Меню Рубрики

Определение первичной структуры белка аминокислотный анализ

Для определения природы С-концевой аминокислоты часто используют ферментативные методы. Обработка полипептида карбоксипептидазой, которая разрывает пептидную связь с того конца пептида, где содержится свободная СООН-группа, приводит к освобождению С-концевой аминокислоты, природа которой может быть идентифицирована методом хроматографии.

Предложен также химический метод Акабори (S. Akabori), который основан на гидразинолизе полипептида:

Гидразин, вызывая распад чувствительных к нему пептидных связей полипептида, реагирует со всеми аминокислотами, за исключением С-концевой аминокислоты, поскольку ее карбоксильная группа не участвует в образовании пептидной связи. При этом образуется смесь аминоацил-гидразинов и свободной С-концевой аминокислоты. Последнюю после обработки всей смеси ДНФБ отделяют и идентифицируют хроматографи-чески, для чего образовавшиеся динитрофенилпроизводные аминоацил-гидразинов предварительно экстрагируют уксусно-этиловым эфиром.

С-концевую аминокислоту идентифицируют также путем обработки полипептида восстанавливающим агентом, например боргидридом натрия. В простейшей форме эту процедуру можно представить в следующем виде:

Видно, что в указанных условиях только одна, а именно С-концевая, аминокислота будет превращаться в α-аминоспирт, легко идентифицируемый методом хроматографии. Таким образом, при помощи указанных методов определяют природу N- и С-концевых аминокислот.

Следующий этап работы связан с определением чередования (последовательности) аминокислот внутри полипептидной цепи. Для этого сначала проводят избирательный, частичный (химический и ферментативный), гидролиз полипептидной цепи на короткие пептидные фрагменты, последовательность аминокислот в которых может быть точно определена описанными ранее методами.

Химические методы избирательного и неполного гидролиза основаны на применении таких химических реактивов, которые вызывают селективный, высокоспецифический разрыв пептидных связей, образованных определенными аминокислотами, оставляя незатронутыми остальные пептидные связи. К этим избирательно гидролизующим веществам относятся цианогенбромид, CNBr (по остаткам метионина), гидроксиламин (по связям между остатками аспарагиновой кислоты и глицина), N-бромсукцинамид (по остаткам триптофана). Метионина в составе белков содержится обычно меньше, чем других аминокислот, поэтому обработка CNBr предпочтительнее, так как при этом образуется небольшое число пептидов, первичную структуру которых определяют с помощью рассмотренных ранее методов, всякий раз начиная с определения природы N- и С-концевых аминокислот.

Ферментативные методы гидролиза основаны на избирательности действия протеолитических (вызывающих распад белков) ферментов, расщепляющих пептидные связи, образованные определенными аминокислотами. В частности, пепсин ускоряет гидролиз связей, образованных остатками фенилаланина, тирозина и глутаминовой кислоты, трипсин – аргинина и лизина, химотрипсин – триптофана, тирозина и фенилаланина. Ряд других ферментов, например папаин, субтилизин, проназа и другие бактериальные протеиназы, также используется для неполного гидролиза белков. В результате полипептидная цепь расщепляется на мелкие пептиды, содержащие иногда всего несколько аминокислот, которые отделяют друг от друга сочетанными электрофоретическими и хроматографическими методами, получая своеобразные пептидные карты. Далее определяют чередование аминокислот в каждом индивидуальном пептиде. Завершается работа воссозданием первичной структуры полной полипептидной цепи на основании определения последовательности аминокислот в отдельных пептидах.

Метод составления пептидных карт, получивший образное название «метод отпечатков пальцев», используется при определении сходства или различия гомологичных белков по первичной структуре. Белок инкубируют с каким-либо протеолитическим ферментом. Часто порции белка инкубируют как с пепсином, так и с трипсином. При этом вследствие гидролиза строго определенных пептидных связей образуется смесь коротких пептидов, легко разделяемых с помощью хроматографии в одном направлении и электрофореза – в другом , под углом 90° от первого (пептидная карта).

Дальнейшие задачи – установление последовательности расположения аминокислот в каждом из выделенных пептидов (фенилтиогидантоиновым или другими методами), сопоставление полученных данных и установление первичной структуры всей молекулы.

Возможность применения рентгеноструктурного анализа для определения последовательности аминокислот в белковой молекуле была рассмотрена ранее. Следует отметить совершенно новый подход к решению этой важной проблемы – определение последовательности аминокислот в белковой молекуле с использованием данных о комплементарной нуклеотидной последовательности ДНК. Этому способствуют как методы быстрого секвенирования ДНК, так и техника изолирования и доступности самого гена.

В настоящее время выяснение первичной структуры белков является вопросом времени и технического оснащения лабораторий. Полностью выяснена первичная структура многих природных белков и прежде всего инсулина, содержащего 51 аминокислотный остаток [Сэнджер Ф., 1954]. Более крупным белком с выясненной первичной структурой оказался иммуноглобулин, в четырех полипептидных цепях которого насчитывается 1300 аминокислотных остатков. За эту работу Дж. Эдельман и Р. Портер были удостоены Нобелевской премии (1972).

Рис. 1.14. Структура проинсулина.

Расшифрованы первичные структуры миоглобина человека (153 аминокислотных остатка), α-цепи (141) и β-цепи (146) гемоглобина человека, цитохрома С из сердечной мышцы человека (104), лизоцима молока человека (130), химотрипсиногена быка (245) и многих других белков, в том числе ферментов и токсинов. На рис. 1.14 представлена последовательность аминокислотных остатков проинсулина. Видно, что молекула инсулина (выделена темными кружками), состоящая из двух цепей (А – 21 и В – 30 аминокислотных остатков), образуется из своего предшественника – про-инсулина (84 аминокислотных остатка), представленного одной полипептидной цепью, после отщепления от него пептида, состоящего из 33 аминокислотных остатков. Строение молекулы инсулина (51 аминокислотный остаток) схематически можно представить следующим образом:

Между цепями А и В и внутри А-цепи инсулина образуются дисуль-фидные (—S—S—) связи. Выяснена первичная структура более 18 инсули-

нов, выделенных из разных источников. Близкими по первичной структуре оказались инсулины из поджелудочной железы человека, свиньи и кашалота. Единственным отличием инсулина человека является нахождение треонина в положении 30 В-цепи вместо аланина.

Вторым белком, первичная структура которого расшифрована С. Муром и У. Стейном, является рибонуклеаза (рис. 1.15) из поджелудочной железы, катализирующая расщепление РНК. Фермент состоит из 124 аминокислотных остатков с N-концевым лизином и С-концевым валином, между остатками цистеина образуются дисульфидные (—S—S—) связи в 4 участках.

Полностью расшифрована последовательность аминокислот полипептидной цепи фермента лизоцима, имеющего важное защитное и медицинское значение, так как он вызывает лизис ряда бактерий, расщепляя основное вещество их клеточной оболочки. Лизоцим белка куриного яйца содержит 129 аминокислот (рис. 1.16) с N-концевым лизином и С-концевым лейцином.

Отечественными исследователями установлена первичная структура многих белков и полипептидов, в том числе крупного белка РНК-полимера-зы (в частности, последовательности ее β- и β 1 -субъединиц, 1342 и 1407 аминокислотных остатков соответственно фактора элонгации G из Е.coli (701 аминокислота) (Ю.А. Овчинников и др.), фермента аспартатамино-трансферазы, состоящей из 412 аминокислотных остатков (А.Е. Браун-штейн, Ю.А. Овчинников и др.), леггемоглобина, белка L25 из рибосом E.coli, нейротоксинов из яда кобры (Ю.А. Овчинников и др.), пепсиногена и пепсина (В.М. Степанов и др.), L-липотропина и лактогенного гормона быка (Н.А. Юдаев, Ю.А. Панков) и др.

Рис. 1.15. Первичная структура РНКазы. Цветом выделены четыре дисульфидные связи.

Рис. 1.16. Первичная структура полипептидной цепи лизоцима (схема).

Исследования первичной структуры α- и β-цепей гемоглобина способствовали выяснению структуры необычных, так называемых аномальных, гемоглобинов, встречающихся в крови больных гемоглобинопатиями. Иногда развитие болезни, как и изменение пространственной структуры гемоглобина человека, обусловлено заменой лишь одной какой-либо аминокислоты в структуре β-цепей (реже α-цепей) гемоглобина (см. главу 2).

Анализ данных о первичной структуре белков позволяет сделать следующие общие выводы.

1. Первичная структура белков уникальна и детерминирована генетически. Каждый индивидуальный гомогенный белок характеризуется уникальной последовательностью аминокислот: частота замены аминокислот приводит не только к структурным перестройкам, но и к изменениям физико-химических свойств и биологических функций.

2. Стабильность первичной структуры обеспечивается в основном глав-новалентными пептидными связями; возможно участие небольшого числа дисульфидных связей.

3. В полипептидной цепи могут быть обнаружены разнообразные комбинации аминокислот; в полипептидах относительно редки повторяющиеся последовательности.

4. В некоторых ферментах, обладающих близкими каталитическими свойствами, встречаются идентичные пептидные структуры, содержащие неизменные (инвариантные) участки и вариабельные последовательности аминокислот, особенно в областях их активных центров. Этот принцип структурного подобия наиболее типичен для ряда протеолитических ферментов: трипсина, химотрипсина и др. (см. главу 4).

5. В первичной структуре полипептидной цепи детерминированы вторичная, третичная и четвертичная структуры белковой молекулы, определяющие ее общую пространственную конформацию.

источник

ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ

Все белки различаются по своей первичной структуре. Установление первичной структуры белка служит основой для определения вторичной и третичной структур, выяснения расположения функциональных групп в его активном центре и открывает путь к познанию механизма его функционирования.

Первичную структуру белков можно определять путем непосредственного анализа аминокислотной последовательности или путем расшифровки нуклеотидной последовательности соответствующих генов с помощью генетического кода.

При записи последовательности аминокислот в полипептидных цепях используется однобуквенное или трехбуквенное сокращение и предполагается, что a -аминогруппа находится слева, а a -карбоксильная группа — справа от символа, т. е. полипептидная цепь начинается с остатка, имеющего свободную a -аминогруппу, и заканчивается остатком, имеющим свободную карбоксильную группу. Аминокислотные остатки—называются соответственно N-концевым и С-концевым остатком.

В качестве примера использования сокращенной символики и для демонстрации ее преимуществ приведены структуры гормона вазопрессина, который производится гипофизом и регулирует кровяное давление, сужая капилляры и усиливая ресорбцию воды в почках.

Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2 или C YFQNCPR G-NH2

Рис. 1. Молекула вазопрессина:

а)—записанная с помощью трехбуквенной символики; б) записанная с помощью однобуквенной символики. Линия, соединяющая символы остатков цистеина в формуле, означает наличие между ними дисульфидного мостика; С-концевая карбоксильная группа аминокислоты амидирована

Исследование первичной структуры белка начинается с определения его молекулярной массы, аминокислотного состава, N — и С-концевых аминокислотных остатков. Поскольку пока не существует метода, позволяющего установить полную первичную структуру белка на целой молекуле, полипептидную цепь подвергают специфичному расщеплению химическими реагентами или протеолитическими ферментами. Смесь образовавшихся пептидных фрагментов разделяют, и для каждого из них определяют аминокислотный состав и аминокислотную последовательность. После того как структура всех фрагментов установлена, необходимо выяснить порядок их расположения в исходной полипептидной цепи. Для этого белок подвергают расщеплению при помощи другого агента и получают второй, отличный от первого набор пептидных фрагментов, которые разделяют и анализируют аналогичным образом.

Предположим, что исследуемый модельный полипептид имеет последовательность представленную на рис.2. При действии на него трипсином гидролизуются связи: Lys Val и Arg Ser , а при обработке бромцианом ( BrCN ) расщепляются связи: Met Tyr и Met Ala .

Полная аминокислотная последовательность модельного полипептида

Сопоставление аминокислотных последовательностей бромциановых и триптических пептидов позволяет однозначно выяснить их расположение вдоль полипептидной цепи белка. Обычно для определения полной структуры белка двух гидролизатов оказывается недостаточно, причем чем длиннее полипептидная цепь белковой молекулы, тем большее число различных типов расщеплений белка приходится использовать.

На завершающей стадии исследования первичной структуры белка проводится определение положения дисульфидных мостиков, если таковые имеются. Образование дисульфидных мостиков происходит при окислении двух остатков цистеина в составе уже сформированных пептидных цепей. В результате из двух остатков цистеина образуется остаток диаминодикарбоновой кислоты цистина:

При этом возникает сшивка либо внутри одной полипептидной цепи, либо между двумя различными цепями. В качестве примера небольшого белка, имеющего две полипептидные цепи (А- и В-цепь), скрепленные дисульфидными мостиками, а также сшивки внутри отдельных цепей, можно привести молекулу инсулина (рис. 3) — гормона, вырабатываемого поджелудочной железой и ответственного за усвоение углеводов, в первую очередь глюкозы. Нарушения в синтезе инсулина вызывают тяжелое и, к сожалению, весьма распространенное заболевание—сахарный диабет, при развитых формах которого необходимо ежедневно вводить в организм этот гормон.

FYNQHLC GSHLVEALY L V C GERGFFYTPKA ( В цепь )

Рис. 3. Схема строения молекулы инсулина человека в однобуквенной символике.

Скобкой обозначен внутрицепочечный, а вертикальными линиями — межцепочечные дисульфидные связи

Развитие методов анализа последовательности ДНК сделало возможным на основе генетического кода выводить соответствующие аминокислотные последовательности, исходя из установленных нуклеотидных. При реализации такого подхода следует, однако, иметь в виду целый ряд ограничений и возможные источники ошибок. Во-первых, выведенная из нуклеотидной аминокислотная последовательность может не соответствовать реальной, вследствие процессинга, который часто происходит как на уровне информационной РНК, так и при превращении белка-предшественника в конечный белок. Во-вторых, лишь одна ошибка в определении последовательности ДНК (пропуск или вставка) приводит к выведению совершенно неправильной аминокислотной последовательности белка. Таким образом, установление первичной структуры ДНК не всегда может заменить непосредственное исследование аминокислотной последовательности кодируемого ею белка. В то же время параллельное изучение первичных структур белка и ДНК чрезвычайно эффективно. Установление нуклеотидной последовательности дает возможность расположить изученные пептидные фрагменты в непрерывную полипептидную цепь, позволяя решать, таким образом, наиболее сложную задачу структурного анализа белка. С другой стороны, данные по аминокислотной последовательности пептидов упрощают и уточняют анализ нуклеотидной последовательности.

Читайте также:  Значение с реактивного белка в анализах

В последние годы анализ первичной структуры белков на основе исследования нуклеотидной последовательности соответствующих генов принимает все большие масштабы. Первоначально такие исследования касались белков прокариотических организмов, в основном E . coli , генетика которых хорошо изучена, и получение структурных генов не представляло большого труда. По мере развития методов генетической инженерии появилась возможность выделять также структурные гены белков эукариот.

Во многих ведущих лабораториях мира созданы так называемые «банки» или «библиотеки» генов многих высших животных и человека. В этих банках гены разнообразных белков хранятся в составе специальных векторов — плазмид или фагов. Для выделения соответствующего гена из банка используются гибридизационные зонда — небольшие нуклеотидные фрагменты, синтезированные на основе установленной аминокислотной последовательности пептидов исследуемого белка. Из-за «вырожденности» генетического кода могут использоваться не любые последовательности.. Подходящими являются пептиды, содержащие в своем составе аминокислоты, представленные одним или двумя кодонами, поскольку в этом случае минимально число различных вариантов олигонуклеотидов, способных кодировать данный пептид. Оптимальными являются пептиды, содержащие остатки метионина и триптофана, кодируемые уникальными кодонами. Поэтому особое значение приобретают исследования по выделению и изучению таких пептидов. Имеются и другие методические подходы для выделения структурных генов белков, связанные, в частности, с их способностью в определенных условиях экспрессироваться.. Синтезируемый в результате экспрессии белок может быть идентифицирован, например, с помощью иммунохимических методов.

Определение аминокислотного состава.

Анализ аминокислотного состава включает полный кислотный гидролиз исследуемого белка или пептида с помощью 5,7н соляной кислоты и количественное определение всех аминокислот в гидролизате. Гидролиз образца проводится в запаянных ампулах в вакууме при 110 0 в течение 24 часов. При этом полностью разрушается триптофан и частично серии, треонин, цистин и цистеин, а глутамин и аспарагин превращаются в глутаминовую и аспарагиновую кислоты соответственно. В то же время пептидные связи, образованные аминокислотными остатками с разветвленной боковой цепью (Val, Ile, Leu), из-за стерических препятствий гидролизуются частично. Особенно стабильны связи Val-Val, Ile-Ile, Val-Ile, Ile-Val и т . п .

С целью более надежного определения аминокислотного состава белка проводится параллельный гидролиз в течение 24, 48 и 96 часов, и все пробы далее количественно анализируются. Для валина, лейцина и изолейцина берутся максимальные значения, а для серина и треонина полученные значения экстраполируются к нулевому времени. При анализе содержания в белке триптофана вместо соляной кислоты для гидролиза используется 4н метансульфоновая кислота (СН3-SО3). Триптофан можно идентифицировать спектрофотометрически или с помощью цветных реакций.

Обычно при определении аминокислотного состава белка ограничиваются анализом суммарного содержания глутамина и глутаминовой кислоты, аспарагина и аспарагиновой кислоты, а их дифференциация проводится в процессе установления первичной структуры. Цистеин и цистин анализируются в виде цистеиновой кислоты или карбоксиметилцистеина.

Количественное определение аминокислот в гидролизате белка или пептида проводится с помощью аминокислотного анализатора — прибора, разработанного в 1958 году С.Муром и У.Стенном. Смесь аминокислот разделяется методом ионообменной хроматографии на колонке, заполненной сульфированной полистирольной смолой. Колонка промывается буферными растворами с последовательным повышением их рН и молярности. Время удерживания каждой аминокислоты строго определенно и зависит от степени ее ионизации.

Постколоночная модификация. Выходящий с колонки элюат смешивается с раствором нингидрина и в специальной ячейке нагревается до 100°С. Интенсивность образущейся окраски измеряется сначала в одном калориметре при 570 нм. а затем в другом, где при 440 нм определяется концентрация пролина и оксипролина. В 1972 г. в качестве селективного флуорогенного реагента на первичные амины был предложен флуорескамин, а несколько позже он стал использоваться для модификации аминокислот после их выхода с колонки аминокнслотного анализатора. Получаемая при этом чувтвительность определения в 10-100 раз превышает возможности нингидринового метода. Широкому распространению флуорескамина помешали его нестабильность в водной среде и высокая стоимость. Этих недостатков лишен введенный в практику почти одновременно с флуорескамином о-фталевый альдегид (ОФА), но с его помощью нельзя определить пролин и вторичные амины.

Предколоночная модификация. Реакция фенилизотиоцианата (ФИТЦ) с аминокислотами изучена детально, поскольку она лежит в основе метода Эдмана (рис.5). Первая стадия этой реакции — образование фенилтиокарбамильных (ФТК) производных — используется для количественного определения аминокислот в гидролизате белка в PICO — TAG -анализаторе ( Waters ). ФТК-аминокислоты стабильны, легко синтезируются и успешно идентифицируются методом ВЭЖХ на обращенной фазе. В этих же целях можно использовать реакции аминокислот с ОФА и дансилхлоридом (рис.4). Однако, воспроизводимость результатов уступает достигаемой в постколоночном методе.

Определение чистоты препарата белка с помощью N-концевого анализа

Анализ концевых остатков играет важную роль в процессе определения аминокислотной последовательности белка. На первом этапе исследования он дает возможность судить о числе полипептидных цепей, составляющих молекулу белка, и о чистоте исследуемого препарата. На последующих этапах с помощью анализа N-концевых аминокислотных остатков осуществляется контроль за процессом разделения пептидных фрагментов.

Один из первых методов определения N-концевых аминокислотных остатков был предложен Ф. Сэнгером в 1945 году — динитрофенильный метод — заключающийся в реакции a -аминогруппы белка или пептида с 2,4-динитрофторбензолом. При этом образуется динитрофенильное производное (ДНФ) окрашенное в желтый цвет. Последующий кислотный гидролиз 5,7н соляной кислотой (НС l ) приводит к разрыву пептидных связей и образованию ДНФ-производного N-концевой аминокислоты, которое экстрагируется эфиром и идентифицируется методом тонкослойной хроматографии в присутствии стандартов.

В настоящее время наибольшее применение находит метод дансилирования, разработанный в 1962 году В. Греем и Б. Хартли. Метод основан на введении в a -аминогруппу белка «флуоресцентной метки», устойчивой в условиях полного расщепления белка до аминокислот при кислотном гидролизе.

Первая стадия: 1-диметиламинонафталин-5-сульфохлорид (дансилхлорид, ДНС-С1) реагирует с непротонированной
a -аминогруппой пептида (и с боковыми группами цистеина, тирозина, лизина и гистидина) с образованием дансильного производного пептида (ДНС-пептида). Эта реакция проводится в щелочной среде в смешанном водно-органическом растворителе (органический компонент для растворения ДНС-С1). В этих условиях конкурируют два процесса: дансилирование и гидролиз дансилхлорида до кислоты (ДНС-ОН), а степень модификации пептида определяется соотношением скоростей протекания этих процессов (рис.4). Присутствие следовых количеств солей аммония привносимых с соответствующими буферами приводит к образованию, в процессе реакции, дансиламида (ДНС- NH 2).

Вторая стадия: кислотный гидролиз модифицированного ДНС-пептида приводит к разрыву пептидных связей и образованию ДНС-производного N-концевой аминокислоты. Гидролиз проводится в 5,7н соляной (НС1) кислоте в течение 4-16 час при 110 0 С или смесью 5.7 н НС l и концентрированной трифторуксусной (ТФУ) кислот в соотношении 1:2 — 50мин при 166 0 С. Из производных, образующихся по боковым группам после гидролиза сохраняются e -ДНС-лизин и о-ДНС-тирозин.

Производные ДНС-аминокислот обладают интенсивной флуоресценцией в ультрафиолетовой области спектра ( l 366 нм) и обычно для их идентификации используют как высокоэффективную двумерную тонкослойную хроматографию (ВЭТСХ) на силикагеле или полиамиде, так и ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой, при этом достаточно иметь 0,05-0,5 нмоль вещества. В условиях жесткого кислотного гидролиза полностью разрушаются ДНС-триптофан и происходит дезаминирование остатков дикарбоновых кислот, которые превращаются соответственно в ДНС-апарагиновую и ДНС-глутаминовую аминокислоту. Степень разрушения ДНС-пролина, ДНС-серина и ДНС-треонина возрастает по мере увеличения времени гидролиза.

В то же время связи, образованные остатками валина, лейцина и изолейцина обладают повышенной устойчивостью к гидролизу. Образующиеся при этом дансилдипептиды (ДНС- Ile — Ile , ДНС- Ile — Val , ДНС- Val — Leu и т.п.) на хроматограмме могут быть ошибочно приняты за дансиламинокислоты. Правильность идентификации может быть проверена с помощью более продолжительного гидролиза (24час).

Определение аминокислотной последовательности белков с помощью метода Эдмана

Основным методом определения аминокислотной последовательности является метод деградации полипептидной цепи белка с помощью фенилизотиоцианата (ФИТЦ), разработанный П. Эдманом в 1950-1956г.г. Метод Эдмана позволяет последовательно отщеплять N -концевые аминокислотные остатки в виде фенилтиогидантоинов аминокислот (ФТГ).

Каждый цикл деградации включает три стадии: (рис.6)

I стадия — конденсация , образование фенилтиокарбамил пептида (ФТК-пептид);

II стадия — циклизация, отщепление N -концевого остатка аминокислоты и его циклизация в 2-анилино-5-тиазолинон;

III стадия — изомеризация , 2-анилино-5-тиазолинон N -концевого остатка аминокислоты изомеризуется в фенилтиогидантоин, который в дальнейшем идентифицируется.

Первая стадия . На первой стадии реакции происходит присоединение фенилизотиоцианата (ФИТЦ) к a -аминогруппе пептида с образованием фенилтиокарбамильного производного пептида (ФТК-пептида). Реакция проводится в летучих буферных системах при рН 9,0-9,5, в качестве оснований используются тритичные и ароматические амины (триэтиламин, триметиламин, N -метилпипиридин, пиридин). Выход на этой стадии может существенно снижаться вследствие побочных реакций. Такими реакциями являются окислительное десульфирование ФТК-группы пептида под действием кислорода воздуха, блокирование a -аминогруппы пептида за счет образования оснований Шиффа со следовыми количествами альдегидов, присутствующих в реагентах и растворителях. Поэтому все стадии деградации пептидов проводятся в атмосфере инертного газа, а используемые реагенты предварительно тщательно очищаются. В щелочных условиях ФИТЦ гидролизуется с образованием моно- и дифенилтиомочевины и анилина. Избыток реагентов и побочных

продуктов удаляется экстракцией органическими растворителями (этилацетатом и хлорбунаном).

Вторая стадия . На второй стадии деградации в присутствии безводной сильной трифторуксусной кислоты отщепляется N-концевой остаток в виде 2-анилино-5-тиазолинона и образуется укороченный на одну аминокислоту пептид со свободной a -аминогруппой следующего остатка. Условия реакции обычно не вызывают неспецифического расщепления полипептидной цепи белка. Однако остаток глутамина, когда он становится N-концевым в пептиде, может превращаться в остаток пироглутаминовой кислоты, блокирующий дальнейшую деградацию. В случае последовательности Asn — Gly возможна перегруппировка, при которой образуется циклический имид ангидрида аспартилглицила (рис.6). Возможна также 0—N-ацильная миграция у остатков ацилсерина и ацилтреонина, которая приводит к блокированию процесса расщепления.

Третья стадия . Изомеризация — состоит из быстрого гидролиза тиазолинона в производное фенилтиокарбамил аминокислоты (ФТК-аминокислота), а затем циклизация последнего в фенилтиогидантоин N -концевого остатка аминокислоты (ФТГ-аминокислота).

Способ обнаружения ФТГ-производных аминокислот основан на их сильной абсорбции в УФ-области спектра с максимумом поглащения 265-270 нм (среднее значение молярного коэффициента экстинкции равно 16000).

Повторное, цикл за циклом, проведение реакции Эдмана с одновременной идентификацией ФТГ-производного отщепляемой аминокислоты («прямой» Эдман) позволяет устанавливать аминокислотную последовательность исходного белка или пептида.

В 1972 г. В.Греем было предложено использовать метод Эдмана в сочетании с реакцией дансилирования (ДНС-Эдман). С этой целью после каждого цикла отщепления по Эдману отбирается небольшая проба образца (аликвота) и анализируется N-концевой остаток укороченного пептида с помощью реакции дансилирования. Этот подход выгодно отличается от «прямого» Эдмана, так как при этом отсутствует стадия промывки (экстракции), удаляющая избыток реагентов и побочных продуктов, образовавшихся в процессе реакции конденсации, что позволяет исключить возможные потери пептидов (особенно неполярных) за счет их растворения в органическом расворителе. Постепенное уменьшение количества анализируемого материала (в результате отбора аликвот) компенсируется более высокой чувствительностью определения флуоресцирующих производных аминокислот.

Определения С-концевой последовательности белков с помощью карбоксипептидаз

Ферментативный метод основан на использовании карбоксипептидаз (экзопептидазы класса гидролаз), которые атакуют в молекуле белка связи, расположенные по соседству со свободными a -карбоксильными группами, и отщепляют последовательно по одному остатку аминокислоты с С-конца полипептидной цепи. Изучая кинетику отщепления аминокислот карбоксипептидазами, можно получить информацию о последовательности расположения их на С-концевом участке молекулы белка или пептида. При исследовании структуры белков используется несколько типов карбоксипептидаз (А, В, С, Р, Y ), которые различаются по скорости отщепления индивидуальных аминокислот. Карбоксипептидаза А (из поджелудочной железы крупного рогатого скота) отщепляет с наибольшей скоростью аминокислоты с ароматической и длинной алифатической боковой цепью: Phe , Tyr , Trp , Leu , Ile , Met , Val . С меньшими скоростями отщепляются Thr, Gln, His, Ala, HSer, Asn, Ser, Lys. Очень медленно высвобождаются Gly , Glu , Asp , Cys — SO 3 H , KM — Cys и совсем не гидролизуются связи образованные С-концевыми Pro и Arg . Карбоксипептидаза В (из поджелудочной железы свиньи) быстрее всех других отщепляет основные аминокислоты — лизин, аргинин, орнитин и не отщепляет С-концевой Pro . Пептидная связь, образованная остатком аргинина, гидролизуется быстрее, чем связь, образованная остатком лизина. Оптимальным значением рН для карбоксипептидаз А и В являются рН 7,5-8,5. Оно меняется в зависимости от субстрата. Так при снижении рН до 5,0 возрастает скорость отщепления С-концевых дикарбоновых аминокислот, тогда как при рН более 9,0 возрастает скорость отщепления лизина и гистидина. Карбоксипептидаза С ( выделена из ряда растительных источников, включая цитрусовые ) Этот фермент соединяет в себе специфичность карбоксипептидаз А и В и в то же время может отщеплять С-концевой Pro . Скорости высвобождения приблизительно одинаковы для всех аминокислот, за исключением Gly, который выщепляется очень медленно . Карбоксипептидаза Р ( получена из Aspergillus и Penicillum ) Она активна при рН 2,5 и имеет специфичность, сходную с таковой для карбоксипептидазы С. Карбоксипептидаза Y (из пекарских дрожжей) отщепляет, практически все аминокислоты, включая Pro . Гидролиз проходит наиболее эффективно при рН 5,5 — 6 , 5. Оптимальное значение рН для отцепления лизина и аргинина = 7,0.

Читайте также:  Сдать анализ на непереносимость белков молока

При работе с карбоксипептидазами следует учитывать следующие основные проблемы: 1) многие препараты панкреатических ферментов А и В содержат эндонуклеазы (трипсин, химотрипсин), которые следует инактивировать добавлением диизопропилфторфосфата( DIPF ); 2) следует учитывать различие в скоростях отщепления отдельных аминокислот, зависящее как от природы боковой цепи у отщепляемого остатка, так и от природы аминокислоты расположенной в соседнем положении. Отщепление С-концевой аминокислоты значительно ускоряется, если перед ней находится остаток с ароматической или алифатической боковой цепью. Напротив, если в соседнем положении находится глицин, пролин, глутаминовая кислота, то скорость гидролиза снижается; 3) возникают осложнения и в случае, когда в С-концевой последовательности стоят подряд несколько остатков одной и той же аминокислоты. Поэтому при использовании карбоксипептидаз, надежно, удается вывести последовательность не более чем трех-пяти аминокислотных остатков, расположенных в белке в С-концевом положении.

Количество анализируемого материала зависит от чувствительности используемого метода идентификации. Освобождающиеся аминокислоты определяют или методом дансилирования с последующей ВЭТСХ, или количественно на аминокислотном анализаторе. Результаты представляют в виде графика зависимости количества отщепившейся аминокислоты (моль/моль белка) от времени (рис.7). Скорость появления освобождающихся аминокислот во времени позволяет сделать вывод о С-концевой последовательности белка.

(рис. 7) Отщепление аминокислот альдолазы

мышцы кролика карбоксипсптидазой А

Перед проведением количесвенного анализа следует убедиться, что отщепление действительно происходит, подобрать оптимальное соотношение фермента и субстрата, подобрать продолжительность расщепления. Для белков обычно необходимы предварительная денатурация и перевод в растворенное состояние. Для плохо растворимых белков расщепление можно проводить в 6М мочевине или в 0,05М додецилсульфате натрия ( SDS ). В обычном эксперименте образец белка инкубируют с карбоксипептидазами в подходящем буферном растворе (0,2М N-этилморфолинацетатном, 0,1М Na -бикарбонатном, аммоний-бикарбонатном, 0,05М пиридин-ацетатном и т.п.). Если в ходе предварительного эксперимента обнаруживается высвобождение многих аминокислот, то следует использовать соотношение фермент:субстрат 1:100 или 1:200 (по весу) и/или проводить отщепление при комнатной температуре. Если аминокислоты высвобождаются медленно, то следует увеличить соотношение фермент:субстрат 1:20 или 1:10 (по весу) и температуру до 37 0 С.

Структура a -аминокислот, наиболее часто встречающихся в белках

источник

Определение первичной структуры белков

Глава 7. Методы исследования белков

7.3. Определение первичной структуры белков

Определение первичной структуры белков сводится к выяснению порядка расположения аминокислот в полипептидной цепочке. Эту задачу решают с помощью метода секвенирования (от англ. sequence последовательность).

Собственно секвенирование на его сегодняшнем уровне позволяет определить аминокислотную последовательность а полипептидах, размер которых не превышает несколько десятков аминокислотных остатков. В то же время исследуемые полипептидные фрагменты значительно короче тех природных белков, с которыми приходится иметь дело. Поэтому необходимо предварительное разрезание исходного полипептида на короткие фрагменты. После секвенирования полученных фрагментов их необходимо снова сшить в первоначальной последовательности.

Таким образом определение первичной последовательности белка сводится к следующим основным этапам:
1) Расщепление белка на несколько фрагментов длиной, доступной для секвенирования.
2) Секвенирование каждого из полученных фрагментов.
3) Сборка полной структуры белка из установленных структур его фрагментов.

Для специфического расщепления белков по определенным точкам применяются как ферментативные, так и химические методы. Из ферментов, катализирующих гидролиз белков по определенным точкам, наиболее широко используют трипсин и химотрипсин. Трипсин катализирует гидролиз пептидных связей, расположенных после остатков лизина и аргинина. Химотрипсин преимущественно расщепляет белки после остатков ароматических аминокислот — фенилаланина, тирозина и триптофана. При необходимости специфичность трипсина может быть повышена или изменена. Например, обработка цитраконовым ангидридом исследуемого белка приводит к ацилированию остатков лизина. В таком модифицированном белке расщепление будет проходить только по остаткам аргинина.

Наряду с ферментативными методами используются и химические методы расщепления белков. Для этой цели часто применяют бромциан, расщепляющий белок по остаткам метионина:

Секвенирование проводят методом, известным как метод Эдмана. Последовательная обработка полипептида, имеющего свободную концевую -аминогруппу, каким-либо алкил- или арилизотиоцианатом в слабощелочной среде приводит к образованию соответствующей тиомочевины, которая в умеренно кислой среде приводит (при значениях кислотности, не повреждающих пептидной связи) отщепляется в виде соответствующего тиогидантоина. Оригинальная процедура Эдмана основана на использовании фенилизотиоцианата и тем самым на образовании фенилтиогидантоинов:

В результате образуется фенилтиогидантоин, содержащий боковой радикал аминокислоты R 1 , который может быть идентифицирован путем измерения какой-либо физической или физико-химической характеристики, позволяющей различать гидантоины, соответствующие разным входящим в состав белков аминокислотам. В качестве такой характеристики может служить хроматографическая подвижность в какой-либо предварительно проградуированной по стандартным образцам гидантоинов системе или молекулярная масса, определяемая с помощью масс-спектрометра.

Превращение N-концевого аминокислотного остатка в тиогидантоин приводит к укорочению анализируемой полипептидной цепи на одно звено. Выделив этот пептид, исследователь получает возможность повторить всю процедуру, установить природу второго аминокислотного остатка и выделить полипептид, укороченный на два звена. Многократное повторение такой ступенчатой деградации дает возможность последовательно идентифицировать все составляющие исходный полипептид остатки аминокислот, т.е. установить его первичную структуру. Практически метод Эдмана позволяет сделать один-два десятка шагов. Работа сводится к многократному повторению одних и тех же чередующихся процедур: добавления изотиоцианата, отщепления тиогидантоина, отделения его от укороченного пептида для последующей идентификации, выделение оставшегося полипептида в виде пригодном для следующего шага обработки. Чтобы избавить исследователей от такой монотонной работы, требующей вместе с тем строгого соблюдения условий эксперимента на каждом шаге, созданы специальные автоматизированные установки для проведения всех перечисленных операций — автоматические секвенаторы полипептидов. С их помощью удается произвести до 40-60 шагов ступенчатой деградации.

Завершающим этапом установления первичной структуры белка является восстановление порядка, в котором просеквенированные фрагменты располагались в исходном полипептиде. Чаще всего для этой цели используют подход изветный как метод перекрывающихся белков. Ниже излагается основная идея метода.

Если установлена структура всех полипептидов, полученных расщеплением исследуемого белка с помощью трипсина (далее такие полипептиды обозначаются буквой Т от слова «трипсиновые»), то остается определить для каждого из этих пептидов, с какими двумя Т-пептидами он соседствует с N- и С-конца. В структуре просеквенированных Т-пептидов такая информация полностью отсутствует. Однако ее можно частично, а в ряде случаев и полностью восстановить, если располагать аналогичными данными для серии полипептидов, полученных расщеплением того же исследуемого белка по какой-либо другой группе аминокислотных остатков. Для определенности ниже речь будет идти о полипептидах, полученных расщеплением химотрипсином (пептиды группы С, chymotryptic).

Как видно из рисунка, если два Т-пептида являются соседними в исходной цепи, то существует С-пептид, который либо содержит в своем составе полностью оба или один из рассматриваемых Т-пептидов, либо как минимум содержит С-концевую часть левого и N-концевую часть правого пептида группы Т. этот С-пептид перекрывает два соседних Т-пептида, с чем и связано название метода.

Таким образом, просматривая структуры пептидов Т и С, можно для любой пары Т-пептидов выявить, являются ли они соседями в исследуемом белке или разделены одним или несколькими другими Т-пептидами. Неоднозначность может появиться только в том случае, если перекрываемый каким-либо из С-петидов концевой фрагмент встречается у двух или нескольких Т-пептидов. Вероятность этого как правило невелика. Если это все же происходит, то применяют более сложные методы комбинаторики.

источник

Определению первичной структуры предшествует денатурация и разрыв поперечных дисульфидных связей в белке. Это достигается посредством избытка меркаптоэтанола.

Цистин превращается в два остатка цистеина, которые затем блокируют избытком иодуксусной кислоты, чтобы предотвратить обратное образование связей — S-S-.

Расщепление полипептидной цепи на фрагменты проводят обычно при помощи протеолитических ферментов, таких, как трипсин, химотрипсин или пепсин. Эти ферменты действуют на различные участки полипептидной цепи, так как имеют повышенное сродство к различным аминокислотным остаткам. Необходимо учитывать также соседние аминокислотные остатки, т.е. пространственное окружение атакуемой пептидной связи. Оказалось, что трипсин гидролизует только те пептидные связи, в образовании которых участвует карбоксильная группа лизина или аргинина, а химотрипсин гидролизует связи по фенилаланину, триптофану и тирозину. Обычно протеолитические ферменты, гидролизующие полипептидные цепи, предварительно иммобилизуют на нерастворимых матрицах для более легкого отделения их от продуктов гидролиза. Далее определяют аминокислотные последовательности каждого полипептидного фрагмента. Для этого чаще всего используют метод Эдмана, заключающийся в анализе полипептида только с N-конца. Концевая аминокислота при взаимодействии с фенилизотиоцианатом в щелочной среде образует стойкое соединение, которое можно отщепить от полипептида без его деградации. Фенилтиогидантоиновое (ФТГ) производное аминокислоты идентифицируется хроматографическим методом.

После идентификации концевого N-аминокислотного остатка метка вводится в следующий аминокислотный остаток, который становится концевым. Метод Эдмана можно автоматизировать, пользуя секвенатор (от англ. sequetice- последовательность) с помощью которого ФТГ-производные отщепляются от полипептида и идентифицируются посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Ф. Сэнгер впервые полностью расшифровал первичную структуру белкового гормона инсулина, используя метод Эдмана.

Другим высокочувствительным методом является так называемый дансильный метод, связанный с присоединением к концевой аминокислоте дансилхлорида (1-диметиламино-нафталин-5-сульфохлорида) по следующей схеме:

Определение вторичной структуры белков

Для определения вторичной структуры белков используются в основном оптические методы. Конечно, более надежным является рентгеноструктурный метод, однако его применение сопряжено с определенными трудностями и требует значительного времени. Такие оптические методы, как дисперсия оптического вращения и круговой дихроизм, являются более простыми и, что весьма важно, позволяют определять изменения вторичной структуры белка в растворах. При помощи дисперсии оптического вращения можно получить информацию о степени спирализации белковой макромолекулы. Несмотря на то, что метод является приближенным, достаточно отчетливо просматриваются переходы типа спираль-клубок. Что касается метода кругового дихроизма, то его спектр определяется набором углов ψ и φ,свойственных тому или иному типу вторичной структуры. Оба метода можно расценивать как скриннинговые, и для полной идентификации вторичной структуры их надо комбинировать с рентгеноструктурным анализом белков.

Определение третичной и четвертичной структур белков

Третичная и четвертичная структуры белков определяются при помощи рентгеноструктурного анализа, который впервые был проведен применительно к миоглобину и гемоглобину Дж. Кендрью и М. Перутцем в Кембридже. Значение рентгеноструктурного анализа белков трудно переоценить, так как именно этот метод дал возможность впервые получить своеобразную фотографию белковой молекулы. Для получения информативной рентгенограммы необходимо было иметь полноценный кристалл белка с включенными в него атомами тяжелых металлов, так как последние рассеивают рентгеновские лучи сильнее атомов белка и изменяют интенсивность дифрагированных лучей. Таким образом можно определить фазу дифрагированных на белковом кристалле лучей и затем электронную плотность белковой молекулы.

Это впервые удалось сделать М. Перутцу в 1954 г., что явилось предпосылкой для построения приближенной модели молекулы белка, которая затем была уточнена при помощи ЭВМ. Однако первым белком, пространственная структура которого была полностью идентифицирована Дж. Кендрью, оказался миоглобин, состоящий из 153 аминокислотных остатков, образующих одну полипептидную цепь. В результате было экспериментально подтверждено предположение Л. Полинга и Р. Кори о наличии в молекуле миоглобина α-спиральных участков, а также М. Перутца и Л. Брэгга о том, что они имеют цилиндрическую форму. Несколько позднее М. Перутцем была расшифрована структура гемоглобина, состоящая из 574 аминокислотных остатков и содержащая около 10000 атомов. В отличие от миоглобина гемоглобин имеет четвертичную структуру, включающую в себя четыре глобулы: две α-субъединицы и две β-субъединицы[1].

Денатурация белков

Под денатурацией понимают изменение пространственной структуры белков и, как следствие, уменьшение или полное подавление функциональной активности, растворимости и других биологических и физико-химических свойств. Следует различать денатурацию и деградацию белков. При деградации происходит фрагментация первичной структуры и образование фрагментов белковой макромолекулы. Денатурация не сопровождается фрагментацией, однако может происходить разрыв дисульфидных мостиков, а также слабых водородных, гидрофобных и электростатических связей. В результате изменениям подвергается четвертичная (при ее наличии), третичная и в меньшей степени вторичная структуры.

Читайте также:  Сколько белка в анализах должно быть

Денатурирующие агенты делятся на химические и физические. К последним относится прежде всего температурное воздействие, в частности замораживание или нагревание, а также давление, ультразвуковое воздействие, облучение и др. Химические агенты — это органические растворители (ацетон, хлороформ, спирт), концентрированные кислоты, щелочи, ионы тяжелых металлов. В лабораторной практике в качестве денатурирующих агентов чаще всего используют мочевину или гуанидинхлорид, легко разрывающие водородные и гидрофобные связи, при помощи которых формируется третичная структура белка. Максимальное денатурирующее действие оба реагента проявляютпри высоких концентрациях (8-10 моль/л). Тепловая денатурация белков в растворах при 50-60°С также связана с разрывом связей, при помощи которых образуется третичная структура. Денатурация, осуществляемая в мягких условиях, часто оказывается обратимой, т.е. при удалении денатурирующего агента происходит восстановление нативной конформации белковой молекулы. Для ряда белков восстановление связей может быть 100% -м, причем это касается не только водородных или гидрофобных связей, но и дисульфидных мостиков. Денатурация изменяет как стабильность, так и функции белков, поэтому весьма важно определять ее характер в научных экспериментах, а также при применении белков в промышленности и медицине. Как правило, при денатурации изменяется форма белковой молекулы, поэтому для контроля ее нативности применяют такие методы, как коэффициент вращательной диффузии, рассеяние света, электронная микроскопия. Кроме того, при переходе молекулы белка в денатурированную форму меняется ее растворимость, спектры поглощения, иммунохимические свойства [5].

Выделение и очистка белков

Для изучения структур и функций белков требуется выделение и очистка их с минимальным количеством примесей, а в идеале — до гомогенного состояния. Связи, поддерживающие высшие структуры белковых макромолекул, легко разрываются, число гидрофобных и гидрофильных группировок на поверхности белковых глобул изменяется, что сказывается в первую очередь на их растворимости. Для выделения белков из клеток последние разрушаются, причем если для деградации цитоплазматических мембран животных клеток достаточно применения гомогенизаторов, то разрушение клеточных стенок растительных и особенно микробных клеток требует больших усилий (ультразвук, шаровые мельницы и т.д.). После удаления остатков клеточных структур при помощи диализа освобождаются от различных малых молекул. Затем последовательно используются различные методы фракционирования.

Высаливание. Высокие концентрации сульфата аммония, а также солей щелочных металлов осаждают белки. Механизм осаждения связан со способностью солей разрушать гидратную оболочку растворенных белковых макромолекул, что приводит к их агрегации и последующему осаждению. Далее используют ряд методов концентрирования и тонкой очистки белков, причем наиболее эффективными являются различные хроматографические процедуры. К преимуществам хроматографических методов следует отнести:

. технологическую гибкость — разделение веществ можно осуществлять при реализации различных типов межмолекулярных взаимодействий сорбент-сорбат;

. динамичность, т.е. большое преимущество перед такими одноактными методами, как экстракция и осаждение. Концентрирование продукта в этом случае состоит в селективности взаимодействия хроматографического носителя с целевым веществом, содержащимся в многокомпонентной смеси;

. вещества в процессе хроматографического разделения, как правило, не подвергаются химическим изменениям [2].

Дата добавления: 2018-04-15 ; просмотров: 142 ; ЗАКАЗАТЬ РАБОТУ

источник

Первичная структура белков. Гидролиз белков, определение аминокислотного состава. Анализ N- и С-концевых аминокислот.

Синтез белка происходит на рибосомах в виде первичной структуры, т.е. расположенных в определенном количестве и определенной последовательности аминокислот, соединенных пептидными связями, образованными карбоксильной и α-аминогруппами соседних аминокислотных остатков Пептидная связь — жесткая, ковалентная, генетически детерминированная.В структурных формулах изображается в виде одинарной связи: ,однако на самом деле эта связь между углеродом и азотом носит характер частично двойной связи:

Вокруг нее вращение невозможно и все четыре атома лежат в одной плоскости, т.е. компланарны. Вращение же других связей вокруг полипептидного остова достаточно свободно.

Первичная структура открыта в 1898 году профессором казанского университета Данилевским. В 1913 году Эмилем Фишером были синтезированы первые пептиды.

Такая последовательность аминокислот является уникальной для каждого белка и закреплена генетически. При нарушении процесса синтеза первичной структуры белка на рибосоме могут развиваться различные гететические заболевания. Например, при нарушении двух аминокислот в гемоглобине развивается серповидноклеточная анемия.

Для изучения аминокислотного состава белков пользуются сочетанием (или одним из них) кислотного (НСl), щелочного (Ва(ОН)2) и реже ферментативного гидролиза. Установлено, что при гидролизе чистого белка, не содержащею примесей, освобождается 20 различных а-аминокислот. Все другие открытые в тканях животных, растений и микроорганизмов аминокислоты (более 300) существуют в природе в свободном состоянии или в виде коротких пептидов или комплексов с другими органическими веществами.

α-аминокислоты представляют собой производные карбоновых кислот, у которых один водородный атом, у α -углерода, замещен на аминогруппу (-NH2), например: следует подчеркнуть, что все аминокислоты, входящие в состав природных белков являются а-аминокислотами, хотя аминогруппа в свободных аминикарбоновых кислотах может находиться, как увидим ниже, в β, γ, δ, ε -положениях.

9. Вторичная структура белков — α-спирали и β-структуры. Строение и функциональная роль доменов.

Вторичная структура — это пространственное расположение полипептидной цепочки в виде α-спирали или β-складчатости безотносительно к типам боковых радикалов и их конформации. Она стабилизирована водородными связями, которые замыкаются между пептидными, амидными (-N-H) и карбонидными (-C=O) группами, т.е. входят в пептидную единицу, и дисульфидными мостиками между остатками цистеина

Полинг и Кори предложили модель вторичной структуры белка в виде левозакрученной α-спирали, в которой водородные связи замыкаются между каждой первой и четвертой аминокислотой, что позволяет сохранять нативную структуру белка, осуществление им простейших функций, защищать от разрушения. На один виток спирали приходится 3,6 аминокислотных остатка, шаг спирали составляет 0,54 нм. В образовании водородных связей принимают участие все пептидные группы, что обеспечивает максимальную стабильность, снижает гидрофильность и увеличивает гидрофобность белковой молекулы. Альфа-спираль образуется самопроизвольно и является наиболее устойчивой конформацией, отвечающей минимуму свободной энергии

Полинг и Кори предложили и другую упорядоченную структуру — складчатый β-слой. В отличие от конденсированной α-спирали β- слои почти полностью вытянуты и могут располагаться как параллельно , так и антипараллельно

В стабилизации данных структур также принимают участие дисульфидные мостики и водородные связи.

Супервторичная структура — это более высокий уровень организации белковой молекулы, представленный ансамблем взаимодействующих между собой вторичных структур: α-спираль — два антипараллельных участка, взаимодействуют гидрофобными комплементарными поверхностями (по принципу впадина-выступ) αсα, сверхспирализация α-спирали, (βхβ)-элементы в глобулярных белках, представленные двумя параллельными β-цепями, связанные сегментом х, βαβαβ-элементы, представленные двумя сегментами α-спирали, вставленными между тремя параллельными β-цепями.

источник

Первый этап в определении первичной структуры белков заключается в качественной и количественной оценке аминокислотного состава данного индивидуального белка.

Для определения аминокислотного состава необходимо провести разрушение всех пептидных связей в белке. Анализируемый белок гидролизуют в 6 мол/л НС1 при температуре около 110 °С в течение 24 ч. В результате разрушаются пептидные связи в белке, а в гидролизате присутствуют только свободные аминокислоты

Разделение аминокислот с помощью ионообменной хроматографииСмесь аминокислот, полученных кислотным гидролизом белков, разделяют в колонке с катионообменной смолой.

Количественный анализ полученных фракций.нагреваютотдельные фракции аминокислот с нингидрином, образующим соединение красно-фиолетового цвета. Интенсивность окраски в пробе пропорциональна количеству находящейся в ней аминокислоты.

Определение N-концевой аминокислоты в белке и последовательности аминокислот в олигопептидах

Изучение первичной структуры белков имеет важное общебиологическое и медицинское значение. Изучая порядок чередования аминокислотных остатков в индивидуальных, можно выявить общие фундаментальные закономерности формирования пространственной структуры белков.многие генетические болезни — результат нарушения в аминокислотной последовательности белков. Информация о первичной структуре нормального и мутантного белка может быть полезна для диагностики и прогнозирования развития заболевания.

Установление первичной структуры белков включает 2 основных этапа:

определение аминокислотного состава изучаемого белка;

аминокислотной последовательности в белке.

Например, при серповидноклеточной анемии в шестом положении β-цепи гемоглобина происходит замена глутаминовой кислоты на валин. Это приводит к синтезу гемоглобина S (HbS) – такого гемоглобина, который в дезоксиформеполимеризуется и образует кристаллы. В результате эритроциты деформируются, приобретают форму серпа, теряют эластичность и при прохождении через капилляры разрушаются. Это в итоге приводит к снижению оксигенации тканей и их некрозу.

Последовательность и соотношение аминокислот в первичной структуре определяет формирование вторичной, третичной и четвертичной структур.

8. Вторичная структура белкапространственная структура, образующаяся в результате взаимодействий между функциональными группами, входящими в состав пептидного остова.регулярные структуры двух типов: а-спираль и б-структура.

Вторичная структура образуется только при участии водородных связеймежду пептидными группами: атом кислорода одной группы реагирует с атомом водорода второй, одновременно кислород второй пептидной группы связывается с водородом третьей и т.д.

пептидный остов закручивается в виде спирали за счёт образования водородных связей между атомами кислорода карбонильных групп и атомами азота аминогрупп. Водородные связи ориентированы вдоль оси спирали. На один виток а-спирали приходится 3,6 аминокислотных остатка.

В образовании водородных связей участвуют практически все атомы кислорода и водорода пептидных групп. В результате ?-спираль «стягивается» множеством водородных связей. связи относят к слабых, их количество обеспечивает максимально возможную стабильность ?-спирали. гидрофильность ?-спиралей уменьшается, а их гидрофобность увеличивается.

?-Спиральная структура — наиболее устойчивая конформация пептидного остова, отвечающая минимуму свободной энергии. В результате образования ?-спиралей полипептидная цепь укорачивается.

Радикалы аминокислот находятся на наружной стороне ?-спирали и направлены от пептидного остова в сторонынекоторые из них могут нарушать формирование ?-спирали. К ним относят:

пролин. Его атом азота входит в состав жёсткого кольца, что исключает возможность вращения вокруг -N-CH- связи. Кроме того, у атома азота пролита, образующего пептидную связь с другой аминокислотой, нет атома водорода. В результате пролин не способен образовать водородную связь в данном месте пептидного остова, и ?-спиральная структура нарушается. Обычно в этом месте пептидной цепи возникает петля или изгиб;

участки, где последовательно расположены несколько одинаково заряженных радикалов, между которыми возникают электростатические силы отталкивания;

участки с близко расположенными объёмными радикалами, механически нарушающими формирование ?-спирали, например метионин, триптофан

β-Складчатый слойСтруктура формируется за счёт образования множества водородных связей между атомами пептидных групп линейных областей одной полипептидной цепи, делающей изгибы, или между разными полипептидными цепями, ?-Структура образует фигуру, подобную листу, сложенному «гармошкой» Когда водородные связи образуются между атомами пептидного остова различных полипептидных цепей, их называют межцепочечными связями. Водородные связи, возникающие между линейными участками внутри одной полипептидной цепи, называют внутрицепочечными. В ?-структурах водородные связи расположены перпендикулярно полипептидной цепи.

Если связанные полипептидные цепи направлены противоположно, возникает антипараллельная ?-структура, если же N- и С-концы полипептидных цепей совпадают, образуется структура параллельного ?-складчатог

9. Третичная структура – это укладка полипептидной цепи в глобулу («клубок»). Четкой границы между вторичной и третичной структурами провести нельзя, в основе третичной структуры лежат стерические взаимосвязи между аминокислотами, отстоящими далеко друг от друга в цепи. Благодаря третичной структуре происходит еще более компактное формирование цепи. В стабилизации третичной структуры белка принимают участие:

ковалентные связи(между двумя остаткамицистеина—дисульфидные мостики);

ионные связимежду противоположно заряженными боковыми группами аминокислотных остатков;

гидрофильно-гидрофобныевзаимодействия. При взаимодействии с окружающими молекулами воды белковая молекула «стремится» свернуться так, чтобы неполярные боковые группы аминокислот оказались изолированы от водного раствора; на поверхности молекулы оказываются полярныегидрофильныебоковые группы.

Связь с первичной структурой. Третичная структура в значительной степени предопределенапервичной структурой. Усилия по предсказанию третичной структуры белка основываясь на первичной структуре известна как задачапредсказания структуры белка. Однако, окружающая среда, в которой белок сворачивается существенно определяет конечную форму, но обычно непосредственно не принимается во внимание текущими методами предсказания. Большинство таких методов полагаются на сравнения с уже известными структурами, и таким образом включают окружающую среду косвенно. Супервторичная структура белков. сравнение конформаций разных по структуре и функциям белков выявило наличие у них похожих сочетаний элементов вторичной структуры. Такой специфический порядок формирования вторичных структур называют супервторичной структурой белков.она формируется за счёт межрадикальных взаимодействий. Определённые характерные сочетания а-спиралей и б-структур часто обозначают как «структурные мотивы».

источник