Методы санитарно микробиологического анализа питьевой воды

Наш организм напрямую взаимодействует с окружающей средой. Для того чтобы сохранять здоровье, независимо от того, скольк.

Все организмы, которые заселяют нашу планету, состоят из клеток. Зависимо от организации, организмы разделяются на два т.

Бактериологическое исследование готовых консервов проводится по ГОСТ 30425—97. Консервы. Метод определения промышленно.

Эффективная профилактика внутрибольничных инфекций должна учитывать решение многокомпонентной задачи, которая включает.

Определение понятия. Госпитальными инфекциями являются эндогенные и экзогенные инфекции, приобретенные больными в меду.

Вода является естественной средой обитания многих микробов. Основная масса микробов поступает из почвы. Количество микробов в 1 мл воды зависит от наличия в ней питательных веществ. Чем вода сильнее загрязнена органическими остатками, тем больше в ней микробов. Наиболее частыми являются воды глубоких артезианских скважин, а также родниковые воды. Обычно они не содержат микробов. Особенно богаты микробами открытые водоемы и реки. Наибольшее количество микробов в них находится в поверхностных слоях (в слое 10 см от поверхности воды) прибрежных зон. С удалением от берега и увеличением глубины количество микробов уменьшается. В чистой воде находится 100— 200 микробных клеток в 1 мл, а в загрязненной — 100— 300 тыс. и больше.

Реки в районах городов часто являются естественными приемниками стоков хозяйственных и фекальных нечистот, поэтому в черте населенных пунктов резко увеличивается количество микробов. Но по мере удаления реки от города число микробов постепенно уменьшается, и через 3—4 десятка километров снова приближается к исходной величине. Это самоочищение воды зависит от ряда факторов: механическое осаждение микробных тел, уменьшение в воде питательных веществ, усвояемых микробами, действие прямых лучей солнца, пожирание бактерий простейшими и др.

Если считать, что бактериальная клетка имеет объем 1 мк3, то при содержании их в количестве 1000 клеток в 1 мл, получится около тонны живой бактериальной массы в кубическом километре воды. Такая масса бактерий осуществляет различные превращения в круговороте веществ в водоемах и является начальным звеном в пищевой цепи питания рыб.

Патогенные микробы попадают в реки и водоемы со сточными водами. Возбудители таких кишечных инфекций, как брюшной тиф, паратифы, дизентерия, холера и др., могут сохраняться в воде длительное время. В этом случае вода становится источником инфекционных заболеваний.

Особенно опасно попадание болезнетворных микробов в водопроводную сеть. Поэтому за состоянием водоемов и подаваемой из них водопроводной воды установлен сани-тарно-бактериологический контроль.

Санитарно-микробиологическнй анализ питьевой

Для отбора проб воды используют специально предназначенную для этих целей одноразовую посуду или емкости многократного применения, изготовленные из материалов, не влияющих на жизнедеятельность микроорганизмов. Емкости должны быть оснащены плотно закрывающимися (силиконовыми, резиновыми или из других материалов) пробками и защитным колпачком (из алюминиевой фольги, плотной бумаги). Многоразовая посуда, в том числе пробки, должны выдерживать стерилизацию сухим жаром или автокла-вированием.

Пробу отбирают в стерильные емкости с соблюдением правил стерильности. Емкость открывают непосредственно перед отбором, удаляя пробку вместе со стерильным колпачком. Во время отбора пробка и края емкости не должны чего-либо касаться. Ополаскивать посуду запрещается.

При исследовании воды из распределительных сетей отбор проб из крана производят после предварительной его стерилизации обжиганием и последующего спуска воды не менее 10 минут при полностью открытом кране. Если отбирают воду после обеззараживания химическими реагентами, то для нейтрализации остаточного количества дезинфектан-та в емкость, предназначенную для отбора проб, до стерилизации вносят натрий серноватистокислый в виде кристаллов или концентрированного раствора из расчета 10 мг на 500 мл воды.

После наполнения емкость закрывают стерильной пробкой и колпачком. Отобранную пробу маркируют и сопровождают актом отбора проб воды с указанием названием пробы, места забора, даты (год, месяц, число, час), цель исследования, куда направляется проба для исследования, подпись лица, взявшего пробу.

Безопасность питьевой воды по эпидемиологическим показателям (по СанПиНу 2.1.4.559-96)

источник

Цель занятия.Ознакомить студентов с основными методами и показателями, необходимыми для санитарно-микробиологической оценки объектов внешней среды.

Оборудование и материалы. Прибор для подсчета колоний, колбы с пробами воды, бактериологические пробирки с 9 мл воды, пробирки с 10 мл расплавленного агара, мерные стерильные пипетки на 2 мл, стерильные чашки Петри, чашки Петри с МПА, чашки Петри с кровяным МПА, навески почвы, стерильная водопроводная вода в колбе — 270 мл, пробирки со средой Кесслера, Вильсона—Блера.

Для оценки санитарно-гигиенического состояния объектов окружающей среды проводят санитарно-бактериологические исследования, цель которых состоит в определении эпизоотологической и эпидемиологической безопасности. Показателем неблагополучия служит выявление патогенных микроорганизмов. Однако прямое их обнаружение связано с большими трудностями, и прежде всего с низкой концентрацией данных микробов, которые в основном не могут размножаться в воде, воздухе и почве. Поэтому в санитарно-микробиологической практике используют косвенные методы, направленные на определение микробной обсемененности объекта и обнаружение в нем так называемых санитарно-показательных бактерий. О бактериальной обсемененности судят по микробному числу — общему количеству микроорганизмов, содержащихся в единице объема или массы (1 мл воды, 1 г почвы, 1 м 3 воздуха).

Содержание санитарно-показательных бактерий определяют по двум показателям: титру и индексу. Титром называют минимальный объем или массу, в которых выявляют данные бактерии, индексом — количество санитарно-показательных бактерий, содержащихся в соответствующем количестве среды.

К санитарно-показательным бактериям относят представителей облигатной микрофлоры организма человека и теплокровных животных, для которых среда обитания — кишечник или воздушно-дыхательные пути. Они характеризуются следующими свойствами: 1) постоянно выделяются с калом или капельками слизи из воздушно-дыхательных путей; 2) не имеют других мест обитания; 3) способны сохраняться в окружающей среде то же время, что и патогенные бактерии, паразитирующие в кишечнике или воздушно-дыхательных путях; 4) не способны интенсивно размножаться вне организма хозяина и изменять свои свойства.

Перечисленные признаки присущи бактериям, признанным санитарно-показательными для различных объектов окружающей среды.

Санитарно-показательные бактерии группы кишечных палочек принадлежат к различным родам семейства энтеробактерий.

Обнаружение кишечной палочки в разных объектах окружающей среды считают наиболее достоверным признаком свежего фекального загрязнения. Наличие в этих же объектах бактерий родов Citrobacter и Enterobacter указывает на относительно давнее фекальное загрязнение.

Присутствие С. perfringens, С. sporogenes и других клостридий в почве свидетельствует о ее фекальном загрязнении, причем как свежем, так и давнем, поскольку эти бактерии образуют споры, что позволяет им длительно переживать в окружающей среде (в частности, в почве).

Обнаружение в объектах окружающей среды Streptococcus faecalis также свидетельствует об их фекальном загрязнении. Резкое увеличение количества этих бактерий в саморазогревающемся навозе и компостах может свидетельствовать о загрязнении почвы разлагающимися отбросами.

Гемолитические стрептококки, будучи облигатными обитателями носоглотки и зева, выделяются с капельками слизи орально-капельным путем. Сроки выживания гемолитических стрептококков в окружающей среде практически не отличаются от сроков, характерных для большинства других возбудителей воздушно-капельных инфекций. Обнаружение гемолитических стрептококков в воздухе помещений указывает на возможное его загрязнение микроорганизмами, содержащимися в зеве, носоглотке, верхних дыхательных путях и вызывающими инфекции, передаваемые воздушно-капельным путем.

Staphylococcus aureus — также факультативный обитатель носоглотки и зева. Его присутствие в воздухе помещений служит показателем орально-капельного загрязнения.

Одновременное обнаружение золотистого стафилококка и гемолитических стрептококков свидетельствует о высокой степени загрязнения воздуха.

Санитарно-микробиологическое исследование воды. Вода — естественная среда обитания микробов, которые в большом количестве поступают из почвы, воздуха, с отбросами, стоками. Особенно много микроорганизмов в открытых водоемах и реках. Кроме сапрофитов в воде могут находиться возбудители инфекций животных и человека.

При контроле санитарного состояния воды исследованию подлежат: вода централизованного водоснабжения, колодцев, открытых водоемов (реки, озера), плавательных бассейнов, сточные жидкости.

Отбор проб воды. Из открытых водоемов пробы воды отбирают с глубины 10. 15 см от поверхности и на расстоянии 10. 15 см от дна. Водопроводную воду набирают в стерильные флаконы объемом 0,5 л с притертой пробкой. Предварительно кран обжигают и спускают воду в течение 10. 15 мин. Хлорированную воду перед исследованием нейтрализуют тиосульфатом натрия из расчета 10 мл на 1л воды. Бактериологическое исследование проб воды следует проводить в течение двух часов после отбора или шести часов при температуре хранения 1. 5°С.

Определение микробного числа воды. Водопроводную воду засевают в количестве 1мл, воду открытых водоемов — по 1,0; 0,1; 0,01 мл. Все пробы вносят в стерильные чашки Петри, после чего их заливают 10. 12 мл расплавленного и охлажденного до 40. 45 °С питательного агара, который тщательно перемешивают с водой. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 1. 2сут. Воду из открытых водоемов засевают параллельно на две серии чашек, одну из которых инкубируют при 37 ºС в течение суток, другую — 2 сут при 20 °С. Затем подсчитывают количество выросших на поверхности и в глубине колоний и вычисляют микробное число воды — количество микроорганизмов в 1 мл.

Определение коли-титра и коли-индекса воды. Минимальное количество воды в мл, в котором обнаруживают бактерии группы кишечных палочек (БГКП), называют коли-титром воды, количество БГКП, содержащихся в 1л исследуемой воды, называют кол и-и ндексом воды. Коли-титр и коли-индекс воды определяют титрационным (бродильным) методом или методом мембранных фильтров.

Титрационный метод. В глюкозо-пептонную среду (1%-я пептонная вода, 0,5%-й раствор хлорида натрия, 0,5%-й раствор глюкозы, индикатор Андреде и поплавок) проводят посевы различных объемов воды.

Воду открытых водоемов исследуют в объемах 100; 10; 1 и 0,1 мл. Для анализа водопроводной воды делают посевы трех объемов по 100 мл, трех объемов по 10 мл и трех объемов по 1 мл. Посевы инкубируют при 37 °С в течение суток. О брожении судят по образованию пузырьков газа в поплавке. Из забродивших или помутневших проб делают посевы на среду Эндо. Из выросших колоний готовят мазки, окрашивают по Граму и ставят оксидазный тест, с помощью которого дифференцируют бактерии родов Escherichia, Citrobacter и Enterobacter от грамотрицательных бактерий семейства Pseudomonadaceae и других оксидазоположительных бактерий, обитающих в воде. С этой целью 2. 3 изолированные колонии наносят «штрихом» на фильтровальную бумагу, смоченную диметил-n-фенилендиамином. При отрицательном оксидазном тесте цвет бумаги не изменяется, при положительном она окрашивается в синий цвет в течение 1 мин. Грамотрицательные палочки, не образующие оксидазу, вновь исследуют в бродильном тесте — вносят в полужидкий питательный агар с 0,5 % глюкозы и инкубируют при 37 °С в течение суток. При положительном результате определяют коли-титр и коли-индекс по статистической таблице.

Метод мембранных фильтров. Определенный объем воды пропускают под давлением через мембранный фильтр № 3, предварительно стерилизованный кипячением в дистиллированной воде. Водопроводную воду и воду артезианских скважин фильтруют в объеме 333 мл. Чистую воду открытых водоемов фильтруют в объеме 100, 10, 1 и 0,1 мл, более загрязненную воду перед фильтрованием разводят стерильной водой. Фильтры накладывают на агар Эндо в чашки Петри и после инкубации при 37 °С в течение суток подсчитывают количество выросших красных колоний. Из двух-трех колоний делают мазки, окрашивают их по Граму и ставят оксидазный тест. Грамотрицательные палочки, не образующие оксидазу, принадлежат к БГКП. По существующим нормативам (ГОСТ 2874—82) питьевую воду считают качественной, если ее коли-индекс не более 3, а микробное число — не более 100.

Общепринятым дополнительным показателем фекального загрязнения воды служит количество S.faecalis. Для определения его титра цельную воду и ее 10-кратные разведения засевают в жидкую элективную среду (щелочная полимиксиновая среда). После инкубирования при 37 ºС в течение двух суток, а затем еще через сутки и двое суток делают высевы на плотные элективные среды. Фекальные стрептококки идентифицируют по морфологическим, культуральным и тинкториальным свойствам.

Есть данные о корреляции между содержанием в воде фекальных кишечных палочек и фагами бактерий группы кишечных палочек. Поэтому определение данных фагов служит косвенным показателем возможного присутствия кишечных палочек в исследуемой пробе воды.

Санитарно-микробиологическое исследование воздуха. Микрофлора воздуха зависит от микрофлоры почвы и воды. Воздух — неблагоприятная среда для обитания микроорганизмов из-за отсутствия питательных веществ, действия солнечных лучей, высушивания. Наряду с сапрофитами в воздухе могут находиться патогенные бактерии, споры грибов родов Aspergillus, Mucor и др.

Санитарную оценку воздуха осуществляют по двум показателям: 1) определение микробного числа воздуха; 2) определение количества санитарно-показательных бактерий — гемолитических стрептококков и стафилококков.

Количественные микробиологические методы исследования воздуха основаны на принципах осаждения (седиментации), аспирации или фильтрации.

Седиментационный метод осаждения Коха. Чашки Петри с МПА оставляют открытыми на 5. 10 мин. Для определения санитарно-показательных бактерий берут чашки Петри с кровяным МПА и время экспозиции увеличивают до 40 мин. Чашки выдерживают при 37 °С и комнатной температуре 24 ч и подсчитывают выросшие колонии.

Микробное число воздуха (общее количество бактерий в 1 м3) определяют по формуле Омелянского

Х= а * 100 * 1000 * 5 / (b * 10 * T),

где X— количество микробов в 1 м 3 (1000 л) воздуха; а — количество выросших колоний в чашках; b — площадь чашки; Т— время, в течение которого чашка была открыта; 5 — время по правилу Омелянского; 10 — объем воздуха в литрах. (Правило Омелянского предусматривает, что на поверхности агара в чашке Петри площадью 100 см 3 за 5 мин из воздуха оседает такое количество микробов, которое находится в его 10 л.)

Прямое обнаружение патогенных микробов воздуха проводят только при специальных показаниях.

Аспирационный метод. Более точный количественный способ определения микробного числа воздуха, так как посев микроорганизмов из воздуха производят с помощью приборов. При использовании аппарата Кротова воздух с заданной скоростью засасывается через щель плексигласовой пластины и ударяется о поверхность питательной среды открытой чашки Петри, находящейся на вращающейся подставке, благодаря чему происходит равномерный посев бактерий из воздуха на поверхность МПА (при определении микробного числа) или кровяного МПА (при выделении гемолитических стафилококков и стрептококков). После инкубации в термостате в течение двух суток подсчитывают количество выросших колоний и определяют микробное число воздуха. При исследовании воздуха могут быть использованы и другие приборы (Дьякова, Киктенко, ПАБ-1 — прибор аэрозольный бактериологический и ПОВ-1 — прибор для отбора воздуха). В практику входят ускоренные методы индикации микрофлоры воздуха с помощью мембранных фильтров, каскадных им-пакторов, фильтров Петрякова и др.

Санитарно-микробиологическое исследование почвы. Анализ почвы включает в себя определение микробного числа, коли-тит-ра, перфрингенс-титра и титра термофильных бактерий. По эпидемиологическим признакам проводят определение в почве патогенных микроорганизмов: сальмонелл, шигелл, возбудителей столбняка, ботулизма, злокачественного отека, сибирской язвы. Бактериологический анализ почвы нужен при выборе территории под пастбище, ферму, хозяйственные постройки, детские сады, больницы и др.

Предварительно делают отбор проб почвы. На обследуемой территории площадью до 1000 м 3 выделяют два участка по 25 м 3 (один — вблизи источника загрязнения, другой — в отдалении от него), берут пробы из 5 точек (4 — по углам участка, 1 — в центре) на глубине 10. 20 см стерильным совком (из более глубоких мест — с помощью специального бура Некрасова или Френкеля). Пробы почвы по 200. 300 г отбирают в широкогорлые стеклянные банки с ватными пробками (можно все взятые с одного участка пробы перемешать и на исследование направить 1 кг). На банки наклеивают этикетки, отправляют с нарочным и сопроводительным письмом. Пробы почвы полагается исследовать сразу же или в течение 6. 18 ч, сохраняя их при температуре не выше 1. 5ºС.

В лаборатории почву измельчают, освобождают от камней, осколков стекол, корней растений, просеивают через сито, тщательно перемешивают и отвешивают 30 г. В колбу на 500 мл наливают 270 мл стерильной водопроводной воды и вносят в нее отвешенную пробу почвы, все интенсивно встряхивают 10 мин, не давая отстояться частицам суспензии, готовят серию десятикратных последовательных разведений. Для относительно чистых почв достаточно 4 степени разведения, для загрязненных — 6. 9 разведений. В штатив ставят нумерованные пробирки с 9 мл стерильной воды в каждой. В первую вносят 1 мл суспензии пробы почвы, смешивают, затем 1 мл из первой пробирки вносят во вторую, смешивают, из нее — 1 мл в третью и т. д. В результате в пробирке № 1 получается разведение 1 : 100, № 2 — 1 : 1000 и т.д. Подготовленные таким образом пробы почвы исследуют.

Определение общего микробного числа. Из последних 3. 4 пробирок с разведенной суспензией отдельными стерильными пипетками вносят по 1 мл в стерильные чашки Петри (каждое разведение в отдельности). В каждую чашку добавляют еще по 10. 15 мл расплавленного и охлажденного до 45 ºС МПА. Равномерными осторожными круговыми движениями содержимое чашек перемешивают, оставляют на столе для уплотнения (затвердения) агара. С застывшей средой чашки перевертывают вверх дном, надписывают и помещают в термостат для культивирования на 24. 48 ч при 37 °С. Выросшие колонии подсчитывают в каждой чашке, умножают на степень разведения, полученные числа суммируют и вычисляют среднеарифметическое число, что составит количество микробов, содержащихся в 1 г почвы.

Определение коли-титра, перфрингенс-титра и титра термофильных бактерий почвы. Для определения коли-титра почвы различные разведения почвенной взвеси засевают по 1 мл в пробирки со средой Кесслера (на 1л дистиллированной воды — 10г пептона, 50 мл бычьей желчи — 2,5 г лактозы, 4 мл 1%-го водного раствора генцианвиолета) и инкубируют при 43 ºС в течение 48 ч. В дальнейшем исследования проводят по схеме, применяемой при определении коли-титра воды. Наибольшее разведение почвенной суспензии, в котором отмечена ферментация лактозы (газообразование), соответствует коли-титру почвы. Для определения перфрингенс-титра почвы различные разведения почвенной суспензии по 1 мл засевают в пробирки со стерильным обезжиренным молоком или железосульфитной средой Вильсона— Блера, приготовленной ex tempore. Посевы инкубируют при 43 °С в течение 24. 48 ч, после чего учитывают результаты по свертыванию молока или по образованию черных колоний С. perfringens в агаровом столбике среды Вильсона—Блера. Из колоний делают мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют и вычисляют перфрингенс-титр, который соответствует наибольшему разведению почвы, вызвавшему почернение и разрыв среды Вильсона— Блера в первые 12 ч роста.

Для определения титра термофильных бактерий разведения почвенной суспензии по 1 мл вносят в чашки Петри, заливают расплавленным и охлажденным агаром. Посевы инкубируют в течение суток при 60 ºС, а затем подсчитывают количество выросших колоний и пересчитывают на 1 г почвы.

Санитарно-микробиологическую оценку почвы проводят по комплексу показателей, из которых наиболее важный ление степени фекального загрязнения.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Определить микробное загрязнение воздуха.

2. Провести исследование воды с целью установления микробного числа и коли-титра.

3. Определить микробное число и перфрингенс-титр почвы.

1. Что такое санитарно-показательные микроорганизмы?

2. Как определяют коли-титр воды?

3. Как определяют микробное число почвы?

4. Как определяют перфрингенс-титр почвы?

5. Какие методы применяют для определения микробного числа воздуха?

6. Что такое санитарно-показательные микробы воздуха и как их определяют?

источник

Документ по состоянию на август 2014 г.

Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
4 июля 1997 года

Дата введения — с момента
утверждения

1. Разработаны авторским коллективом в составе: Недачин А.Е., Артемова Т.З., Доскина Т.В., Дмитриева Р.А., Тишкова Н.Ю., Сидоренко С.Г. (НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина Российской академии медицинских наук).

При участии Трухиной Г.М. (Московский НИИ гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана Минздрава Российской Федерации); Кашкаровой Г.П., Ахапкиной Е.Н. (Аналитический центр контроля качества воды «Роса»); Кривопаловой Н.С., Воронцовой Г.В., Сорокиной Р.С. (Федеральный центр Государственного санитарно — эпидемиологического надзора), Русановой Н.А. (НИИ коммунального водоснабжения и очистки воды).

2. Утверждены и введены в действие Председателем Госкомсанэпиднадзора России — Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 4 июля 1997 года.

3. Введены впервые к СанПиН 2.1.4.559-96 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества».

Методические указания устанавливают методы микробиологического анализа питьевой воды по нормируемым показателям СанПиН 2.1.4.559-96 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества». Настоящие Методические указания являются обязательными для контроля качества питьевой воды в отношении ее эпидемической безопасности при проведении государственного и производственного контроля, а также сертификационных испытаний, и распространяются на все лаборатории, выполняющие эти исследования, вне зависимости от подчиненности и форм собственности.

В настоящих Методических указаниях использованы ссылки на следующие документы:

2.1. СанПиН 2.1.4.559-96 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества».

2.2. ИСО 9308-1: 1990. Качество воды. Обнаружение и подсчет колиформных организмов, термотолерантных колиформных организмов и предполагаемых E. coli. — часть 1: Метод мембранной фильтрации.

2.3. Обнаружение и подсчет колиформных организмов, термотолерантных колиформных организмов и предполагаемых E. coli. — Часть 2: Титрационный метод (определение наиболее вероятного числа).

2.4. ИСО 6222-1988. Качество воды. Проведение анализа на наличие жизнеспособных микроорганизмов.

2.5. ИСО 6461-2: 1986. Качество воды. Обнаружение и подсчет спор сульфитредуцирующих анаэробов (клостридий). — Часть 2: Метод мембранной фильтрации.

2.6. Методические указания по санитарно — микробиологическому анализу воды поверхностных водоемов. Москва, 1981, N 2285-81.

2.7. ГОСТ 18963-73. Вода питьевая. Методы санитарно — бактериологического анализа.

2.8. Руководство по контролю качества питьевой воды. ВОЗ. Женева 1994. Часть 1.

Емкости должны быть оснащены плотно закрывающимися пробками (силиконовыми, резиновыми или из других материалов) и защитным колпачком (из алюминиевой фольги, плотной бумаги).

Многоразовая посуда, в том числе пробки, должна выдерживать стерилизацию сухим жаром или автоклавированием.

При исследовании воды из распределительных сетей отбор проб из крана производят после предварительной его стерилизации обжиганием и последующего спуска воды не менее 10 минут при полностью открытом кране. При отборе пробы напор воды может быть уменьшен. Пробу отбирают непосредственно из крана без резиновых шлангов, водораспределительных сеток и других насадок.

Если через пробоотборный кран происходит постоянный излив воды, отбор проб производят без предварительного обжига, не изменяя напора воды и существующей конструкции (при наличии силиконовых или резиновых шлангов).

Если отбирают воду после обеззараживания химическими реагентами, то для нейтрализации остаточного количества дезинфектанта в емкость, предназначенную для отбора проб, вносят до стерилизации натрий серноватистокислый в виде кристаллов или концентрированного раствора из расчета 10 мг на 500 мл воды.

После наполнения емкость закрывают стерильной пробкой и колпачком.

При заполнении емкостей должно оставаться пространство между пробкой и поверхностью воды, чтобы пробка не смачивалась при транспортировании.

При отборе проб в одной и той же точке для различных целей, первыми отбирают пробы для бактериологических исследований.

Отобранную пробу маркируют и сопровождают актом отбора проб воды с указанием места, даты, времени забора и другой информации.

К исследованию проб в лаборатории необходимо приступить как можно быстрее с момента отбора.

Доставка проб осуществляется в контейнерах — холодильниках при температуре +4 — +10 град. C. В холодный период года контейнеры должны быть снабжены термоизолирующими прокладками, обеспечивающими предохранение проб от промерзания. При соблюдении указанных условий срок начала исследований от момента отбора проб не должен превышать 6 часов.

Если пробы нельзя охладить, их анализ следует провести в течение 2-х часов после забора.

Если не может быть соблюдено время доставки пробы и температура хранения, анализ пробы проводить не следует.

Пробы питьевой воды должны доставляться в отдельных продезинфицированных контейнерах.

Термостат, способный поддерживать рабочую температуру 37 град. C и обеспечивать градиент температуры в камере +/- 1 град. C

Термостат, способный поддерживать рабочую температуру 44 град. C и обеспечивать градиент температуры в камере +/- 1 град. C

Термостат или водяная баня, способные поддерживать рабочую температуру в камере 44 град. C с градиентом температуры в камере +/- 0,5 град. C

Водяная баня, обеспечивающая поддержание рабочего температурного режима 75 град. C с градиентом температуры +/- 5 град. C

Водяная баня или термостат, способные поддерживать температуру 45 — 50 град. C (для питательных сред)

Прибор для мембранной фильтрации под вакуумом с диаметром фильтрующей поверхности 35 или 47 мм; вакуумный насос для создания разрежения 0,5 — 1,0 атм.; прибор вакуумного фильтрования ПВФ-35 и вакуумный насос СП-4-044 отечественного производства

Весы лабораторные общего назначения 4-го класса точности, наибольший предел взвешивания 200 г, допускается погрешность не более 0,02 г

Весы лабораторные общего назначения 4-го класса точности, наибольший предел взвешивания 1 кг, допускается погрешность не более 0,1 г

РН-метр, обеспечивающий измерение с погрешностью до 0,01

Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды не ниже ГОСТа 6709-72

Шкаф сушильный, стерилизационный, обеспечивающий температуру +180 град. C

Стерилизатор паровой с режимами стерилизации от температуры +100 град. C (текучим паром) до +126 град. C (под давлением)

Вытяжной шкаф для работы с хлороформом при проведении анализа на колифаги

Магнитные мешалки с подогревом до 300 град. C для варки сред, либо другой нагревательный прибор

Дозаторы для разлива питательных сред

Дозаторы пипеточные для использования в анализе

Примечание. К применению допускается только измерительное оборудование, вошедшее в Государственный реестр.

Мембранные фильтры нитрат или ацетат целлюлозные для микробиологических целей с диаметром пор 0,45 мкм и размером 35 или 47 мм: отечественные фильтрующие мембраны Владипор МФАС-ОС-1, МФАС-ОС-2, МФА-МА (номер 4 — 6); или аналогичные мембраны зарубежного производства, имеющие международный сертификат качества ISO 9000 или EN 29 000

Горелки газовые или спиртовки

Индикаторы бумажные для определения pH в диапазоне 6 — 8 с интервалом определения 0,2

Пинцеты для работы с мембранными фильтрами

Фольга алюминиевая, колпачки силиконовые, металлические

Лабораторная посуда стеклянная либо одноразового использования (колбы, цилиндры, пипетки, флаконы, стаканы, чашки Петри, пробирки, стеклянные палочки, поплавки, емкости для отбора проб)

Пробки различных размеров: силиконовые, резиновые и другие, выдерживающие стерилизацию сухим жаром или автоклавированием

Карандаши или фломастеры по стеклу

Марля медицинская в кусках или бинты

Все химические реактивы должны соответствовать квалификации не ниже ч.д.а.

Вещества обладают канцерогенным и мутагенным действием, работать с соблюдением мер предосторожности.

Допускаются к использованию коммерческие питательные среды, диагностические препараты и системы идентификации производства зарубежных фирм, предназначенные для целей описываемых методов. Питательные среды и биологические препараты зарубежного производства должны иметь международный сертификат качества ISO 9000 или EN 29 000.

При использовании следует руководствоваться рекомендациями фирмы — производителя.

Все обезвоженные коммерческие питательные среды и препараты отечественного производства должны иметь сертификат соответствия, паспорт и инструкцию по применению.

Pseudomonas aeruginosa или Pseudomonas fluorescens

Контрольные штаммы получают в Российском государственном институте медицинских и биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича или областном Центре госсанэпиднадзора.

Предпочтительно использование стандартизованных сухих питательных сред промышленного производства.

При использовании промышленных сухих питательных сред их приготавливают в соответствии с указаниями изготовителя на этикетке. В этом случае следует соблюдать способ применения и срок хранения питательных сред, указанных на упаковках.

Сухие питательные среды хранят в сухих помещениях, в темноте, при комнатной температуре. Открытые упаковки тщательно закупоривают. Среды с измененным внешним видом (уплотненные, с комками), а также с истекшим сроком годности не используют.

Для приготовления растворов, реактивов и питательных сред применяют воду дистиллированную по ГОСТу 6709-72.

Питательные среды приготовляют в посуде из инертного материала.

Учитывая возможное изменение pH питательных сред после кипячения и стерилизации при приготовлении сред устанавливают pH на 0,2 — 0,3 выше заданного, что определяют опытным путем для каждой среды. Окончательный контроль pH проводят в готовой среде при температуре 25 град. C с использованием pH-метра (жидкие среды) или бумажных индикаторов (агаризованные среды).

После стерилизации питательные среды оставляют для охлаждения при комнатной температуре.

Температура сред, хранящихся в холодильнике, перед посевом должна быть доведена до комнатной.

При необходимости разлить готовую питательную среду в чашки Петри, ее следует охладить до температуры 50 — 60 град. C.

Готовые полужидкие питательные среды хранят при комнатной температуре.

Готовят из заменителей мяса (мясного экстракта, рыбного гидролизата или других) по способу, указанному на этикетке.

Для приготовления десятикратного питательного бульона количество пептона и хлористого натрия (п. 5.3.1) или сухого препарата (п. 5.3.2) увеличивают в 10 раз.

Готовят из сухого препарата по способу, указанному на этикетке.

2% МПА готовят, увеличивая концентрацию агара до 20 г на тот же объем МПБ.

Готовят по п. 5.4.2, заменяя мясо — пептонный бульон на питательный бульон из заменителей мяса.

2-процентный питательный агар готовят, увеличивая навеску сухого препарата на 1/4 от прописи.

Готовят из сухого препарата по способу, указанному на этикетке.

Для повышения дифференцирующих свойств среды в готовую и охлажденную до 60 — 70 град. C среду перед разливкой в чашки допускается прибавлять на 100 мл среды 0,2 мл 5-процентного спиртового раствора основного фуксина.

Если на поверхности среды заметны следы влаги, чашки перед посевом необходимо подсушить. Срок хранения чашек со средой не более 2 — 3 суток в темноте, раствора фуксина — не более 1-го месяца.

При исследовании питьевой обеззараженной воды с преобладанием микрофлоры, не относящейся к бактериям кишечной группы, помимо фуксина, допускается добавление на 100 мл среды Эндо 0,2 мл 5-процентного спиртового раствора розоловой кислоты. Срок хранения розоловой кислоты — не более 1-го месяца.

Для приготовления концентрированной лактозо — пептонной (глюкозо — пептонной) среды все ингредиенты, кроме воды, увеличивают в 10 раз, разливают по 1 мл в пробирки и по 10 мл во флаконы.

5.7. Питательные среды для подтверждения способности ферментировать лактозу или маннит (глюкозу) до кислоты и газа

Глюкозу используют при отсутствии маннита.

Готовят из сухого препарата по способу, указанному на этикетке. Срок хранения — не более 2-х недель.

Готовят при отсутствии сухого препарата.

Правильно приготовленная среда — зеленого цвета с синеватым оттенком (цвет бутылочного стекла). Посев производят уколом до дна пробирки. При образовании кислоты цвет среды изменяется в желтый, при газообразовании газ скапливается или по уколу, или на поверхности, или в толще среды появляются разрывы. При инкубации посевов более 5 часов газ может улетучиться. В таких случаях на присутствие газа указывают оставшиеся в толще среды «карманы» — потемнения среды на месте бывшего пузырька газа.

При использовании в качестве подтверждающей следует добавить 2 мл 1,6-процентного неспиртового раствора индикатора бромтимолового синего на 1000 мл среды.

Разливают по 4 — 5 мл в пробирки с поплавками или комочками ваты.

Готовят по прописи завода — изготовителя.

1 вариант — 1-процентный водный раствор тетраметил-п — фенилендиамина гидрохлорида.

2 вариант — 1-процентный реактив — 1-процентный спиртовой раствор а-нафтола, 2 реактив — 1-процентный водный раствор фенилендиаминового соединения.

Растворы сохраняют в темных флаконах с притертыми пробками: 1-ый — до одного месяца, 2-ой — до одной недели. Перед употреблением (при работе со 2 вариантом) к трем частям первого раствора добавляют семь частей второго раствора.

Вместо реактива можно использовать системы индикаторные бумажные (СИБ-оксидаза) или бумажки, приготовленные заранее.

Приготовление бумажек для оксидазного теста: 30 мг а-нафтола растворить в 2,5 мл 96-процентного этилового спирта, добавить 7,5 мл дистиллированной воды и затем 50 мг диэтиланилинсульфата. Смочить фильтровальную бумажку, высушить и хранить в темноте в черной бумаге не более 6 месяцев.

С каждой новой партией реактивов, а также периодически в процессе хранения реактивов или готовой бумажной системы следует проводить контрольные испытания с тест — культурами известных микроорганизмов, дающих положительную реакцию (Pseudomonas aeruginosa или Pseudomonas fluorescens) и отрицательную реакцию (E. coli).

Основная среда. В 1000 мл стерильного расплавленного питательного агара (по п. 5.4) добавляют 10 г глюкозы, нагревают до растворения, разливают мерно во флаконы, автоклавируют при (112 +/- 2) град. C 12 минут.

Лабораторная посуда должна быть тщательно вымыта, ополоснута дистиллированной водой до полного удаления моющих средств и других посторонних примесей и высушена.

Пробирки, колбы, бутылки, флаконы должны быть заткнуты силиконовыми или ватно — марлевыми пробками и упакованы так, чтобы исключить загрязнения после стерилизации в процессе работы и хранения. Колпачки могут быть металлические, силиконовые, из фольги или плотной бумаги.

Флаконы для отбора проб закрывают силиконовыми, резиновыми и другими пробками, исключая ватно — марлевые, а также колпачками, изготовленными из фольги, плотной бумаги и др.

Новые резиновые пробки кипятят в 2-процентном растворе натрия двууглекислого 30 мин. и 5 раз промывают водопроводной водой (кипячение и промывание повторяют дважды). Затем пробки кипятят в дистиллированной воде 30 мин., высушивают, заворачивают в бумагу или фольгу и стерилизуют в паровом стерилизаторе. Резиновые пробки, использованные ранее, обеззараживают, кипятят 30 минут в водопроводной воде с нейтральным моющим средством, промывают в водопроводной воде, высушивают, монтируют и стерилизуют.

При приготовлении емкостей для отбора проб с притертой пробкой между стенкой горлышка и пробкой следует вложить полоску тонкой бумаги.

Пипетки со вставленными тампонами из ваты должны быть уложены в металлические пеналы или завернуты в бумагу.

Чашки бактериологические в закрытом состоянии должны быть уложены в металлические пеналы или завернуты в бумагу. Бумага, используемая для обертывания лабораторной посуды, не должна разрушаться при стерилизации.

Подготовленную посуду стерилизуют в сушильном шкафу при 160 — 170 град. C 1 час, считая с момента достижения указанной температуры. Простерилизованную посуду можно вынимать из сушильного шкафа только после его охлаждения ниже 60 град. C.

После охлаждения удаляют остатки сред, затем чашки и пробирки замачивают, кипятят в водопроводной воде и моют с последующим ополаскиванием дистиллированной водой.

Прежде чем приступить к посеву пробу необходимо тщательно перемешать и обработать горящим тампоном край емкости с тем, чтобы устранить его возможное загрязнение во время транспортирования. На используемых для посева пробирках и чашках необходимо обозначить номер пробы, объем воды или разбавление, дату посева.

Перед каждым отбором новой порции воды для анализа пробу необходимо перемешать стерильной пипеткой.

Мембранные фильтры должны быть подготовлены к анализу в соответствии с указаниями завода — изготовителя.

Фильтровальный аппарат обтирают ватным тампоном, смоченным спиртом ректификованным, и фламбируют. После охлаждения на нижнюю часть фильтровального аппарата (столик) кладут фламбированным пинцетом стерильный мембранный фильтр, прижимают его верхней частью прибора (стаканом, воронкой) и закрепляют устройством, предусмотренным конструкцией прибора.

В верхнюю часть прибора для фильтрования наливают точно отмеренный объем воды, затем создают вакуум в нижней части прибора.

При посеве нескольких объемов одной пробы следует фильтровать через один фильтровальный аппарат сначала меньшие, а затем большие объемы воды, меняя каждый раз фильтры.

При фильтровании 1 мл исследуемой воды или ее разбавления следует в воронку налить предварительно не менее 10 мл стерильной водопроводной воды, а затем внести анализируемую воду.

После окончания фильтрования воронку снимают, фильтр осторожно приподнимают за край фламбированным пинцетом при сохранении вакуума для удаления излишка воды на нижней стороне фильтра, а затем переносят его, не переворачивая, на питательную среду, разлитую в чашки Петри, избегая пузырьков воздуха между средой и фильтром. Поверхность фильтра с оседавшими на ней бактериями должна быть обращена вверх. Вакуум отключают до внесения следующей порции анализируемой воды.

Под каждым фильтром на дне чашки делают надпись с указанием объема профильтрованной воды, даты посева и номера пробы. На одну чашку можно поместить 3 — 4 фильтра с условием, чтобы фильтры не соприкасались.

Если исследуемая вода содержит большое количество взвешенных веществ, то ее фильтруют сначала через предварительный мембранный фильтр для удаления крупной взвеси, который помещают в фильтровальный прибор, накладывая на фильтр для бактериологического анализа. После окончания фильтрования фильтры переносят на плотную питательную среду раздельно и при выведении результатов анализа учитывают колонии, выросшие на обоих фильтрах.

Метод определяет в питьевой воде общее число мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (ОМЧ), способных образовывать колонии на питательном агаре при температуре 37 град. C в течение 24 часов, видимые с увеличением в 2 раза.

Из каждой пробы должен быть сделан посев не менее двух объемов по 1 мл.

После тщательного перемешивания пробы воды вносят по 1 мл в стерильные чашки Петри, слегка приоткрывая крышки. Сразу же после внесения воды в каждую чашку вливают 6 — 8 мл (на чашку диаметром 90 — 100 мм) расплавленного и остуженного до 45 — 46 град. C питательного агара после фламбирования края посуды, в которой он содержится. Затем быстро смешивают содержимое чашек, равномерно распределяя по всему дну, избегая образования пузырьков воздуха, попадания агара на края и крышку чашки. Эту процедуру производят на горизонтальной поверхности, где чашки оставляют до застывания агара.

Расплавленный агар на период проведения анализа помещают в водяную баню или термостат, поддерживающие температуру 45 — 46 град. C.

Тонкий слой агара увеличивает эффективность учета сапрофитной микрофлоры за счет лучших условий для роста аэробных бактерий, преобладающих в воде. Колонии вырастают более крупными, легко подсчитываемыми на фоне прозрачного тонкого слоя агара. Ограничен рост расплывчатых колоний.

После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат вверх дном и инкубируют при температуре (37 +/- 1) град. C в течение 24 +/- 2 часов.

Должны быть подсчитаны все выросшие на чашке колонии, наблюдаемые при увеличении в 2 раза. Подсчет следует производить только на тех чашках, на которых выросло не более 300 изолированных колоний.

Подсчитанное количество колоний на каждой чашке суммируют и делят на два. Результат выражают числом колоний образующих единиц (КОЕ) в 1 мл исследуемой пробы воды и заносят в протокол.

Результат дают на основании подсчета колоний на одной чашке, если на другой подсчет невозможен.

Если на всех чашках имеет место рост расплывчатых колоний, не распространяющийся на всю поверхность чашки, или выросло более 300 колоний и анализ нельзя повторить, подсчитывают сектор чашки с последующим пересчетом на всю поверхность. В этих случаях в протоколе отмечают «число КОЕ в 1 мл — ориентировочно».

Если подсчет колоний на чашках невозможен, то в протоколе отмечают: «сливной рост».

На качество результата метода влияет соблюдение деталей техники анализа (срока хранения пробы, температуры и времени инкубации посевов, правил учета результатов, качество питательного агара).

К общим колиформным бактериям относятся грамотрицательные не образующие спор палочки, не обладающие оксидазной активностью, ферментирующие лактозу или маннит с образованием альдегида, кислоты и газа при температуре 37 град. C в течение 24-х часов.

Термотолерантные колиформные бактерии обладают всеми признаками общих колиформных бактерий, которые кроме того способны ферментировать лактозу до кислоты и газа при температуре 44 град. C в течение 24-х часов.

Метод основан на фильтрации установленного объема воды через мембранные фильтры, выращивании посевов на селективной питательной среде с лактозой и последующей идентификации колоний по культуральным и биохимическим свойствам.

При исследовании воды на выходе с водопроводных сооружений и в распределительной сети необходимо анализировать 3 объема по 100 мл.

Если анализируемая вода стабильно соответствует нормативам, то допустима фильтрация 300 мл воды через один фильтр.

При необходимости возможно увеличение количества фильтруемых объемов для получения изолированных колоний на фильтре (например, из водопроводной сети можно фильтровать 10, 40, 100, 150 мл воды).

Необходимый точно отмеренный объем воды фильтруют через мембранные фильтры с соблюдением требований, изложенных в п. 7.

Фильтры помещают на среду Эндо, приготовленную по п. 5.5.1 или п. 5.5.2. Чашки с фильтрами ставят в термостат дном вверх и инкубируют посевы при температуре (37 +/- 1) град. C в течение 24 +/- 2 часов.

Результат считается отрицательным, если на фильтрах вообще не выросли колонии или выросли колонии с неровными краями и поверхностью (пленчатые, губчатые, плесневые, прозрачные, слизистые).

При сливном росте на всех фильтрах проводят рассев на среде Эндо для получения изолированных колоний обычными бактериологическими методами.

При наличии типичных лактозоположительных колоний, дающих отпечаток на обратной стороне мембранного фильтра и среде — темно — красных, красных с металлическим блеском и без него, выпуклых с красным центром и других оттенков, а также лактозоотрицательных — розовых без отпечатков, подсчитывают число колоний каждого типа.

Для идентификации отбирают не менее 5 колоний каждого вида, делают их посев на скошенный питательный агар, либо на чашки секторами, инкубируют при температуре (37 +/- 1) град. C 16 — 18 часов. При росте колоний одного вида исследуют не менее 10 колоний.

Все дальнейшие биохимические тесты проводят только с чистыми субкультурами.

В качестве подтверждающих тестов используют оксидазный тест и тест образования кислоты и газа при ферментации лактозы или маннита (глюкозы).

Для определения оксидазной активности поместить на фильтровальную бумагу 2 — 3 капли свежеприготовленного реактива для оксидазного теста п. 5.8. Заранее приготовленные бумажки для оксидазного теста смачивают дистиллированной водой. Стеклянной палочкой или платиновой петлей (металлическая петля может дать ложно положительную реакцию) помещают мазок свежей культуры, выращенной на питательной агаровой среде, на подготовленную фильтровальную бумагу. Реакция считается положительной, если в течение 10 — 30 секунд появляется фиолетово — коричневое (п. 5.8, вариант 1) или синее (п. 5.8, вариант 2) окрашивание. Более позднюю реакцию не учитывают.

При посеве секторами оксидазный тест допустимо выполнить накапливанием реактива на часть сектора.

В тех случаях, когда на фильтрах выросло более 10 колоний, допустимо оксидазный тест выполнить, помещая мембранный фильтр на кружок фильтровальной бумаги, обильно смоченный реактивом. После проявления положительной реакции, но не позднее 5 мин., фильтр переносят обратно на среду Эндо и при необходимости дальнейшей идентификации немедленно делают пересев на подтверждающую среду.

Культуры, давшие оксидазоположительные реакции, дальнейшему исследованию не подлежат.

Все типичные лактозоположительные колонии засевают параллельно в две пробирки с одной из лактозных сред, приготовленных по п. 5.7. Для определения общих колиформных бактерий посев инкубируют при температуре (37 +/- 1) град. C в течение 24 +/- 2 часов. Для определения термотолерантных бактерий посев производят в среду, предварительно прогретую до температуры 44 град. C, и инкубируют при температуре (44 +/- 0,5) град. C в течение 24 +/- 2 часов.

Нетипичные колонии (лактозоотрицательные) пересевают в подтверждающем тесте со средой с маннитом (глюкозой) по п. 5.7 и инкубируют посевы при температуре (37 +/- 1) град. C в течение 24 +/- 2 часов.

Для ускорения анализа допустимо производить посев в подтверждающие среды с лактозой или маннитом непосредственно из колоний на фильтрах параллельно с посевом на скошенный агар (при росте крупных изолированных колоний).

Первичный учет газообразования на подтверждающих средах осуществляют через 5 — 6 часов. При отсутствии кислоты и газа или при наличии только кислоты пробирки оставляют для окончательного учета через 24 часа.

При необходимости, если отсутствует газообразование в пробирках с лактозой, допустимо, для подтверждения принадлежности колоний к общим колиформным бактериям, сделать пересев в среду с маннитом (глюкозой), инкубируя посевы при температуре (37 +/- 1) град. C в течение 24 +/- 2 часов.

Колонии учитывают как общие колиформные бактерии при отрицательном оксидазном тесте, ферментации лактозы или маннита (глюкозы) при температуре (37 +/- 1) град. C с образованием кислоты и газа.

Среди этих колоний учитывают как термотолерантные колиформные бактерии при отрицательном оксидазном тесте и ферментации лактозы при температуре (44 +/- 0,5) град. C с образованием кислоты и газа.

Если при выборочной проверке колоний одного типа получены неодинаковые результаты, то для вычисления числа колиформных бактерий среди этих колоний используют формулу:

X — число колоний одного типа;

a — общее число колоний этого типа;

b — число проверенных из них;

c — число колоний с положительным результатом.

Результат анализа выражают числом колоний образующих единиц (КОЕ) общих колиформных бактерий в 100 мл воды.

Для подсчета результата суммируют число колоний, подтвержденных как общие колиформные бактерии, выросших на всех фильтрах, и делят на 3.

При получении изолированных колоний после рассева заросших фильтров и подтверждения их как общие колиформные бактерии результат является качественным, в протоколе отмечают «обнаружено». При необходимости получения количественного результата анализ следует повторить.

В случаях сплошного роста на всех фильтрах и невозможности получения изолированных колоний результат не учитывается. В протоколе отмечают «зарост фильтров».

1. При посеве 3-х фильтров по 100 мл выросло две колонии на 100 мл, на остальных 2-х фильтрах нет роста. Число общих колиформных бактерий будет

2. При посеве 10, 40, 100 и 150 мл на фильтрах с профильтрованным объемом 40 мл выросли 4 изолированные колонии, с профильтрованным объемом 100 — 3 колонии общих колиформных бактерий. Фильтры с объемами 10 мл и 150 мл заросли и учету не подлежат. Суммируют общее число изолированных колоний и пересчитывают на объем 100 мл. В данном случае суммарное число изолированных колоний равно 7 (3 + 4 = 7) в объеме 140 мл (100 + 40). Число КОЕ будет составлять (7 x 100) : 140 = 5 КОЕ в 100 мл.

При отсутствии общих колиформных бактерий на всех фильтрах результат записывают как «не обнаружено КОЕ в 100 мл».

Вычисление и оформление результатов в протоколе определения термотолерантных колиформных бактерий проводят аналогично.

Определение понятия термотолерантных колиформных бактерий по п. 8.2.1.

Титрационный метод может быть использован:

— при отсутствии материалов и оборудования, необходимых для выполнения анализа методом мембранной фильтрации;

— при анализе воды с большим содержанием взвешенных веществ;

— в случае преобладания в воде посторонней микрофлоры, препятствующей получению на фильтрах изолированных колоний общих колиформных бактерий.

Метод основан на накоплении бактерий после посева установленного объема воды в жидкую питательную среду, с последующим пересевом на селективную плотную питательную среду с лактозой и идентификации колоний по культуральным и биохимическим тестам.

При исследовании питьевой воды централизованного водоснабжения засевают 3 объема по 100 мл (анализ качественный). При исследованиях воды с целью количественного определения общих колиформных бактерий и при повторном анализе производят посев: 3 объемов по 100 мл, 3 объемов по 10 мл, 3 объемов по 1 мл. Каждый объем исследуемой воды засевают в лактозо — пептонную среду, приготовленную по п. 5.6. Посев 100 мл и 10 мл воды производят в 10 и 1 мл концентрированной лактозо — пептонной среды, посев 1 мл пробы проводят в 10 мл среды обычной концентрации.

Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) град. C в течение 24 — 48 часов. После 24 часов инкубации проводят предварительную оценку посевов. Из емкостей, где отмечено наличие роста и образование газа, производят высев на сектора среды Эндо, приготовленной с добавлением фуксина (п. 5.5.1). Посев делают петлей с таким расчетом, чтобы получить изолированные колонии.

Засеянные емкости без наличия роста и образования газа оставляют при (37 +/- 1) град. C до 48 часов. После 48 часов инкубации посевы без признаков роста считают отрицательными и дальнейшему исследованию не подлежат. Из емкостей, где отмечено помутнение и образование газа или только помутнение, делают высев на сектора среды Эндо.

Посевы на среде Эндо инкубируют при температуре (37 +/- 1) град. C в течение 18 — 20 часов.

Допустимо в качестве среды накопления использовать глюкозо — пептонную среду вместо лактозо — пептонной. В этом случае высев на сектора среды Эндо производят через 24 часа инкубации из посевов, где отмечено помутнение и газообразование или только помутнение. Дальнейший анализ выполняют так же, как и при использовании лактозо — пептонной среды.

При образовании помутнения и газа в среде накопления и росте на среде Эндо типичных для лактозоположительных бактерий колоний, дающих отпечаток на среде, образующих альдегид — темно — красных или красных, с металлическим блеском или без него, выпуклых с красным центром, дают положительный ответ на присутствие общих колиформных бактерий в данном объеме пробы.

В следующих случаях требуется подтвердить наличие общих колиформных бактерий:

— если в среде накопления отмечено только помутнение (подтверждают на среде с маннитом (глюкозой));

— когда принадлежность к лактозоположительным колониям вызывает сомнение у исследователя, подтверждают на среде с лактозой.

При этом проверяют наличие отпечатка на среде Эндо после снятия петлей подозрительной колонии. Среда под лактозоположительной колонией окрашена в красный цвет. Выполняют оксидазный тест на чистой агаровой субкультуре, как это описано в п. 8.2.4, после посева этих колоний на скошенный агар или сектор чашки с питательным агаром. Подтверждают способность к газообразованию при посеве изолированных 1 — 2-х колоний с сектора на среду с лактозой или маннитом (глюкозой) по п. 5.7 (в зависимости от цели исследования) с последующей инкубацией посевов при температуре (37 +/- 1) град. C в течение 24-х часов.

Если на секторе получено наслоение культур, то необходимо произвести рассев подозрительных на типичные колонии общепринятыми бактериологическими методами.

Дальнейшему исследованию подлежат также сектора среды Эндо, где выросли лактозоотрицательные розовые колонии. Для идентификации выполняют оксидазный тест путем накапывания реактива на часть колоний, выросших на секторе. После обнаружения оксидазоотрицательных колоний, 2 — 3 из них каждого типа и с каждого сектора пересевают на подтверждающие среды с маннитом (глюкозой) по п. 5.7 и инкубируют при температуре (37 +/- 1) град. C в течение 24-х часов.

Первичный учет газообразования осуществляют через 5 — 6 часов. При отсутствии кислоты и газа или при наличии только кислоты пробирки оставляют для окончательного учета через 24 часа. Положительный ответ на наличие общих колиформных бактерий дают при ферментации лактозы или маннита (глюкозы) до кислоты и газа хотя бы одной колонией с сектора.

Отрицательный ответ дают, если:

— в среде накопления нет признаков роста;

— на секторах среды Эндо нет роста;

— на секторах среды Эндо выросли не характерные для колиформных бактерий колонии (прозрачные, с неровными краями, расплывчатые и т.п.);

— все колонии на секторе оказались оксидазоположительными;

— если в подтверждающем тесте на среде с лактозой или маннитом (глюкозой) не отмечено газообразования.

Для определения термотолерантных колиформных бактерий работают с секторами среды Эндо, где выросли типичные лактозоположительные колонии и отмечено помутнение и газообразование в среде накопления. Делают посев 2 — 3 изолированных колоний каждого типа с каждого сектора в пробирки с любой из лактозных сред, приготовленных по п. 5.7.

Среда перед посевом должна быть нагрета на водяной бане или в термостате до 44 град. C. Немедленно после посева пробирки помещают в термостат и инкубируют при температуре (44 +/- 0,5) град. C в течение 24 +/- 2 часов.

При образовании газа в среде накопления, росте на среде Эндо лактозоположительных бактерий, образующих альдегид, и выявлении способности этих бактерий ферментировать лактозу до кислоты и газа в течение 24-х часов при температуре 44 град. C дают положительный ответ на наличие в этом объеме пробы воды термотолерантных колиформных бактерий. Во всех остальных случаях дают отрицательный ответ.

Допустимо для ускорения выдачи ответа на присутствие термотолерантных колиформных бактерий производить высев 1 мл из объемов среды накопления, где отмечено помутнение и газообразование, в пробирки с лактозо — пептонной средой с поплавком по п. 5.7 и прогретой предварительно до температуры 44 град. C. Посевы выдерживают в термостате при температуре (44 +/- 0,5) град. C в течение 24 +/- 2 часов. При обнаружении кислоты и газа дают положительный ответ.

При исследовании 3-х объемов по 100 мл результаты оцениваются качественно, и при обнаружении общих или термотолерантных колиформных бактерий хотя бы в одном из трех объемов делают запись в протоколе «обнаружены» в 100 мл.

При исследовании количественным методом, после определения положительных и отрицательных результатов на наличие общих и термотолерантных колиформных бактерий в объемах воды, посеянных в среду накопления, вычисляют наиболее вероятное число бактерий в 100 мл пробы по табл. 1. Результат сообщают без доверительного интервала.

При отрицательном ответе на наличие общих или термотолерантных колиформных бактерий во всех исследованных объемах выдают заключение в протоколе «не обнаружены» в 100 мл.

Сульфитредуцирующие клостридии, преимущественно Closridium perfringens, — спорообразующие анаэробные палочковидные микроорганизмы, редуцирующие сульфит натрия на железо — сульфитном агаре при температуре 44 град. C в течение 24-х часов.

Метод основан на фильтрации исследуемого объема воды через мембранные фильтры, выращивании посевов в железо — сульфитном агаре в условиях, приближенных к анаэробным, и подсчете числа черных колоний.

Пробу воды 20 мл прогревают на водяной бане в пробирках при температуре (75 +/- 5) град. C в течение 15 минут для исключения вегетативных форм.

Из каждой пробы питьевой воды на выходе с водопроводных сооружений фильтруют 20 мл. При необходимости подбирают объемы с таким расчетом, чтобы на фильтрах выросло не более 10 — 15 колоний. При этом ориентируются на результаты предыдущих исследований.

Фильтрование воды производят в соответствии с требованиями, изложенными в п. 7.

Вариант 1 — определение в пробирках.

Перед посевом пробирки с железо — сульфитным агаром, приготовленным по п. 5.9, расплавляют на водяной бане (не кипятить!). В течение посева поддерживают среду нагретой до 70 — 80 град. C в водяной бане желательно с автоматическим регулированием температуры.

После фильтрации установленного объема воды мембранный фильтр фламбированным пинцетом берут за два противоположных края и согнутый в виде трубочки помещают в пробирку с горячим агаром. Сторона фильтра с осевшими бактериями обращена внутрь. При этом фильтр распрямляется и располагается по стенке пробирки.

Сразу же после посева пробирку с агаром и фильтром для создания анаэробных условий быстро охлаждают, помещая в емкость с холодной водой. Культивируют посевы при (44 +/- 1) град. C в течение 24 +/- 2 часов.

Вариант 2 — определение в чашках Петри.

Чашки Петри диаметром 55 — 60 мм заливают тонким слоем железо — сульфитного агара. После фильтрации фильтр помещают фильтрующей поверхностью вниз на застывшую питательную среду так, чтобы под фильтром не было пузырьков воздуха. Заливают расплавленным железо — сульфитным агаром до верхнего края чашки, чтобы крышка плотно прилегала к среде для создания анаэробных условий. Культивируют посевы при (44 +/- 1) град. C в течение 24 +/- 2 часов.

Недопустимо на чашку помещать более одного фильтра.

Подсчитывают черные колонии. Учету подлежат только те посевы, где получены изолированные колонии, как выросшие на фильтрах, так и в толще среды. Предварительный учет результатов проводят через 16 — 18 часов инкубации. Окончательный учет результатов осуществляют через 24 часа.

Результат анализа выражают числом колоний образующих единиц (КОЕ) спор сульфитредуцирующих клостридий в 20 мл воды.

Если не отмечен рост черных колоний на всех фильтрах, в протоколе анализа дают ответ «не обнаружено» в 20 мл воды.

При наличии колоний, после их подсчета, результат вычисляют по формуле:

X — число клостридий в 20 мл;

a — число подсчитанных колоний в сумме;

V — фактически профильтрованный объем на фильтрах, где велся учет колоний.

При невозможности учета колоний из-за сливного роста результат оценивается как качественный, в протоколе отмечают «обнаружено» в 20 мл. При необходимости получения количественного результата анализ необходимо повторить.

Определение понятия показателя по п. 8.6.1.

Метод основан на посеве установленного объема воды в пробирки с железо — сульфитным агаром, инкубации посевов при температуре 44 град. C в течение 24-х часов и подсчете черных колоний.

Железо — сульфитный агар во флаконах и пробу воды готовят, как это описано в п. 8.4.3.

Из каждой пробы делают посев 20 мл в железо — сульфитный агар, приготовленный по п. 5.9.

В стерильные пробирки вносят:

— по 10 мл в 2 пробирки при использовании пробирок, вмещающих не менее 30 мл;

— по 5 мл воды в 4 пробирки при использовании пробирок, вмещающих не менее 15 мл.

Посевы заливают горячим 75 — 80 град. C железо — сульфитным агаром в количестве, превышающем объем воды в 2 раза. Среду заливать по стенке пробирки, избегая образования пузырьков воздуха. После этого пробирку быстро охлаждают, помещая ее в емкость с холодной водой для создания анаэробных условий. Посевы инкубируют при (44 +/- 1) град. C в течение 24 +/- 2 часов.

Учет результатов выполняют по п. 8.4.4.

Подсчет и представление результатов выполняют по п. 8.4.5.

Колифаги — бактериальные вирусы, способные лизировать кишечную палочку и формировать зоны лизиса (бляшки) через 18 +/- 2 часа при температуре (37 +/- 1) град. C на ее газоне на питательном агаре. Колифаги — индикаторы очистки питьевой воды в отношении энтеровирусов.

Прямой метод выделения колифагов из воды целесообразно применять при проведении исследований по эпидпоказаниям или в случае необходимости получения быстрого результата анализа.

Принцип прямого метода определения колифагов в питьевой воде заключается в исследовании нормируемого объема воды (100 мл) путем его прямого посева и последующего учета зон лизиса (бляшек) на газоне E. coli в чашках Петри с питательным агаром. Для контроля используют чашку с чистым газоном E. coli на питательном агаре. Нижний предел определения колифагов — 1 БОЕ (бляшкообразующая единица) в 100 мл воды.

Накануне проведения анализа необходимо сделать посев E. coli на косяк с питательным агаром (п. 5.4).

Если агар застыл не полностью, чашки Петри следует инкубировать в термостате не переворачивая.

Учет результатов проводят путем подсчета и суммирования бляшек, выросших на 5-ти чашках Петри. Результаты выражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ) на 100 мл пробы воды. В контрольной чашке бляшки колифагов должны отсутствовать.

При наличии бляшек в контрольной чашке следует получить новый штамм E. coli из бактериологической лаборатории областного центра госсанэпиднадзора и анализ повторить.

Метод предназначен для проведения текущего анализа питьевой воды.

Принцип метода определения колифагов в питьевой воде титрационным методом заключается в предварительном подращивании колифагов в среде обогащения в присутствии E. coli и последующем выявлении бляшек колифага на газоне E. coli на питательном агаре.

Определение НВЧ колифагов производят по табл. 3.

5.3. В каждую емкость внести смыв бактерий E. coli в концентрации

Сделать посев E. coli на косяк с питательным агаром (по п. 5.4) и инкубировать в термостате при температуре (37 +/- 1) град. C.

Через 18 +/- 2 часа инкубации пробы извлечь из термостата. Из колбы с 50 мл пробы воды стерильно отлить в пробирку 10 мл. Эту пробирку и остальные 5 пробирок промаркировать, в каждую добавить по 1 мл хлороформа, заменить ватно — марлевые пробки на резиновые, пробирки тщательно встряхнуть и оставить при комнатной температуре на 15 минут для осаждения хлороформа.

После этого чашку с агаром для исследуемой пробы разделить на 6 секторов, промаркировать их в соответствии с исследуемыми объемами и в каждый сектор внести по 1 капле надосадочной жидкости (без хлороформа) из каждой пробирки.

После подсыхания капель чашку с исследуемой пробой и контрольную чашку поместить в термостат при (37 +/- 1) град. C на 18 +/- 2 часа.

При одновременном анализе нескольких проб воды контролем газона E. coli может служить одна чашка.

Учет результатов проводится по наличию на секторах выросших бляшек колифага. Индекс колифага определяется по таблице НВЧ (табл. 3). На контрольной чашке бляшки колифага должны отсутствовать. При обнаружении бляшек колифага на контрольной чашке следует поступить как в п. 8.6.4.

источник