Предпочтительно использование стандартизованных сухих питательных сред промышленного производства.
При использовании промышленных сухих питательных сред их приготавливают в соответствии с указаниями изготовителя на этикетке.
В этом случае следует соблюдать способ применения и срок хранения питательных сред, указанные на упаковках.
Сухие питательные среды хранят в сухих помещениях, в темноте, при комнатной температуре. Открытые упаковки тщательно закупоривают. Среды с измененным внешним видом (уплотненные, с комками), а также с истекшим сроком годности не используют.
Для приготовления растворов, реактивов и питательных сред применяют воду дистиллированную по ГОСТу 6709-72.
Питательные среды готовят в посуде из инертного материала.
Учитывая возможное изменение рН питательных сред после кипячения и стерилизации, окончательный контроль рН проводят в готовой среде при температуре 25 °С с использованием индикаторной бумаги.
После стерилизации питательные среды оставляют для охлаждения при комнатной температуре. При необходимости розлива в чашки Петри среды охлаждают до температуры (50-60) °С.
Температура сред, хранящихся в холодильнике, перед посевом должна быть доведена до комнатной.
5.2.1. Готовят из сухого препарата промышленного производства по способу, указанному на этикетке.
5.2.2. Питательный бульон (десятикратный) для колифагов готовят путем увеличения в 10 раз навески сухого препарата, указанной на этикетке.
5.3.1. Готовят из сухого препарата промышленного производства по способу, указанному на этикетке.
5.3.2. Питательный агар для определения колифагов прямым методом готовят, увеличивая навеску сухого препарата в 2 раза от прописи.
5.3.3. Питательный агар запрещается выдерживать в расплавленном состоянии более 8 ч. Оставшийся неиспользованным агар повторному расплавлению не подлежит.
5.3.4. Полужидкий питательный агар готовят следующим образом: сухой питательный бульон (15 г) и агар микробиологический (3 г) растворить при нагревании в 1000 мл дистиллированной воды. Довести рН до 7,0-7,2, разлить в пробирки и стерилизовать автоклавированием при 121 °С в течение 15 мин.
5.3.5. Питательный агар со стрептомицином готовят из расчета содержания 100 мкг стрептомицина на 1 мл питательного агара, приготовленного по стандартной прописи. Стерильно на стерильной дистиллированной воде готовят раствор стрептомицина в концентрации 10 мг на 1 мл. В готовый питательный агар, отмеренный по объему и остуженный до температуры (45-49) °С, вносят приготовленный стерильный раствор стрептомицина из расчета 0,1 мл на 10 мл питательного агара. Разливают в пробирки для приготовления скошенного агара. Повторное расплавление питательной среды со стрептомицином запрещается.
5.4. Фуксин-сульфитная среда Эндо
Готовят из сухого препарата по способу, указанному на этикетке. Если на поверхности среды заметны следы влаги, чашки перед посевом необходимо подсушить. Срок хранения чашек со средой не более 2-3 суток в темноте, если производителем не оговорены другие сроки.
5.4.2. Повышение дифференцирующих свойств среды
Для повышения дифференцирующих свойств среды в готовую и охлажденную до (60-70) °С среду перед разливкой в чашки допускается прибавлять на 100 мл среды 0,2 мл 5 %-ного спиртового раствора основного фуксина. Срок хранения раствора фуксина — не более 1 мес.
5.4.3. Модификация среды с добавлением розоловой кислоты
В случаях, когда мембранные фильтры зарастают микрофлорой, не относящейся к бактериям кишечной группы, помимо фуксина, допускается добавление на 100 мл среды Эндо 0,2 мл 5 %-ного спиртового раствора розоловой кислоты. Срок хранения раствора розоловой кислоты -не более 1 мес.
Модификацию среды Эндо с добавлением розоловой кислоты используют только при работе методом мембранной фильтрации.
5.5. Лактозо-пептонная среда
10 г пептона, 5 г натрия хлористого, 5 г лактозы растворяют при нагревании в 1 л дистиллированной воды. После растворения ингредиентов устанавливают рН 7,4-7,6, разливают по 10 мл в пробирки, стерилизуют при (112 ±2) °С 12 мин.
Для приготовления концентрированной лактозо-пептонной среды все ингредиенты, кроме воды, увеличивают в 10 раз, разливают по 1 мл в пробирки и по 10 мл во флаконы.
5.6. Питательные среды для подтверждения способности ферментировать лактозу до кислоты и газа
5.6.1. Полужидкая среда с лактозой из сухого препарата
Готовят по способу, указанному на этикетке.
Срок хранения — не более 2 недель при комнатной температуре.
Посев производят уколом до дна пробирки. При образовании кислоты цвет питательной среды изменяется в соответствии с использованным индикатором. При газообразовании газ скапливается или по уколу, или на поверхности, или в толще среды появляются разрывы. При инкубации посевов более 5 ч газ может улетучиться. В таких случаях на присутствие газа указывают оставшиеся в толще среды “карманы” -потемнения среды на месте бывшего пузырька газа.
5.6.2. Полужидкая среда с лактозой
Готовят при отсутствии сухого препарата.
В 1 л дистиллированной воды растворяют 10 г пептона, 5 г натрия хлористого, (4-5) г агар-агара, доводят до кипения, устанавливают рН 7,2-7,4, добавляют 1 мл 1,6%-ного спиртового раствора бромтимолового синего. Стерилизуют при (120±2)°С 20 мин. В расплавленную среду вносят 5 г лактозы, нагревают до кипения, разливают в стерильные пробирки на; высоту (3-5) см и стерилизуют при (112 ± 2) °С 12 мин. Срок хранения — не более 2 недель при комнатной температуре.
Правильно приготовленная среда зеленого цвета с синеватым оттенком (цвет, бутылочного стекла). При образовании кислоты цвет среды изменяется на желтый.
5.6.3. Лактозо-пептонная среда
Готовят по п. 5.5 с добавлением 1 мл 1,6%-ного спиртового раствора бромтимолового синего на 1 л и разливают по (3-5) мл в пробирки с поплавком.
Готовят по прописи завода-изготовителя.
5.7. Реактивы для оксидазного теста
1 %-ный водный раствор тетраметил-п-фенилендиамина гидрохлорид. Готовят перед употреблением.
Реактив № 1. 1 %-ный спиртовой раствор a -нафтола.
Реактив № 2. 1 %-ный водный раствор фенилендиаминового соединения.
Растворы сохраняют в темных флаконах с притертыми пробками: 1 — до одного месяца, 2 — до одной недели. Перед употреблением к трем частям первого раствора добавляют семь частей второго раствора.
Могут быть использованы коммерческие тест-системы для постановки оксидазного теста (СИБ-оксидаза или аналоги).
Перед работой с каждой серией проб реактивы или тест-системы на оксидазу следует испытывать с тест-культурами микроорганизмов, дающих положительную (Ps. aeruginosa, Ps. fluorescens) и отрицательную оксидазную реакцию (Е. со li).
В 1000 мл стерильного расплавленного питательного агара (по п. 5.4) добавляют 10 г глюкозы, нагревают до растворения, разливают мерно во флаконы, автоклавируют при (112 ± 2) °С 12 мин (основная среда).
20 %-ный раствор сульфита натрия (Na2SO3) и 8 %-ный раствор железа серно-кислого закисного ( FеSO4 ) или железа хлористого (FeCl2) готовят непосредственно перед употреблением в стерильной посуде на стерильной дистиллированной воде. Раствор сульфита натрия нагревают до полного растворения. Перед выполнением анализа в 100 мл расплавленной основной среды вносят 5 мл 20 %-ного раствора сульфита натрия, перемешивают, затем вносят 1 мл 8 %-ного раствора сернокислого железа, перемешивают и стерильно разливают в пробирки высоким столбиком (12-15) см для работы методом мембранной фильтрации или во флаконы для работы методом прямого посева.
5.9. Реактивы для окраски препаратов по Граму
5.9.1. Карболовый раствор генциана фиолетового готовят следующим образом: 1 г генциана фиолетового, 10 мл ректификованного этилового спирта, 5 г фенола растирают в ступке, добавляя 100 мл дистиллированной воды.
5.9.2. Раствор Люголя готовят следующим образом: 1 г йода, 2 г йодистого калия растворяют в 300 мл дистиллированной воды. Хранить во флаконе из темного стекла.
5.9.3. Фуксин Циля готовят следующим образом: 1 г основного фуксина, 10 мл спирта этилового ректификованного, 54 г фенола растирают в ступке, добавляя 100 мл дистиллированной воды.
источник
Исследованию подлежит вода:
1) централизованного водоснабжения;
2) из колодцев различного типа;
3) открытых водоемов (рек, озер, морей);
Примечание. Пробы хлорированной воды берут во флаконы с дехлоратором (гипосульфитом).
Отбор проб воды. Из открытых водоемов воду берут с помощью специальных бутылей или батометров, снабженных грузилами. Пробу воды рекомендуют брать на глубине 10-15 см от поверхности (так как поверхность подвергается воздействию атмосферных факторов) и на расстоянии 1,5 м от берега (вода у самого берега может быть загрязнена микрофлорой почвы).
Для отбора проб водопроводной воды используют стерильные флаконы вместимостью 500 мл, закрытые ватно-марлевыми пробками и покрытые бумажными колпачками.
Кран предварительно обжигают тампоном, смоченным спиртом, после чего воду спускают в течение 10-15 мин и набирают во флаконы. Заполненные флаконы закрывают стерильными пробками.
Примечание. Исследуют 333 мл воды (табл. 54).
Таблица 54. Эмпирическая таблица ГОСТ 16963-73
В распределительной сети водопровода отбор проб воды осуществляют в зависимости от количества населения, проживающего в зоне обслуживания.
Стандартные методы исследования регламентированы для воды центрального водоснабжения (ГОСТ 18963-73) и предусматривают:
1. Определение общего числа микроорганизмов (в 1 мл исследуемой воды должно быть не более 100).
2. Определение коли-индекса и коли-титра (коли-индекс 3, коли-титр 333 и выше; для Москвы и Ленинграда коли-индекс не более 2, а коли-титр более 500).
3. Исследование по эпидемиологическим показаниям на патогенную микрофлору (патогенных микроорганизмов не должно быть обнаружено).
Согласно ГОСТу 18963-73 общее число бактерий — это то количество микроорганизмов, которое содержится в 1 мл исследуемой воды, способных в течение суток при температуре 37° С образовывать колонии, видимые невооруженным глазом (или при увеличении с помощью лупы).
При исследовании водопроводной воды засевают 2 чашки. В одну из них вносят 1 мл неразведенной воды, в другую 1 мл воды, разведенной в 10 раз (т. е. 0,1 мл исходной пробы).
При исследовании более загрязненной воды засевают 1 мл воды, разведенной в 100 раз. Это соответствует 0,01 и 1 мл .воды, разведенной в 1000 раз (0,001 мл) и т. д. Для получения таких объемов готовят последовательно десятикратные разведения, по 1 мл каждого разведения вносят в чашку и заливают тонким слоем (12-15 мл) растопленного и остуженного до 45° С питательного агара. Для равномерного распределения исследуемой воды залитые агаром чашки перемешивают путем вращения их. После застывания агара посевы ставят в термостат и инкубируют при температуре 37° С 24 ч.
Чашки с посевами вынимают из термостата и подсчитывают число выросших колоний. Учитывают только те чашки, где число колоний находится в пределах 30-300. Если колоний немного, их подсчитывают невооруженным глазом или при помощи лупы.
Если колоний много, то подсчет можно вести с помощью специального прибора для счета микробных колоний (рис. 54).
Рис. 54. Прибор для счета колоний микроорганизмов. 1 — столик для чашки Петри; 2 — игла с пружинным устройством; 3 — показатель счетчика; 4 — тумблер для включения импульсного счетчика; 5 — тумблер для включения лампы освещения счетчика
Подсчитанное количество колоний умножают на разведение и узнают число микробов в 1 мл исследуемой воды.
Наличие БГКП (бактерий группы кишечной палочки) является показателем фекального загрязнения, интенсивность которого характеризуют:
Коли-индекс — количество кишечных палочек, обнаруженных в 1 л воды.
Коли-титр — наименьшее количество воды, в котором обнаруживают присутствие кишечной палочки * .
* ( Коли-титр и коли-индекс — это один показатель, различно выраженный.)
Для выявления в воде БГКП можно пользоваться двумя методами: титрационным (бродильным) и методом мембранных фильтров.
Для исследования воды используют среду накопления глюкозопептонную (ГПС) среду Эйкмана с индикатором и бродильными трубками. Среда готовится концентрированной (в 10 раз) и нормальной концентрации — для посева 1 мл воды.
Исследуемую воду засевают по 100 мл в 3 колбы, по 10 мл в 3 пробирки (с концентрированной средой) и по 1 мл в 3 пробирки (со средой нормальной концентрации) — всего 333 мл. Посевы инкубируют в термостате при 37° С 24 ч.
Вынимают посевы из термостата и просматривают их.
При наличии помутнения в колбах или пробирках из них производят посев петлей на сектора среды Эндо в чашках Петри. Посевы инкубируют в термостате при 37° С.
Вынимают чашки из термостата. Из подозрительных колоний делают мазки. При наличии грамотрицательных палочек ставят пробу на оксидазную активность. Положительная проба на оксидазу дает право дать отрицательный ответ.
Проба на оксидазу. 1-й способ: со среды Эндо снимают петлей 2-3 колонии каждого типа и наносят на поверхность фильтровальной бумаги, смоченной диметилпарафенилендиамином. Положительная реакция характеризуется посинением штрихов, сделанных из колоний.
2-й способ: реактив можно нанести на изолированную колонию на среде Эндо (красная колония — синеет) (рис. 55).
Рис. 55. Определение коли-индекса воды титрационным методом
Отрицательная проба на оксидазу свидетельствует о наличии в воде БГКП. В этом случае вычисляют коли-индекс и коли-титр с помощью стандартных (эмпирических) таблиц ГОСТа 16963-73 (см. табл. 54).
Эти таблицы предусматривают любую возможную комбинацию объемов посева, из которых выделена кишечная палочка.
Для фильтрации воды можно использовать воронку Гольдмана вместимостью 700-800 мл.
В воронку смонтированного и простерилизованного фильтровального прибора Зейтца наливают отмеренный объем исследуемой воды. С помощью насоса создают вакуум в приемном сосуде (обычно воду фильтруют через фильтры № 2 и 3). По окончании фильтрации стерильным или обожженным в огне пинцетом снимают фильтр и накладывают его на среду Эндо в чашке Петри так, чтобы поверхность с осевшими на ней микробами была обращена вверх (на одну чашку можно помещать 3-4 мембранных фильтра).
Посевы инкубируют в термостате при температуре 37° С 18-24 ч.
Чашки с посевами (фильтрами) вынимают из термостата. Отсутствие подозрительных колоний дает право дать отрицательный ответ.
Учету подлежат все красные и розовые колонии с металлическим блеском или без него. Из выросших колоний делают мазки, окрашивают по Граму (рис. 56).
Рис. 56. Определение коли-индекса воды методом мембранных фильтров
При наличии грамотрицательных палочек ставят пробу на оксидазу. Положительная оксидазная проба дает право дать отрицательный ответ. При отрицательной оксидазной пробе производят посев на полужидкую среду с глюкозой и индикатором или на среду ГПС с бродильными трубками — для выявления ферментации углевода до кислоты и газа. При наличии кислоты и газа вычисляют коли-индекс. Например, на всех фильтрах, находящихся на среде Эндо, выросло 3 колонии, пропущено через фильтр было 300 мл воды.
Примечание. Титрационный метод более точный и может быть использован при наличии в воде примесей. Метод мембранных фильтров экономичнее и дает возможность дать ответ на 2-й день.
Для определения наличия в воде свежих фекальных кишечных палочек производят посев воды (3-х объемов) на лактозопептонную среду с борной кислотой. Инкубируют при 43° С 24 ч. Наличие кислоты и газа свидетельствует о свежем фекальном загрязнении.
По эпидемиологическим показаниям в воде определяют сальмонеллы, шигеллы, энтеровирусы.
Примечание. Общепринятым дополнительным показателем фекального загрязнения питьевой воды являются энтерококки. При проведении бактериологического исследования определяют все группы энтерококков, хотя санитарное значение имеют преимущественно фекальные стрептококки, обнаружение которых является показателем свежего фекального загрязнения.
1. Какова основная задача санитарной микробиологии?
2. Что такое санитарно-показательные микроорганизмы?
3. Что такое коли-индекс и коли-титр?
4. Какие Вы знаете методы определения БГКП?
Определите общее число микробов в исследуемой пробе воды. Среда ГПС (Эйкмана).
ГПС (Эйкмана) концентрированная. В 1 л воды растворяют 100 г пептона, 50 г хлорида натрия. Нагревают смесь до кипения, фильтруют, прибавляют 100 г глюкозы, устанавливают рН 7,4-7,6 и разливают по 10 мл в колбы вместимостью 250 мл, по 1 мл в 3 пробирки (концентрированной среды) и по 1 мл в 3 пробирки со средой нормальной концентрации (во всех емкостях среду до нужной концентрации доводят стерильной водой).
Примечание. При исследовании особенно загрязненных вод делают большие разведения (например, 10 -6 , 10 -7 и т. д.).
источник
Мясопептонный бульон и мясопептонный агар являются пригодными для большинства бактерий наиболее простыми питательными средами. Исходным материалом для приготовления этих и ряда других питательных сред служит мясная вода, представляющая собой желтоватую прозрачную жидкость с кислой реакцией. Мясная вода содержит растворимые белковые вещества (альбумины), экстрактивные вещества и некоторые соли.
Мясо говяжье или конское после удаления костей, жира и сухожилий пропускают через мясорубку, и фарш заливают холодной водопроводной водой, вливая на каждые 500 г мясного фарша 1 л воды. После перемешивания смесь медленно нагревают до кипения и умеренное кипение поддерживают в течение 1,5 ч. Небольшое количество смеси фарша с водой (до 5 л) можно кипятить на открытом огне, часто помешивая, чтобы не произошло пригорания мелких частичек мяса.
Большое количество лучше кипятить в котлах с паровой рубашкой. Готовность мясной воды определяют фильтрованием небольшого количества ее в пробирку через бумажный фильтр. Если фильтрат прозрачен, мясная вода готова. Если же фильтрат получается мутным, то варку следует производить до тех пор, пока не получится вполне прозрачный фильтрат. После окончания варки жидкость отцеживают через полотно или вдвое сложенную марлю, отжимают из вареного мяса весь сок и полученную жидкость доводят кипяченой водой до первоначального объема. Добавления большого количества воды обычно не требуется, так как в результате варки в мясную воду переходит много сока из мяса. Только при слишком длительной варке и очень бурном кипении наблюдается большое выпаривание жидкости.
Полученную мясную воду разливают в стеклянные пол-литровые банки, закатывают и стерилизуют в автоклаве 20 мин при температуре 120 °С. Из заготовленной таким образом мясной воды по мере надобности приготовляют необходимые питательные среды.
Чтобы получить концентрированный мясопептонный бульон (МПБ), к 1 л мясной воды прибавляют 10 г пептона1 и 5 г хлористого натрия. Доводят реакцию среды до pH 7,0-7,2, кипятят, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в чистые пробирки и, закрыв ватными пробками, стерилизуют в автоклаве 20 мин при температуре 120 °С.
Приготовление мясной воды производится так же, как и для концентрированного бульона, но вместо 500 г мясного фарша берется 250 г его на 1 л воды. Можно заготовленную концентрированную мясную воду развести вдвое водой. К 1 л разведенной мясной воды добавляют 5 г пептона, 2,5 г хлористого натрия, устанавливают pH 7,0-7,2, а далее поступают так же, как при приготовлении концентрированного мясопептонного бульона.
На заводах, вырабатывающих рыбные консервы, вместо мясной воды для приготовления сред можно пользоваться рыбной водой. Рыбную воду следует готовить из крупной тощей рыбы. Лучше всего для этой цели подходит судак, треска или щука. Освобожденную от костей и жира рыбу пропускают через мясорубку и заливают холодной водопроводной водой из расчета 1 л воды на 500 г рыбного фарша. Все дальнейшие операции приготовления рыбной воды аналогичны операциям приготовления мясной воды.
Рыбная вода используется для приготовления рыбопептонного бульона. На 1 л рыбной воды прибавляют 10 г пептона, 5 г поваренной соли, нейтрализуют до pH 7,0-7,2 и стерилизуют так же, как мясопептонный бульон.
Розлив бульона в пробирки (перед стерилизацией) производится через стеклянную воронку, на конец которой надета резиновая трубка с наконечником и зажимом Мора (рис. 52). Стеклянный наконечник следует несколько погружать при розливе в пробирку, чтобы края пробирки не смачивались бульоном, иначе ватная пробка присохнет к стеклу и может прорасти микроорганизмами.
При микробиологических исследованиях постоянно приходится учитывать кислотные и щелочные свойства питательных сред. Активная кислотность питательного субстрата имеет, как уже указывалось, большое значение в жизненных процессах микробов: она влияет на их рост, морфологические и физиологические свойства. Для большинства бактерий необходима среда с pH 7,2-7,4, для дрожжей и плесеней — с pH 4,5-5,5.
Питательные среды, приготовляемые для выявления биохимических свойств микробов, должны иметь оптимальную, строго определенную для данного микроба реакцию. Установить pH приготовленной среды в микробиологической лаборатории можно либо электрометрическим, либо колориметрическим методами. Электрометрически pH определяют с помощью лабораторного рН-метра (например, ЛП-58 — рис. 53) или иономера (КФВ-И1 — рис. 54).
Чтобы измерить величину pH исследуемой питательной среды с помощью иономера, в прилагаемый к нему стаканчик наливают около 40 мл этой среды, погружают в нее патрон с хлор-серебряным полуэлементом и присоединяют электродное устройство. Стрелки гальванометра отклоняются и показывают значение величины pH.
При использовании лабораторного рН-метра (ЛП-58) удобнее применять стеклянный и каломельный электроды. Шарик стеклянного электрода имеет очень тонкие стенки — 0,03-0,05 мм, поэтому при работе с ним нужно соблюдать осторожность. Перед применением стеклянный электрод следует не менее 1-2 ч выдерживать в дистиллированной воде, а при частой эксплуатации нужно постоянно хранить его в дистиллированной воде, периодически заменяя ее свежей.
Перед измерением pH стеклянным электродом производят корректировку шкалы pH по буферному раствору. Величина pH буферного раствора должна быть близка к pH исследуемого раствора. Температурный компенсатор прибора устанавливают на температуру буферного раствора и настраивают усилитель и потенциометрическую часть прибора по нормальному элементу. Затем, промыв дистиллированной водой электроды и измерительный сосуд, наполняют его исследуемой средой и производят измерение pH среды; устанавливая температурный компенсатор на температуру среды и нажимая кнопку для включения прибора на фронтальной доске рН-метра, замечают показания стрелки гальванометра на шкале pH. Подробно правила пользования, настройки и ухода за приборами описываются в инструкциях, прилагаемых к приборам. Длительность анализа 3-5 мин. Результаты достаточно точны.
Электрометрически с помощью рН-метра и иономера, очень удобно проверять pH готовых сред. А так как при изготовлении питательных субстратов для бактериологических анализов приходится не только фиксировать имеющийся уровень pH среды, но и доводить реакцию до определенного его значения, то в практике оказался более удобным колориметрический метод.
В основу колориметрического метода положено свойство индикаторов менять свою окраску с изменением концентрации ионов H- растворов. Для каждого индикатора характерен свой диапазон pH, в пределах которого меняется его цвет. Согласно ГОСТу 10444-63 для установления pH питательных сред применяют 0,04%-ный раствор бромтимолового синего. Диапазон бромтимолового синего 6,0-7,6. В кислых средах он приобретает желтую окраску, в щелочных — синюю. При pH 7,1 дает салатово-зеленую окраску.
Для определения реакции среды или консервов после развития в них микроорганизмов применяют 0,04%-ный раствор бромкрезолпурпура. Бромкрезолпурпур изменяет окраску в диапазоне pH 5,2-6,3. В кислых средах он бледно-желтый, в нейтральных — красно-фиолетовый, а при pH 6,3 дает зеленую с пурпурным оттенком окраску.
Индикаторы готовят следующим образом: 0,1 г соответствующего индикатора, взвешенного на аналитических весах, растирают в ступке (желательно агатовой) с 1/20 н. раствором едкого натра. Для растворения 0,1 г бромтимолового синего берут 3,2 мл 1/20 н. раствора NaOH; для растворения 0,1 г бромкрезолпурпура — 3,7 мл 1/20 н. раствора щелочи. К полученному щелочному раствору добавляют 250 мл дистиллированной воды и получают 0,04%-ный раствор индикатора. Приготовленный раствор индикатора следует хранить на холоду в стеклянных сосудах с притертой пробкой.
Перед стерилизацией pH среды доводят до необходимого уровня (7,0-7,2). Для этого в большую колбу (2-3 л) вливают 1,5 л приготовляемой питательной среды. Из бюретки в нее начинают приливать по каплям 10%-ный раствор двууглекислой соды или слабый раствор щелочи (например, 0,1 н. раствор едкого натра), все время проверяя реакцию среды по индикатору (в данном случае по бромтимоловому синему). Для этого на белую фарфоровую плитку (можно даже кафельную) наносят несколько капель среды, в которые добавляют каплю индикатора. Если бромтимоловый синий при этом даст желтую окраску, то приливание соды или щелочи нужно продолжать до тех пор, пока среда от капли индикатора не окрасится в салатово-зеленый цвет. Если в капле исследуемой среды при внесении индикатора появляется зелено-синий тон, то щелочной раствор при титровании прилит в избытке и в колбу со средой следует добавить свежую, еще не титрованную питательную среду и опять проверить реакцию.
Прекрасно зарекомендовал себя на практике метод определения pH (пш) с помощью компаратора и стандартной шкалы Михаэлиса. Этот метод является достаточно точным — реакция среды определяется до 0,1 единицы pH. Для определения pH среды с помощью прибора Михаэлиса необходимо предварительно проверить реакцию среды с помощью лакмусовой бумажки, чтобы знать, каким индикатором и каким рядом ампул из прибора Михаэлиса следует воспользоваться. Так как для большинства питательных сред необходима нейтральная и слабощелочная реакция (pH 7,0-7,2), то из прибора нужно брать индикатор метанитрофенол и ряд ампул с pH 6,8-8,2. При стерилизации pH субстрата обычно снижается на 0,2 единицы, поэтому для создания оптимальных условий для роста микроорганизмов перед стерилизацией приготовляемая среда должна иметь pH 7,2-7,4.
После проверки реакции среды по лакмусу и подбора индикатора берут компаратор, устанавливают в него, пробирки и стандартные ампулы с соответствующим pH (рис. 55). Во вторую пробирку первого ряда (№ 2) в компараторе вливают 2 мл исследуемой питательной среды; сюда же добавляют 4 мл дистиллированной воды и 1 мл 0,3%-ного раствора избранного индикатора (обычно, как уже сказано, метанитрофенола). В две крайние пробирки первого ряда № 1 и 3 вливается по 2 мл питательной среды и по 5 мл дистиллированной воды. В среднюю пробирку второго ряда № 5 помещают только 7 мл дистиллированной воды. В два крайних гнезда второго ряда компаратора № 4 и 6 вставляются ампулы со стандартным раствором с показателями pH, в интервале между которыми устанавливается реакция среды.
Рассматривая пробирки на свет через нижнее отверстие в компараторе на фоне белой матовой пластинки, сравнивают окраску исследуемой жидкости с окраской индикатора. Если окраска в пробирке со средой совпадает с окраской индикатора в одной из ампул, то величина pH среды будет равна значению pH данной стандартной ампулы. Если же цвет исследуемой среды (во второй пробирке) окажется более светлым, чем в стандартной ампуле, то в пробирку со средой по каплям добавляют 10%-ный раствор двууглекислой соды или 0,1 н. раствор едкого натра, используя для этой цели микробюретку. Приливание нейтрализующих растворов по каплям продолжают до тех пор, пока цвет в пробирке не сравняется с цветом в одной из ампул. По количеству миллилитров соды или щелочи, израсходованной на нейтрализацию 2 мл среды (помещенных в пробирку № 2), нетрудно подсчитать, какое количество миллилитров нейтрализующего раствора потребуется для установления уровня pH во всем объеме приготовляемой питательной среды.
В очень кислых средах величину pH определяют с помощью индикатора пара-нитрофенола. Растворы применяемых индикаторов готовят следующим образом.
1. 0,3 г мета-нитрофенола растворяют в 100 мл дистиллированной воды (интервал значений pH от 6,8 до 8,4).
2. 0,1 г пара-нитрофенола растворяют в 100 мл дистиллированной воды (интервал значений pH от 5,4 до 7,0).
Установить приблизительное значение pH среды можно также с помощью универсального индикатора. Для этого в фарфоровую чашку наливают 2-3 мл исследуемой среды и приливают 2-3 капли универсального индикатора. Размешав смесь стеклянной палочкой, сравнивают ее цвет с окраской полос на цветной бумажной шкале. pH исследуемой среды будет такой же, какой указан у равноокрашенной полоски цветной шкалы. Степень точности определения pH универсальным индикатором около 0,5.
Агар (по-малайски «желе») — сложное органическое вещество, получаемое из морских водорослей. По химическому составу он представляет собой смесь углеводов, относящихся к полисахаридам — производным галактозы — и обладающих желирующей способностью. Добавленный к жидкой среде агар придает ей такую плотность, что расплавление ее наступает лишь при температуре кипения. Плавится агар в воде примерно при 80-86 °С, затвердевает при 36-40 °С. Благодаря этому на агаровых средах можно выращивать культуры микробов при любой температуре, допускающей их жизнь.
Мясопептонный агар готовят из концентрированного мясопептонного бульона. В большую эрленмейеровскую колбу из тугоплавкового стекла емкостью до 2 л, снабженную ватной пробкой, вливают концентрированный мясопептонный бульон, добавляют от 2 до 4% (в зависимости от сорта) мелко нарезанного агара и, не закрывая пробкой, ставят на слабый огонь для расплавления.
Мясопептонный бульон нужно брать с реакцией среды 7,4, потому что при стерилизации pH снизится на 0,2. Реакцию мясопептонного агара можно установить после того, как произойдет полное расплавление. Если агар хорошего качества и не дает осадка, то после установления pH его кипятят 12-15 мин, фильтруют через вату и, разлив в колбы или пробирки (в зависимости от надобности), стерилизуют в автоклаве 20 мин при 120 °С.
Если агар недостаточно очищен, он может дать осадок. В этом случае до стерилизации мясопептонный агар следует осветлить. Для этого к расплавленному и охлажденному до 50 °С мясопептонному агару прибавляют яичный белок, смешанный с 30 мл воды и взбитый до состояния пены. На 1 л среды берут белок одного куриного яйца. Агар тщательно взбалтывают с введенным белком и ставят в автоклав на 10 мин при 120°С. Во время кипения белок свертывается и увлекает с собой все взвешенные частицы. После автоклавирования агар фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Для этого берут стеклянную воронку большого диаметра, натягивают на нее марлю, а сверху кладут тонкий слой ваты. Фильтровать кипящий агар нужно быстро и фильтрат до застывания разлить в пробирки по 5-10 мл. Стерилизацию среды проводят в автоклаве, как указано выше.
После стерилизации пробирки со средой, содержащие по 5 мл агара, ставят в наклонное положение, так чтобы агар не касался пробки. После застывания получают «косой» (или скошенный) агар. Пробирки с 10 мл агара помещают в штатив и дают застыть, получая среду, разлитую на «высокий столбик». Косой агар хранить более 4-7 дней не рекомендуется, так как он высыхает.
Мясопептонный агар — основная питательная среда, используемая при бактериологических анализах в микробиологических лабораториях. Его используют как в виде «простого агара», так: и после добавления углеводов, приготовляя сложные дифференциально-диагностические среды.
источник
Название (русское/английское)
Расход среды
Селективные добавки
Стандартный агар для подсчета колоний Американской ассоциации здравоохранения/Standard Plate Count Agar APHA
Стандартная среда, соответствующая составу APHA для использования в исследовании молока,воды, пищи и молочных продуктов
Агар для подсчета колоний из воды (ISO)/Water Plate Count Agar (ISO)
Среда для подсчета способных к восстановлению организмов из воды
Селективная хромогенная среда для E.coli/колиформ/
Brilliance E. coli/coliform Selective Agar
Среда для выделения E. coli и колиформов из пищи, воды и образцов окружающей среды
Лаурил-триптозный бульон/Lauryl Tryptose Broth (Lauryl Sulphate Broth)
Среда для исследования воды и сточных вод, рекомендованная APHA
Агар для легионелл (основа)/LEGIONELLA CYE AGAR BASE
Cелективная среда MWY для легионелл (селективная среда для выделения Legionella Pneumophila из питьевой воды)
Селективная добавка MWY для легионелл, 10 флаконов: SR0118E- флакон на 100 мл среды, SR0118B- флакон на 500 мл среды. Селективная добавка BCYE для легионелл, 10 флаконов: SR0110A- флакон на 100 мл среды SR0110C- флакон на 500 мл среды
Агар M-CP для Clostridium perfringens (основа)/Membrane Clostridium perfringens Medium (m-CP)
Хромогенная среда для быстрой изоляции и предварительной идентификации Clostridium perfringens из водных образцов
SR0188E Селективная добавка к агару M-CP для Clostridium perfringens, 10 флаконов (1 флакон на 500 мл среды)
Лаурил-триптозный бульон с МУГ (модифицированный)/Lauryl Tryptose Broth (Modified) with MUG
Среда для предварительного подсчета E. coli и других колиформ в воде, молочных продуктах и пищевых образцах; с добавлением триптофана
Бульон МакКонки/MacConkey Broth
Дифференциальная среда,содержащая нейтральный красный для выявления колиформных организмов в воде и молоке красный для выявления колиформных организмов в воде и молоке
Минеральная модифицированная среда + глютамат натрия/Minerals Modified Glutamate Medium
Среда для подсчета организмов группы колиформ в воде (поставляется в двойной упаковке)
Бульон азида декстрозный (ROTHE)/Azide Dextrose Broth (Rothe Broth)
Среда для выявления энтерококков в воде, сточных водах и пище
Селективная хромогенная среда для E.coli/колиформ/Brilliance E. coli/coliform Selective Agar
Среда для выделения E.coli и колиформ из пищевых, водных и образцов окружающей среды
Азидный кровяной агар (основа)/Azide Blood Agar Base
Селективная среда для выявления и изоляции стрептококков и стафилококков из сточных вод, фекальных и других образцов
Среда для подсчета гетеротрофных бактерий их водных образцов
EC-бульон с МУГ/EC Broth with MUG
Среда для изоляции и предварительной идентификации E.coli
Лаурил-триптозный бульон с МУГ/Lauril Triptose Broth with MUG
Среда для предварительной идентификации E.coli
Цетримидный агар для Pseudomonas/ Pseudomonas Cetrimide Agar Base
Среда для селективной изоляции и идентификации Pseudomonas aeruginosa из ряда образцов. Состав рекомендован USP, EP и AOAC методами
Агар Эндо (основа) для подсчета колиформ методом мембранной фильтрации/Membrane Endo Agar LES an APHA
Среда для подтверждения колиформ методом мембранной фильтрации
BR0050A Основной фуксин, 10 г
Лаурил-сульфатный бульон/ Membrane Lauryl Sulphate Broth
Среда для подсчета колиформ методом мембранной фильтрации
Бульон МакКонки с бромкрезолпурпуром (формула США)/ MacConkey Broth Purple (US Formulation)
Дифференциальная среда, содержащая бромкрезоловый пурпурный для выявления колиформ
источник
Известно очень много питательных сред для культивирования микроорганизмов (более двух тысяч наименований было классифицировано Левином и Шенлейном еще в 1930 г.), но число ингредиентов, являющихся их неотъемлемыми компонентами, относительно невелико. Однако качественный диапазон этих сред весьма широк — от растворов неорганических солей, на которых могут расти автотрофы, до сложных питательных сред, приготавливаемых из мясных гидролизатов, обогащенных кровью или сывороткой; ими обычно пользуются для выделения патогенных микроорганизмов типа стрептококков, отличающихся высокой требовательностью к составу питательной среды. Различают два основных типа питательных сред: так называемые синтетические среды, главные составные части которых точно известны (например, глюкозо-солевая питательная среда), и эмпирически подобранные питательные среды природного происхождения, состав которых точно неизвестен (к ним относятся пептоны, приготавливаемые из частично гидролизованного белка).
Выбор питательной среды зависит в значительной степени от цели эксперимента. Герберт настойчиво высказывался за повсеместное использование синтетических питательных сред. Однако следует признать, что они обладают рядом практических неудобств. Микроорганизмы, выращенные на таких питательных средах, обычно фенотипически отличаются от выращенных на питательных средах естественного происхождения типа бульона (например, по составу и по скорости деления). Размножение микроорганизмов на таких средах обычно легче подавляется избыточной аэрацией или токсическими катионами; они также более чувствительны к нарушениям баланса между некоторыми составными частями питательной среды, особенно аминокислотами. Многие бактерии нуждаются в большом числе факторов роста, и для некоторых из них до сих пор не найдены искусственные среды, на которых они могли бы размножаться. Возможно, что все эти неудобства со временем будут преодолены, но пока среды неизвестного состава типа бульонов, приготовленных из перевара, используются весьма широко, хотя они и вносят в эксперимент неконтролируемые факторы.
В литературе опубликованы результаты количественных анализов многих питательных сред природного происхождения, что является определенным шагом на пути к их стандартизации. Однако данными этих анализов следует пользоваться с осторожностью, поскольку результаты определений, проведенных независимо друг от друга, демонстрируют существенные различия состава различных партий одной и той же питательной среды. Более того, при проведении анализов обычно игнорируется наличие в питательных средах многих существенно важных составных частей, хотя ясно, что компоненты, требуемые в следовых количествах, например витамины и катионы, могут присутствовать в исключительно малой концентрации. При этом может оказаться, что размножение бактерий идет нормально, тогда как процессы типа споруляции или адсорбции фага ингибируются.
В состав сред, применяемых для выращивания бактерий, входят необходимые для построения белков цитоплазмы элементы: азот, углерод, водород, кислород, неорганические соединения, содержащие фосфор, калий, серу, натрий, магний, железо, микроэлементы: кобальт, йод, марганец, бор, цинк, молибден, медь и др. Все перечисленные элементы должны находиться в питательной среде в удобоусвояемом для данного микроорганизма соединении, причем требования различных микробов в этом отношении неодинаковы. Потребность в кислороде и водороде бактерии удовлетворяют главным образом за счет поступающей в клетку воды.
По характеру усвоения азота патогенные микроорганизмы делятся следующим образом: одни из них извлекают азот из простых аммонийных соединений, другие нуждаются в аминокислотах, третьи расщепляют высокомолекулярные вещества — пептоны, представляющие собой продукты неполного ферментативного переваривания белков. Строго паразитические виды бактерий размножаются только в присутствии нативного, т. е. неизмененного, белка.
Источником углерода для патогенных бактерий являются, главным образом, различные углеводы: сахар, многоатомные спирты, органические кислоты и их соли.
Потребность бактерий в неорганических элементах удовлетворяется прибавляемыми к питательной среде солями: NaCI, KH2PO4, K2HPO4 и т. д. Микроэлементы, выполняющие роль катализаторов химических процессов, необходимы в ничтожно малых количествах и поступают в питательную среду с пептоном, неорганическими солями и водой.
Наряду с перечисленными органическими и неорганическими элементами бактерии нуждаются в ростовых факторах, которые по своей роли соответствуют витаминам для животных. Источником факторов роста являются прибавляемые к питательной среде продукты растительного и животного происхождения, содержащие в своем составе никотиновую, пантотеновую, парабензойную кислоты, витамины А, В, С и др.
Питательные вещества могут усваиваться микробами только при определенной реакции питательной среды, так как проницаемость оболочек микробных клеток изменяется в зависимости от рН среды.
Потребность в питательных веществах и физических условиях у различных видов микробов неодинакова и этим исключается возможность создания универсальной питательной среды.
По консистенции различают плотные и жидкие питательные среды. Плотные питательные среды готовят из жидких посредством прибавления к ним клеевых веществ — агара или желатина. Агар-агар (по малайски – желе) — продукт растительного происхождения, добываемый из морских водорослей. В воде агар-агар растворяется при температуре 80—86°С, застудневает при 36—40°С. Применение агаровых сред благодаря их способности сохранять плотность при температуре 37°С дало возможность выращивать патогенные микробы при оптимальной для большинства из них температуре на плотных средах. Желатин — вещество белковой природы животного происхождения. В теплой воде при температуре 32—34°С он набухает и растворяется, а при более низкой температуре превращается в студень. Однако при рН ниже 6,3 и выше 7,0 плотность желатина уменьшается, и он плохо застывает.
Исходные продукты для приготовления питательных сред. Для приготовления питательных сред используют:
Продукты животного происхождения (мясо, рыба, казеин, молоко, яйца, кровь и т. д.).
Продукты растительного происхождения (картофель и др.).
Органические и неорганические соединения определенного химического состава.
Питательные среды, приготовленные из продуктов растительного и животного происхождения, несмотря на то, что они не могут быть стандартны и не имеют определенного химического состава, находят широкое применение в практике микробиологии. Синтетические питательные среды, составленные из химических соединений, используют преимущественно для изучения обмена веществ микробной клетки.
Требования, предъявляемые к питательным средам. Питательные среды должны:
Содержать необходимые для питания микроба питательные вещества.
Иметь реакцию рН, оптимальную для выращиваемого вида микроба.
Иметь достаточную влажность, так как микробы питаются по законам диффузии и осмоса.
Быть стерильными, обеспечивая тем самым возможность выращивания чистых культур микробов.
Питательные среды подразделяются на среды общего назначения и специальные.
К первой группе относятся мясо-пептонные: агар, бульон, питательный желатин. Среды общего назначения используют для выращивания многих патогенных микробов и применяют в качестве основы для приготовления специальных сред, добавляя к ним кровь, сахар, молоко, сыворотку и другие ингредиенты, необходимые для размножения того или иного вида микроба.
К специальным питательным средам относятся элективные (избирательные) и дифференциально-днагностическне.
Элективные (избирательные) среды. Принцип создания элективных питательных сред основан на удовлетворении основных биохимических и энергетических потребностей того вида микроба, для культивирования которого они предназначены. Определенный состав и концентрация питательных микроэлементов, ростовых факторов при строгом значении рН обеспечивают оптимальные условия для выращивания одного или нескольких видов микроорганизмов. При посеве на них материала, содержащего смесь различных микроорганизмов, раньше всего будет проявляться рост того вида, для которого данная среда будет элективной.
Дифференциально-диагностические питательные среды. Дифференциально-диагностические питательные среды используют для определения видовой принадлежности исследуемого микроба, основываясь на особенностях его обмена веществ. По своему назначению дифференциально-диагностические питательные среды подразделяются следующим образом:
Среды для выявления протеолитической и гемолитической способности микробов, содержащие в своем составе белковые вещества: кровь, молоко, желатин, свернутую кровяную сыворотку и т. д.
Среды с индифферентными химическими веществами, которые служат источником питания для одних видов микробов и не усваиваются другими видами.
Среды с углеводами и многоатомными спиртами для обнаружения соответствующих ферментов.
Среды для определения редуцирующей способности микробов.
В состав дифференциально-диагностических сред, предназначенных для выявления сахаролитических и окислительно-восстановительных ферментов, вводят индикаторы: нейтральный красный, метиленовый синий, лакмусовую настойку, кислый фуксин, бромтимоловый синий, водный голубой краситель и розоловую кислоту. Изменяя свою окраску при различных значениях рН, индикатор указывает на наличие или отсутствие расщепления, окисления или восстановления введенного в среду ингредиента. Однако индикатор не является обязательной составной частью сред, предназначенных для выявления ферментов. Так, наличие желатиназы и других протеолитических ферментов в культуре определяют по разжижению желатина, свернутого яичного или сывороточного белка.
Сухие питательные среды. Приготовление питательных сред — один из наиболее ответственных и трудных участков работы бактериологической лаборатории. В связи с этим биопромышленность выпускает стандартные, консервированные, сухие питательные среды, различного назначения, для культивирования микроорганизмов.
Приготовление обычных питательных сред. Основой для приготовления этих сред служит мясная вода, содержащая экстрактивные вещества.
Посуда. Питательные среды готовят в кастрюлях, эмалированных или из нержавеющей стали. Готовые питательные среды разливают во флаконы, пробирки, чашки.
Новую стеклянную посуду кипятят в 1—2% растворе соляной кислоты для нейтрализации растворимой щелочи, затем тщательно промывают в проточной воде и сушат. Посуду, бывшую в употреблении, стерилизуют, затем моют, прополаскивают и сушат. Сухие флаконы, колбы, пробирки закрывают ватно-марлевыми пробками.
500 г свежей говядины или телятины освобождают от костей, жира и сухожилий, пропускают через мясорубку, фарш заливают 1 литром водопроводной воды, хорошо размешивают. Оставляют на сутки в прохладном месте или помещают на 2 часа в термостат.
Мясную пасту отжимают через марлю, кипятят в течение 5 минут. Для свертывания белков дают остыть. Фильтруют через ватный фильтр, доливают водой до первоначального объема. Мясную воду разливают во флаконы, стерилизуют 20-30 минут при 120°С и сохраняют в темном месте. Она имеет вид прозрачной желтоватой жидкости слабокислой реакции (рН 6,2—6,4), без белков. В мясной воде содержится небольшое количество аминокислот, солей, углеводов, факторов роста и экстрактивных веществ. Для приготовления обычных питательных сред к мясной воде прибавляют сухой пептон, который является первичным продуктом гидролиза белка и состоит из смеси полипептидов и аминокислот, полученных путем пептического или триптического переваривания.
На мясокомбинатах для производства сухого пептона используют фибрин, кровь и другие отходы. Сушат пептон в распылительной вакуум-сушилке.
Жидкий пептон можно приготовить в лабораторных условиях путем пептического переваривания белков.
Пептон Мартена. Свиные желудки (не промытые водой) с обильным слизистым слоем очищают от пленок, жира и пропускают через мясорубку. К фаршу прибавляют воду и соляную кислоту в следующем соотношении: фарш из свиных желудков 250 г, вода водопроводная, нагретая до 50°С, 1000 мл, соляная кислота (удельный вес 1,18) 10 мл. Смесь выдерживают в термостате при 50°С. Через 24 часа пептон прогревают в автоклаве при 100°С и фильтруют, фильтрат подщелачивают 10% раствором NaOH до щелочной реакции по лакмусу. После этого фильтрат разливают в колбы и стерилизуют при 115°С 30 минут.
Для приготовления бульона пептон Мартена смешивают с равным объемом мясной воды, устанавливают необходимую реакцию, кипятят 30 минут, фильтруют и стерилизуют при 115°С 30 минут.
Мясо можно переваривать с помощью трипсина — перевар Хоттингера, при этом более полно используют белки мяса, которые расщепляются до пептонов, полипептидов и свободных аминокислот. При триптическом переваривании мяса получают в 10 раз больше бульона, чем при обычном методе.
Мясной перевар Хоттингера. Мясо, освобожденное от жира и сухожилий, нарезают небольшими кусочками, помещают в кастрюлю с кипящей водопроводной водой (в полуторном объеме) и кипятят 15—20 минут, затем мясо извлекают из жидкости и пропускают через мясорубку. Установив рН охлажденной до 40—45°С жидкости, равный 8, заливают ею фарш. К полученной смеси добавляют сухой панкреатин в количестве 0,5—1% или поджелудочную железу из расчета 100 г железы на 1 л жидкости. Затем смесь снова подщелачивают до рН 8 и разливают ее в бутыль. Туда же добавляют 2—3% хлороформа и, закрыв бутыль резиновой пробкой, несколько раз встряхивают содержимое. Бутыль ставят на 7—14 суток при температуре 37°С.
В результате переваривания мясной фарш превращается в гомогенный сероватый осадок, над которым находится совершенно прозрачная жидкость соломенно-желтого цвета. Перевар Хоттингера хорошего качества дает положительную реакцию на триптофан и содержит 560—860 мг% аминного азота. Для приготовления бульона к 1 части перевара прибавляют 6—7 частей воды.
В 1 л мясной воды растворяют при подогревании и помешивании 10 г пептона (1%) и 5 г (0,5%) хлористого натрия. Рекомендуется брать 3 части хлористого натрия и 2 части двузамещенного фосфорнокислого натрия. Смесь вводится в количестве 0,5%. Фосфорнокислый натрий стабилизирует реакцию среды и служит дополнительным источником фосфора. Устанавливают рН среды до 7,6—7,8, кипятят 30—45 минут до выпадения осадка.
Охлаждают, фильтруют через бумажный фильтр, доливают водой до первоначального объема, проверяют рН.
Разливают по пробиркам, флаконам и стерилизуют 15— 20 минут в автоклаве при 120°С.
Концентрированный мясо-пептонный бульон готовят на особой мясной воде (1 кг мяса заливают 1 л воды). Такой бульон служит для выращивания анаэробных и других микробов.
К мясо-пептонному бульону для придания плотности добавляют 2—2,5% мелко нарезанного и промытого агар-агара.
Агар-агар получают путем специальной обработки морских водорослей. Он является веществом полисахаридной природы, содержит незначительное количество азота и не представляет собой питательный субстрат. Студень, образуемый агар-агаром, расплавляется при 70— 100°C и застывает при 40—50°.
Кипятят, помешивая, до полного расплавления агара. В некоторых случаях для просветления среды прибавляют белок одного куриного яйца, смешанного с двойным количеством холодной воды. Среду помещают в автоклав на 45 минут при 115°С. Свернувшиеся хлопья белка адсорбируют взвешенные частицы и осаждаются на дно.
Проверяют и исправляют реакцию среды. Отстаивают и фильтруют через ватно-марлевый фильтр в горячем автоклаве или в специальной металлической воронке с двойными стенками, между которыми находится горячая вода.
Разливают среду через стеклянную воронку с зажимом в пробирки и флаконы и стерилизуют в автоклаве при 120°С в течение 15—20 минут.
Из расплавленного стерильного мясо-пептонного агара приготовляют скошенный и прямой агар (агар столбиком). В первом случае пробирки укладывают горизонтально до полного застывания, во втором — пробирки помещают в штатив вертикально.
В настоящее время бактериологические лаборатории широко используют сухие питательные среды в виде порошков, хранящихся в герметически закрытых банках и пакетах.
Кроме обычных питательных сред (МПБ и МПА), имеются специальные и дифференциально-диагностические среды. Готовят среды по прописи, указанной на этикетке, навеску порошка растворяют в определенном объеме дистиллированной воды, среду разливают в пробирки и стерилизуют при соответствующей температуре. Постоянство состава, стандартность среды, простота и удобство в работе, легкость транспортировки и хранения являются большим преимуществом сухих питательных сред.
Для определения рН плотных питательных сред их расплавляют. Определяют pH с использованием pH-метров или (менее точно) с помощью индикаторной бумаги.
После установления соответствующего рН среду кипятят, фильтруют, осветляют, разливают во флаконы, пробирки и стерилизуют. Следует учитывать, что после стерилизации среда становится более кислой.
Стерилизация питательных сред. Стерилизацию питательных сред осуществляют различными способами в зависимости от тех ингредиентов, которые входят в их состав.
Синтетические среды и все агаровые среды, не содержащие в своем составе нативного белка и углеводов, стерилизуют 15—20 мин в автоклаве при температуре 115—120°С.
Среды с углеводами и молоком (в состав которого входит лактоза), питательный желатин стерилизуют текучим паром при температуре 100°С дробно или в автоклаве при 112°С.
Среды, в состав которых входят белковые вещества (сыворотка крови, асцитическая жидкость), обеспложиваются тиндализацией или фильтрованием.
Для стерилизации питательных сред, содержащих в своем составе нативные белки, пользуются фильтрацией через мембранные фильтры Зейтца.
Подготовленные к употреблению питательные среды проверяют на стерильность. Для этого их ставят в термостат при температуре 37°С. Среды, простерилизованные в автоклаве, выдерживают в термостате 1 сутки, простерилизованные текучим паром — 3 суток.
источник
Оценка роста бактерий
Количественную оценку роста обычно проводят в жидких средах, где растущие бактерии образуют гомогенную суспензию. Увеличение количества клеток устанавливают, определяя концентрацию бактерий в 1 мл, либо определяют увеличение клеточной массы в весовых единицах, отнесённых к единице объёма.
Подсчёт микроорганизмов можно проводить непосредственно под микроскопом с использованием различных счётных камер (например, Петрова-Хаузера или Горяева).
Кроме состава питательных сред, на которых развиваются бактерии, большое значение имеют условия культивирования и, прежде всего, температура, аэрация и концентрация водородных ионов в среде.
В количественном отношении придерживаются простого правила: соотношение важнейших элементов, вводимых в воду, должно быть примерно таким же, как в бактериальной клетке (например, среднее соотношение углерод:азот:фосфор:сера:калий:кальций:магний:железо = 5:1:0,3:0,1:0,1:0,05:0,05:0,02. В граммах эти величины дают примерное содержание элементов на 1 л среды).
Питательные среды являются основой бактериологических исследований. Они служат для выделения из исследуемого материала чистых культур микробов, для изучения их свойств. На питательных средах создаются оптимальные условия для размножения микроорганизмов. В состав сред должны входить вещества, необходимые для построения всех компонентов цитоплазмы, т.е. все источники роста живого организма. Сюда, в первую очередь, относятся источники азота, углерода, водорода и кислорода.
Источник водорода и кислорода в питательных средах — вода.
Источником азотаслужат органические соединения, которые получают из мяса, рыбы, плаценты, молока, яиц, крови. В результате гидролиза панкреатином или трипсином из этих продуктов получаются т.н. гидролизаты, содержащие большое количество аминокислот и пептонов, которые хорошо усваиваются большинством микроорганизмов. Нативный белок усваивают только некоторые микроорганизмы, имеющие экзопротеазы. Гидролизаты являются основой для приготовления сред для многих микроорганизмов.
Источником углерода для патогенных микробов являются, главным образом, различные углеводы: моно- и дисахара, многоатомные спирты, органические кислоты и их соли.
Кроме органогенов, бактериям необходимы неорганические соединения, содержащие фосфор, калий, серу, натрий, магний, железо, а также микроэлементы: кобальт, йод, марганец, бор, цинк, молибден, медь и др.
Потребность микроорганизмов в неорганических соединениях удовлетворяется прибавлением к питательной среде солей КН2РO4; К2НРO4 и др. Микроэлементы, выполняющие роль катализаторов химических процессов, необходимы в ничтожно малых количествах и поступают в питательную среду с пептоном, неорганическими солями и водой. Наряду с перечисленными органическими элементами, многие микроорганизмы нуждаются в факторах роста, т.е. в веществах, которые они сами не могут синтезировать. Факторы роста необходимо добавлять в питательные среды в готовом виде. К факторам роста относятся различные витамины, источником которых в питательных средах являются прибавленные к питательной среде продукты растительного и животного происхождения, содержащие в своем составе никотиновую, пантотеновую, парабензойную кислоты, витамины А, В, С и др.
Питательные вещества микробами могут усваиваться только при определенной реакции среды, т.к. проницаемость оболочек микробных клеток изменяется в зависимости от рН среды.
Требования, предъявляемые к питательным средам.
1. Питательные среды должны содержать необходимые для питания микробов питательные вещества.
2. Иметь реакцию рН, оптимальную для выращиваемого вида микроба. —
3. Питательные среды должны иметь достаточную влажность и вязкость, т.к. микробы питаются по законам диффузии и осмоса.
4. Обладать изотоничностью и иметь определенный окислительно-восстановительный потенциал (гН2).
5. Питательные среды должны быть стерильными, обеспечивая тем самым возможность выращивания чистых культур.
Потребность в питательных веществах и физических условиях у различных видов микробов неодинакова, и этим исключается возможность создания универсальной питательной среды.
По консистенции различают плотные и жидкие питательные среды. Плотные готовят на основе жидких посредством прибавления к ним клеевых веществ: агар-агара или желатина. Агар-агар (по-малайски — желе) — продукт растительного происхождения, добывается из морских водорослей. В воде агар-агар растворяется при температуре 80-86°С, затвердевает при 36-40 , и поэтому используется для уплотнения питательных сред для выращивания разных групп микроорганизмов при оптимальной для них температуре.
Классификация питательных сред производится по их составу и назначению
1.По составу питательные среды делятся на простые и сложные
Также по составу выделяют белковые, безбелковые и минеральные среды.2. По происхождению среды разделяют на искусственные и естественные (природные).
Естественные питательные среды могут содержать компоненты животного (например, кровь, сыворотка, жёлчь) или растительного (например, кусочки овощей и фруктов) происхождения.
3.По назначению выделяют консервирующие среды (для первичного посева и транспортировки), среды обогащения (для накопления определённой группы бактерий), среды для культивирования среды для идентификации (дифференциальные и элективно-дифференциальные).
Консервирующие питательные среды предупреждают отмирание патогенов и подавляют рост сапрофитов. Наибольшее применение нашли глицериновая смесь, гипертонический раствор, глицериновый консервант с LiCl2, раствор цитрата натрия и дезоксихолата натрия.
Среды обогащения для бактерий
Среды обогащения (например, среда Китта-Тароцци, селенитовый бульон, тиогликолевая среда) применяют для накопления определённой группы бактерий за счёт создания условий, оптимальных для одних видов и неблагоприятных для других. Наиболее часто в качестве подобных агентов используют различные красители и химические вещества — соли жёлчных кислот, тетратионат Na+, теллурит К , антибиотики, фуксин, генциановый фиолетовый, бриллиантовый зелёный и др.
Также по назначению различают среды элективные, специальные и дифференциально-диагностические.
Среды элективные (селективные, избирательные, накопления, обогащения). Принцип создания элективных питательных сред основан на удовлетворении основных биохимических и энергетических потребностей того вида микроба, для культивирования которого они предназначены, или на добавление ингибиторов, подавляющих рост сопутствующей микрофлоры. Определенный состав и концентрация питательных веществ, микроэлементов, ростовых факторов при строго определённом значении pH или добавлении ингибиторов обеспечивают оптимальные условия для выращивания одного или нескольких видов микроорганизмов. При посеве на них материала, содержащего смесь различных микробов, раньше всего будет проявляться рост того вида, для которого среда будет элективной. Примером элективных сред являются желчный бульон, селенитовый бульон, среда Плоскирева – для выращивания микробов семейства кишечных, щелочная пептонная вода – для холерного вибриона.
Желчный бульон. К МПБ добавляют 10-20% бычьей желчи. Желчь подавляет рост коков и воздушной флоры, но благоприятна для размножения сальмонелл.
Селенитовый бульон. Состоит из фосфатного бульона с добавлением натриевой соли селенита, которая является ингибитором роста кокковой флоры, кишечной палочки, но не задерживает роста сальмонелл.
Среда Плоскирева. Плотная среда, содержащая ингибиторы кишечной палочки, коков, но благоприятная для роста шигелл и сальмонелл, размножение которых не тормозится бриллиантовым зелёным и желчными солями.
Пептонная вода. Содержит 1% пептона и 0,5% хлористого натрия. Среда является элективной для холерных вибрионов, т.к. они лучше других бактерий размножаются на “голодных средах”, особенно при щелочной реакции, потому что сами выделяют кислые продукты жизнедеятельности.
Специальные среды. Необходимы для культивирования бактерий, не растущих на простых питательных средах. Для некоторых организмов к простым питательным средам необходимо добавлять углеводы, кровь и др. дополнительные питательные вещества. Примерами простых питательных сред являются сахарный бульон и сахарный агар для стрептококка (готовится соответственно из МПБ и МПА, к которым добавляется 0,5-2% глюкозы).
Для пневмококков и менингококков специальной средой являются сывороточный бульон и сывороточный агар (для приготовления сывороточного бульона смешивают 1 часть МПБ с 2 частями свежей сыворотки, для получения, сывороточного агара к расплавленному МПА добавляется 10-25% стерильной лошадиной или бычьей сыворотки).
Дифференциально-диагностические среды используют для определения видовой принадлежности исследуемого микроба, основываясь на особенностях его обмена веществ. По своему назначению дифференциально-диагностические среды разделяют следующим образом:
1. Среды для выявления протеолитической способности микробов, содержащие в своем составе молоко, желатин, кровь и т.д.
2. Среды с углеводами и многоатомными спиртами для
обнаружения различных сахаролитических ферментов.
В состав дифференциально-диагностических сред, предназначенных для выявления сахаролитических свойств и окислительно-восстановительных ферментов, вводят индикаторы: нейтральную красную, кислый фуксин, бромтимоловый синий, водный голубой с розоловой кислотой (ВР). Изменяя свою окраску при различных значениях рН, индикатор указывает на наличие фермента и расщепление введённого в среду ингредиента.
Примеры дифференциально-диагностических сред:
Среда Эндо. Состоит из МПА с добавлением 1% лактозы и обесцвеченного сульфитом натрия основного фуксина (индикатор). Среда Эндо имеет слаборозовый цвет. Используется в диагностике кишечных инфекций для дифференциации бактерий, разлагающих лактозу с образованием кислых продуктов, от бактерий, не обладающих этой способностью. Колонии лактозопозитивных микробов (кишечная палочка) имеют красный цвет вследствие восстановления фуксина. Колонии лактозонегативных микроорганизмов — сальмонелл, шигелл и др. -бесцветны.
К дифференциально-диагностическим средам относятся короткий и развёрнутый пёстрый ряд. Он состоит из сред с углеводами (среды Гисса), МПБ, молока, мясопептонной желатины.
Среды Гисса готовятся на основе пептонной воды, к которой прибавляются химически чистые моно-, ди- или полисахариды (глюкоза, лактоза, крахмал и др.).
Для обнаружения сдвигов рН в результате образования кислот и разложения углевода в среды прибавляют индикатор. При более глубоком расщеплении углеводов образуются газообразные продукты (СО2, СН4 и др.), которые улавливаются при помощи поплавков — маленьких пробирочек, опущенных в среду кверху дном. Среды с углеводами могут готовиться и плотными – с добавлением 0,5-1% агар-агара. Тогда газообразование улавливается по образованию пузырьков (разрывов) в столбике среды.
На МПБ, входящем в пёстрый ряд, обнаруживают продукты, образующиеся при расщеплении аминокислот и пептонов (индол, сероводород). Сероводород обнаруживается путем помещения в МПБ после засева культуры полоски фильтровальной бумаги, пропитанной раствором уксуснокислого свинца. При расщеплении аминокислот, содержащих серу, выделяется сероводород, бумажка чернеет за счёт образования сернистого свинца. Для определения индола можно использовать сложный индикатор. Индол образуется при расщеплении триптофана, и его можно обнаружить при добавлении к культуре, выращенной на МПБ, этого индикатора. При наличии индола МПБ окрашивается в зеленый или синий цвет.
В практических бактериологических лабораториях широко применяют микро- и экспресс-методы для ориентировочного изучения биохимических свойств микроорганизмов. Для этой цели существует множество тест-систем. Наиболее часто используют систему индикаторных бумаг (СИБ). СИБы представляют из себя диски фильтровальной бумаги, пропитанные растворами сахаров или других субстратов в сочетании с индикаторами. Такие диски опускают в пробирку с выросшей в жидкой питательной среде культурой. По изменению цвета диска с субстратом судят о работе фермента. Микро-тест системы для изучения идентификации энтеробактерий представлены одноразовыми пластиковыми контейнерами со средами, содержащими различные субстраты, с добавлением индикаторов. Посев чистой культуры микроорганизмов в такие тест-системы позволяет быстро выявить способность бактерий утилизировать цитраты, глюкозу, сахарозу, выделять аммиак, индол, разлагать мочевину, лизин, фенилаланин и т.д.
Дата добавления: 2014-01-11 ; Просмотров: 2053 ; Нарушение авторских прав? ;
Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет
источник