Методы для анализа аминокислотного состава белков

Разделение и анализ аминокислот и их производных используются при определении аминокислотного состава белков, секвенировании пептидов, а также с целью диагностики нарушений аминокислотного и белкового обмена. В этом разделе рассматриваются два наиболее важных в практическом отношении метода аминокислотного анализа.

А. Ионообменная хроматография свободных аминокислот

Ионообменная хроматография основана на электростатическом взаимодействии между ионами противоположного заряда. Главное условие при этом, чтобы ионы одного заряда были ковалентно фиксированы на инертном носителе. Такой ионообменник будет связывать ионы противоположного заряда. При промывании ионообменника раствором с более высокой ионной силой или иным значением рН сорбированные ионы можно селективно перевести в раствор (э люировать) .

При разделении аминокислот методом ионообменной хроматографии в качестве неподвижной фазы используются гранулы синтетического полимера, несущие сульфогруппы (-SО 3 — ). Эти группы ионизированы во всем диапазоне рН и несут отрицательный заряд. Для подготовки к работе ионообменник помещают в колонку и промывают Na + -содержащим буферным раствором с рН 2. При этом сульфогруппа (красный цвет) связывает ионы натрия (синий цвет). Если теперь нанести на колонку раствор аминокислот ( 1а ), то положительно заряженные аминокислоты (зеленый цвет) вытеснят ионы натрия и будут сорбированы на ионите. Поскольку аминокислоты не несут заряда в изоэлектрической точке, их злюируют с колонки буфером с более высоким значением рН ( 1б ). В качестве примера приведен эксперимент ( 3 ) по разделению аспарагиновой кислоты, треонина и гистидина. Графики титрования ( 2 ) наглядно объясняют, почему три аминокислоты элюирутся в указанной последовательности.

Строго говоря, аминокислоты элюируются при величинах рН, значительно ниже изоэлектрических точек, поскольку за связывание с ионообменником конкурируют Na + -ионы буферного раствора.

Б. Распределительная хроматография ФТЦ-производных аминокислот

Распределительная хроматография основана на различной полярности разделяемых веществ. Если на инертный носитель нанести мапополярную неподвижную фазу , а затем смесь неполярных веществ, то они будут удерживаться носителем за счет гидрофобного взаимодействия (см. с. 34). Если такую колонку промыть смесью полярных растворителей ( подвижной фазой ), то компоненты смеси будут перемещаться с различной скоростью в зависимости от их полярности. Вначале будут элюироваться гидрофильные вещества, слабо взаимодействующие с неподвижной фазой, а затем гидрофобные вещества.

В первых вариантах распределительной хроматографии гидрофильной была неподвижная фаза, а гидрофобной — подвижная. Приведенная здесь современная модификация метода носит название обращенно-фазовая хроматография (ОФХ).

Сначала при взаимодействии с фенилизотиоцианатом получают производные аминокислот ( 1 ). ФТЦ-аминокислоты (РТС-аминокислоты) малополярны и благодаря поглощению в УФ-обпасти спектра их можно обнаруживать в элюате фотометрически. В качестве неподвижной фазы используются мелкие частицы силикагеля (диаметром 5 мкм) с привитыми углеводородными цепями (лигандами). Использование мелкодисперсных носителей позволяет повысить качество разделения, однако при этом растет механическое сопротивление колонки. Поэтому высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) проводят в капиллярах или колонках, выполненных из нержавеющей стали, а элюент подают с помощью насосов высокого давления ( 2 ). В качестве элюентов используются системы растворителей с возрастающей концентрацией ацетонитрила (СН 3 СN). Состав подвижной фазы, а следовательно, и качество разделения ( 3 ) оптимизируют с помощью программируемых градиентных смесителей.

источник

Учебно-методическое пособие

«ОСНОВЫ БИОХИМИИ»

(практический курс)

0407 Лабораторная диагностика

Составлено в соответствии с Государственными требованиями к минимуму содержания и уровню подготовки выпускника по специальности 0407 «Лабораторная диагностика». Учебно-методическое пособие включает биохимические методы исследования для выполнения самостоятельной работы на практических занятиях по дисциплине «Основы биохимии с методами клинико-диагностических исследований», а также задания для конроля.

Автор: Жаднова И.В., преподаватель биохимии и ТЛР ГОУЗ «ВОМК №1»

Рецензенты: Догадова И.В., зав. КДЛ МУЗ ДКБ №25

Островский О.В., зав. кафедрой биохимии ВолГМУ д.м.н.

Утверждено на заседании методического Совета колледжа (протокол № от )

Председатель С.В. Сотникова

Предназначено для студентов и преподавателей медицинских колледжей и училищ Волгоградской области.

Раздел 1. Макромолекулы, составляющие основу живой материи – организма человека.

1.1. Анализ аминокислотного состава белков при помощи цветных реакций.

Работа №1. Биуретовая реакция на белки

Работа № 2. Реакция на ароматические аминокислоты (реакция нитрования)

Работа № 3. Реакция на тирозин (реакция Миллона)

Работа № 4. Реакция на цистеин (реакция Фоля)

Работа № 5. Реакция на аргинин (реакция Сакагути)

Колическтвенное определение белка

Работа № 6. Количественное определение белка биуретовым методом

Работа № 7. Количественное определение белка по методу Лоури

Физико-химические свойсва белков

Работа № 8. Разделение альбуминов и глобулинов яичного белка методом высаливания

Работа № 9. Обессоливание растворов белка методом диализа

Работа №10. Обессоливание белкового раствора методом гель-фильтрации

1.4. Элекро-химические свойсва белков.

Работа №11. Электрофоретическое фракционирование белков сыворотки крови на мембране из ацетатцеллюлозы

Работа №12. Турбидиметрический метод определения белковых фракций сыворотки крови.

Размеры и формы белковых молекул. Денатурация белка.

Работа №13. Осаждение белков при нагревании

Раздел 2. Химические сойства углеводов.

Работа №14 Обнаружение пентоз (проба Биаля)

Работа №15 Обнаружение лактозы и мальтозы

Работа №16 Обнаружение крахмала

Работа №17 Определение глюкозы

Раздел 3. Химические свойства липидов.

Работа №18 Обнаружение глицеринсодержащих липидов. Акролеиновая проба.

Работа №19 Обнаружение лецитина в желтке куриного яйца.

Работа №20 Обнаружение холестерина.

Работа №21 Растворение и эмульгирование жиров.

Раздел 4. Химические свойства нуклеиновых кислот.

Работа №22 Изучение состава нуклеопротеидов дрожжей.

Раздел 5. Витамины.

Работа №23 Количественное определение аскорбиновой кислоты (витамина С) в моче.

Раздел 6. Свойства ферментов, влияние различных факторов на скорость химических реакций

Работа №24 Ферментный гидролиз крахмала.

Работа №25 Кинетика ферментов. Специфичность действия ферментов.

Работа №26 Влияние температуры на активность ферментов.

Работа №27 Влияние рН среды на активность ферментов.

Работа №28 Влияние активаторов и ингибиторов на активность ферментов.

Раздел 6. Количественное определение ферментов.

Работа №29 Колориметрический динитрофенилгидразиновый метод исследования активности аминотрансфераз в сыворотке крови (по Райтману, Френкелю, 1957)

Работа №30 Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови методом конечной точки по Бессею, Лоури, Броку

Работа №31 Определение активности альфа-амилазы методом Каравея

Работа №32 Колориметрический динитрофенилгидразиновый метод определения активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови (по Севелу и Товареку)

Работа №33 Определение активности креатинкиназы в сыворотке крови

Работа №34 Определение активности сьюороточной холинэстеразы колориметрическим методом

Работа №35 Цитохимический метод определения миелопероксидазы (МП) нейтрофилов

Приложение 1. Список условных сокращений.

Приложение 2. Международная система единиц измерения в клинико-биохимических исследованиях.

ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА

Методическое пособие «Основы биохимии (практический курс)» составлено для студентов специальности 0407 «Лабораторная диагностика».

Цель создания учебного пособия — помощь студентам в изучении практических основ биохимии и овладении биохимическими методами анализа. Пособие составлено в соответствии с учебной программой по биохимии с методами клинико-биохимических исследований.

Данное пособие содержит основные виды исследований химических свойств белков, углеводов, липидов, нуклеиновых кислот, витаминов и ферментов, применяемых в клинико-биохимических лабораториях. В конце каждого раздела приведены задания для контроля.

В пособие включены практические работы, которые могут быть выполнены в течение 6ч, отводимых для практического занятия. В то же время даны практические работы, в которых студенты знакомятся с методами экспресс — диагностики.

В конце пособия даны приложения, которые, несомненно, облегчат организацию лабораторных занятий.

Пособие адресовано студентам и слушателям медицинских колледжей, а также лабораторным техникам и технологам, работающим в биохимических и клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений.

Макромолекулы, составляющие основу живой

материи – организма человека.

АНАЛИЗ АМИНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА БЕЛКОВ ПРИ ПОМОЩИ ЦВЕТНЫХ РЕАКЦИЙ

В лабораторной практике для идентификации, полуко­личественного определения белков и отдельных амино­кислот очень часто используются цветные реакции. В цветных реакциях происходит взаимодействие специ­фических реактивов с функциональными группами ради­калов аминокислот, входящих в состав белков, или с пеп­тидными группировками.

Цветные реакции на белки проводят параллельно с растворами двух белков: яичного белка (I) и желатина (II). Результаты оформляют в виде таблицы.

Работа №1. Биуретовая реакция на белки

В щелочной среде раствор белка при добавлении раз­бавленного раствора сульфата меди окрашивается в сине-фиолетовый цвет. Окраска обусловлена образовани­ем комплексов ионов меди с пептидными группами белка.

Биуретовую реакцию дают все белки, а также олиго-пептиды, содержащие не менее двух пептидных связей.

Материал для исследования* (для выполнения работ №1-5).Яичный белок — 1 % раствор; желатин — 1 % раствор.

Реактивы (для выполнения работ № 1—5).CuS0₄, 1 % раствор; гидроксид натрия, 10 % и 30 % растворы; азотная кислота, концентрирован­ный раствор; аммиак, концентрированный раствор; аце­тат свинца, 5 % раствор; а-нафтанол, 0,1 % спиртовой раствор; гипобромит натрия.

Оборудование.Штативы с пробирками; пипетки; газо­вые горелки; водяные бани.

Ход работы.В одну пробирку наливают 5 капель рас­твора яичного белка, в другую — 5 капель раствора жела­тина. В каждую пробирку добавляют по 5 капель 10 % раствора NaOH и по 1 капле 1 % раствора CuS0₄. В обе­их пробирках наблюдают устойчивое сине-фиолетовое окрашивание.

Оформление работы.Результаты опыта вносят в таб­лицу.

источник

Первый этап в определении первичной структуры белков заключается в качественной и количественной оценке аминокислотного состава данного индивидуального белка.

Для определения аминокислотного состава необходимо провести разрушение всех пептидных связей в белке. Анализируемый белок гидролизуют в 6 мол/л НС1 при температуре около 110 °С в течение 24 ч. В результате разрушаются пептидные связи в белке, а в гидролизате присутствуют только свободные аминокислоты

Разделение аминокислот с помощью ионообменной хроматографииСмесь аминокислот, полученных кислотным гидролизом белков, разделяют в колонке с катионообменной смолой.

Количественный анализ полученных фракций.нагреваютотдельные фракции аминокислот с нингидрином, образующим соединение красно-фиолетового цвета. Интенсивность окраски в пробе пропорциональна количеству находящейся в ней аминокислоты.

Определение N-концевой аминокислоты в белке и последовательности аминокислот в олигопептидах

Изучение первичной структуры белков имеет важное общебиологическое и медицинское значение. Изучая порядок чередования аминокислотных остатков в индивидуальных, можно выявить общие фундаментальные закономерности формирования пространственной структуры белков.многие генетические болезни — результат нарушения в аминокислотной последовательности белков. Информация о первичной структуре нормального и мутантного белка может быть полезна для диагностики и прогнозирования развития заболевания.

Установление первичной структуры белков включает 2 основных этапа:

определение аминокислотного состава изучаемого белка;

аминокислотной последовательности в белке.

Например, при серповидноклеточной анемии в шестом положении β-цепи гемоглобина происходит замена глутаминовой кислоты на валин. Это приводит к синтезу гемоглобина S (HbS) – такого гемоглобина, который в дезоксиформеполимеризуется и образует кристаллы. В результате эритроциты деформируются, приобретают форму серпа, теряют эластичность и при прохождении через капилляры разрушаются. Это в итоге приводит к снижению оксигенации тканей и их некрозу.

Последовательность и соотношение аминокислот в первичной структуре определяет формирование вторичной, третичной и четвертичной структур.

8. Вторичная структура белка–пространственная структура, образующаяся в результате взаимодействий между функциональными группами, входящими в состав пептидного остова.регулярные структуры двух типов: а-спираль и б-структура.

Вторичная структура образуется только при участии водородных связеймежду пептидными группами: атом кислорода одной группы реагирует с атомом водорода второй, одновременно кислород второй пептидной группы связывается с водородом третьей и т.д.

пептидный остов закручивается в виде спирали за счёт образования водородных связей между атомами кислорода карбонильных групп и атомами азота аминогрупп. Водородные связи ориентированы вдоль оси спирали. На один виток а-спирали приходится 3,6 аминокислотных остатка.

В образовании водородных связей участвуют практически все атомы кислорода и водорода пептидных групп. В результате ?-спираль «стягивается» множеством водородных связей. связи относят к слабых, их количество обеспечивает максимально возможную стабильность ?-спирали. гидрофильность ?-спиралей уменьшается, а их гидрофобность увеличивается.

?-Спиральная структура — наиболее устойчивая конформация пептидного остова, отвечающая минимуму свободной энергии. В результате образования ?-спиралей полипептидная цепь укорачивается.

Радикалы аминокислот находятся на наружной стороне ?-спирали и направлены от пептидного остова в сторонынекоторые из них могут нарушать формирование ?-спирали. К ним относят:

пролин. Его атом азота входит в состав жёсткого кольца, что исключает возможность вращения вокруг -N-CH- связи. Кроме того, у атома азота пролита, образующего пептидную связь с другой аминокислотой, нет атома водорода. В результате пролин не способен образовать водородную связь в данном месте пептидного остова, и ?-спиральная структура нарушается. Обычно в этом месте пептидной цепи возникает петля или изгиб;

участки, где последовательно расположены несколько одинаково заряженных радикалов, между которыми возникают электростатические силы отталкивания;

участки с близко расположенными объёмными радикалами, механически нарушающими формирование ?-спирали, например метионин, триптофан

β-Складчатый слойСтруктура формируется за счёт образования множества водородных связей между атомами пептидных групп линейных областей одной полипептидной цепи, делающей изгибы, или между разными полипептидными цепями, ?-Структура образует фигуру, подобную листу, сложенному «гармошкой» Когда водородные связи образуются между атомами пептидного остова различных полипептидных цепей, их называют межцепочечными связями. Водородные связи, возникающие между линейными участками внутри одной полипептидной цепи, называют внутрицепочечными. В ?-структурах водородные связи расположены перпендикулярно полипептидной цепи.

Если связанные полипептидные цепи направлены противоположно, возникает антипараллельная ?-структура, если же N- и С-концы полипептидных цепей совпадают, образуется структура параллельного ?-складчатог

9. Третичная структура – это укладка полипептидной цепи в глобулу («клубок»). Четкой границы между вторичной и третичной структурами провести нельзя, в основе третичной структуры лежат стерические взаимосвязи между аминокислотами, отстоящими далеко друг от друга в цепи. Благодаря третичной структуре происходит еще более компактное формирование цепи. В стабилизации третичной структуры белка принимают участие:

ковалентные связи(между двумя остаткамицистеина—дисульфидные мостики);

ионные связимежду противоположно заряженными боковыми группами аминокислотных остатков;

гидрофильно-гидрофобныевзаимодействия. При взаимодействии с окружающими молекулами воды белковая молекула «стремится» свернуться так, чтобы неполярные боковые группы аминокислот оказались изолированы от водного раствора; на поверхности молекулы оказываются полярныегидрофильныебоковые группы.

Связь с первичной структурой. Третичная структура в значительной степени предопределенапервичной структурой. Усилия по предсказанию третичной структуры белка основываясь на первичной структуре известна как задачапредсказания структуры белка. Однако, окружающая среда, в которой белок сворачивается существенно определяет конечную форму, но обычно непосредственно не принимается во внимание текущими методами предсказания. Большинство таких методов полагаются на сравнения с уже известными структурами, и таким образом включают окружающую среду косвенно. Супервторичная структура белков. сравнение конформаций разных по структуре и функциям белков выявило наличие у них похожих сочетаний элементов вторичной структуры. Такой специфический порядок формирования вторичных структур называют супервторичной структурой белков.она формируется за счёт межрадикальных взаимодействий. Определённые характерные сочетания а-спиралей и б-структур часто обозначают как «структурные мотивы».

источник

Определение аминокислотного состава белков может быть осуществлено различными методами: химическим, хроматографическим, микробиологическим и изотопным. Чаще используются хроматографические методы.

Бумажная хроматография. Бумажная хроматография используется для идентификации компонентов смеси аминокислот с ди- и три-пептидами, получаемой при частичном гидролизе белков и полипептидов.

Гидролиз может быть осуществлен кислотным, щелочным или ферментативным методом. Кислотный метод используется чаще (6 н. HCl, 8 н. H₂SO₄). Гидролиз проводят при нагревании, иногда при повышенном давлении. Показателями окончания гидролиза могут служить: прекращение нарастания карбоксильных или аминных групп в гидролизате, либо отрицательная биуретовая реакция. Избыток гидролизующего реагента удаляют: серную кислоту осаждают Ca(OH)₂, соляную кислоту отгоняют в вакууме, а остаток кислоты осаждают нитратом серебра.

Компоненты гидролизата распределяются между водой, адсорбированной на целлюлозе и являющейся неподвижной фазой, и органическим растворителем, подвижной фазой, которая движется вдоль листа вверх или вниз. В качестве подвижной фазы используется смесь бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:5). Более липофильные аминокислоты сильнее увлекаются органическим растворителем, более гидрофильные – проявляют большую тенденцию связываться с неподвижной фазой. Гомологические соединения, отличающиеся даже на одно метиленовое звено, движутся с различной скоростью и легко могут быть разделены. По окончании хроматографии бумагу высушивают и обрабатывают проявителем (0,5% раствор нингидрина в смеси ацетон-ледяная уксусная кислота-вода) и нагревают в течение нескольких минут. Аминокислоты проявляются в виде окрашенных пятен. Подвижность – постоянная величина, характерная для каждого соединения возрастает с увеличением молекулярной массы. Для аминокислот с неразветвленной цепью величина подвижности несколько больше, чем для соответствующих изомеров. Введение в молекулу полярных групп снижает подвижность соединения. Аминокислоты с объемными неполярными боковыми цепями (лейцин, изолейцин, фенилаланин, триптофан и др.) перемещаются быстрее, чем аминокислоты с более короткими неполярными боковыми цепями (пролин, аланин, глицин) или с полярными боковыми цепями (треонин, аргини, цистеин, гистидин, лизин). Это обусловлено большей растворимостью полярных молекул в гидрофильной стационарной фазе и неполярных – в органических растворителях.

Бумажная хроматография может быть использована для количественной оценки содержания аминокислот. Каждое пятно вырезают и элюируют подходящим растворителем; затем проводят количественный колориметрический (нингидриновый) анализ. В другом варианте бумагу опрыскивают нингидрином и измеряют с помощью фотометра интенсивность окрашивания пятна в отраженном или проходящем свете. При полуколичественной оценке содержание аминокислот оценивают по площади пятен на хроматограмме, которые пропорциональны концентрациям аминокислот в разделяемой смеси.

Тонкослойная хроматография. Для разделения и определения аминокислот может быть также использована тонкослойная хроматография. ТСХ, как известно, существует в двух вариантах. Распределительная ТСХ сходна с распределительной на бумаге и адсорбционная ТСХ, основана совершенно на других принципах.

При проведении РТСХ на порошке целлюлозы или других относительно инертных носителях можно использовать такие же системы растворителей и такие же проявляющие реагенты, как и при хроматографии на бумаге.

Разделение с помощью АТСХ определяется способностью растворителя (этот растворитель не обязательно является бинарной или более сложной смесью) элюировать компоненты образца с места его адсорбции на активированном сорбенте. Например, на нагретом силикагеле. АТСХ применима для разделения таких неполярных соединений, как липиды, но не для разделения аминокислот и большинства пептидов. Для разделения аминокислот используют РТСХ, которая позволяет достаточно быстро разделять и определять 22 аминокислоты белковых гидролизатов.

Аминокислоты в белковом гидролизате могут быть определены также методом газовой хроматографии, но перед хроматографическим анализом аминокислоты как правило переводят в летучие соединения.

-Взаимодействие с нингидрином. Образуются соответствующие альдегиды.

Таким образом, получают смесь альдегидов и анализируют ее. Это простейший случай, пригоден лишь для некоторых аминокислот.

-Переводят аминоксилоты в летучие эфиры (алкильные эфиры, метильные эфиры оксикислот, метиловые эфиры хлорзамещенных кислот и др.).

Выбор производных зависит от исследуемой смеси аминокислот.

Ионообменная хроматография. В настоящее время аминокислотный состав пищевых продуктов определяется исключительно с помощью автоматической ионообменной хроматографии.

В методе Мура и Штейна используют короткую и длинную колонки, заполненные смолой из сульфонированного полистирола в Na + – форме. Когда кислотный гидролизат при рН = 2 наносят на колонку, аминокислоты связываются в результате катионного обмена с ионами натрия. Далее колонку элюируют раствором цитрата натрия при заранее запрограммированных значениях рН и температуры. Короткую колонку элюируют одним буфером, длинную – двумя. Элюат обрабатывают нингидрином, измеряя интенсивность окраски с помощью проточного колориметра. Данные автоматически регистрируются на ленте самописца и могут передаваться в компьютер для вычисления площади под пиком.

Высоковольтный электрофорез на инертных носителях. В биохимии широкое применение нашло разделение аминокислот, полипептидов и других амфолитов (молекул, суммарный заряд которых зависит от рН среды) под действием наложенного постоянного электрического поля. Это метод высоковольтного электрофореза на инертных носителях. При разделении аминокислот в качестве инертных носителей чаще всего используют полоски бумаги или тонкие слои целлюлозного порошка. Разделение проводят в течение 0,5–2 ч при напряжении 2000–5000 В в зависимости от суммарных зарядов амфолитов и их молекулярных масс. Среди молекул, несущих одинаковый заряд, более легкие мигрируют быстрее. Но более важным параметром при разделении является суммарный заряд. Метод применяется для разделения аминокислот, низкомолекулярных пептидов, некоторых белков, нуклеотидов. Образец помещают на носитель, смачивают буфером при соответствующем рН и соединяют с буферным резервуаром полоской фильтровальной бумаги. Бумагу прикрывают стеклянной пластинкой или погружают в углеводородный растворитель для охлаждения. В электрическом поле молекулы, несущие при данном рН отрицательный заряд, мигрируют к аноду, а те, которые несут положительный заряд, – к катоду. Далее высушенную электрофореграмму «проявляют» нингидрином (при работе с аминокислотами, пептидами) или измеряют поглощение в УФ-свете (при работе с нуклеотидами).

Выбор рН определяется значениями рК диссоциирующих групп, входящих в состав молекул смеси. При рН 6,4 глутамат и аспарат несут заряд –1 и движутся к аноду; разделение их осуществляется благодаря различию в молекулярной массе. Лизин, аргинин и гистидин движутся в противоположном направлении, а все другие аминокислоты, входящие в состав белка, остаются вблизи места нанесения. При разделении пептидов, образовавшихся в результате ферментативного расщепления, уменьшение рН до 3,5 приводит к увеличению заряда катионных групп и обеспечивает лучшее разделение.

Методы бумажной, тонкослойной хроматографии, микробиологические, газохроматографические и ряд других, в настоящее время практически не используются вследствие худшей воспроизводимости и большой длительности. Современные хроматографы позволяют определять аминокислотный состав смеси, содержащей лишь 10 –7 –10 –9 моль каждого компонента с воспроизводимостью до 5% за 2–4 часа.

Анализ аминокислотного состава включает полный гидролиз исследуемого белка или пептида и количественное определение всех аминокислот в гидролизате. Поскольку при нейтральных рН пептидные связи стабильны, применяют кислотный или щелочной катализ. Ферментативный катализ для полного гидролиза менее пригоден. Полный гидролиз белка на составляющие аминокислоты неизбежно сопровождается частичной потерей некоторых аминокислотных остатков. Для гидролиза обычно используется 6 н. водный раствор соляной кислоты (110ºС), в вакуумированной ампуле. Количественное определение аминокислот в гидролизате проводят с помощью аминокислотного анализатора. В большинстве таких анализаторов смесь аминокислот разделяют на сульфокатионитах, а детектирование осуществляют спектрофотометрически по реакции с нингидрином или флуориметрически с о-фталевым диальдегидом.

Однако данные по аминокислотному составу однотипных продуктов, полученные в разных лабораториях по отдельным аминокислотам, иногда различаются до 50%.

Эти различия обусловлены не только сортовыми, видовыми или технологическими различиями, а главным образом условием проведения гидролиза пищевого продукта. При стандартном кислотном гидролизе (6 н. HСl, 110–120ºС, 22–24 часа) происходит частичное разрушение некоторых аминокислот, в том числе треонина, серина (на 10–15% и тем больше, чем дольше проводится гидролиз) и особенно метионина (30–60%) и цистина 56–60%, а также практически полное разрушение триптофана и цистеина. Этот процесс усиливается в присутствии больших количеств углеводов в продукте. Для количественного определения метионина и цистина рекомендуется проводить предварительное их окисление надмуравьиной кислотой. При этом цистин превращается в цистеиновую кислоту, а метионин в метионин-сульфон, которые весьма устойчивы при последующем кислотном гидролизе.

Цистин Цистеиновая кислота

Трудной задачей в аминокислотном анализе является определение триптофана. Как уже говорилось, при кислотном гидролизе происходит почти полное его разрушение (до 90%). Поэтому для определения триптофана проводят один из вариантов щелочного гидролиза 2 н. NaOH, 100ºС, 16–18 часов в присутствии 5% хлорида олова или 2 н. гидроокиси бария, при которых он разрушается незначительно (до 10%). Минимальное разрушение происходит в присутствии тиогликолевой кислоты и предварительно гидролизованного крахмала. (При щелочном гидролизе происходит разрушение серина, треонина, аргинина и цистеина). Гидролизат после нейтрализации смесью лимонной и соляной кислот немедленно (во избежание студнеобразования) анализируют на аминокислотном анализаторе. Что касается многочисленных химических методов определения триптофана, то они, как правило, в пищевых продуктах плохо воспроизводимы и поэтому их использовать не рекомендуется.

Для мясных продуктов дополнительной необходимой аминокислотой является оксипролин, который характеризует количество соединительных тканных белков в мясе. Его можно определять ионообменной хроматографией с помощью автоматических анализаторов или химическим колориметрическим методом. Метод основан на нейтрализации кислотного гидролизата до рН 6,0, последующем окислении оксипролина с помощью 1,4% раствора хлорамина Т (или хлорамина Б) в смеси пропилового спирта и буфера, колориметрическом определении при 533 нм продуктов окисления оксипролина после реакции с 10%-ным раствором пара-диметиламинобензальдегида в смеси хлорной кислоты и пропилового спирта (1:2).

В связи с тем, что тирозин, фенилаланин и пролин в присутствии кислорода могут частично окисляться, стандартный кислотный гидролиз рекомендуется проводить в атмосфере азота. Ряд аминокислот, в том числе лейцин, изолейцин и валин, требуют для своего полного выделения из белков более длительного кислотного гидролиза – до 72 ч. В биохимии при анализе белков гидролизуют параллельные пробы в течение 24, 48, 72 и 96 ч.

Для точного количественного определения всех аминокислот требуется проводить 5 различных гидролизов, что весьма удлиняет определение. Обычно же проводят 1–2 гидролиза (стандартный с соляной кислотой и с предварительным оксилением надмуравьиной кислотой).

Во избежание потерь аминокислот удаление избытка кислоты при кислотном гидролизе следует проводить немедленно многократным выпариванием в вакуум-эксикаторе с добавлением дистиллированной воды.

При правильной работе анализатора ионообменные колонки работают без замены смолы довольно долго. Однако, если образцы содержат заметные количества красящих веществ и липидов, то колонка быстро забивается и для восстановления ее разделительных способностей требуется многократная регенерация, иногда с перенабивкой колонки. Поэтому, для продуктов, содержащих более 5% жира, рекомендуется предварительно удалять липиды экстракцией. В таблице 2.3 приведены условия пробоподготовки основных пищевых продуктов при анализе аминокислотного состава.

Таблица 2.3. – Условия подготовки проб пищевых продуктов к анализу

Контрольные вопросы:

1. Дайте определение понятию «белки».

2. На какие группы делят белки по их функциям в организме?

3. Какова роль белков в питании человека?

4. Каковы рекомендуемые нормы белка в питании?

5. Каково рекомендуемое соотношение белков растительного и животного происхождения и как белки различного происхождения отличаются по своему аминокислотному составу?

6. Какие незаменимые аминокислоты вы знаете и какие аминокислоты могут стать незаменимыми?

7. Как определяют содержание общего азота в продуктах питания?

8. Как определяют аминокислотный состав белков?

9. Какие методы определения аминокислот вы знаете?

§ 2.4. Углеводы

Углеводы широко представлены в растениях и животных, где они выполняют как структурные, так и метаболические функции. В растениях в процессе фотосинтеза из углекислого газа и воды синтезируется глюкоза, которая далее запасается в виде крахмала или превращается в целлюлозу – структурную основу растений. Животные способны синтезировать ряд углеводов из жиров и белков, но большая часть углеводов поступает с пищей растительного происхождения.

Дата добавления: 2015-05-29 ; Просмотров: 2822 ; Нарушение авторских прав? ;

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

источник

Можно выделить следующие этапы выяснения первичной структуры белков и пептидов:

1. Выделение белка в чистом виде и определение его молекулярной массы

2. Определение аминокислотного состава

3. Определение N-концевой аминокислоты

4. Определение С-концевой аминокислоты

5. Определение аминокислотной последовательности

Выделение белка в чистом виде. Как правило, исходный материал содержит много различных белков. В связи с этим возникает проблема выделения из этой смеси интересующего белка в чистом виде. При очистке белков используются методы, которые основаны на разнице:

1.Поверхностного заряда белков

2.Молекулярного размера белков (зависящего от их молекулярной массы)

3.Биологической активности вследствие связывания с субстратами или ингибиторами

Разделение белков по разнице величины поверхностного заряда. Суммарный поверхностный электрический заряд белка при данном значении рН может быть отрицательным, нейтральным или положительным. Для разделения белков с различным зарядом, подобно тому, как это было в случае аминокислот, может быть использован метод ионообменной хроматографии (см. выше). Концентрацию белка в пробирках с элюатом определяют с помощью спектрофотометра по интенсивности поглощения ультрафиолетового света и строят графическую зависимость её от объема вытекшей из хроматографической колонки жидкости.

Разделение белков по молекулярной массе. Если представить молекулы белков в виде шариков различной величины, размер которых зависит от их молекулярной массы, то окажется, что у больших шариков будет большей молекулярная масса или размер молекул. Это означает, что белки можно разделить подобно частичкам в сите — молекулярном сите, образованном гелем. Такой способ часто называют гель-фильтрацией или хроматографией исключения размером. Ниже приводится иллюстрация того, как с помощью гель-фильтрации удается разделить смесь белков различного размера (рис.1.12).

Хроматографическую колонку заполняют набухшим гелем. Частицы геля приготовлены из связанного поперечными сшивками полисахаридного материала и содержат большое количество микропор. Размер микропор подбирают таким образом, чтобы в них проникали меньшие из разделяемых молекул, в то время как большие этого сделать не могли. Смесь разделяемых белков наносят на верхнюю часть колонки и элюируют буферным раствором. Увлекаемые током нисходящей жидкости большие молекулы, не имея возможности проникнуть в поры гелевых частиц, будут двигаться быстрее. Меньшие молекулы проникают в поры и задерживаются там. Если собирать вытекающий из колонки раствор равными порциями в пробирки, то окажется, что в более ранних порциях вытекающей жидкости будут содержаться белки больших размеров, а в более поздних — меньших размеров. Путем подбора размера пор можно добиться разделения самых разных смесей белков.

Рис.1.12. Схематическое изображение разделения белков методом гель-фильтрации

Если учесть, что размер молекулы зависит от молекулярной массы, то оказывается, что разделяя белки методом гель-фильтрации, одновременно можно установить его молекулярную массу.

Рис.1.13. График зависимости молекулярной массы белков от объема выхода их из хроматографической колонки в ходе гель-фильтрации

Объем вытекающего из колонки элюата обратнопропорционален логарифму молекулярной массы белка. Таким образом, достаточно знать объем жидкости, в котором вышел из колонки интересующий белок, чтобы, пользуясь подобным графиком, можно было установить его молекулярную массу (рис.1.13).

Ещё одним методом, который позволяет разделить белки в зависимости от их молекулярной массы, является гель-электрофорез (см. выше).

Ультрацентрифугирование. Если встряхнуть сосуд, заполненный песком с водой, а затем поставить его на ровную поверхность, то песок быстро осядет на дно благодаря силе земного притяжения. С высокомолекулярными веществами, находящимися в растворе, этого не произойдет, так как тепловое (броуновское) движение сохраняет их равномерное распределение в растворе. Оседание макромолекул, подобно песчинкам, произойдет, только если их подвергнуть значительному ускорению.

В 1923 году шведский биохимик Т. Сведберг впервые использовал ультрацентрифугирование. При скорости вращения ротора 80000 об/мин ему удалось показать, что многие белки состоят из субъединиц. Позже ультрацентрифугирование стало незаменимым методом для разделения белков, нуклеиновых кислот и субклеточных частиц.

Рис.1.14. Схематическое изображение зонального ультрацентрифугирования.

Образец наслаивают на градиент сахарозы (слева). После центрифугирования (середина) каждая частица осаждается на уровне, зависящем от его массы. После остановки ротора центрифужную пробирку прокалывают и разделенные частицы (зоны) собирают в пробирки (справа).

Осаждение проводят в растворе химически инертного вещества (сахарозы или CsCl), концентрация которого и, следовательно, плотность увеличивается в направлении от поверхности до дна центрифужной пробирки. Использование таких градиентов плотности значительно усиливает разрешающую способность ультрацентрифуги. Различают зональное препаративное ультрацентрифугирование (рис.1.14) и ультрацентрифугирование в равновесном градиенте плотности (изократное ультрацентрифугирование) (рис.1.15).

Разделение белков по разнице биологической активности вследствие связывания с лигандами. Характерной особенностью белков является их способность прочно связываться с различными молекулами, но нековалентными связями. На этом основан метод разделения белков аффинной хроматографией (рис.1.16).

Рис.1.16. Схематическое изображение принципа иммуноаффинной хроматографии

Антиген — лиганд для выделяемого белка. Антитело — выделяемый белок.

Молекулы веществ, с которыми специфически связываются определенные белки, ковалентно соединяют с частицами инертного матрикса. Тогда они выполняют роль своеобразных «рыболовных крючков», задерживающих необходимый белок. Все остальные белки транзитом проходят через колонку. Задержанный белок затем можно вымыть из колонки с помощью буферного раствора, содержащего в свободном состоянии такие же молекулы, которые выполняли роль «рыболовных крючков», или с помощью какого-нибудь другого реактива, способного нарушить это взаимодействие. Одним из вариантов этого метода является иммуноаффинная хроматография. Тогда антитела к определенному белку присоединяют к частицам сорбента. Они обеспечивают с очень высокой специфичностью задержку в колонке этого белка (рис.1.16).

Определение аминокислотного состава белка.До определения аминокислотной последовательности выделенного белка желательно иметь представление о его аминокислотном составе, то есть знать, какие аминокислоты и в каком количестве входят в состав его молекулы. Для этого проводят полный гидролиз белка с последующим количественным анализом высвободившихся аминокислот. Чаще используют кислотный гидролиз. Полипептид растворяют в 6N НCl в отсутствие кислорода, чтобы предотвратить окисление серусодержащих аминокислот. Смесь нагревают до 100-120 0 С и выдерживают при этой температуре в течение 10-100ч. К сожалению при этом способе гидролиза некоторые аминокислоты (Сер, Три, Тир, Глн, Асн) разрушаются.

Аминокислотный состав полипептидного гидролизата определяют с помощью автоматического аминокислотного анализатора. Прибор разделяет аминокислоты посредством ионообменной хроматографии (см. выше). Их идентифицируют по элюционному объему и количественно учитывают по интенсивности флюоресценции после проведения реакции с дансилхлоридом. Современные аминокислотные анализаторы проводят анализ гидролизата белка в течение 1ч с чувствительностью, которая позволяет определить до 1 пикомоля аминокислоты.

Определение N-концевой аминокислоты.Имеется несколько эффективных подходов, с помощью которых можно идентифицировать N-концевую аминокислоту. 1-Диметиламинонафталин-5-сульфонилхлорид (дансил хлорид) взаимодействует с первичными аминами с образованием дансилированного полипептида. Последующее проведение кислотного гидролиза позволяет высвободить из полипептидной цепи N-концевую аминокислоту в виде дансил-аминокислоты, обладающей интенсивной желтой флюоресценцией (рис.1.17).

Рис.1.17. Этапы определения N-концевой аминокислоты методом дансилирования

Благодаря этому дансил-производное аминокислоты можно идентифицировать хроматографически.

Ещё более популярным методом идентификации N-концевой аминокислоты является разрушение по Эдману (Pehr Edman — автор метода). Фенилизотиоцианат (ФИТЦ, реактив Эдмана) взаимодействует с N-концевой аминогруппой белков в слабо щелочной среде (рис.1.18). В результате образуется фенилтиокарбамильный продукт. Его обрабатывают безводной сильной кислотой, такой как трифторуксусная кислота. При этом тиазолиновое производное N-концевой аминокислоты отщепляется, в то время как остальные пептидные связи не подвергаются гидролизу. Тем самым разрушение по Эдману заключается в отщеплении остатка только N-концевой аминокислоты и сохранении оставшейся части полипептидной цепи.

Тиазолиновое производное аминокислоты избирательно экстрагируют органическим растворителем и превращают в более стабильное фенилтиогидантоиновое производное. Последнее можно идентифицировать сравнением с известными стандартами при проведении тонкослойной хроматографии, электрофореза, высокоэффективной жидкостной хроматографии или газо-жидкостной хроматографии.Наиболее важным преимуществом расщепления по Эдману по сравнению с другими методами определения N-концевой аминокислоты является то, что, проводя повторно с одним и тем же пептидом эту процедуру, каждый раз можно идентифицировать новую N-концевую фенилгидантоин-аминокислоту, выясняя таким образом аминокислотную последовательность.

Идентификация С-концевой аминокислоты. Один из подходов заключается в использовании ферментов — карбоксипептидаз (катализирует отщепление от пептида С-концевой аминокислоты). Карбоксипептидазы, подобно другим ферментам, обладают субстратной специфичностью, то есть они катализируют отщепление определенных аминокислот. Вместе с тем, наличие рядом с С-концевой аминокислотой остатка Про делает невозможной её отщепление под влиянием карбоксипептидазы. В этом случае наиболее надежным считается метод гидразинолиза. Полипептид обрабатывают безводным гидразином при температуре 90 0 С в течение 20-100ч в присутствии ионообменного сорбента (в качестве катализатора). При этом разрушаются все пептидные связи, а из высвобождающихся аминокислот образуются гидразиды. Но С-концевая аминокислота высвобождается как свободная и поэтому её можно идентифицировать хроматографически.

Определение аминокислотной последовательности. Установление концевых аминокислот в исследуемом пептиде позволяет в дальнейшем определить всю его аминокислотную последовательность. Для этого обычно проводят повторное разрушение по Эдману (см. выше) в автоматическом приборе — секвенаторе, который был предложен П. Эдманом и Г. Бэгом. Современный такой прибор определяет 1 аминокислотный остаток в час. Таким способом можно установить последовательность расположения 40-60 остатков аминокислот. Затем накапливаются незавершенные реакции, продукты побочных реакций. Наряду с потерей самого пептида они делают малоинформативной и ненадежной дальнейшую идентификацию аминокислот. Чтобы установить последовательность их расположения в больших полипептидных молекулах, их подвергают расщеплению ферментативным или химическим путем на фрагменты с размерами, достаточными для проведения секвенирования (рис.1.19).

Рис.1.19. Аминокислотную последовательность полипептидной цепи определяют, совмещая перекрывающиеся последовательности фрагментов пептида. В данном случае после расщепления исследуемого пептида трипсином (катализирует разрыв пептидных связей, в образовании которых участвует карбоксильные группы Арг и Лиз), а в другом случае — бромцианом (CNBr) (катализирует разрыв пептидных связей, в образовании которых участвует Мет) были получены два набора пептидных фрагментов. Порядок связывания первых двух фрагментов, образовавшихся в результате действия трипсина, устанавливается на основании того наблюдения, что фрагмент Гли-Ала-Лиз-Лей-Про-Мет (результат расщепления CNBr) имеет последовательность аминокислот на N и С — концах, включающую N и С — концы двух трипсиновых фрагментов. Иными словами, обнаружение накладывающихся участков позволяет установить последовательность расположения пептидных фрагментов, то есть аминокислотную последовательность всего исследуемого пептида.

Исследование последовательности нуклеотидов ДНК — рутинная операция в молекулярной биологии.Этот метод в последнее время вытеснил другие методы исследования первичной структуры белков. Зная последовательность нуклеотидов, можно легко установить последовательность аминокислот (более подробное описание этого метода см. в главе 13).

Метод пептидных карт.Процесс определения аминокислотной последовательности в белке — процедура достаточно длительная. Её можно существенно ускорить в случае выяснения аминокислотной последовательности гомологичного белка[2], если у сравниваемого белка она уже известна. Метод носит название «метод пептидных карт» или «метод отпечатков пальцев». Он включает в себя сочетание хроматографии и электрофореза на бумаге продуктов неполного гидролиза сравниваемых белков. При этом пептидные фрагменты, отличающиеся аминокислотной последовательностью, будут обладать разной подвижностью по сравнению с таковыми у исходного белка (рис.1.21).

Рис.1.21. Сравнение «отпечатков пальцев» (окраска нингидрином) продуктов расщепления трипсином (а) гемоглобина А и (б) гемоглобина S. Пептиды, отличающиеся по подвижности, обведены квадратом. Они включают в себя 98 аминокислот, расположенных на N-конце b-субъединицы гемоглобина. Различие заключается в замене 6-ой аминокислоты (Глю) в составе Hb A на Вал в составе Hb S.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №1

Принцип метода. Анализ аминокислотного состава белка проводят после его гидролиза кислотой или щелочью. Пептидная связь является ковалентной и химически устойчивой, поэтому гидролиз проводят в жестких условиях.

Ход работы. При проведении кислотного гидролиза белок кипятят в растворе 6 М НСl при 105° С в течение 24 час. в запаяных ампулах под вакуумом.

Образовавшийся гидролизат используют в дальнейших опытах.

ОПЫТ 2. РАЗДЕЛЕНИЕ СМЕСИ АМИНОКИСЛОТ МЕТОДОМ БУМАЖНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Цель работы: Анализ гидролизата белка методом бумажной хроматографии в присутствии маркеров. Определение коэффициента распределения аминокислот.

Принцип метода. Это метод распределительной хроматографии. Основан на различии растворимости аминокислот в двух несмешивающихся жидкостях: вода (неподвижная фаза, так как зафиксирована на хроматографической бумаге ) и органический растворитель ( фенол, изобутиловый или бутиловый спирт). Скорость перемещения аминокислот по бумаге зависит от степени их растворимости в подвижной и неподвижной фазах и может характеризоваться величиной Rf .

где а — расстояние, пройденное аминокислотой. b — расстояние, пройденное растворителем.

Коэффициент Rf является величиной, характерной для каждой аминокислоты и постоянной при данных условиях опыта.

Бумажная хроматография бывает восходящая, нисходящая и круговая. Для быстрого разделения аминокислот можно использовать метод круговой хроматографии на бумаге.

Ход работы. Диск хроматографической бумаги радиусом 9-10 см разделить на 4 сектора путем сгибания. Из середины диска провести карандашом окружность радиусом 1 см. На середину каждой полученной дуги нанести 1 каплю (0,002 мл) раствора гидролизата или аминокислоты и высушить на воздухе. Диск поместить между двумя половинками чашки Петри, нижняя из которых наполовину заполнена растворителем. Сделать из фильтровальной бумаги фитилек и вставить его верхний конец в центр хроматографического диска, а нижний поместить в расворитель. Когда граница растворителя достигнет краев чашки Петри, хроматографическую бумагу снимают и высушивают при 70-80° С для удаления растворителя.

Для окрашивания хроматограмму быстро проводят через ванночку с раствором нингидрина и высушивают при 80-100° С в сушильном шкафу. На хроматорамме появляются окрашенные пятна на месте аминокислот.

ТЕМА: КАЧЕСТВЕННЫЕ ( ЦВЕТНЫЕ) РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ

Цветные реакции на белки являются реакциями на функциональные группы радикалов аминокислот, входящих в состав белков.

ОПЫТ1 . ПОЛУЧЕНИЕ РАСТВОРА ЯИЧНОГО АЛЬБУМИНА

Цель метода: Анализ растворов на принадлежность к белковым веществам и сравнение их по аминокислотному составу.

Принцип метода: Яичный белок – это 10%-водный раствор нескольких белков без заметных примесей углеводов и липидов. Альбумин в яичном белке составляет 70% и легко отделяется путем 10-кратного разведения дистиллированной водой.

Ход работы: 20 мл яичного белка разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1:10 при постоянном помешивании стеклянной палочкой. Яичный альбумин остается в растворе, а белки глобулиновой фракции выпадают в виде хлопьевидного осадка, который отфильтровывают через бумажный фильтр.

Результат: Полученный раствор яичного альбумина используют в дальнейших опытах.

ОПЫТ №2. БИУРЕТОВАЯ РЕАКЦИЯ

Принцип метода: Пептидные группы белков и пептидов (- СО — NH- ) в щелочной среде образуют комплексные соединения с ионами меди (Сu 2+ ). Раствор окрашивается в сине-фиолетовый цвет.

Ход работы: Берут три пробирки: в одну вносят 5 капель раствора белка, в другую – 5 капель гидролизата, в третью 5 капель желатина. Далее в каждую пробирку добавляют по 3 капли NaOH и по 1 капле CuSO4. Пробирки встряхивают. Наблюдают за изменением окраски.

Результаты: I пробирка_________________________________

II пробирка _________________________________________________

ОПЫТ 3. НИНГИДРИНОВАЯ РЕАКЦИЯ НА АЛЬФА-АМИНОГРУППЫ

Принцип метода: Нингидрин вступает в реакцию с концевыми α-аминогруппами белков, пептидов или аминокислот. Продукты этой реакции окрашены в сине- фиолетовй цвет.

Ход работы: Берут три пробирки: в одну вносят 5 капель раствора белка, в другую-5 капель гидролизата, в третью 5 капель желатина. В каждую пробирку добавляют по 5 капель раствора нингидрина. Кипятят 2 минуты на водяной бане. Следят за изменением окраски.

Нингидриновая реакция применяется для обнаружения белков, пептидов и аминокислот в растворах.

ОПЫТ 4. КСАНТОПРОТЕИНОВАЯ РЕАКЦИЯ НА ЦИКЛИЧЕСКИЕ АМИНОКИСЛОТЫ

Принцип метода: Радикалы аминокислот, имеющие в своем составе бензольное кольцо (фен, тир, трп) вступают с азотной кислотой в реакцию нитрования. Продукты реакции окрашены в желтый цвет.

Ход работы: Берут три пробирки: в одну вносят 5 капель раствора белка, в другую – 5 капель гидролизата, в третью 5 капель желатина. Затем в каждую пробирку добавляют по 3 капли концентрированной азотной кислоты (HNO₃ – агрессивная жидкость!). Кипятят 2 минуты на водяной бане. Регистрируют изменение цвета.

ОПЫТ 5. РЕАКЦИЯ МИЛЛОНА НА ТИРОЗИН

Принцип метода: Фенол с солями ртути дает красное окрашивание. Тирозин, имеющий фенольную группу в радикале, также дает красное окрашивание при реакции с солями ртути.

Ход работы Берут четыре пробирки: в первую вносят 10 капель раствора белка, во вторую – 10 капель гидролизата, в третью – 10 капель желатина, в четвертую – 10 капель раствора фенола. В каждую пробирку добавляют по 5 капель реактива Миллона (смесь солей ртути в концентрированной азотной кислоте). Кипятят 5 минут. Регистрируют изменение окраски.

ТЕМА: ФИЗИКО – ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ

ОПЫТ № 1. ВЫДЕЛЕНИЕ КАЗЕИНА ИЗ МОЛОКА

Принцип метода: В молоке содержится специфический белок казеин, содержащий фосфор. 80% всех белков молока приходится на долю казеина. Этот белок обладает кислыми свойствами и находится в молоке в виде растворимой кальциевой соли. При подкислении казеин выпадает в осадок в виде белых рыхлых хлопьев, которые фильтрованием отделяются от раствора.

Ход работы: В стакан ( 50 мл ) отмеряют 3 мл молока и добавляют 7 мл дистиллированной воды. После перемешивания добавляют 10 мл 1% HCl, т.к. в избытке соляной кислоты осадок казеина растворяется. Перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 5 минут до образования рыхлого осадка.

Для удаления соляной кислоты в стакан приливают 10 мл дистиллированной воды, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 5 минут. Жидкость осторожно сливают с осадка. Процедуру повторяют. Осадок фильтруют через бумажный фильтр.

ОПЫТ № 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ ТОЧКИ КАЗЕИНА

Принцип метода: Белки являются амфотерными электролитами, поэтому диссоциируют с образованием как положительно, так и отрицательно заряженных групп. При определении pH среды можно добиться такого соотношения ионизированных групп, при котором белковый раствор наименее устойчив и белок выпадает в осадок.

Ход работы: В 5 пробирок приливают из бюретки следующие количества 0,1 н. раствора уксусной кислоты: в первую – 0,25 мл; во вторую – 0,5 мл; в третью – 1,0 мл; в четвертую – 2,0 мл; в пятую – 4,0 мл. Из другой бюретки в той же последовательности в каждую пробирку прибавляют 8,75 мл; 8,5 мл; 8,0 мл; 7,0 мл и 5,0 мл воды.

В каждую из пробирок приливают пипеткой по 1 мл раствора казеина и наблюдают за степенью помутнения раствора.

ОПЫТ №3. ОСАДОЧНЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ

3.1. Осаждение белков при кипячении.

Принцип метода. Для осаждения белка необходимо разрушить его гидратную оболочку и нейтрализовать его заряд. При кипячении происходит денатурация, разрушается гидратная оболочка. Белок теряет заряд, если pH раствора близок к изоэлектрической точке этого белка.

Ход работы. В 5 пробирок вносят по 5 капель раствора яичного белка. Затем добавляют:

во вторую пробирку – 1 каплю уксусной кислоты;

в третью – 10 капель уксусной кислоты;

в четвертую – 5 капель уксусной кислоты и 2 капли насыщенного раствора хлорида натрия;

в пятую – 2 капли гидроксида натрия.

Все пробирки кипятят 5 минут в водяной бане.

3.2. Осаждение белка ацетоном

Ход работы. В пробирку наливают 5 капель раствора белка, затем добавляют 0,5 мл ацетона, осторожно наслаивая по стенке пробирки.

3.3. Осаждение белков спиртом

Ход работы: В пробирку вносят 5 капель раствора белка, добавляют несколько кристаллов хлорида натрия (NaCl ) и приливают 5 мл этилового спирта.

3.4. Осаждение белка органическими кислотами

Принцип метода: органические кислоты, такие как трихлоруксусная и сульфосалициловая кислоты, вызывают денатурацию и осаждение белка.

Ход работы: В пробирку наливают 5 капель раствора белка, затем добавляют 3 – 4 капли 8% трихлоруксусной кислоты (CCl₃COOH ).

3.5. Осаждение белка концентрированной азотной кислотой

Принцип метода: Концентрированная азотная кислота вызывает денатурацию белка и его осаждение. Осадок белка не растворяется в избытке азотной кислоты.

Ход работы: В пробирку вносят 10 капель концентрированной азотной кислоты, затем осторожно из пипетки наслаивают по стенке пробирки примерно 1 мл раствора белка так, чтобы жидкости не смешивалтсь.

3.6. Осаждение белка солями тяжелых металлов

Ход работы: В пробирку вносят 5 капель раствора белка, осторожно, по каплям при встряхивании добавляют раствор сульфата меди (CuSO ).

ОПЫТ № 4. ФРАКЦИОННОЕ ВЫСАЛИВАНИЕ БЕЛКОВ

Ход работы: К 1 мл неразбавленного яичного белка добавляют 6 мл воды. Образунтся небольшое количество белого хлопьевидного осадка глобулинов. Глобулины могут растворяться в слабых растворах солей и не растворяются в дистиллированной воде.

В пробирку наливаем несколько капель насыщенного раствора (NH₄)₂SO₄, после чего происходит растворение выпавшего глобулина.

К 1 мл данного раствора яичного белка. Содержащего альбумины и глобулины приливаем 1 мл насыщенного раствора (NH₄)₂SO₄. Выпадает осадок глобулинов. Который удаляется фильтрованием.

К фильтрату добавляем кристаллический сульфат аммония до полного насыщения. Образуется осадок яичного альбумина. Который всплывает вверх вследствие высокой плотности жидкости. Осаждение белков солями является обратимым процессом и при добавлении воды белки снова растворяются.

Результаты опыта и выводы оформляют в виде таблицы:

Принцип метода: Очень удобным методом очистки белковых растворов от низкомолекулярных примесей, например от избытка солей после высаливания, является диализ.

Диализом называют процесс разделения высокомолекулярных и низкомолекулярных веществ с помощью полупроницаемых мембран (коллодий, целлофан, пергамент и т.д.). Обладая большим диаметром, белковые молекулы не способны проникать через такие мембраны, в то время как частицы низкомолекулярных веществ легко проходят через них.

Ход работы: В пробирку наливают 1 мл раствора яичного альбумина и прибавляют к раствору 1 мл насыщенного раствора сульфата аммония. Образовавшийся осадок отделяют фильтрованием, переносят в пробирку и растворяют физиологическим раствором.

Из листа целлофана, предварительно смоченного дистиллированной водой, делают мешочек (диализатор) и выливают в него содержимое пробирки.

Края мешочка зажимают между двумя стеклянными палочками, прижатыми друг к другу резиновыми колечками, надетыми на концы палочек. Мешочек помещают в стакан с дистиллированной водой, укладывая палочки, зажимающие мешочек, на края стакана. Необходимо проследить за тем, чтобы уровень жидкости в мешочке был ниже уровня жидкости в стакане.

Через 1 час после диализа берут в две пробирки по 1 мл жидкости из стакана и проделывают две реакции:

а) на присутствие SO₄ 2- : добавляют в первую пробирку 3 – 4 капли 5%-ного раствора BaCl₂ .

б) на присутствие белка: проделывают биуретовую реакцию.

Жидкость из мешочка сливают в пробирку ( диализат), отмеривают 10 капель диализата и с ним тоже проделывают биуретовую реакцию.

Дата добавления: 2016-11-24 ; просмотров: 254 | Нарушение авторских прав

источник