания фильтрования откручивают зажимы и снимают верхнюю часть фильтродержателя. Мембрану осторожно приподнимают за край пинцетом, стерилизованным путем обжигания и переносят в стерильную емкость, соответствующую диаметру мембраны (может быть использована тарелка, чашка Петри диаметром не менее 142 мм и др.). Затем на поверхность мембраны наносят 10 мл элюента (3 % бифэкстракт на трисбуфере с рН 9,1-9,5) и стерильной пипеткой с целым концом проводят механический смыв (соскабливанием и струей) вируса с поверхности мембраны в течение нескольких минут. К концу манипуляции мембрана должна приобрести первоначальный вид. Полученный элюат переносят в стерильный флакон. Затем на эту же мембрану наносят второй объем (10 мл) того же элюента и проводят вторичное смывание вирусов струей с обеих сторон мембраны и вторую часть элюата помещают в тот же флакон, что и первую. Затем рН полученного элюата доводят до 7,0-7,5 1 N раствором соляной кислоты.

Для удаления бактериальной микрофлоры элюат подвергают обработке одним из двух методов: обработкой хлороформом или фильтрацией через стерилизующие мембраны.

5.1.6.1. При использовании хлороформа его добавляют в элюа (1 мл на 10 мл элюата), интенсивно встряхивают 10 мин и центрифугируют 10 мин при 2 000 об./мин для разделения фаз. Водную фазу (верхнюю) аккуратно отбирают пипеткой в стерильный флакон, добавляют 100 МЕ/мл пенициллина и 10,0 мг/мл стрептомицина.

5.1.6.2. При использовании стерилизующих насадок с фильтрами 0,22 мкм элюат пробы переносят в стерильный шприц объемом 5 — 20 мл с установленной фильтрующей насадкой и поршнем шприца продавливают в стерильный флакон. Этот способ позволяет избежать использования антибиотиков, токсичного хлороформа и связанных с этим мер безопасности, не требует длительного встряхивания и центрифугирования.

Стерильные элюаты хранят до испытания при 4 °С не более 24 ч. При температуре -20 °С их можно хранить в течение 1 года. При необходимости многократного исследования элюат делят на несколько порций, чтобы избежать повторного замораживания.

Метод рекомендуется для концентрирования вирусов из чистых вод, воды поверхностных водоемов и сточных вод. Объем проб для исследования определенного вида воды представлен в табл. 1.

5.2.2. Подготовка ионообменной смолы

Подготовку ионообменных смол (аниониты АВ-17-8, АВ-17-8-чс) осуществляют следующим образом: сухую смолу замачивают в течение 2-3-х суток в дистиллированной воде. Затем воду сливают и смолу обрабатывают смесью равных объемов свежеприготовленных растворов 2 % соляной кислоты и 10 % хлорида натрия из расчета 1 л смеси на 100 г смолы. Продолжительность контакта 24 ч. После этого смолу отмывают дистиллированной водой до нейтрального рН 7,0.

5.2.3. Концентрирования вирусов из проб воды

Перед концентрированием рН исследуемой пробы воды доводят до значений 5,5-6,0 путем добавления концентрированной соляной кислоты.

Для осуществления концентрирования стеклянную бюретку (колонку) диаметром 1,2-1,5 см, к нижнему концу которой присоединен резиновый шланг с завинчивающимся зажимом, устанавливают в штативе строго вертикально. На дно колонки помещают небольшой слой стекловаты для удержания смолы. В колонку вносят суспензию смолы, удаляя через нижний резиновый шланг избыток воды. Заполнение колонки следует проводить тщательно, избегая образования пузырьков воздуха в столбике смолы. Высота столбика смолы должна быть 10-12 см.

Емкость с пробой воды располагают выше колонок, в нее опускают стерильный резиновый шланг с битой пипеткой на конце. С другой стороны шланга должна быть резиновая пробка с отверстием для прохождения воды. Через резиновый шланг с пробкой на конце воду подают в колонку, закрывая ее пробкой. Винтовым зажимом на нижнем шланге регулируют подачу воды через смолу, создавая скорость 10-12 мл в минуту.

5.2.4. Элюция вирусов с ионообменной смолы

После окончания концентрирования (примерно через 16-18 ч, при исследовании 10 л) осуществляют элюцию вирусов со смолы 0,5 М раствором фосфатного буфера с рН 8,2. Для этого в колонку вносят 10 мл фосфатного буфера, интенсивно встряхивают и оставляют в горизонтальном положении в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем элюат переносят в стерильный флакон и доводят до рН 7,2 1М раствором соляной кислоты.

Готовят навески солей: Na₂HPО₄ 2Н₂О — 89,0 г (раствор А) и КН₂РО₄ — 68,06 г (раствор В). Каждую навеску вносят в отдельную мерную колбу, добавляют дистиллированную воду до объема 1 л и растворяют соли. Для получения буфера с рН 8,2 смешивают 96,9 мл раствора А и 3,1 мл раствора В и одним из этих растворов доводят рН буфера до 8,2.

5.3. Двухэтапный метод концентрирования вирусов (сорбция на ионообменной смоле и осаждение с помощью сульфата аммония)

Метод рекомендуется для концентрирования вируса гепатита А и энтеровирусов из проб питьевой воды и воды водоисточников. Объем проб может колебаться от 10 до 50 л.

5.3.2. I этап. Концентрирование и элюция вируса гепатита А и энтеровирусов из проб воды при помощи сорбции на ионообменной смоле

В качестве сорбента используют смесь, состоящую из ионообменной смолы АВ-17-8 (подготовленной в соответствии с п. 5.2.2) и гидроксида алюминия, которой заполняют стеклянную бюретку (колонку) диаметром 36-38 мм и длиной 250-300 мм. Колонка должна иметь в нижней части впаянную перегородку из пористого стекла (стеклянный фильтр Шотта № 2) и резиновый шланг, присоединенный к нижнему концу колонки. После установки колонки в штативе в нее вносят ионообменную смолу (высота столбика смолы должна составлять не менее 30-40 мм) и навеску гидроксида алюминия (8-10 г).

Исследуемую пробу воды в бутылях или канистре подкисляют с помощью соляной кислоты до рН 3,0-4,5, располагают выше колонки и через резиновую трубку с пробкой для колонки подают воду в колонку, регулируя скорость прохождения с помощью винта на резиновой трубке, присоединенной к нижнему концу колонки. Скорость прохождения воды через колонку должна составлять 10-15 мл/мин.

После прохождения исследуемой воды через колонку нижний резиновый шланг перекрывают и осуществляют элюцию вируса с адсорбента при помощи 0,05 М глицинового буфера с рН 11,5, который вносят в колонку в объеме 100 мл. Адсорбент в колонке и элюент тщательно перемешивают и выдерживают в течение 10-15 мин. Затем элюат удаляют из колонки через нижний резиновый шланг и с помощью глицинового буфера с рН 1,5 устанавливают рН элюата на уровне 7,0-8,0.

Навеску 0,385 г аминоуксусной кислоты растворяют в 100 мл дистиллированной воды и получают глицин. К 50 мл глицина добавляют 50 мл 0,1 N раствора гидроксида натрия и получают глициновый буфер с рН 11,5.

Для приготовления глицинового буфера (рН 1,5-1,6) к 38 мл глицина добавляют 62 мл 0,1 N раствора соляной кислоты.

5.3.3. II этап. Вторичное концентрирование антигена и энтеровирусов — осаждение с помощью сульфата аммония

Вторичное концентрирование (осаждение) вирусов проводят на холоде. Для этого к элюату дробно (в течение 20-30 мин) добавляют ½ объема насыщенного раствора сульфата аммония / (NH₄)₂ SO ₄ /, тщательно перемешивают и оставляют на ночь. Утром смесь центрифугируют в течение 1 ч при 5-6 тыс. об./мин. Супернатант сливают, а осадок растворяют в 1-2 мл физиологического раствора с рН 7,2-7,4.

При необходимости концентрат делят на 2 части, одну из которых исследуют на наличие антигена ВГА, другую — подвергают антибактериальной обработке в соответствии с п. 5.1.6 и используют для заражения тканевых культур с целью выделения энтеровирусов.

В 1 л теплой стерильной дистиллированной воды (30-35 °С) растворяют 800 г сульфата аммония / (NH₄)₂SO₄ /. Полученный раствор фильтруют, доводят до рН 7,2 и охлаждают в холодильнике.

Метод рекомендован Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) «Рекомендации по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде», ВОЗ, 2003.

Метод концентрирования двухфазным разделением используют для индикации вирусов из 1 л очищенных и неочищенных сточных вод.

5.4.2. Подготовка реактивов (для 2-х проб по 1 л)

5.4.2.1. 22 % декстран (по весу) — 40 г декстрана Т 40, 142 мл стерильной дистиллированной воды. Для растворения используют магнитную мешалку. Готовый раствор можно хранить 2 недели при 4 °С.

5.4.2.2. 29 % ПЭГ 6 000 (по весу) — 363 г ПЭГ 6 000 и 888 мл стерильной дистиллированной воды. Для растворения используют магнитную мешалку. Готовый раствор можно хранить 2 недели при 4 °С. Раствор можно автоклавировать (15 мин при 45 °С).

5.4.2.3. 150 мл (примерно) 5М NaCl.

5.4.2.4. 1 N NaOH и 1N HCL для установки рН.

5.4.3. Концентрирование пробы по 0,5л

5.4.3.1. Пробу центрифугируют в течение 10 мин при 1 000 g. Над- осадочную жидкость переносят из пробирок в колбу Эрленмейра емкостью 1 л, осадок хранят при 4 °С.

5.4.3.2. Доводят рН надосадочной жидкости до нейтрального уровня (7,0-7,5) 1N раствором NaOH и измеряют конечный объем надосадочной жидкости.

5.4.3.3. К 500 мл надосадочной жидкости добавляют 39,5 мл 22 % раствора декстрана, 287 мл 29 % раствора ПЭГ 6000 и 35 мл 5N раствора NaCl. Тщательно перемешивают и выдерживают 1 ч при температуре 4 °С при непрерывном встряхивании или перемешивании, используя прибор горизонтального встряхивания или магнитную мешалку.

5.4.3.4. Для каждой пробы подготавливают стерильную коническую делительную воронку и закрепляют ее в штативе. Смазывают скользящие поверхности кранов, но так, чтобы не закрыть в них отверстие. Проверяют плотность кранов небольшим количеством воды. Смесь, приготовленную по п. 5.4.3.3, переливают в воронку и оставляют на ночь при 4° С.

5.4.3.5. Утром осторожно открывают кран воронки, медленно выпускают жидкость и собирают нижний ее слой и промежуточную фазу в стерильную пробирку (обычно 5-10 мл от каждой пробы объемом 0,5 л.).

5.4.3.6. В полученную жидкость (п. 5.4.3.5) вносят осадок (п. 5.4.3.1), добавляют хлороформ (20 % от объема образовавшейся взвеси) и встряхивают в течение 1 мин. Центрифугируют, отбирают верхнюю водную фазу в стерильную пробирку и добавляют антибиотики (пенициллин G или отечественный аналог и стрептомицин до конечной концентрации 100 МЕ/мл и 100 мг/мл соответственно).

5.4.3.7. Помещают 1 мл полученного концентрата в холодильник с температурой -20 или -70 ºС для сохранения (при необходимости дальнейшего исследования). Остаток концентрата исследуют на наличие вирусов на культурах тканей, РНК методом ОТ-ПЦР и антигена -методом ИФА.

Метод (качественный) используют для концентрирования вирусов из воды поверхностных водоемов, сточной воды. Время концентрирования вирусов должно составлять 3-7 суток.

5.5.2. Подготовка макропористого стекла (МПС)*

Для повышения сорбционных свойств макропористого стекла, представляющего собой белый порошок, его обрабатывают следующим образом: один объем стекла заливают в колбе одним объемом смеси (1:1) 3 % раствора Н₂О₂ и 6М раствора НС l кислоты и кипятят в вытяжном шкафу в течение 1 ч без пробки, соблюдая меры предосторожности. Отмывают большим количеством дистиллированной воды до нейтрального значения рН и высушивают при 100 °С.

В пакет из флизелина размером 5×7 см помещают 3,0 см подготовленного сорбента.

*Можно использовать готовые стандартные наборы, разрешенные к применению в Российской Федерации в установленном законодательством порядке.

5.5.3. Концентрирование вирусов

Пакет с сорбентом закрепляют с помощью лески за неподвижный предмет так, чтобы он оказался в токе воды. После экспозиции в течение 3-7 суток пакет вынимают, помещают в отдельный новый полиэтиленовый мешочек или стерильный флакон и доставляют в лабораторию в сумке-холодильнике в максимально короткий срок (не более 6 ч). Каждую пробу маркируют с указанием точки отбора, датой установки и времени экспозиции пакета. До обработки пробы можно хранить не более суток при 4 °С.

Пакет с сорбентом извлекают из транспортировочной емкости и помещают в стерильную чашку Петри. Обрезают край пакета, вымывают стекло дистиллированной водой (5 мл) с помощью пипетки в эту же чашку Петри и переносят пипеткой или через воронку в колонку объемом 5-10 мл. Вирусы элюируют ступенчато тремя растворами по 3 мл каждый, собирая фракции в отдельные пенициллиновые флаконы. Исследованию подвергают каждую фракцию в отдельности (всего 3 фракции). В качестве элюирующих растворов используют: 1) 0,05 М трис-НС l рН 9,1; 2) 0,05 М трис-HCl рН 9,1 и 0,5 М NaCl; 3) 3 % мясной экстракт на 0,05 М трис-HCl рН 9,1.

5.6. Метод концентрирования вирусов с использованием набора для сбора и концентрирования вирусов из питьевой воды с помощью ловушечного устройства

Ловушечное устройство состоит из насадки на водопроводный кран, к которой с помощью синтетической трубки прикреплен держатель. В держатель, состоящий из двух свинчивающихся частей с резьбой, вставляется специальная ловушка, внутри которой находится адсорбент, сорбирующий вирусы из воды. Применяемая ловушка является одноразовой, а само устройство может использоваться после стерилизации многократно в соответствии с прилагаемой инструкцией.

Метод используют для концентрирования вирусов из водопроводной воды.

5.6.2. Подготовка ловушечного устройства и фильтрование воды

Перед использованием в ловушечное устройство вставляют ловушку, после чего его заворачивают в бумагу для стерилизации и стерилизуют сухим жаром при температуре 80 °С 45 мин. Ловушечное устройство с вставленной ловушкой доставляют на место отбора в стерильной упаковке. После трехкратного обжигания водопроводного крана и спуска воды в течение 15 мин устанавливают необходимую скорость ее протекания — 1 л за

1,5 мин, что составляет 40-45 л/ч. Ловушечное устройство извлекают из стерильной упаковки и устанавливают его на кран. Объем пропускаемой воды должен составить 1 000 л, что достигается при скорости тока воды 40-45 л/ч в течение 24 ч. Спустя 24 ч ловушечное устройство снимают с крана и помещают в стерильный пакет, который доставляют в вирусологическую лабораторию. После извлечения ловушки использованное ловушечное устройство подвергают обеззараживанию в 3 % растворе перекиси водорода в течение 12 ч, затем многократно (не менее 10 раз) промывают в проточной воде и высушивают для последующей стерилизации и повторного использования.

5.6.3. Элюция сконцентрированных вирусных частиц

Ловушку с адсорбентом в стерильных условиях извлекают из ловушечного устройства и помещают в чашку Петри. С помощью ножниц ловушку вскрывают, содержащийся внутри адсорбент вымывают в чашку Петри стерильной дистиллированной водой в объеме 5-10 мл. Полученную взвесь адсорбента в дистиллированной воде переносят с помощью пипетки с отпиленным концом в стеклянную колонку. Вытекающую из колонки воду собирают в стерильный пенициллиновый флакон. Элюцию вирусов осуществляют с помощью специального элюента, содержащегося в наборе. Для получения рабочего раствора концентрат разводят стерильной дистиллированной водой в соотношении 1:10 (объем элюента/объем воды). Вирус элюируют путем пропускания 3 мл элюента через адсорбент в колонке. Полученную фракцию (элюат) собирают в стерильный пенициллиновый флакон.

Использованный адсорбент заливают 3 % раствором перекиси водорода для обеззараживания на 12 ч.

С целью увеличения эффективности обнаружения вирусов в элюатах проб воды при исследовании методом ПЦР (обнаружение РНК энтеровирусов) и ИФА (обнаружение антигенов энтеровирусов) проводят дополнительное концентрирование элюатов с помощью ультрацентрифугирования либо обрабатывают элюаты полиэтиленгликолем 6000 (ПЭГ 6 000).

5.6.3.1. Ультрацентрифугирование элюата.

Ультрацентрифугирование проводят при 40 000-50 000 g в течение 2 ч с использованием угловых или бакет-роторов. В стерильную центрифужную пробирку наливают вируссодержащий элюат, а затем с помощью шприца на дно пробирки наслаивают 10-20% раствор сахарозы так, чтобы она занимала 5-10 % от объема пробирки. После центрифугирования супернатант удаляют. Осадок ресуспендируют в 0,5 мл стерильной дистиллированной воды для ПЦР-исследований или в фосфатно-солевом твинсодержащем буфере (рН 7,2) для ИФА.

5.6.3.2. Обработка элюата полиэтиленгликолем 6 000 (ПЭГ 6000).

В элюат добавляют ПЭГ 6000 и хлористый натрий, находящийся непосредственно в пробирках для центрифугирования, до конечных концентраций 10 % и 0,5М, соответственно. Смесь тщательно перемешивают до растворения ПЭГ и затем выдерживают в течение 10-12 ч при 4 °С. Образовавшуюся суспензию центрифугируют при 10000 g в течение 1 ч или при 6000 g в течение 2 ч. Супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют в 0,5 мл стерильной дистиллированной воды для ПЦР-исследований или в фосфатносолевом твинсодержащем буфере (рН 7) — для ИФА.

Исследование полученных элюатов на энтеровирусы проводят в культуре ткани в соответствии с документом «Руководство по вирусологическим исследованиям полиомиелита», рекомендованным Всемирной организацией здравоохранения (1998). При этом следует отметить, что для выделения вирусов используют максимально возможный полученный элюат (кроме 1 мл, заложенного на хранение, и объема, используемого для исследования в ИФА и ПЦР). Для выделения вирусов используют следующие культуры тканей: RD, Hep-2, BGM и другие чувствительные к энтеровирусам линии клеток.

Перевиваемые культуры клеток RD, Hep-2 (Cincinnatti), BGM наиболее пригодны для проведения лабораторных исследований и позволяют выделять достаточно широкий спектр энтеровирусов, которые могут присутствовать в водных объектах окружающей среды.

Культура клеток RD, происходящая из человеческой рабдомиосаркомы, обладает высокой чувствительностью к вирусам полиомиелита, многим типам вируса ECHO, некоторым вирусам Коксаки А. Вирусы полиомиелита и вирусы Коксаки В хорошо размножаются в культуре клеток Нер-2, полученной из эпидермоидной карциномы человека. Культура клеток BGM — перевиваемая культура клеток почек африканской зелёной мартышки, чувствительна к вирусам полиомиелита и вирусам Коксаки В. Использование, по крайней мере, двух культур позволяет выявлять, возможно, больший спектр вирусов, а комбинация клеток, обладающих различной чувствительностью к различным энтеровирусам, может помочь при идентификации выделенного цитопатогенного агента. Чрезвычайно полезным является поддержание и использование в лабораторных исследованиях культуры клеток L20B. Эта культура клеток создана на основе мышиной линии L-клеток, в которую экспрессированы человеческие рецепторы к полиовирусу. Она позволяет селективно выделять только полиовирусы, что делает её незаменимой культурой при идентификации выделенных цитопатогенных агентов для разделения смесей вирусов. Чувствительность культур клеток к различным энтеровирусам представлена в табл. 2.

Чувствительность перевиваемых культур клеток к различным энтеровирусам

Проявление цитопатогенного эффекта на культуре клеток

±, за исключением Al, A19 А22

+ — наличие цитопатогенного эффекта;

Культуры клеток для лабораторного исследования следует получать из аттестованного источника, например, из лаборатории, обладающей банком клеток. Необходимо периодически контролировать чувствительность используемых в лаборатории клеток. Для этого после каждых 8-10 пассажей клеток на них проводят титрование референс-штаммов вакцинного вируса полиомиелита. После 15-20 последовательных пассажей следует перейти на свежую линию из банка клеточных культур или получить её в референс-лаборатории. Эта процедура позволяет сохранять высокую чувствительность клеток и снижает риск контаминации клеток микоплазмами.

Для исследования одной пробы используют не менее двух культур клеток площадью не менее 75 см 2 . Это соответствует трём флаконам ёмкостью 50,0 мл (поверхность каждого флакона составляет 25 см 2 ). Два из этих флаконов должны быть с культурой клеток RD, один — с любой другой из рекомендованных культур. Флаконы со свежеобразованным монослоем клеток микроскопируют для того, чтобы убедиться в здоровом состоянии клеток. Монослой клеток, подходящий для заражения, обычно формируется в течение 2-3 дней после «посадки» клеток на флаконы при концентрации клеток 1×10 6 мл ростовой среды. После замены ростовой среды на 4,5 мл поддерживающей среды (без сыворотки) флаконы маркируют (указывают номер пробы, дату заражения, номер пассажа). В каждый флакон вносят по 0,5 мл обработанной исследуемой пробы воды. Все используемые клеточные линии следует инокулировать одновременно. Обязательно оставляют по 1 незаражённому контрольному флакону каждой культуры. Флаконы инкубируют в термостате при температуре 36 °С. Ежедневно, обычно в течение 5-7 дней, проверяют культуры на наличие цитопатогенного эффекта (ЦПЭ). Все признаки ЦПЭ, токсичности, контаминации посторонними микроорганизмами регистрируют в лабораторном журнале. При появлении ЦПЭ (при охвате изменениями 75 % клеточного монослоя) прекращают инкубацию флаконов и сохраняют культуральную жидкость при 20 °С для следующего пассажа на той же культуре клеток. Содержимое каждого флакона с культурой клеток пассируют индивидуально, флаконы никогда не объединяют. Для пассажа могут быть использованы культуры, выращенные в пробирках. Если при первичном заражении не наблюдали ЦПЭ, то делают так называемый «слепой» пассаж. Культуры, в которых не проявлялся ЦПЭ, инкубируют и наблюдают в течение не менее 14 дней. При отсутствии ЦПЭ в течение этого срока культуры отбрасывают как негативные.

При хорошем состоянии культуры клеток первичное заражение и один пассаж вместе составляют период наблюдения 14 дней. В ряде случаев (например, при выделении агента с низкой цитопатогенной активностью, или при наличии в пробе вируса в небольшом количестве) необходимо сделать последующие пассажи. При этом следует помнить, что каждый последующий пассаж увеличивает риск перекрестной контаминации.

При выделении вирусов из проб воды различного происхождения в культуре клеток можно столкнуться с рядом нежелательных явлений. Если при первичном заражении в культуре клеток развивается быстрая (в течение 1-2 дней после внесения исследуемого субстрата) дегенерация клеток, то, скорее всего, это связано с неспецифической токсичностью пробы. Такие культуры нужно заморозить при -20 °С, оттаять и выполнить пассаж. Если признаки токсичности обнаружатся вновь, то следует вернуться к исходной пробе, развести её ФСБ 1:10 и повторить заражение. Бактериальная контаминация, которая проявляется в виде помутнения среды, приводит к гибели клеток и делает выявление вирусного ЦПЭ затруднительным или невозможным. В этом случае следует вернуться к исходной пробе, обработать её хлороформом и повторить процедуры заражения.

Особое внимание следует уделять предупреждению перекрёстной вирусной контаминации во время процедур заражения и пассирования. Нельзя сливать среду через край флакона или пробирки, в которые вносилась исследуемая проба, даже если ЦПЭ отсутствует. Удаление среды производят пипеткой, которую меняют после каждой процедуры. При заражении с помощью автоматических микропипеток используют только наконечники с фильтрами. Следует избегать процедур, при которых образуются аэрозоли (например, энергичное пипетирование); по возможности не рекомендуется использование посуды с резиновыми пробками, которые помещаются внутрь горлышка флакона или пробирки, целесообразно использовать посуду с внешней резьбой на горлышке, которая закрывается завинчивающимися крышками.

Известно, что в пробах воды присутствуют смеси вирусов, с чем могут быть связаны затруднения при идентификации выделенных изолятов. Для разделения смесей и правильной идентификации выделенных вирусов, а также для того, чтобы избежать потери вирусов полиомиелита, все изоляты, «положительные» на культуре клеток RD, следует пассировать на клетки L20B. Наличие выраженного ЦПЭ указывает на присутствие в пробе вируса полиомиелита. Некоторые реовирусы, аденовирусы, а также неполио-энтеровирусы могут проявлять ЦПЭ на клетках L20B и затруднять идентификацию выделенных изолятов и интерпретацию результатов исследования. Такие изоляты следует направить в соответствующую референс-лабораторию для заключительного исследования.

В лабораторной практике часто используют метод адсорбции исследуемого материала на клеточном монослое. При использовании этого метода из флакона/пробирки удаляют ростовую среду, ополаскивают монослой стерильным ФСБ, вносят исследуемую пробу и инкубируют флакон при температуре 36 °С в течение 1 ч. Таким образом, создают лучшие условия для адсорбции вируса клетками, если он присутствует в пробе. После истечения срока инкубации в каждый флакон/пробирку вносят необходимое количество поддерживающей среды. Применение этого метода может способствовать выявлению вируса при его незначительных количествах в исследуемом материале, а также ускорить проявление ЦПЭ, по крайней мере, на 1 сутки. Следует иметь ввиду, что при использовании этого метода, в результате дополнительных открываний крышек, во много раз возрастает вероятность контаминации (перекрёстной вирусной или бактериальной). Его рекомендуется проводить в ламинарном шкафу. Ввиду высокого риска контаминации этот метод не следует использовать для пассирования или инокуляции изолятов вирусов.

В основе идентификации выделенных цитопатических агентов (ЦПА) в реакции нейтрализации лежит взаимодействие исследуемого вируса с гомологичной антисывороткой (или смесью антисывороток), которая нейтрализует вирус, что проявляется в виде отсутствия ЦПЭ на культуре клеток. Обычно в опыте нейтрализации вирусную суспензию, содержащую 100 ТЦД₅₀, смешивают с диагностическими сыворотками. После инкубации в течение 1-2 ч при 37 °С, эту смесь соединяют с культурой клеток. Опыт ежедневно просматривают под микроскопом в течение не менее 3 дней. Иммунная сыворотка, которая предотвращает развитие ЦПЭ, указывает тип вируса.

При постановке реакции нейтрализации необходимо соблюдать несколько важнейших положений.

Для идентификации ЦПА всегда используют ту культуру клеток, на которой они были выделены. Если ЦПА был выделен в нескольких культурах клеток, то следует провести идентификацию каждого штамма. Это связано с тем, что в пробах воды могут содержаться смеси энтеровирусов, а чувствительность клеточных культур к различным энтеровирусам различна.

В опыте необходимо использовать разведение испытуемого изолята, содержащее 100 ТЦД₅₀. Для того чтобы определить необходимое разведение, проводят предварительное титрование выделенного ЦПА. Опытные лаборатории, использующие культуры клеток со стабильной чувствительностью, могут избежать этой процедуры. Известно, что суспензия вируса, полученная на культуре, где цитопатогенные изменения поражают 75-100% клеточного монослоя, содержит примерно 10 6 ТЦД₅₀. Поэтому в опыте используют разведения 10 -3 и 10 -4 Это экономит время исследования и материалы, необходимые для предварительного титрования. Однако контрольное титрование исследуемого изолята рекомендуется включать в каждый опыт по идентификации. Это позволяет рассчитать титр вируса в условиях данного опыта.

Реакцию нейтрализации проводят в панелях для культуры клеток с плоским дном (микрометод). Микрометод позволяет экономить все компоненты, необходимые для постановки опыта, однако при недостаточном опыте возникает опасность перекрёстной лабораторной контаминации.

Титрование вирусов, а также постановку реакции нейтрализации выполняют в соответствии с документом «Руководство по вирусологическим исследованиям полиомиелита».

8. Выявление РНК кишечных вирусов (вируса гепатита А, ротавирусов, энтеровирусов) методом полимеразной цепной реакции с этапом обратной транскрипции

Организация и постановка полимеразной цепной реакции с этапом обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) для выявления РНК энтеровирусов, ротавирусов и вируса гепатита А из концентратов проб воды поверхностных, подземных источников, питьевой и сточных вод может быть осуществлена в лабораториях, оснащенных необходимым оборудованием.

8.1. Меры предосторожности и правила работы при постановке полимеразной цепной реакции с этапом обратной транскрипции

Организацию работы в ПЦР-лаборатории осуществляют в соответствии с документом «Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции», утв. Государственным комитетом санитарно-эпидемиологического надзора Российской Федерации 22 июня 1995 г.

8.1.1. Лабораторию разделяют на зоны (комнаты) для каждой из стадий ПЦР-диагностики.

Следует иметь не менее двух комнат:

• пре-ПЦР-помещение, где проводят обработку образцов из объектов окружающей среды (элюаты), выделение нуклеиновых кислот, приготовление реакционной смеси для ПЦР и постановку ПЦР (при наличии условий два последних этапа рекомендуется также проводить в дополнительном отдельном помещении). В этих помещениях не допускается проводить все другие виды работ с инфекционными агентами (микробиологический анализ, ИФА, другие диагностические тесты и т.д.), ПЦР-диагностику которых проводят в данной лаборатории;

• пост-ПЦР-помещение, где проводят детекцию продуктов амплицификации. В пост-ПЦР-помещении допускается использовать другие методы детекции инфекций, диагностика которых проводится в данной лаборатории.

8.1.2. Помещение для детекции продуктов амплификации (пост-ПЦР-помещение) располагают как можно дальше от пре-ПЦР-помещений.

8.1.3. Работу в лаборатории организовывают в одном направлении: от пре-ПЦР-помещений к пост-ПЦР-помещению.

8.1.4. При исследовании материала зараженного или подозрительного на зараженность возбудителями инфекционных заболеваний I-IV групп работу проводят в соответствии с нормативно-методическими документами.

8.1.5. Используют одноразовую пластиковую посуду.

8.1.6. Работают в одноразовых перчатках.

8.1.7. Перчатки и халаты меняют при переходе из одной зоны в другую.

8.1.8. Поверхности столов, а также помещения, в которых проводят постановку ПЦР, до начала и после окончания работ обеззараживают ультрафиолетовым излучением.

8.1.9. Для работы в ПЦР-лаборатории допускается персонал, прошедший специальную подготовку.

Реагент бромистый этидий является сильным мутагеном, поэтому все манипуляции проводят с использованием перчаток. Все реагенты, содержащие бромистый этидий, перед утилизацией подвергают специальной обработке.

Отработанные гели и буфер из камеры помещают в пластиковую емкость на 5 л с плотно завинчивающейся крышкой. Добавляют 1 объем 0,5 М раствора калия перманганата и один объем 2,5 М соляной кислоты. Аккуратно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 4-6 ч. Добавляют один объем 2,5 М натрия гидроксида, аккуратно перемешивают. Сбрасывают нейтрализованные реактивы в канализацию.

Положительный (ПКО) и отрицательный (ОКО) контрольные образцы используют для контроля специфичности ПЦР. В качестве ПКО используют любой штамм энтеровирусов, ротавирусов и вируса гепатита А для выявления соответствующих возбудителей. В качестве ОКО используют стерильную воду, не содержащую вирусной РНК.

Метод ОТ-ПЦР используют для выявления РНК вирусных агентов в исследуемых пробах воды. Исследованию подлежат элюаты проб питьевой воды, воды подземных водоисточников, речной и сточных вод. Для выделения РНК из концентратов проб питьевой воды и воды подземных водоисточников применяют метод афинной сорбции РНК на частицах силикагеля в соответствии с документом «Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции», утв. Госкомсанэпиднадзором 22 июня 1995 года (для выделения РНК рекомендуется использовать готовые комплекты, например, типа «Амплисенс» и др.).

Для выделения РНК из концентратов проб воды поверхностных водоисточников и сточных вод необходимо применять метод двустадийного выделения*:

• сорбция РНК на частицы силикагеля.

*Проводят в соответствии с методическими указаниями МУ 1.3.1888-04 «Организация работы при исследовании методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами 3-4 группы патогенности».

8.5. Постановка реакции обратной транскрипции, проведение полимеразной цепной реакции и электрофоретический анализ продуктов полимеразной цепной реакции с этапом обратной транскрипции-амплификации (ОТ-ПЦР-амплификации)

Рекомендуется использовать ПЦР-тест-системы на вирус гепатита А и ротавирусы с электрофорезом в агарозном геле (кат. № V4-50-R0,5; V4-50-R0,2; V15-50-R0,5; 15-50-R0,2), разрешенные к применению для этих целей в Российской Федерации в установленном законодательством порядке.

8.6. Обнаружение энтеровирусов методом полимеразной цепной реакции с этапом обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) с использованием культуры ткани для выявления репликативной «минус» нити РНК энтеровирусов

Для подтверждения инфекционности выделенных энтеровирусов проводят первичное заражение элюатом культуры клеток, через двое суток после культивирования зараженных клеток проводят ОТ-ПЦР с культуральной жидкостью при наличии ЦПД или с лизатом клеток культур тканей — при отсутствии ЦПД. Суть методики состоит в выявлении с помощью ПЦР негативной минус цепи («-» цепи) РНК энтеровирусов после их культивирования в культуре ткани. Негативная цепь является промежуточным продуктом репликации вируса, и её обнаружение служит косвенным доказательством потенциальной инфекционности вируса.

8.6.1. Заражение культур клеток и их последующая обработка

Для проведения ОТ-ПЦР следует использовать не менее двух культур клеток, учитывая их чувствительность к различным типам энтеровирусов. Рекомендуется использовать следующие сочетания клеточных культур: BGM и Нер-2 или Нер-2 и RD. В пробирках (пенициллиновых флаконах) с хорошо сформированным клеточным монослоем заменяют ростовую среду на поддерживающую с 1-2 % сыворотки крови эмбрионов крупного рогатого скота и добавлением антибиотиков: пенициллина в дозе до 1 000 МЕ/мл и стрептомицина в дозе до 200 мкг/мл. При культивировании клеток в инкубаторе без содержания СО₂, рекомендуется для стабилизации рН в синтетические среды добавлять Hepes (25 м м ).

Маркируют пробирки (по 2 на каждую исследуемую пробу), вносят в каждую по 0,1 мл элюата и помещают в термостат (36,5-37,0 °С). Для контроля оставляют по несколько пробирок с незараженной культурой (со сменой и без смены среды).

Инкубируют зараженные клетки в течение 5 суток, микроскопируя их ежедневно для контроля начала цитопатического действия. При первых признаках деградации культуры (но не позднее 5-х суток), пробирки извлекают из термостата, удаляют из них культуральную среду и промывают физраствором (или раствором Хенкса). После промывки тщательно (пипеткой) удаляют из пробирок остатки промывной жидкости.

Перед началом процедуры выделения РНК пробирки с культурой ткани, освобождённой от промывной жидкости, трижды подвергают замораживанию при -20 °С и размораживанию при 37 °С, что обеспечивает выход энтеровирусов из клеток культуры, после чего переходят к выделению РНК.

Выделение РНК можно осуществлять с использованием стандартных наборов в соответствии с инструкцией производителя, например, типа «Рибозоль», «Рибосорб» и др. РНК можно хранить в течение 1 месяца в изопропаноле при -20 °С. Для длительного хранения к раствору РНК добавляют два объема 70 % этанола и помещают для хранения в морозильную камеру (при -70 °С).

8.6.3. Обратная транскрипция

8.6.3.1. Праймерные последовательности.

Праймерные последовательности можно синтезировать под заказ в организациях-производителях. Для постановки ИКК-ПЦР необходимо специально синтезировать 1 энтеровирусспецифический праймер, используемый на стадии обратной транскрипции (последовательность указана в табл. 3).

источник