Исследованию подлежит вода:
1) централизованного водоснабжения;
2) из колодцев различного типа;
3) открытых водоемов (рек, озер, морей);
Примечание. Пробы хлорированной воды берут во флаконы с дехлоратором (гипосульфитом).
Отбор проб воды. Из открытых водоемов воду берут с помощью специальных бутылей или батометров, снабженных грузилами. Пробу воды рекомендуют брать на глубине 10-15 см от поверхности (так как поверхность подвергается воздействию атмосферных факторов) и на расстоянии 1,5 м от берега (вода у самого берега может быть загрязнена микрофлорой почвы).
Для отбора проб водопроводной воды используют стерильные флаконы вместимостью 500 мл, закрытые ватно-марлевыми пробками и покрытые бумажными колпачками.
Кран предварительно обжигают тампоном, смоченным спиртом, после чего воду спускают в течение 10-15 мин и набирают во флаконы. Заполненные флаконы закрывают стерильными пробками.
Примечание. Исследуют 333 мл воды (табл. 54).
Таблица 54. Эмпирическая таблица ГОСТ 16963-73
В распределительной сети водопровода отбор проб воды осуществляют в зависимости от количества населения, проживающего в зоне обслуживания.
Стандартные методы исследования регламентированы для воды центрального водоснабжения (ГОСТ 18963-73) и предусматривают:
1. Определение общего числа микроорганизмов (в 1 мл исследуемой воды должно быть не более 100).
2. Определение коли-индекса и коли-титра (коли-индекс 3, коли-титр 333 и выше; для Москвы и Ленинграда коли-индекс не более 2, а коли-титр более 500).
3. Исследование по эпидемиологическим показаниям на патогенную микрофлору (патогенных микроорганизмов не должно быть обнаружено).
Согласно ГОСТу 18963-73 общее число бактерий — это то количество микроорганизмов, которое содержится в 1 мл исследуемой воды, способных в течение суток при температуре 37° С образовывать колонии, видимые невооруженным глазом (или при увеличении с помощью лупы).
При исследовании водопроводной воды засевают 2 чашки. В одну из них вносят 1 мл неразведенной воды, в другую 1 мл воды, разведенной в 10 раз (т. е. 0,1 мл исходной пробы).
При исследовании более загрязненной воды засевают 1 мл воды, разведенной в 100 раз. Это соответствует 0,01 и 1 мл .воды, разведенной в 1000 раз (0,001 мл) и т. д. Для получения таких объемов готовят последовательно десятикратные разведения, по 1 мл каждого разведения вносят в чашку и заливают тонким слоем (12-15 мл) растопленного и остуженного до 45° С питательного агара. Для равномерного распределения исследуемой воды залитые агаром чашки перемешивают путем вращения их. После застывания агара посевы ставят в термостат и инкубируют при температуре 37° С 24 ч.
Чашки с посевами вынимают из термостата и подсчитывают число выросших колоний. Учитывают только те чашки, где число колоний находится в пределах 30-300. Если колоний немного, их подсчитывают невооруженным глазом или при помощи лупы.
Если колоний много, то подсчет можно вести с помощью специального прибора для счета микробных колоний (рис. 54).
Рис. 54. Прибор для счета колоний микроорганизмов. 1 — столик для чашки Петри; 2 — игла с пружинным устройством; 3 — показатель счетчика; 4 — тумблер для включения импульсного счетчика; 5 — тумблер для включения лампы освещения счетчика
Подсчитанное количество колоний умножают на разведение и узнают число микробов в 1 мл исследуемой воды.
Наличие БГКП (бактерий группы кишечной палочки) является показателем фекального загрязнения, интенсивность которого характеризуют:
Коли-индекс — количество кишечных палочек, обнаруженных в 1 л воды.
Коли-титр — наименьшее количество воды, в котором обнаруживают присутствие кишечной палочки * .
* ( Коли-титр и коли-индекс — это один показатель, различно выраженный.)
Для выявления в воде БГКП можно пользоваться двумя методами: титрационным (бродильным) и методом мембранных фильтров.
Для исследования воды используют среду накопления глюкозопептонную (ГПС) среду Эйкмана с индикатором и бродильными трубками. Среда готовится концентрированной (в 10 раз) и нормальной концентрации — для посева 1 мл воды.
Исследуемую воду засевают по 100 мл в 3 колбы, по 10 мл в 3 пробирки (с концентрированной средой) и по 1 мл в 3 пробирки (со средой нормальной концентрации) — всего 333 мл. Посевы инкубируют в термостате при 37° С 24 ч.
Вынимают посевы из термостата и просматривают их.
При наличии помутнения в колбах или пробирках из них производят посев петлей на сектора среды Эндо в чашках Петри. Посевы инкубируют в термостате при 37° С.
Вынимают чашки из термостата. Из подозрительных колоний делают мазки. При наличии грамотрицательных палочек ставят пробу на оксидазную активность. Положительная проба на оксидазу дает право дать отрицательный ответ.
Проба на оксидазу. 1-й способ: со среды Эндо снимают петлей 2-3 колонии каждого типа и наносят на поверхность фильтровальной бумаги, смоченной диметилпарафенилендиамином. Положительная реакция характеризуется посинением штрихов, сделанных из колоний.
2-й способ: реактив можно нанести на изолированную колонию на среде Эндо (красная колония — синеет) (рис. 55).
Рис. 55. Определение коли-индекса воды титрационным методом
Отрицательная проба на оксидазу свидетельствует о наличии в воде БГКП. В этом случае вычисляют коли-индекс и коли-титр с помощью стандартных (эмпирических) таблиц ГОСТа 16963-73 (см. табл. 54).
Эти таблицы предусматривают любую возможную комбинацию объемов посева, из которых выделена кишечная палочка.
Для фильтрации воды можно использовать воронку Гольдмана вместимостью 700-800 мл.
В воронку смонтированного и простерилизованного фильтровального прибора Зейтца наливают отмеренный объем исследуемой воды. С помощью насоса создают вакуум в приемном сосуде (обычно воду фильтруют через фильтры № 2 и 3). По окончании фильтрации стерильным или обожженным в огне пинцетом снимают фильтр и накладывают его на среду Эндо в чашке Петри так, чтобы поверхность с осевшими на ней микробами была обращена вверх (на одну чашку можно помещать 3-4 мембранных фильтра).
Посевы инкубируют в термостате при температуре 37° С 18-24 ч.
Чашки с посевами (фильтрами) вынимают из термостата. Отсутствие подозрительных колоний дает право дать отрицательный ответ.
Учету подлежат все красные и розовые колонии с металлическим блеском или без него. Из выросших колоний делают мазки, окрашивают по Граму (рис. 56).
Рис. 56. Определение коли-индекса воды методом мембранных фильтров
При наличии грамотрицательных палочек ставят пробу на оксидазу. Положительная оксидазная проба дает право дать отрицательный ответ. При отрицательной оксидазной пробе производят посев на полужидкую среду с глюкозой и индикатором или на среду ГПС с бродильными трубками — для выявления ферментации углевода до кислоты и газа. При наличии кислоты и газа вычисляют коли-индекс. Например, на всех фильтрах, находящихся на среде Эндо, выросло 3 колонии, пропущено через фильтр было 300 мл воды.
Примечание. Титрационный метод более точный и может быть использован при наличии в воде примесей. Метод мембранных фильтров экономичнее и дает возможность дать ответ на 2-й день.
Для определения наличия в воде свежих фекальных кишечных палочек производят посев воды (3-х объемов) на лактозопептонную среду с борной кислотой. Инкубируют при 43° С 24 ч. Наличие кислоты и газа свидетельствует о свежем фекальном загрязнении.
По эпидемиологическим показаниям в воде определяют сальмонеллы, шигеллы, энтеровирусы.
Примечание. Общепринятым дополнительным показателем фекального загрязнения питьевой воды являются энтерококки. При проведении бактериологического исследования определяют все группы энтерококков, хотя санитарное значение имеют преимущественно фекальные стрептококки, обнаружение которых является показателем свежего фекального загрязнения.
1. Какова основная задача санитарной микробиологии?
2. Что такое санитарно-показательные микроорганизмы?
3. Что такое коли-индекс и коли-титр?
4. Какие Вы знаете методы определения БГКП?
Определите общее число микробов в исследуемой пробе воды. Среда ГПС (Эйкмана).
ГПС (Эйкмана) концентрированная. В 1 л воды растворяют 100 г пептона, 50 г хлорида натрия. Нагревают смесь до кипения, фильтруют, прибавляют 100 г глюкозы, устанавливают рН 7,4-7,6 и разливают по 10 мл в колбы вместимостью 250 мл, по 1 мл в 3 пробирки (концентрированной среды) и по 1 мл в 3 пробирки со средой нормальной концентрации (во всех емкостях среду до нужной концентрации доводят стерильной водой).
Примечание. При исследовании особенно загрязненных вод делают большие разведения (например, 10 -6 , 10 -7 и т. д.).
источник
Исследованию подлежит вода централизованного водоснабжения, колодцев, открытых водоемов, бассейнов, сточные воды.
Отбор проб водопроводной воды. Кран стерилизуют обжиганием с последующим стоком воды в течение 10 мин при полностью открытом кране. Пробу воды забирают в стерильную стеклянную посуду с плотно закрывающимися пробками. Доставка воды производится в контейнерах-холодильниках при температуре 4-10 0 С.
Для оценки санитарно-бактериологического состояния воды используют следующие показатели:
1. определение общего микробного числа (ОМЧ);
2. определение бактерий семейства Enterobacteriaceae и термотолерантных колиформных бактерий;
3. определение спор сульфитредуцирующих клостридий;
5. определение патогенных бактерий кишечной группы.
Исследование питьевой воды на наличие колифагов, патогенных бактерий кишечной группы проводится по эпидемиологическим показателям. Определение спор сульфитредуцирующих клостридий проводится при оценке эффективности технологий обработки воды.
Определение общего микробного числа (ОМЧ)
Для определения ОМЧ вносят два объема воды по 1 мл в стерильные чашки Петри, в которые выливают по 6-8 мл расплавленного и остуженного до 45 0 С МПА. Содержимое чашки смешивают, оставляют до застывания агара и помещают в термостат на 24 ч. Подсчитывают количество колоний на чашках, вычисляют среднее арифметическое. Результат выражают числом КОЕ (колониеобразующих единиц) в 1 мл воды.
Определение бактерий семейства Enterobacteriaceae
и термотолерантных колиформных бактерий
Термотолерантные колиформные бактерии обладают всеми признаками бактерий семейства Enterobacteriaceae, но они способны ферментировать лактозу до кислоты и газа при температуре 44 0 С в течение 24 ч.
Для выявления бактерий семейства Enterobacteriaceae и термотолерантных колиформных бактерий используют два метода: 1) метод мембранных фильтров, 2) титрационный метод.
Метод мембранных фильтров. Необходимый объем воды — 300 мл -фильтруют через мембранные фильтры по 100 мл. Фильтры переносят на среду Эндо в чашке Петри и инкубируют при 37 0 С 24 ч. Подсчитывают число красных и красных с металлическим блеском колоний.
Идентификацию бактерий проводят по оксидазному тесту и тесту образования кислоты и газа при ферментации лактозы (маннита) для чего исследуют не менее 10 колоний.
Так как, микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae и термотолерантные колиформные бактерии не обладают оксидазной активностью, то оксидазоположительные культуры дальше не исследуются.
Все лактозоположительные колонии засевают в две пробирки с одной из лактозных сред и 1 пробирку инкубируют при 37 0 (для культивирования микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae), а другую при 44 0 (для культивирования термотолерантных колиформных бактерий).
Учитывают бактерии семейства Enterobacteriaceae – показатели давнего фекального загрязнения воды и термотолерантные колиформные бактерии – показатели свежего фекального загрязнения.
Результаты анализа выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) бактерий семейства Enterobacteriaceae и термотолерантных колиформных бактерий в 100 мл воды.
Титрационный метод. Принцип метода заключается в посеве установленного объема воды (300 мл – 3 объема по 100 мл – качественный анализ и 333 мл – 3 объема по 100 мл, 3 объема по 10 мл, 3 объема по 1 мл – количественный анализ) в лактозно-пептонную (или глюкозо-пептонную) среду, с последующим пересевом в среду Эндо и идентификацией культуры по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам для определения бактерий семейства Enterobacteriaceae.
Для выявления термотолерантных колиформных бактерий делают посев 2-3 изолированных колоний в пробирки с лактозной средой, нагретой на водяной бане или в термостате до 44 0 С.
При обнаружении бактерий семейства Enterobacteriaceae и термотолерантных колиформных бактерий хотя бы в одном из трех объемов делают заключение – об обнаружении колиформных бактерий в 100 мл воды.
Определение спор сульфитредуцирующих бактерий
Сульфитредуцирующие клостридии, преимущественно C. perfringens – спорообразующие анаэробные палочки, редуцирующие сульфит натрия на железосульфитном агаре при 44 0 в течение 24 ч.
Определение сульфитредуцирующих клостридий проводят двумя методами: 1) метод мембранных фильтров, 2) прямым посевом.
Метод мембранных фильтров. Метод основан на фильтровании воды через мембранные фильтры, выращивании посевов в железо-сульфитном агаре в анаэробных условиях и подсчете черных колоний.
Результаты анализа выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) спор сульфитредуцирующих клостридий в 20 мл воды.
Метод прямого посева. Производят посев 20 мл воды в пробирки с железо-сульфитным агаром (2 объема по 10 мл в 2 пробирки или 4 объема по 5 мл в 4 пробирки) инкубируют при 44 0 С 24 ч и посчитывают черные колонии. Результаты выражают числом КОЕ в 20 мл воды.
Колифаги – вирусы, лизирующие кишечную палочку и образующие зоны лизиса (бляшки) на бактериальном газоне.
Определение колифагов проводят прямым и титрационным методами.
Прямой метод. Исследуемую воду вносят в 5 стерильных чашек по 20 мл. В 6-ю — контрольную воду не берут. Затем во все чашки заливают расплавленный и остуженный до 45 0 агар с добавлением суточной культуры E.сoli, штамм К2 (1,5 мл смыва E.сoli в концентрации 10 9 на 150 мл агара). Перемешивают, оставляют для застывания и инкубируют при 37 0 С 24 ч.
Учитывают результат подсчетом бляшек в чашках Петри в БОЕ (бляшкообразующих единицах) в 100 мл воды. В контрольной чашке бляшки должны отсутствовать.
Титрационный метод. В основе метода — предварительное подращивание колифагов в среде обогащения в присутствии E.сoli и последующее выявления бляшек колифага на газоне E.сoli.
Определение бактерий родов сальмонелла и шигелла
Для выявления патогенных энтеробактерий исследуемый объем воды (не менее 2-3 мл) засевают в среды обогащения (Мюллера-Кауфмана, магниевая среда) с последующим высевом на плотные селективные и дифференциально-диагностические среды – Плоскирева, Эндо, Левина, висмут-сульфитный агар. Выделенные культуры идентифицируют по морфологическим, тинкториальным, биохимическим и серологическим свойствам.
Оценка воды по микробиологическим показателям
Критерии оценки воды разработаны дифференциально в зависимости от ее категории и назначения. Вода плавательных бассейнов по своим качествам должна соответствовать ГОСТу питьевой воды (табл. 3).
Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:
Лучшие изречения: Да какие ж вы математики, если запаролиться нормально не можете. 8164 — 
| 7155 — 
или читать все.
193.124.117.139 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.
Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)
очень нужно
источник
1.1. Для отбора проб воды используют стерильные флаконы вместимостью 0,5 дм 3 с притертой каучуковой или корковой пробкой.
1.2. Место и время отбора пробы определяют в зависимости от цели анализа в наиболее характерных точках водопроводной сети: ближайших к насосной станции, наиболее удаленных от нее, наиболее возвышенных, в тупиках, а также в точках, качество воды в которых вызывает сомнение.
1.3. Пробы воды периферической водопроводной сети отбирают в периоды наибольшего расхода воды при соблюдении правил стерильности, после предварительной стерилизации кранов обжиганием пламенем горящего тампона, смоченного спиртом, и последующего спуска воды в течение 10 — 15 мин при полностью открытом кране. Бумажный пакет или колпачок с флакона снимают вместе с пробкой непосредственно перед отбором пробы, не касаясь пробки руками. Наполняют флаконы с таким расчетом, чтобы при транспортировании не замочить пробку. Объем отбираемой пробы — 500 см 3 . Наполненные флаконы закрывают притертыми, каучуковыми или корковыми пробками и стерильными бумажными колпачками, которые обвязывают ниткой и бечевкой.
1.4. Пробы хлорированной водопроводной воды (с аммонизацией или без нее) отбирают во флаконы с дехлоратом: во флакон, предназначенный для отбора 500 см 3 воды, до стерилизации вносят 10 мг серноватистокислого натрия.
1.5. Отобранные пробы должны сопровождаться документом, содержащим:
точное наименование этапа очистки и обеззараживания;
при отборе проб из периферической водопроводной сети — точное месторасположение крана, из которого отбирают пробу;
дату отбора пробы (с указанием года, месяца, числа и часа);
особые обстоятельства, имевшие место при отборе проб (время спуска воды из крана, условия транспортирования и т.п.);
цель исследования: сделан ли отбор пробы в порядке текущего санитарного надзора или по особым показаниям (рекомендации санитарно-эпидемиологической службы; сигналы, поступающие от населения, об изменении органолептических качеств воды и т.п.).
Все сопроводительные документы должны быть подписаны лицом, отбиравшим пробу, с указанием его места работы и должности.
При невозможности выполнения этих условий анализ допускается проводить не позже чем через 6 ч после отбора пробы, сохраняя при этом пробу при температуре от 1 до 5 °С.
1.7. При невозможности исследовать пробы на месте допускается транспортировать их в пределах времени, указанных в п. 1.6.
1.8. Посуда с пробами должна быть упакована в сумки-холодильники или в ящики с теплоизолирующей прокладкой.
1.9. Температуру, указанную в п. 1.6, необходимо поддерживать, применяя резиновые или пластмассовые мешки, наполненные летом льдом, а зимой теплой водой.
1.10. Необходимо избегать при транспортировании резких толчков, которые могут привести к намоканию пробок.
банки широкогорлые с притертыми пробками;
колбы конические вместимостью 250 и 500 см 3 по ГОСТ 25336;
флаконы стеклянные вместимостью 100 — 250 см 3 ;
посуда мерная лабораторная стеклянная по ГОСТ 1770;
пипетки вместимостью 1, 5, 10 см 3 с ценой деления 0,1 см 3 исполнений 4, 5, 6 по ГОСТ 29227;
пипетки Мора вместимостью 50 и 100 см 3 ;
цилиндры вместимостью 100, 250, 500 см 3 исполнений 1, 3 или мензурки вместимостью 250, 500, 1000 см 3 по ГОСТ 1770;
пробирки бактериологические по ГОСТ 25336;
флаконы для отбора проб с притертыми пробками или без них вместимостью 500 см 3 ;
стекла покровные для микропрепаратов по ГОСТ 6672;
стекла предметные для микропрепаратов по ГОСТ 9284;
чашки бактериологические (Петри);
насос водоструйный стеклянный лабораторный по ГОСТ 25336;
поплавки для пробирок и колб длиной 20, 45 и 75 мм и диаметром соответственно 5, 9 и 10 мм;
автоклав электрический по ТУ 27-31-2939;
аппараты фильтровальные с диаметром фильтрующей поверхности 32 мм;
весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104*, 4-го класса точности, наибольший предел взвешивания 200 г, допускаемая погрешность не более 0,02 г; весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104, 4-го класса точности, наибольший предел взвешивания 1 кг, допускаемая погрешность не более 0,1 г;
* С 1 июля 2002 г. введен в действие ГОСТ 24104-2001 (здесь и далее).
лупа с увеличением 2 — 5 × по ГОСТ 25706;
микроскоп биологический по нормативно-техническому документу;
пеналы металлические для пипеток;
пластинка с сеткой для счета колоний;
прибор для счета колоний бактерий;
термостаты электрические для выращивания бактерий с автоматическим терморегулятором до 50 °С и с термометром с ценой деления 0,2 °С;
холодильник электрический или газовый бытовой, поддерживающий температуру на 4 — 6 °С;
холодильники походные (сумки) или ящики для транспортирования проб с теплоизоляцией и резиновыми мешками (для льда или теплой воды);
часы сигнальные или песочные по ОСТ 25-11-38;
агар-агар в волокнах или в порошке по ГОСТ 17206;
индикатор бриллиантовый зеленый;
индикатор бромтимоловый синий;
вата гигроскопическая медицинская по ГОСТ 5556;
вата хлопчатобумажная негигроскопическая по ТУ-17 РСФСР 63-9022;
индикатор генциан фиолетовый;
желчь крупного рогатого скота свежая или сухая обезвоженная;
калий фосфорнокислый двузамещенный по ГОСТ 2493;
калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198;
индикатор кристаллический фиолетовый;
марля медицинская в кусках и бинтах по ГОСТ 9412;
масло иммерсионное для микроскопии по ГОСТ 13739;
натрий серноватистокислый по ГОСТ 27068;
пептон сухой ферментативный для бактериологических целей по ГОСТ 13805;
проволока из никелевых сплавов диаметром 0,3 — 0,5 мм;
спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962*;
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 51652-2000.
среда Эндо сухая питательная;
препарат с индикатором ВР и глюкозой;
препарат с индикатором ВР и лактозой;
фильтры мембранные № 2 и 3 и фильтры планктонные № 6 или фильтрующие мембраны «Владипор» марки МФА-МА № 5, 6, 7, 8, 10 диаметром 35 мм;
пробки резиновые разных размеров для флаконов;
3.1. Подготовка посуды и материалов
3.1.1. Вся бактериологическая посуда должна быть перед стерилизацией тщательно вымыта и высушена.
3.1.2. Пробирки и флаконы должны быть заткнуты ватными пробками и завернуты в бумагу. На горлышки флаконов следует надеть бумажные колпачки, которые обвязывают шнурком (ниткой).
3.1.3. Флаконы для отбора проб должны быть заткнуты ватными пробками, снабжены бумажными колпачками. Хорошо подобранные притертые, каучуковые или корковые пробки, завернутые в бумагу, привязывают к горлышку флаконов.
3.1.4. Пробки для пробирок и флаконов готовят из ваты, обертывают слоем марли и завязывают ниткой на свободном конце.
3.1.5. Чашки Петри укладывают в металлические пеналы или завертывают в бумагу. Между крышкой и дном бактериологических чашек, предназначенных для разливки среды Эндо, можно проложить кружки фильтровальной бумаги диаметром на 1 — 2 см больше диаметра чашки.
3.1.6. В конец пипетки, который берется в рот, вкладывают кусочек ваты. Пипетки помещают в металлические пеналы не более 6 — 10 шт. в каждый или завертывают в бумагу.
3.2.1. Подготовленную посуду стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при (160 ± 5) °С в течение 1 ч, считая с момента достижения этой температуры. Флаконы с привязанными к ним каучуковыми пробками стерилизуют отдельно в автоклаве при (126 ± 2) °С (1,47 × 10 5 Па) 30 мин.
3.2.2. Простерилизованную посуду вынимают из сушильного шкафа после его охлаждения ниже 60 °С.
3.2.3. Стерильную посуду хранят в плотно закрытых шкафах или ящиках лабораторных столов.
3.2.4. При отсутствии сушильного шкафа посуду стерилизуют в автоклаве при (126 ± 2) °С (1,47 × 10 5 Па) 30 мин.
3.3. Приготовление сред и реактивов
Водопроводную (колодезную, речную) воду разливают в пробирки по 10 см 3 в каждую или во флаконы по 100 см 3 в каждый, закрывают ватными пробками и стерилизуют в автоклаве при (120 ± 2) °С (1,078 × 10 5 Па) 20 мин. Срок хранения — не более двух недель.
Целесообразнее воду стерилизовать во флаконе и разливать в пробирки по 9 см 3 непосредственно перед посевом, соблюдая правила стерильности.
3.3.2. Приготовление мясной воды
500 г мясного фарша без жира и сухожилий заливают 1 дм 3 дистиллированной воды, настаивают 12 ч на холоде или 1 ч в водяной бане при 50 — 60 °С. Затем настой кипятят, фильтруют через марлю или вату и опять доводят дистиллированной водой до 1 дм 3 , разливают во флаконы, стерилизуют в автоклаве при (120 ± 2) °С (1,078 × 10 5 Па) 20 мин или приступают непосредственно к приготовлению мясного бульона или других питательных сред.
3.3.3. Приготовление мясопептонного бульона
К 1 дм 3 мясной воды прибавляют 10 г пептона и 5 г хлористого натрия, нагревают до полного растворения пептона и соли, устанавливают рН (7,2 — 7,4), осветляют, фильтруют и разливают в пробирки или флаконы в количествах, необходимых для анализа, закрывают ватными пробками и стерилизуют в автоклаве при (120 ± 2) °С (1,078 × 10 5 Па) 20 мин.
Примечание . Допустимая погрешность взвешивания 0,1 %.
3.3.4. Приготовление мясопептонного агара
К 1 дм 3 мясопептонного бульона прибавляют 15 г агара в волокнах или порошке, нагревают до полного растворения, проверяют рН (7,2 — 7,4), осветляют, фильтруют в горячем виде через ватно-марлевый фильтр и разливают во флаконы или пробирки в количествах, необходимых для анализа. Стерилизуют в автоклаве при (120 ± 2) °С (1,078 × 10 5 Па) 20 мин.
Вместо мясопептонного бульона также используют перевар Хоттингера с концентрацией аминного азота не менее 100 мг/дм 3 .
3.3.1 — 3.3.4. (Измененная редакция, Изм. № 2).
3.3.5. Приготовление питательного агара Дагестанского НИИ питательных сред
Готовят по прописи на этикетке.
3.3.6. Приготовление глюкозопептонной среды
Среду готовят двух видов: нормальную и концентрированную.
Среда нормальной концентрации: 10 г пептона, 5 г натрия хлористого, 5 г глюкозы, 1 дм 3 дистиллированной воды. После растворения указанных ингредиентов прибавляют индикатор (2 см 3 1,6 %-ного спиртового раствора бромтимолового синего или 10 см 3 индикатора Андреде), устанавливают рН (7,4 — 7,6), разливают по 10 см 3 в пробирки с поплавками или комочками ваты, стерилизуют в автоклаве при 112 °С (0,49 × 10 5 Па) 12 мин. Приготовляя концентрированную среду, количество всех ингредиентов, кроме воды, увеличивают в 10 раз.
3.3.7. Приготовление лактозопептонной среды
Готовят так же, как глюкозопептонную среду, заменив глюкозу лактозой.
3.3.8. Приготовление индикатора Андреде
1 г фуксина кислого растворяют в 32 см 3 нормального раствора гидрата окиси натрия, прибавляют 200 см 3 дистиллированной воды, настаивают 24 ч при 37 °С, фильтруют, стерилизуют 5 мин при 100 °С. Хранят во флаконе из темного стекла с притертой пробкой.
3.3.9. Приготовление полужидкой среды с индикатором ВР и глюкозой
Готовят по прописи на этикетке. Срок хранения — не более 7 сут.
3.3.10. Приготовление полужидкой среды с глюкозой
Полужидкую среду применяют при отсутствии сухих сред. Для этого в 1 дм 3 дистиллированной воды растворяют 10 г пептона, 5 г хлористого натрия, 4 — 5 г агар-агара, доводят до кипения, устанавливают рН (7,2 — 7,4), добавляют 1 см 3 1,6 %-ного спиртового раствора бромтимолового синего. Стерилизуют при (120 ± 2) °С (1,078 × 10 5 Па) 20 мин. В расплавленную среду вносят 5 г глюкозы, нагревают до кипения, разливают в стерильные пробирки столбиком высотой около 3 см и стерилизуют при 112 °С (0,49 × 10 5 Па) 12 мин. Срок хранения — не более 7 сут.
3.3.11. Приготовление среды Эндо (модификация)
Готовят из сухого препарата по прописи на этикетке.
В готовую и охлажденную до 60 — 70 °С среду перед разливкой в чашки допускается прибавлять на 100 см 3 среды: 0,2 см 3 10 %-ного спиртового раствора основного фуксина для повышения дифференцирующих свойств среды и 0,2 см 3 5 %-ного спиртового раствора розоловой кислоты во избежание зарастания посевов споровыми аэробными бактериями. После тщательного перемешивания среду разливают в чашки по 20 — 25 см 3 . Если на поверхности среды заметны следы влаги, чашки перед посевом необходимо подсушить. Для этого можно оставить чашки со средой на 0,5 — 1 ч для застывания и подсушивания накрытыми стерильными кружками фильтровальной бумаги. Хранить чашки со средой допускается не более двух-трех суток в темноте или в холодильнике. Срок хранения растворов фуксина и розоловой кислоты — не более одного месяца.
3.3.12. Приготовление желчно-лактозного бульона с бриллиантовым зеленым
10 г пептона, 10 г лактозы, 200 см 3 свежей фильтрованной желчи крупного рогатого скота (или 20 г сухой обезвоженной желчи, растворенной в 200 см 3 дистиллированной воды) растворяют при нагревании в 700 см 3 дистиллированной воды, устанавливают рН (7,2 — 7,4), прибавляют 13,3 см 3 1 %-ного водного раствора бриллиантового зеленого, доливают дистиллированной водой до общего объема 1 дм 3 , фильтруют через ватный фильтр, разливают по 5 см 3 в пробирки с поплавками и стерилизуют при 112 °С (0,49 × 10 5 Па) 12 мин или три дня при 100 °С. Срок хранения — не более двух недель.
3.3.13. Приготовление борнокислой буферной среды с лактозой
10 г пептона, 12,2 г калия фосфорнокислого двузамещенного (безводного), 4,1 г калия фосфорнокислого однозамещенного (безводного), 3,2 г борной кислоты, 5 г лактозы растворяют в 1 дм 3 дистиллированной воды, разливают по 5 см 3 в пробирки с поплавками, стерилизуют при 112 °С (0,49 × 10 5 Па) 12 мин. Срок хранения — не более двух недель.
3.3.12, 3.3.13. (Измененная редакция, Изм. № 2).
3.3.14. Приготовление реактивов для окраски по Граму*
Карболовый раствор генциана фиолетового готовят следующим образом: 1 г генциана фиолетового, 10 см 3 ректификованного этилового спирта, 5 г фенола растирают в ступке, добавляя 100 см 3 дистиллированной воды.
Раствор Люголя готовят следующим образом: 1 г йода, 2 г йодистого калия растворяют в 300 см 3 дистиллированной воды. Хранить во флаконе из темного стекла.
Фуксин Циля готовят следующим образом: 1 г основного фуксина, 10 см 3 спирта этилового ректификованного, 5 г фенола растирают в ступке, добавляя 100 см 3 дистиллированной воды.
Мазок на предметном стекле фиксируют трехкратным проведением через пламя горелки. На препарат накладывают полоску фильтровальной бумаги и на нее наливают карболовый раствор генциана фиолетового на 0,5 — 1 мин, снимают бумагу, наливают раствор Люголя на 0,5 — 1 мин, сливают раствор Люголя и стекло прополаскивают в этиловом спирте в течение 0,5 — 1 мин, пока не перестанет отходить краситель. Затем стекло тщательно промывают водой и докрашивают от 1 до 2 мин фуксином Циля, разведенным 1:10 дистиллированной водой. После промывки и просушивания препарата мазок микроскопируют.
Экспресс-метод окраски по Граму.
Приготовление реактива № 1: 0,5 %-ный спиртовой раствор кристаллического фиолетового.
Приготовление реактива № 2: в 100 см 3 этилового ректификованного спирта растворяют 0,4 г йодистого калия, нагревают на водяной бане или оставляют на сутки при комнатной температуре. Затем прибавляют 0,2 г кристаллического йода и 0,1 г основного фуксина. Хранить во флаконе из темного стекла.
На обезжиренное спиртом предметное стекло наносят петлей одну каплю дистиллированной воды (при приготовлении препарата из колоний на плотных средах) или одну каплю бульонной культуры. В каплю дистиллированной воды вносят небольшое количество микробных клеток из анализируемой колонии или газона чистой культуры на плотной среде. Затем в каплю вносят петлей одну каплю реактива № 1, распределяют смесь по стеклу и подсушивают мазок при комнатной температуре. Затем фиксируют на пламени горелки, промывают водой, просушивают фильтровальной бумагой и наносят реактив № 2, покрывая им всю поверхность стекла, на 1 — 5 мин (продолжительность окраски не влияет на ее результат). Тщательно и быстро прополаскивают препарат водой, просушивают фильтровальной бумагой, микроскопируют. При приготовлении на одном стекле нескольких мазков на лицевую сторону стекла наносят восковым карандашом линии, делящие поверхность стекла на необходимое количество квадратов.
* Вместо карболового раствора генциана фиолетового и фуксина Циля допускается использовать полоски фильтровальной бумаги, пропитанные соответствующими растворами и высушенные.
3.3.15. Приготовление реактива для определения оксидазной активности бактерий
30 — 40 мг α-нафтола растворяют в 2,5 см 3 ректификованного этилового спирта, прибавляют 7,5 см 3 дистиллированной воды и растворяют 40 — 60 мг диметил- n -фенилендиамина. Раствор готовят непосредственно перед определением.
Оксидазный тест предназначается для дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae от грамотрицательных бактерий семейства Pseudomonadaceae и других водных сапрофитных бактерий, которые обладают активным ферментом оксидазой и окисляют фенилендиаминовые соединения до индофенола ярко-синего цвета.
Мембранный фильтр с выросшими на нем колониями бактерий переносят пинцетом, не переворачивая, на кружок фильтровальной бумаги несколько большего диаметра, чем фильтр, обильно смоченный реактивом. Через 2 — 4 мин определяют результат. Все посиневшие колонии или с синим ободком не относятся к семейству Enterobacteriaceae, их учитывают.
Колонии, не изменившие своего первоначального цвета, в подавляющем большинстве образованы бактериями группы кишечных палочек, но среди них могут быть кокки, спорообразующие и грамотрицательные палочки, не имеющие санитарно-показательного значения, которые не учитывают после микроскопирования и отсутствия образования газа на полужидкой среде с глюкозой при (37 ± 0,5) °С. Учитывая бактерицидность реактива для определения оксидазной активности, мембранный фильтр сразу же после четкого проявления реакции переносят обратно на среду Эндо и немедленно (не позднее чем через 5 мин) пересеивают оксидазоотрицательные колонии в полужидкую среду с глюкозой.
По 2 — 3 изолированные колонии каждого типа, выросшие на секторах среды Эндо, снимают петлей или стеклянной палочкой и наносят штрихом на фильтровальную бумагу, смоченную реактивом. В месте нанесения бактериальной массы бумага не изменяет цвета, если оксидазный тест отрицательный, и синеет в течение 1 мин, если бактерии имеют активную оксидазу. Исследование изолированных колоний является обязательным, иначе можно необоснованно отбросить кишечную палочку при ложном посинении за счет примеси оксидазоположительных бактерий.
Примечание . Если оксидазный тест со среды Эндо проявляется недостаточно четко из-за того, что мешают ингибиторы (это относится в основном к темно-красным колониям), то для получения правильного результата такие колонии можно пересеять на сектора или на скошенный питательный агар и после подращивания повторить оксидазный тест.
4.1. Определение общего количества бактерий в воде
Сущность метода заключается в определении в 1 см 3 воды общего содержания мезофильных, мезотрофных аэробов и факультативных анаэробов, способных расти на питательном агаре данного состава при температуре (37 ± 0,5) °С в течение (24 ± 2) ч, образуя колонии, видимые при увеличении в 2 — 5 раз.
4.1.1. Питательный агар расплавляют в водяной бане и охлаждают до температуры (45 ± 5) °С.
4.1.2. Стерильные чашки Петри раскладывают на столе и подписывают на крышках номер пробы, дату посева и объем посеянной воды.
4.1.3. Из каждой пробы должен быть сделан посев не менее двух различных объемов, выбранных с таким расчетом, чтобы на чашках выросло от 30 до 300 колоний. При исследовании водопроводной воды засевают в каждую из двух чашек по 1 см 3 .
4.1.4. С флаконов с пробой воды снимают бумажные колпачки, вынимают пробки, горлышки фламбируют, после чего воду тщательно перемешивают осторожным продуванием воздуха через стерильную пипетку.
4.1.5. Стерильной палочкой отбирают соответствующие объемы воды и вносят в стерильные чашки, слегка приоткрывая крышку.
4.1.6. Для посева 0,1 см 3 и меньших объемов воды используют разведения анализируемой воды. Для этого в пробирку с 9 см 3 стерильной воды, приготовленной по п. 3.3.1, вносят 1 см 3 анализируемой воды. При этом пипетка должна быть опущена ниже поверхности воды не более чем на 3 мм, чтобы избежать смывания бактерий с наружной стороны. Другой стерильной пипеткой продуванием воздуха тщательно перемешивают содержимое пробирки, отбирают из нее 1 см 3 и переносят в чашку, что будет соответствовать посеву 0,1 см 3 анализируемой воды. При необходимости посева меньших объемов воды этой же пипеткой переносят 1 см 3 содержимого первой пробирки в следующую с 9 см 3 стерильной воды. Посев 1 см 3 из второй пробирки будет соответствовать посеву 0,01 см 3 анализируемой воды и т.д.
4.1.7. После внесения воды в чашки Петри ее заливают 10 — 12 см 3 остуженного питательного агара при фламбировании краев пробирки или бутылки, где он содержится.
Воду быстро смешивают с агаром, осторожно наклоняя или вращая чашку по поверхности стола. Необходимо избегать образования пузырьков воздуха, незалитых частей дна чашки, попадания среды на края и крышку чашки. После этого чашки оставляют на горизонтальной поверхности до застывания среды.
4.1.8. После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат вверх дном не более чем по 3 — 4 чашки вместе. Посевы выращивают при (37 ± 0,5) °С в течение (24 ± 2) ч.
4.1.9. Колонии, выросшие как на поверхности, так и в глубине агара, подсчитывают с помощью лупы с увеличением в 2 — 5 раз или прибора для счета колоний. Для этого чашку кладут вверх дном на черный фон. Для большей точности счета каждую подсчитанную колонию отмечают со стороны дна тушью или чернилами для стекла.
4.1.10. Оценивают только те разведения, при посеве которых на чашке выросло от 30 до 300 колоний. При посеве 1 см 3 неразведенной пробы учитывают любые количества колоний, но не превышающие 300.
Если в чашке с наиболее высоким разведением выросло свыше 300 колоний и анализ нельзя повторить, то допускается подсчитывать колонии с помощью пластинки с сеткой и лупы при сильном боковом освещении. Подсчитывают не менее 20 квадратов площадью 1 см 2 каждый в разных местах чашки, затем выводят среднеарифметическое число колоний на 1 см 2 , значение которого умножают на площадь чашки в см 2 , вычисленную по формуле
4.1.11. Результат подсчета колоний в каждой чашке выражают в количестве бактерий на 1 см 3 анализируемой воды с учетом посеянного объема. За окончательное количество бактерий принимают среднеарифметическое результатов подсчета на двух параллельных чашках или разных разведений. Результаты округляют следующим образом:
если результат находится в пределах чисел от 1 до 100, то записывают те числа, которые получены; если результат находится в пределах чисел от 101 до 1000, то результат округляют до 10; если результат находится в пределах чисел от 1001 до 10000, то результат округляют до 100 и т.д.
4.1.12. Количество колоний учитывают, ориентируясь на одну чашку, в случаях: если на другой чашке при посеве из разведения выросло менее 20 колоний; при ползучем росте бактерий, распространившихся на всю поверхность чашки или значительные зоны, маскирующем рост других колоний; при количестве колоний свыше 300.
Счетную пластинку рекомендуется применять при подсчете количества колоний, когда на обеих чашках отмечен ползучий рост.
При этом просчитывают квадраты на свободных от сплошного роста местах чашки.
4.1.13. Окончательный результат вносят в протокол анализа или в журнал регистрации, где должны быть приведены сведения из сопроводительного документа к пробе воды. Кроме того, отмечают особые обстоятельства анализа (превышение срока хранения пробы, изменение температуры и времени инкубации посевов, применение заменителей при приготовлении питательных сред и прочие вынужденные отклонения).
4.2. Определение количества бактерий группы кишечных палочек
К бактериям группы кишечных палочек относятся грамотрицательные, не образующие спор палочки, сбраживающие лактозу с образованием кислоты и газа при (37 ± 0,5) °С в течение 24 — 48 ч или сбраживающие глюкозу с образованием кислоты и газа при (37 ± 0,5) °С в течение 24 ч и не обладающие оксидазной активностью.
Обнаружение в воде бактерий группы кишечных палочек следует рассматривать как показатель фекального загрязнения воды, а их количество позволяет судить о степени этого загрязнения.
Количество бактерий группы кишечных палочек определяют методом мембранных фильтров и бродильным методом.
Сущность метода заключается в концентрировании бактерий из определенного объема анализируемой воды на мембранный фильтр, выращивании их при (37 ± 0,5) °С на среде Эндо, дифференцировании выросших колоний и подсчете количества бактерий группы кишечных палочек на 1 дм 3 воды.
При анализе воды, поступающей в водопроводную сеть, и в наиболее характерных ее точках необходимо анализировать объем не менее 333 см 3 , профильтровывая этот объем не менее чем через два фильтра.
На этапах очистки анализируют не менее двух десятикратных объемов воды, выбранных в зависимости от ее качества так, чтобы на одном из фильтров вырастало не более 30 колоний бактерий группы кишечных палочек. При этом необходимо ориентироваться на результаты предыдущих анализов воды в этих же пунктах (например для воды после первичного хлорирования могут быть выбраны объемы 10 и 100 см 3 ; для воды необеззараженной — 0,1; 1 и 10 см 3 ).
При анализе воды неизвестного качества следует засевать 3 — 4 десятикратных объема (например из водопроводной сети можно фильтровать 3; 30; 100; 200 см 3 воды; по этапам очистки — 0,1; 1; 10; 100 см 3 воды).
4.2.2. Подготовка мембранных фильтров
Мембранные фильтры № 2 или 3, а также планктонные фильтры № 6, проверенные на отсутствие трещин, отверстий и т.п., помещают по одному на поверхность дистиллированной воды, нагретой до 80 °С в стакане (в чашке для выпаривания, эмалированной кастрюле), и медленно доводят до кипения на слабом огне, после чего воду заменяют и кипятят 10 мин. Смену воды и последующее кипячение повторяют 3 — 5 раз до полного удаления остатков растворителей из фильтров, после чего они готовы к работе. Подготовленные фильтры сохраняют сухими или в широкогорлой банке с дистиллированной водой. Перед употреблением фильтры стерилизуют кипячением в дистиллированной воде.
Фильтрующие мембраны «Владипор» марки МФА-МА № 5, 6, 7, 8 и 10, визуально проверенные на отсутствие трещин, отверстий, пузырей и т.п., стерилизуют кипячением. При этом во избежание скручивания мембран необходимо строго соблюдать следующие правила. На дно сосуда, в котором производят кипячение (химический стакан, эмалированная кастрюля и т.п.), помещают «сторож для молока» или нержавеющую сетку (для ограничения бурного кипения). Дистиллированную воду заливают в этот сосуд в небольшом объеме, ограничивающем свободное вращение в ней фильтрующих мембран, но достаточном для того, чтобы предназначенные для стерилизации фильтрующие мембраны были покрыты водой. Дистиллированную воду доводят в сосуде до 80 — 90 °С, после чего, убавив нагрев, на поверхность воды по одной помещают фильтрующие мембраны. Воду с помещенными в нее мембранами медленно доводят до кипения и кипятят на слабом огне в течение 10 — 15 мин. Затем воду сливают и заменяют небольшим количеством (чтобы покрыть фильтрующие мембраны) стерильной дистиллированной воды. После этого фильтрующие мембраны готовы к употреблению. При необходимости, может производиться повторное кипячение фильтрующих мембран.
4.2.3. Подготовка фильтровального аппарата к анализу
Перед посевом воды фильтровальный аппарат стерилизуют фламбированием после обтирания ватным тампоном, смоченным спиртом. После охлаждения на нижнюю часть фильтровального аппарата (столик) кладут фламбированным пинцетом стерильный мембранный фильтр, прижимают его верхней частью прибора (стаканом, воронкой) и закрепляют устройством, предусмотренным конструкцией прибора.
В воронку (стакан) фильтровального прибора при соблюдении правил стерильности наливают необходимый объем воды и создают вакуум в приемном сосуде. Фильтруют сначала меньшие, а затем большие объемы воды через один фильтровальный аппарат, меняя каждый раз фильтры. При фильтровании небольших объемов воды (1 см 3 ) в воронку сначала наливают 10 см 3 стерильной воды, а затем вносят анализируемую воду.
После окончания фильтрования воронку снимают, фильтр осторожно приподнимают за край фламбированным пинцетом при сохранении вакуума для удаления излишка влаги на нижней стороне фильтра, а затем переносят его, не переворачивая, на среду Эндо, разлитую в чашку Петри, избегая пузырьков воздуха между средой и фильтром. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх.
Под каждым фильтром на дне чашки делают надпись с указанием объема профильтрованной воды, даты посева и номера пробы. На одну чашку можно поместить 3 — 4 фильтра с условием, чтобы фильтры не соприкасались.
4.2.5. Если анализируемая вода содержит большое количество взвешенных веществ или клеток фитопланктона, то ее фильтруют сначала через предварительный фильтр № 6 для удаления крупной взвеси. Для этого фильтр № 6 помещают в фильтровальный прибор над фильтром № 2 или 3. После окончания фильтрования оба фильтра переносят на среду Эндо. При выведении результатов анализа учитывают рост бактерий на обоих фильтрах.
При работе с фильтрующими мембранами «Владипор» марки МФА-МА в качестве предварительной мембраны для удаления крупной взвеси используют мембрану «Владипор» марки МФА-МА № 10, которую помещают в фильтровальный прибор над основной мембраной, задерживающей бактерии группы кишечных палочек. В качестве основной используется фильтрующая мембрана «Владипор» марки МФА-МА № 5, 6, 7 или 8. После окончания фильтрования предварительную и основную мембраны переносят на среду Эндо. При определении результатов анализа учитывают рост бактерий на обеих фильтрующих мембранах.
4.2.6. Чашки с фильтрами на среде Эндо помещают в термостат дном вверх и инкубируют при (37 ± 0,5) °С в течение 18 — 24 ч.
При отсутствии каких-либо колоний на фильтрах или при наличии только пленчатых, губчатых, с неровной поверхностью и краями, плесневых и других нехарактерных для кишечных палочек колоний дают отрицательный результат на присутствие бактерий группы кишечных палочек в анализируемом объеме воды. Анализ на этом этапе заканчивают через 18 — 24 ч.
4.2.8. При наличии на фильтрах колоний, характерных для кишечных палочек (темно-красных с металлическим блеском и без него, розовых, прозрачных), из нескольких колоний каждого типа готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Отсутствие в мазках грамотрицательных неспороносных палочек дает отрицательный ответ. Анализ на этом заканчивают через 18 — 24 ч.
4.2.9. При наличии в мазках грамотрицательных, коротких, полиморфных, не образующих спор палочек (возможны удлиненные нитевидные формы, а также крупные палочки, полярно окрашенные) выполняют оксидазный тест (п. 3.3.15.1).
4.2.10. Наличие активной оксидазы у всех колоний, кроме перечисленных в п. 4.2.7, позволяет дать отрицательный результат.
4.2.11. Отсутствие оксидазы у темно-красных с металлическим блеском и без него (лактозоположительных) колоний позволяет отнести их к бактериям группы кишечных палочек и немедленно дать положительный ответ.
Анализ питьевой воды может быть завершен на этом этапе, если нет других колоний, не обладающих оксидазной активностью.
Анализ воды по этапам очистки заканчивают через 18 — 24 ч подсчетом этих колоний для вычисления колииндекса.
4.2.12. При наличии на фильтрах розовых и бесцветных колоний с отрицательной оксидазной активностью их подсчитывают и подтверждают принадлежность к бактериям группы кишечных палочек посевом 2 — 3 изолированных колоний каждого типа в полужидкую среду с глюкозой. Учет проводят через 4 — 5 ч инкубации при (37 ± 0,5) °С. При образовании кислоты и газа результат анализа считают положительным. При отсутствии кислоты и газа получают отрицательный результат. Анализ заканчивают через 24 — 28 ч.
При наличии только кислоты пробирки оставляют в термостате для окончательного учета через 24 ч. При отсутствии газообразования через 24 ч получают окончательный отрицательный результат, при наличии газообразования — положительный результат.
Результат выражают в виде колииндекса, т.е. количества бактерий группы кишечных палочек в 1 дм 3 воды. Питьевая вода удовлетворяет требованиям ГОСТ 2874*, если колииндекс не превышает 3.
Колииндекс высчитывают следующим образом: количество бактерий группы кишечных палочек, выросших в анализируемом объеме воды, умножают на 1000 см 3 и делят на этот объем воды.
При отсутствии на фильтрах бактерий группы кишечных палочек колииндекс будет меньше той величины, которая была бы определена в случае обнаружения в анализируемом объеме одной клетки кишечной палочки.
Пример 1. При посеве 300 см 3 воды не выросло ни одной колонии. (1 × 1000) : 300 = 3. Колииндекс менее 3.
При наличии бактерий группы кишечных палочек вычисляют колииндекс, учитывая весь объем анализируемой воды.
Пример 2. При посеве трех объемов воды по 100 см 3 на одном фильтре выросло три колонии бактерий группы кишечных палочек, на двух других нет роста; колииндекс равен (3 × 1000) : 300 = 10. При посеве 10 и 100 см 3 воды на одном фильтре выросла одна колония, на другом выросло пять колоний; колииндекс равен (6 × 1000) : 110 = 54.
Если на одном из фильтров сплошной рост бактерий и подсчет их невозможен, тогда в расчет принимают тот объем воды, при фильтровании которого на фильтре выросли изолированные колонии.
Пример 3. В 100 см 3 — сплошной рост, в 10 см 3 — 12 бактерий группы кишечных палочек; колииндекс равен (12 × 1000) : 10 = 1200.
При подсчете колииндекса в пробах воды необеззараженной, с большим фекальным загрязнением, когда для анализа профильтровывают объем воды менее 10 см 3 или ее разведения, то для учета выбирают тот фильтр, на котором выросло не менее 10 и не более 30 изолированных колоний кишечных палочек. Количество колоний на нем, относимых к бактериям группы кишечных палочек, пересчитывают на 1 дм 3 с учетом только того объема воды, который профильтрован через этот фильтр.
Если на всех фильтрах получен более густой рост и анализ невозможно повторить, то допускается подсчет колоний на фильтре с наименьшим разведением, но с записью в протоколе исследования и в журнале регистрации.
Результат в виде колииндекса вносят в журнал регистрации и в протокол анализа, где помечают особые обстоятельства, имевшие место при анализе воды (отклонения в температуре инкубации, составе используемых сред, особенно добавки в среду Эндо и т.п.).
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 51232-98.
Сущность метода заключается в посеве определенных объемов анализируемой воды и подращивании при (37 ± 0,5) °С в средах накопления с последующим высевом бактерий на плотную среду Эндо, дифференцировании выросших бактерий и определении наиболее вероятного числа бактерий группы кишечных палочек в 1 дм 3 воды по таблицам.
а) при исследовании на этапах очистки и обеззараживания засевают 100,0; 10,0; 1,0 и 0,1 см 3 воды;
б) на выходе в водопроводную сеть и в наиболее характерных ее точках засевают три объема по 100,0 см 3 , три объема по 10,0 см 3 и три объема по 1,0 см 3 .
4.2.15. Указанные в п. 4.2.14 объемы воды помещают во флаконы и пробирки с глюкозопептонной или лактозопептонной средой и индикатором, снабженные поплавками или комочками ваты, погруженными на дно сосуда. Посев 100,0 и 10,0 см 3 воды производят во флаконы и пробирки соответственно с 10,0 и 1,0 см 3 концентрированной среды; посев 1,0 и 0,1 см 3 воды — в пробирки с 10,0 см 3 среды нормальной концентрации. Посевы инкубируют 24 ч при (37 ± 0,5) °С. Отсутствие помутнения и образования кислоты и газа во флаконах и пробирках позволяет получить отрицательный результат на наличие бактерий группы кишечных палочек в исследованном объеме воды и закончить исследование через 24 ч.
4.2.16. Из каждого флакона, где отмечены помутнение, кислота и газ, а также помутнение и кислота при использовании глюкозопептонной среды или помутнение при использовании лактозопептонной среды, высевают петлей штрихами на поверхность среды Эндо, разделенной на 3 — 4 сектора. Посевной материал следует брать с таким расчетом, чтобы получить изолированные колонии. При получении сплошного роста необходимо рассеивать посевной материал на чашку со средой Эндо для выделения изолированных колоний. Чашки помещают крышками вниз в термостат и инкубируют 16 — 18 ч при (37 ± 0,5) °С.
4.2.18. Если при высеве из флаконов и пробирок, где отмечены помутнение, кислота и газ, на секторах среды Эндо выросли темно-красные с металлическим блеском и без него (лактозоположительные) колонии, то их принадлежность к бактериям группы кишечных палочек подтверждают микроскопированием и постановкой оксидазного теста по п. 3.3.15.1.
Наличие грамотрицательных палочек в мазках и отрицательный оксидазный тест позволяют немедленно дать положительный ответ о наличии бактерий группы кишечных палочек в анализируемом объеме воды. Анализ воды по этапам очистки заканчивают учетом результатов по наличию или отсутствию на подтверждающей среде Эндо темно-красных колоний грамотрицательных палочек, не обладающих оксидазной активностью.
4.2.19. При анализе питьевой воды учитывают и те секторы, где выросли только розовые и бесцветные колонии, или где темно-красные колонии оказались оксидазоположительными. В этом случае из двух — трех разного типа колоний каждого сектора приготовляют мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют, а также проверяют оксидазную активность по п. 3.3.15.2.
4.2.20. При наличии только грамоположительных спорообразующих бактерий получают отрицательный результат.
4.2.21. Наличие активной оксидазы у всех бактерий, высеянных из флаконов или пробирок, кроме перечисленных в п. 4.2.17, позволяет также получить отрицательный результат. Анализ во всех этих случаях заканчивают через 40 — 42 ч.
4.2.22. При росте на секторах оксидазоотрицательных не окрашивающихся по Граму палочек две — три изолированные колонии разного типа с каждого сектора засеивают в полужидкую среду с глюкозой и инкубируют 4 — 5 ч при (37 ± 0,5) °С.
При наличии кислоты и газа получают положительный результат. При отсутствии кислоты и газа получают отрицательный результат, анализ заканчивают через 44 — 48 ч.
При наличии только кислоты пробирки оставляют на 24 ч для окончательного учета. При отсутствии газообразования через 24 ч получают окончательный отрицательный результат, при наличии газа — положительный результат.
Примечание . Допускается высев из пробирок и флаконов проводить на среду Эндо с добавкой молока или желатина, что даст возможность дифференцировать бактерии группы кишечных палочек от других водных сапрофитов, обладающих протеолитической активностью.
В готовую среду Эндо перед разливкой в чашки помимо 0,2 см 3 10 %-ного спиртового раствора основного фуксина и 0,2 см 3 5 %-ного спиртового раствора розоловой кислоты вводят 10 см 3 стерильного снятого молока (можно использовать сухое молоко, приготовленное по прописи на этикетке, или 15 см 3 стерильного 30 %-ного водного раствора желатина на 100 см 3 среды. При изготовлении среды Эндо следует учитывать воду, вводимую впоследствии с молоком или желатином. Вокруг колоний микробов, обладающих протеолитической активностью, образуются зоны просветления в результате преципитации при выпадении в осадок параказеина или углубления (кратеры) при разжижении желатина. В последнем случае после 16 — 18 ч инкубации чашки вынимают из термостата и оставляют на 1 — 2 ч при температуре 20 °С или в холодильнике для образования кратеров.
В этом случае о наличии на секторах среды Эндо бактерий группы кишечных палочек судят по обнаружению колоний грамоотрицательных неспороносных палочек, сбраживающих глюкозу до кислоты и газа при (37 ± 0,5) °С и не обладающих протеолитической активностью.
4.2.23. Результат анализа выражают в виде колииндекса (наиболее вероятное число бактерий группы кишечных палочек в 1 дм 3 воды), значение которого определяют по таблицам приложения. При анализе питьевой воды на выходе в водопроводную сеть и из нее колииндекс определяют по табл. 1 и 2 приложения. При анализе воды на этапах очистки и обеззараживания колииндекс определяют по табл. 3 приложения.
4.3. Дополнительные исследования на наличие бактерий — показателей свежего фекального загрязнения
При обнаружении бактериального загрязнения воды свыше допустимых норм должен проводиться повторный отбор проб с дополнительным их исследованием на наличие бактерий — показателей свежего фекального загрязнения.
Свежее фекальное загрязнение в воде устанавливают, определяя наличие кишечных палочек (преимущественно Escherichia coli), обладающих способностью ферментировать лактозу до кислоты и газа при (43 ± 0,5) °С в присутствии ингибиторов посторонней микрофлоры.
Если при повторном исследовании воды обнаружены на фильтрах темно-красные с металлическим блеском и без него (лактозоположительные) колонии бактерий группы кишечных палочек, то параллельно с определением колииндекса эти колонии (но не более 15) засевают в лактозную среду с борной кислотой, предварительно нагретую на водяной бане до (43 ± 0,5) °С. Затем засеянные пробирки вместе с баней переставляют в термостат и инкубируют 24 ч при (43 ± 0,5) °С. Наличие мути и газа указывает на присутствие в воде бактерий — показателей свежего фекального загрязнения. Признаки роста (помутнение) без образования газа во внимание не принимают.
Вместо лактозной среды с борной кислотой можно использовать желчно-лактозную среду с бриллиантовым зеленым, инкубируя посевы при (44,5 ± 0,5) °С.
4.3.2. Дополнительные исследования при работе бродильным методом
Если при повторном исследовании на секторах среды Эндо выросли темно-красные колонии с металлическим блеском и без него (лактозоположительные), то по две — три такие колонии с каждого сектора засевают в лактозную среду с борной кислотой или в желчно-лактозную среду с бриллиантовым зеленым. Анализ выполняют по п. 4.3.1.
При необходимости ускоренного анализа высев в эти лактозные среды можно производить параллельно с посевом на сектора среды Эндо непосредственно из пробирок и флаконов, где обнаружены признаки роста, кислота и газообразование.
Примечание . Дополнительные исследования на наличие бактерий — показателей свежего фекального загрязнения можно выполнять не только во время повторных, но и первичных анализов при резком ухудшении санитарно-бактериологической характеристики воды.
4.3.3. В протоколе анализа необходимо указать значение колииндекса, определяемое по основным методам и свидетельствующее о степени фекального загрязнения воды, а также наличие или отсутствие бактерий — показателей свежего фекального загрязнения, что устанавливают по дополнительным исследованиям.
4.3.4. При наличии на фильтрах или секторах среды Эндо бесцветных, прозрачных, нежных (реже слегка мутноватых) оксидазоотрицательных колоний необходимо их выделить и изучить для установления их принадлежности к патогенным бактериям кишечной группы.
Таблицы 1 и 2 для вычисления результатов анализа водопроводной воды бродильным методом заимствованы из Международного стандарта качества питьевой воды (1964 г.) со следующим добавлением: введены индексы при всех положительных и всех отрицательных результатах и даны титры (т.е. наименьшее количество воды, в котором еще содержится хотя бы одна микробная клетка), которые рассчитаны по формуле
По таблицам определяют наиболее вероятное значение индекса бактерий группы кишечных палочек, которое соответствует полученным комбинациям положительных и отрицательных результатов. Доверительные границы указывают бактериологу верхний и нижний пределы, в диапазоне которых может колебаться истинное количество бактерий с 95 %-ной вероятностью. При получении результатов анализа доверительные границы не указывают.
Для определения индекса кишечных палочек на этапах очистки и обеззараживания рекомендуется пользоваться табл. 3 в соответствии с однорядовой схемой посева четырех десятикратных объемов воды. При таком ограничении количества анализируемых объемов доверительные границы не могут быть рассчитаны, результаты следует считать ориентировочными.
В случае, когда необходимо получить более точные результаты, необходимо применять схему трехрядного посева и пользоваться для расчета табл. 1 с доверительными границами. Наиболее достоверные результаты могут быть получены методом мембранных фильтров.
При анализе воды большей степени загрязнения уменьшают объемы анализируемой воды в 10 или 100 раз с тем, чтобы в последнем объеме получить отрицательные результаты. При этом соответственно увеличивают в 10 или 100 раз индекс и уменьшают в 10 или 100 раз титр.
Из таблицы исключены редко встречающиеся комбинации положительных и отрицательных результатов. Если при анализе они получены более чем в 1 % случаев, то их следует отнести к техническим погрешностям анализа, выявить их причину и анализ повторить.
Определение индекса бактерий группы кишечных палочек
при исследовании 300 см 3 воды
источник