Меню Рубрики

Анализ на белки теплового шока

Если температура повышается, живой организм реагирует на это, производя своеобразные соединения, получившие название «белки теплового шока». Так реагирует человек, так отреагирует кошка, так реагирует любое существо, так как оно состоит из живых клеток. Впрочем, не только лишь рост температуры провоцирует синтез белка теплового шока хламидий, других видов. Нередко провоцируют ситуации сильные стрессы.

Так как белки теплового шока производятся организмом только в специфических ситуациях, они имеют ряд отличий от продуцируемых нормально соединений. Период их образования отличается угнетением экспрессии основного белкового пула, играющего важную роль для метаболизма.

БТШ-70 эукариот, DnaK прокариот – это такая семья, в которую ученые объединили белки теплового шока, значимые для выживания на клеточном уровне. Это означает, что благодаря таким соединениям клетка может продолжать функционирование даже в ситуации, когда стресс, нагрев, агрессивная среда противостоят этому. Впрочем, белки этого семейства могут участвовать и в протекающих в нормальных условиях процессах.

Если домены идентичны на 100 %, тогда эукариоты, прокариоты более чем на 50 % гомологичны. Ученые доказали, что в природе среди всех белковых групп именно 70 кДа БТШ – одна из наиболее консервативных. Посвящённые этому исследования были сделаны в 1988 и 1993 году. Предположительно объяснить явление можно через шаперонную функциональность, присущую белкам теплового шока во внутриклеточных механизмах.

Если рассматривать эукариоты, то под влиянием теплового шока происходит индуцирование генов БТШ. Если некоторая клетка избежала стрессовых условий, тогда факторы имеются в ядре, цитоплазме в качестве мономеров. Такому соединению не присуща активность связывания ДНК.

Переживая стрессовые условия, клетка ведет себя следующим образом: Hsp70 отщепляется, что инициирует продуцирование денатурированных белков. БТШ формирует триммеры, активность меняет свой характер и задевает ДНК, что приводит со временем к аккумуляции компонентов в ядре клетки. Процесс сопровождается многократным ростом транскрипции шаперонов. Безусловно, спровоцировавшая это ситуация со временем проходит, и к моменту, когда это случается, Hsp70 вновь может включиться в БТШ. Активность, связанная с ДНК, сходит на нет, клетка продолжает работать, как ни в чем не бывало. Такую последовательность происходящего удалось выявить еще в 1993 году в исследованиях, посвященных БТШ, проведенных Моримото. Если организм поражен бактериями, тогда БТШ могут концентрироваться на синовиальной оболочке.

Ученым удалось выявить, что БТШ формируются как результат влияния самых разных негативных, опасных для жизнедеятельности клетки ситуаций. Стрессовые, повреждающие влияния извне могут быть исключительно разнообразными, но приводящими к одному и тому же варианту. За счет БТШ клетка выживает при влиянии агрессивных факторов.

Известно, что БТШ подразделяются на три семейства. Кроме того, ученые выявили, что существуют антитела к белку теплового шока. Подразделение на группы БТШ производится с учетом молекулярной массы. Три категории: 25, 70, 90 кДа. Если в живом организме есть нормально функционирующая клетка, тогда внутри нее наверняка найдутся различные белки, перемешанные между собой, довольно-таки сходные. Благодаря БТШ денатурированные белки, а также свернувшиеся некорректно, могут снова стать раствором. Впрочем, кроме этой функции, есть и некоторые другие.

До сих пор белок теплового шока хламидий, равно как и иные БТШ, не изучен окончательно. Конечно, есть некоторые группы белков, о которых ученые располагают довольно большим объемом данных, а есть такие, которые еще только предстоит освоить. Но уже сейчас наука дошла до того уровня, когда знания позволят говорить, что при онкологии белок теплового шока может оказаться действительно полезным средством, позволяющим победить одну из самых страшных болезней нашего века – рак.

Наибольшим объемом данных ученые располагают о БТШ Hsp70, способных вступать в связи с различными белками, агрегатами, комплексами, даже с аномальными. Со временем происходит высвобождение, сопровождаемое соединением АТР. Это значит, что в клетке снова появляется раствор, а белки, прошедшие некорректно процесс свертывания, могут заново быть подвергнуты этой операции. Гидролиз, соединение АТР – механизмы, сделавшие это возможным.

Сложно переоценить для живых организмов роль белков теплового шока. Любая клетка всегда содержит аномальные белки, чья концентрация может расти, если к этому есть внешние предпосылки. Типичная история – это перегрев или влияние инфекции. Это означает, что для продолжения жизнедеятельности клетки необходимо срочно сгенерировать большее количество БТШ. Активируется механизм транскрипции, что инициирует выработку белков, клетка подстраивается под меняющиеся условия и продолжает функционировать. Впрочем, наравне с уже известными механизмами многое еще только предстоит открыть. В частности, таким довольно большим полем для деятельности ученых являются антитела к белку теплового шока хламидий.

БТШ, когда полипептидная цепочка увеличивается, а они оказываются в условиях, делающих возможным вступление с нею в связь, позволяют избежать неспецифической агрегации и деградации. Вместо этого фолдинг происходит в нормальном режиме, когда в процессе задействованы необходимые шапероны. Hsp70 дополнительно необходим при развертке полипептидных цепей при участии АТР. Посредством БТШ удается достичь того, что неполярные участки также подвержены влиянию ферментов.

В России ученые ФМБА смогли создать новый препарат, применив для его построения белок теплового шока. Лекарство от рака, представленное научными сотрудниками, уже прошло первичную проверку на подопытных грызунах, пораженных саркомами, меланомами. Эти эксперименты позволили уверенно говорить, что сделан значительный шаг вперед в борьбе с онкологией.

Ученые предположили и смогли доказать, что белок теплового шока – лекарство, а точнее, может стать основой для эффективного препарата, во многом именно благодаря тому, что эти молекулы формируются в стрессовых ситуациях. Так как они изначально организмом продуцируются, чтобы обеспечить выживание клеток, было сделано предположение, что при должной комбинации с другими средствами можно бороться даже с опухолью.

БТШ помогает препарату обнаруживать в больном организме пораженные клетки и справляться с некорректностью ДНК в них. Предполагают, что новый препарат станет в равной степени результативным для любого подтипа злокачественных заболеваний. Звучит похоже на сказку, но врачи идут еще дальше – они предполагают, что излечение будет доступным на совершенно любой стадии. Согласитесь, такой белок теплового шока от рака, когда пройдет все испытания и подтвердит свою надежность, станет бесценным приобретением для человеческой цивилизации.

Наиболее подробную информацию о надежде современной медицины рассказал доктор Симбирцев, один из тех, кто работал над созданием медикамента. Из его интервью можно понять, по какой логике ученые построили препарат и каким образом он должен принести эффективность. Кроме того, можно сделать выводы, прошел ли уже белок теплового шока клинические испытания или это еще впереди.

Как уже было указано ранее, если организм не переживает стрессовых условий, тогда продуцирование БШ имеет место в исключительно малом объеме, но он существенно возрастает с изменением внешнего влияния. В то же время нормальный организм человека не в состоянии продуцировать такое количество БТШ, которое помогло бы победить появившееся злокачественное новообразование. «А что произойдет, если ввести БТШ извне?» – подумали ученые и сделали эту идею основой для исследования.

Чтобы создать новое лекарство, ученые в лабораторных условиях воссоздали все необходимое, чтобы живые клетки начали продуцировать БТШ. Для этого был получен человеческий ген, претерпевший клонирование при применении новейшей аппаратуры. Бактерии, исследованные в лабораториях, видоизменялись до тех пор, пока не начали самостоятельно продуцировать столь желанный для ученых белок.

Научные работники на основе полученной при исследованиях информации сделали выводы о влиянии БТШ на человеческий организм. Для этого пришлось организовать рентгеноструктурный анализ белка. Сделать это совсем непросто: пришлось направить пробы на орбиту нашей планеты. Это обусловлено тем, что земные условия не подходят для правильного, равномерного развития кристаллов. А вот космические условия допускают получение именно тех кристаллов, которые были нужны ученым. По возвращении на родную планету подопытные образцы были разделены между японскими и русскими учеными, которые взялись за их анализ, что называется, не теряя ни секунды.

Пока работы в этом направлении все еще ведутся. Представитель группы ученых сказал, что удалось точно установить: нет точной связи между молекулой БТШ и органом или тканью живого существа. А это говорит об универсальности. Значит, если белок теплового шока и найдет применение в медицине, он станет панацей сразу от огромного количества заболеваний – какой бы орган ни оказался поражен злокачественным новообразованием, его удастся вылечить.

Первоначально ученые изготовили препарат в жидкой форме – подопытным его вводят инъективно. В качестве первых экземпляров для проверки средства были взяты крысы, мыши. Удалось выявить случаи излечения как на начальных, так и на поздних стадиях развития болезни. Текущая стадия именуется доклиническими испытаниями. Ученые оценивают сроки ее завершения не менее чем в год. После этого придет время клинических испытаний. На рынке новое средство, возможно, панацея, будет доступно еще через 3-4 года. Впрочем, как отмечают ученые, все это реально лишь в том случае, когда проект найдет финансирование.

Конечно, обещания врачей звучат привлекательно, но в то же время справедливо вызывают недоверие. Сколько времени человечество страдало от рака, как много жертв у этой болезни было в последние несколько десятилетий, а тут обещают не просто эффективный препарат, но настоящую панацею – от любого вида, на любом сроке. Да как можно поверить в такое? А хуже того – поверить, но не дождаться, или дождаться, но окажется, что вовсе средство не так хорошо, как того ожидали, как это было обещано.

Разработка препарата – это методика генной инженерии, то есть наиболее передовой области медицины как науки. Это означает, что при должном успехе результаты и правда должны быть впечатляющими. Впрочем, одновременно это означает, что процесс исключительно дорогостоящий. Как правило, инвесторы готовы вкладывать довольно большие средства в многообещающие проекты, но когда тематика настолько громкая, давление большое, а временные рамки довольно размыты, риски оцениваются как огромные. Это сейчас звучат оптимистичные прогнозы на 3-4 года, но все знатоки рынка хорошо знают, сколь часто временные рамки расползаются до десятилетий.

Биотехнологии – это область, для обывателя закрытая к пониманию. Поэтому остается только надеяться на слова «успешность доклинических испытаний». Рабочее наименование препарат получил «Белок теплового шока». Впрочем, БТШ – это только главный компонент медикамента, обещающего стать прорывом на рынке лекарств против онкологии. Кроме него, в состав предполагается включение еще ряда полезных веществ, что будет гарантом действенности средства. А возможным все это стало благодаря тому, что новейшие исследования БТШ показали, что молекула не просто помогает уберечь от повреждения живые клетки, но еще и является для иммунитета этаким «указующим перстом», помогающим выявить, какие клетки поражены опухолью, а какие нет. Проще говоря, при появлении в организме в достаточно большой концентрации БТШ, как надеются ученые, иммунный ответ сам по себе уничтожит больные элементы.

Подводя итоги, можно сказать, что новинка против опухоли основана на том, что организм и сам имеет средство, которое могло бы уничтожить новообразование, просто от природы оно достаточно слабое. Концентрация настолько мала, что ни о каком терапевтическом эффекте не приходится и мечтать. В то же время частично БТШ находятся в клетках, не пораженных опухолью, и из них молекула никуда не «уйдет». Поэтому и необходима поставка полезного вещества извне – чтобы оно далее директивно влияло на пораженные элементы. Между прочим, пока ученые предполагают, что даже побочных эффектов у препарата не будет – и это при столь высокой результативности! А объясняют такое «волшебство» тем, что исследования показали – токсичности нет. Впрочем, окончательные выводы будут сделаны, когда доклинические испытания подойдут к концу, что потребует не менее года.

источник

Хламидиоз − бактериальное инфекционное заболевание, вызываемое грамотрица-тельными облигатными внутриклеточными бактериями. Известно 4 вида хламидий: trachomatis, pneumoniae, psittaci, pecorum. Хламидия trachomatis подразделяется на 15 сероваров. Заболевание, вызываемое хламидиями, часто подострого или хронического течения. Характеризуется поражением половых органов, глаз, органов дыхательной системы, суставов.
Клинические проявления данного заболевания многообразны и полисистемны. Если манифестный период заболевания может протекать в виде уретрита, проктита, конъюнктивита, фарингита, венерической лимфогранулемы, пневмонии, отита, бронхиолита, то выраженность клинических симптомов при хронической инфекции минимальна. Наибольшие диагностические трудности представляют бессимптомные формы. Это могут быть: поражения суставов, синдром Рейтера, опухоли урогенитального тракта, а также сальпингит, внематочная беременность, бесплодие, послеродовый эндометрит, преждевременные роды, невынашивание беременности, мертворождение – у женщин; эпидидимит, простатит – у мужчин.
В настоящее время урогенитальный хламидиоз является самой распространённой (до 60 %) причиной негонококковых уретритов. Длительное время скрыто существуя, при неблагоприятных условиях (воздействие антибиотиков, изменение гормонального статуса, перегревание, переохлаждение) хламидии способны трансформироваться в так называемые L-формы — как бы «впадают в спячку». При этом они становятся недоступными для уничтожения иммунной системой, как бы уходят от иммунного ответа. Данный феномен способствует длительному внутриклеточному персистированию. При делении клеток организма спящие хламидии передаются дочерним клеткам. В период (подавления защитных сил возможно активное размножение и пробуждение хламидий из L-форм.
Белки теплового шока, к которым относится сHSP-60, обнаружены в клетках практически всех живых организмов, от бактерий до человека. Белки теплового шока называ-ют согласно их молекулярным массам. Например, наиболее изученные белки теплового шока Hsp60, Hsp70 и Hsp90. Их относятся к семействам белков с молекулярными масса-ми 60, 70 и 90 кДа, соответственно.

Функции белков теплового шока:

Белки теплового шока действуют как внутриклеточные шапероны, главная функция которых состоит в восстановлении правильной нативной третичной или четвертичной структуры белков,
Участвуют в образовании и диссоциации белковых комплексов в отношении других белков.
Играют важную роль в белок-белковых взаимодействиях, например, при сворачивании в третичную структуру и сборке сложных белков, препятствуют нежелательной агрегации белков.
Стабилизируют частично свернутые белки и облегчают их транспорт через мембраны внутри клетки. В течение инфекционного процесса микроорганизмы значительно повы-шают синтез HSP для того, чтобы защититься от посторонних (внешних) иммунологических защитных механизмов. Иммунный ответ на него организма-хозяина может быть как защитным, так и патологическим.

Обнаружение антител класса G к белку теплового шока Chlamydia trachomatis (cHSP60) характеризует персистирующее течение хламидиоза. Появление антител к cHSP60 является предвестником развития иммунопатологического процесса и указывает на уже существующие аутоиммунные процессы. Повышенная выработка как человеческих, так и микробных белков теплового шока приводит к образованию антител. Антитела к сохраненным эпитопам бактериальных сHSP60 вступают в перекрестную реакцию с человеческим сHSP60, что в итоге приводит к развитию аутоиммунного процесса и поддержанию вос-палительной реакции.

Недиагностированная или неэффективно пролеченная хламидийная инфекция может привести к хронической персистенции патогенов. На этой стадии происходит повышенная выработка как человеческих, так и микробных HSP, причем микробные HSP 60 отвечают в основном за развитие иммунопатологических процессов. Антитела к сохраненным эпитопам микробных HSP 60 вступают в перекрестную реакцию с человеческим HSP 60, которая в итоге приводит к аутоиммунным ответам.
HSP 60 присутствует как в ретикулярных, так и в элементарных тельцах хламидий, но его активный синтез начинается только при непродуктивной латентной инфекции. Таким образом, при персистирующем хламидиозе идет активный синтез HSP 60. Иммунный от-вет на хламидийный HSP 60 связан с инфекцией верхнего отдела урогенитального тракта.
Персистирующая инфекция не поддается лечению антибиотиками, так как в неразви-вающихся ретикулярных тельцах прекращаются метаболические процессы. Диагноз этой формы болезни ставят на основании данных культурального исследования – обнаружение в мазках специфических мелких форм хламидийных включений, а также по данным серологического исследования: определение IgG и IgA-АТ к основному белку наружной мембраны Ch. Trachomatis МОМР и определение IgG-антител к HSP 60 Ch. trachomatis.

Метод определения HSP-60– обнаружение антител методом иммуноферментного анализа (ИФА).

Материал для исследования : сыворотка крови

источник

Антитела класса IgG к белку теплового шока Chlamydia trachomatis cHSP60 (Anti-cHSP60-IgG) — показатель, использующийся в качестве прогностического теста оценки иммунопатологических реакций и их осложнений при развитии хламидийной инфекции.

Chlamydia trachomatis (хламидия) — патогенные микроорганизмы для человека, поражающие главным образом мочеполовую систему человека и являются причиной урогенитального хламидиоза.

Инфекция передаётся чаще половым или контактно-бытовым путём. Chlamydia trachomatis вызывает хламидиоз как у мужчин, так и у женщин.

Неосложненный хламидиоз у женщин наблюдается в виде слизисто-гнойного цервицита. Часто хламидиоз у женщин протекает с малыми клиническими признаками, иногда практически бессимптомно. Болезнь часто распознается уже при наличии осложнений. Осложнения хламидиоза протекают форме воспалительным заболеваниям органов малого таза — уретрит, эндометрит, цервицит, сальпингит, сальпингоофорит, проктит. Эти осложнения являются, в свою очередь, причиной серьезных нарушений в репродуктивной сфере — бесплодие, спонтанные аборты. Считается, что 50% бесплодных женщин являются инфицированными Chlamydia trachomatis. Не исключено инфицирование новорожденных, матери которых являются носителями этой инфекции, что проявляется конъюктивитом новорожденных.

У мужчин до 30% случаев хламидиоз протекает с невыраженными клиническими проявлениями и длительное время остаётся нераспознанным. Неосложненный хламидиоз у мужчин чаще протекает в виде уретрита. Частым осложнением хламидийной инфекции у мужчин является эпидидимит, что может быть причиной мужского бесплодия.

Chlamydia trachomatis — этиологический фактор (помимо кишечных инфекций, при наличии генетической предрасположенности) системного патогенного влияния этого микроорганизма, клинически проявляющегося в виде синдрома (болезни) Рейтера. Синдром Рейтера (триада признаков) — сочетанное поражение мочеполовых органов (уретрит и простатит), суставов (артриты) и развитие конъюнктивита.

Читайте также:  Белка много в анализах беременной

Хламидийный белок теплового шока ответственен за развитие различных иммунопатологических процессов, которые могут привести к хроническому инфекционному заболеванию. Появление антител к cHSP60 является предвестником развития иммунопатологических реакций и указывает на уже существующие аутоиммунные процессы. Показано, что cHSP60 активно синтезируются при латентной инфекции. Стрессовые белки (HSP) вырабатываются клетками, как человека, так и бактерий. Их гомология (схожесть) у человека и бактерий составляет 60%. Наиболее изученные белки теплового шока HSP60, HSP70 и HSP90 (семействам белков с молекулярными массами 60, 70 и 90 кДа, соответственно). HSP быстро синтезируются микробной клеткой для защиты от иммунологических механизмов защиты человека. На эти стрессовые белки, в частности на HSP60, находящиеся в хламидиях, у человека вырабатываются антитела — Anti-cHSP60. Поскольку такие же белки есть и у человека, то происходит перекрестная реакция между антителами против стрессовых белков бактерий со стрессовыми белками человека. Это приводит к развитию аутоиммунных процессов в организме человека при инфицировании Chlamydia trachomatis. Разнообразные иммунопатологические процессы при хламидийной инфекции и осложнения хламидийной инфекции можно оценивать по наличию антител к HSP60. К таким осложнениям относятся — преждевременные роды, привычный и самопроизвольный аборты, эктопическая беременность, бесплодие вследствие полной обтурации трубного просвета и др.

Подтверждение наличия персистирующей инфекции Chlamydia trachomatis; оценка выраженности патологических реакций при инфицировании Chlamydia trachomatis.

источник

Определение антител класса G к белку теплового шока Chlamydia trachomatis (cHSP60) позволяет диагностировать персистирующую форму хламидийной инфекции.

Выявление скрытого хламидиоза.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

Специальной подготовки не требуется.

Общая информация об исследовании

Хламидиоз, вызванный Chlamydia trachomatis, является наиболее распространенной инфекцией во всем мире, передающейся половым путем. У мужчин данная инфекция проявляется чаще уретритом, у женщин уретритом, цервицитом и эндометритом. Острый хламидиозный цервицит может приводить, по крайней мере, к трем типам осложнений: к восходящей инфекции с развитием воспалительных заболеваний органов малого таза; к восходящей инфекции во время беременности, приводящей к преждевременным родам, послеродовым и неонатальным инфекционным осложнениям, а также к развитию карциномы шейки матки. Помимо этого, в 3-4 раза повышается риск передачи ВИЧ. По данным Всемирной организации здравоохранения, регистрируется 101 миллион случаев хламидийных инфекций ежегодно.

Хламидии являются облигатными внутриклеточными бактериями, имеющими яйцевидную или сферическую форму. Внутриклеточный паразитизм хламидий отличает его от других бактерий и объединяет с вирусами. От вирусов хламидий отличает наличие как ДНК, так и РНК; содержание собственной рибосомы, наличие клеточной оболочки и восприимчивость к противомикробной терапии. Заражение чаще всего происходит половым путем, а также контактно-бытовым. В организме человека хламидии представлены двумя формами. Внутри клеток они представлены ретикулярными тельцами, созревая, переходят в элементарные тельца, которые выходят из пораженной клетки и внедряются в другие клетки, снова превращаясь в ретикулярные тельца. Непрерывный переход хламидий из одной формы в другую с поражением новых клеток обуславливает наличие воспалительного процесса. Клинические проявления первичной инфекции чаще скудные, или их нет совсем. У женщин она проявляется в виде слизисто-гнойных выделений из влагалища, болями в области гениталий и нижней части живота, иногда с незначительным подъемом температуры. У мужчин могут быть скудные стекловидные выделения из мочеиспускательного канала, боли в паховой области, жжение при мочеиспускании. Инфекция может перейти в персистирующее течение (хроническую инфекцию), что обуславливается задержкой созревания ретикулярной формы в элементарную. При этом снижается реакция иммунитета на инфекцию. Ретикулярные формы продуцируют в малом или следовом количестве хламидийные антигены, однако синтез специфических антигенов − белков теплового шока Chlamydia trachomatis (cHSP60) − продолжается. Данные белки cHSP60 Chlamydiatra chomatis смешиваются с активно продуцирующимися собственными белками теплового шока cHSP60 человека, что может привести к аутоиммунной реакции. Процессы, происходящие во время этих реакций, приводят к повреждению тканей и развитию фиброза пораженных органов.

Определение иммуноглобулинов G к белкам теплового шока Chlamydia trachomatis (cHSP60) может выявить персистирующее (хроническое) течение хламидиоза, при этом подразумевать наличие аутоиммунных реакций. Выявление персистирующей формы имеет важное клиническое значение в тактике диагностики и лечения хламидиоза, выявления и предупреждения осложнений.

Когда назначается исследование?

  • При женском бесплодии, невынашивании беременности, внематочной беременности, мертворождениях, эндометрите, сальпингите, цервиците, особенно возникших во время беременности, синдроме Рейтера;
  • у мужчин − при остром баланопостите, орхите, простатите;
  • у молодых мужчин (реже женщин) − при несимметричном суставном синдроме, конъюнктивите;
  • у детей − при конъюнктивите, пневмонии, отите, бронхиолите;
  • при неэффективно пролеченной хламидийной инфекции;
  • при неоднократном выявлении специфических антител к хламидиям без тенденции к снижению.

Референсные значения: отрицательный результат.

Возможные варианты результатов исследования:

  • отрицательный;
  • положительный;
  • сомнительный.

При положительном результате выдается коэффициент позитивности (КП).

Коэффициент позитивности − это отношение оптической плотности пробы пациента к пороговому значению. КП характеризует степень позитивности исследуемой пробы и может быть полезен врачу для правильной интерпретации полученного результата. Поскольку коэффициент позитивности не коррелирует линейно с концентрацией антител в пробе, не рекомендуется использовать КП для динамического наблюдения за пациентами, в том числе контроля эффективности лечения.

  • высокая вероятность трубного фактора бесплодия, индуцированного Chlamydia trachomatis;
  • перекрестные реакции с антителами к сHSP60 других бактерий;
  • ложноположительные реакции возможны при соматических и инфекционных заболеваниях, сопровождающихся обширными деструктивными процессами в пораженных органах (цирроз печени, туберкулез легких и других тканей, онкологические заболевания), различных аутоиммунных заболеваниях (наличие ревматоидного фактора IgM и других аутоантител), антифосфолипидном синдроме, беременности.
  • инфицирование в прошлом (при наличии антител IgA, IgG к Chlamydia trachomatis);
  • инфекция не обнаружена;
  • ложноотрицательная реакция возможна у иммуносупрессированных лиц, а также у лиц с индивидуальными особенностями иммунной системы и жизнедеятельности возбудителя (низкая иммуногенность).
  • низкий уровень антител;
  • неспецифические сывороточные интерференции − рекомендуется повторить исследование.



[07-013] Chlamydia trachomatis, IgA [07-015] Chlamydia trachomatis, IgМ [10-005] Посев на Chlamydia trachomatis
  • Meenakshi Malhotra, Seema Sood, Anjan Mukherjee, Sumathi Muralidhar, Manju Bala. Genital Chlamydia trachomatis: An update / Indian J Med Res. 2013 Sep; 138(3): 303–316.
  • Agrawal T, Vats V, Salhan S, Mittal A. Mucosal and peripheral immune responses to chlamydial heat shock proteins in women infected with Chlamydia trachomatis. / Clin Exp Immunol. 2007 Jun; 148(3): 461–468.

источник

Тем фактом, что человеческий организм, это сложноорганизованная система со множеством всяких разных премудростей, никого не удивишь. Отчасти разобраться в некоторых из этих премудростей, а также вывести кое-кого на чистую воду, мы с Вами попытаемся в этой статье.

Клетки и гены. Ознакомление

Наш с Вами организм состоит из более чем 100 триллионов клеток (10 в 14 степени или 100 000 000 000 000), которые снабжены механизмами регуляции своего деления, механизмами ликвидации и утилизации отживших свой век клеток, механизмами адаптации к изменениям окружающей среды и многими другими. Эти механизмы заложены в ДНК.

ДНК — Дезоксирибонуклеиновая кислота — макромолекула (одна из трёх основных, две другие — РНК и белки), обеспечивающая хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. ДНК содержит информацию о структуре различных видов РНК и белков. С химической точки зрения ДНК — длинная полимерная молекула, состоящая из повторяющихся блоков — нуклеотидов. Каждый нуклеотид состоит из азотистого основания, сахара (дезоксирибозы) и фосфатной группы. Находится в ядрах клеток, в составе хромосом, имеет в своём составе гены.

Ген (др.-греч. γένος — род) — структурная и функциональная единица наследственности живых организмов. Ген представляет собой участок ДНК, задающий последовательность определённого полипептида (белка) либо функциональной РНК. Гены (точнее, аллели генов) определяют наследственные признаки организмов, передающиеся от родителей потомству при размножении.
РНК — Рибонуклеиновая кислота — одна из трёх основных макромолекул (две другие — ДНК и белки), которые содержатся в клетках всех живых организмов.
Так же, как ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота), РНК состоит из длинной цепи, в которой каждое звено называется нуклеотидом. Каждый нуклеотид состоит из азотистого основания, сахара рибозы и фосфатной группы. Последовательность нуклеотидов позволяет РНК кодировать генетическую информацию. Все клеточные организмы используют РНК (матричную РНК или мРНК) для программирования синтеза белков. Клеточные РНК образуются в ходе процесса, называемого транскрипцией, то есть синтеза РНК на матрице ДНК, осуществляемого специальными ферментами — РНК-полимеразами. Затем матричные РНК (мРНК) принимают участие в процессе, называемом трансляцией. Трансляция — это синтез белка на матрице мРНК при участии рибосом. Другие РНК после транскрипции подвергаются химическим модификациям, и после образования вторичной и третичной структур выполняют функции, зависящие от типа РНК.

Рибосо́ма — важнейший немембранный органоид живой клетки, служащий для биосинтеза белка из аминокислот по заданной матрице на основе генетической информации, предоставляемой матричной РНК (мРНК). Этот процесс называется трансляцией. Рибосомы имеют сферическую или слегка эллипсоидную форму, диаметром 25—30 нанометров, состоят из большой и малой субъединиц.
Для понимания изложенного далее нам нужно знать, что такое экспрессия генов.

Экспрессия генов — это процесс, в ходе которого наследственная информация от гена (последовательности нуклеотидов ДНК) преобразуется в функциональный продукт — РНК или белок. Каждый белок, регулирующий определённый процесс в клетке, кодируется (управляется) определённым геном. Экспрессия гена — синтез и активация того белка, который этим геном кодируется.

Есть в нашем организме множество белков — так называемых «белков теплового шока» (БТШ).
Белки теплового шока (англ. HSP, Heat shock proteins) — это класс функционально сходных белков, экспрессия которых усиливается при повышении температуры или при других стрессирующих клетку условиях (развитие воспаления, инфекция, выраженная недостаточность необходимых питательных веществ, гипоксия и обезвоживание).
Повышение экспрессии генов, кодирующих белки теплового шока, регулируется на этапе транскрипции. Чрезвычайное усиление экспрессии является частью клеточного ответа не только на тепловой шок (нагревание до температуры сворачивания белка), но и на любое сильное стрессовое воздействие. Открыты и выделены данные белки были в условиях воздействия теплового шока, повышающего их экспрессию в 100% случаев. Отсюда и их название. Эти белки обнаружены в клетках практически всех живых организмов, от бактерий до человека. Белки теплового шока называют согласно их молекулярным массам. Например, наиболее изученные белки теплового шока Hsp60, Hsp70 и Hsp90 относятся к семействам белков с молекулярными массами 60, 70 и 90 кДа (кДа -килодальтон — единица измерения молекулярной массы), соответственно.

Теория ВИЧ/СПИД и белки иммуноблота или сказка о белом бычке.

При обследовании самым «высокочувствительным» и «высокоспецифичным» методом — иммуноблотом, если обнаруживаются антитела к следующим белкам: оболочки вируса (env) — gp160, gp120, gp41; ядра вируса (gag) — p17, p24, p55, а также ферментов вируса (pol) — р31, p51, p66 человеку ставят диагноз «ВИЧ-инфекция». Этот анализ считается золотым стандартом, которым проверяют после ИФА тестирования, давшего положительную реакцию. «В человеческом геноме, нет гена, который бы кодировал все эти белки» — говорит нам индустрия СПИД-истеблишмента. В этом случае и белков таких в человеческом организме не должно быть. Но природа распорядилась иначе (как только посмела-то, не советуясь с представителями СПИД -индустрии!).

В клетке синтезируется несколько фракций БТШ с различными молекулярными массами (Feder, Hofmann, 1999). Фракции БТШ разных организмов, приблизительно соответствуют друг другу по молекулярной массе.Общепринятой стала классификация, основанная на разделении БТШ по молекулярным массам на несколько семейств (Lindquist, 1986):

1) семейство малых или низкомолекулярных БТШ (нмБТШ) с молекулярными массами от 10 до 30 кДа; (низкомолекулярные БТШ (нмБТШ) массой 10 — 30 кДа) наименее консервативны в эволюции и проявляют видовую специфичность (Vos et al., 2008). Гены малых БТШ имеют бимодальную экспрессию. С одной стороны, они координированно активируются ТШ (и иными стрессорами), с другой стороны, независимо экспрессируются на разных стадиях развития (Mason et al.)
В частности, приписываемые ядру вируса ВИЧ-1 белки р17 и р24 и ВИЧ-2 р26 относятся просто к группе низкомолекулярных БТШ. Обращаю внимание на фразу —
«независимо экспрессируются на разных стадиях развития». Это объясняет положительность беременных женщин по иммуноблоту.

2) группа высокомолекулярных БТШ, ее основные семейства:
— БТШ40 (40 кДа); относится к группе J-белков, гомологичных белку DnaJ E. сoli (Hartl, Hayer-Hartl, 2002). DnaJ – белок с молекулярной массой 41 кДа. Он обладает шаперонной активностью (может связываться с определёнными белками и предотвращать их агрегацию, т.е склеивание между собой). У человека найдено несколько десятков представителей семейства J-белков (Fan et al., 2003). Также белком с молекулярной массой 41кДа является альфа-актин миокарда, который кодируется локализованным на хромосоме 15 геном АСТС. . Специфическая для миокарда изоформа тропонина I (кодируемая геном TNNI3, локализованным на хромосоме 19) представляет собой белок с молекулярной массой 31 кДа, который выступает в роли ингибиторной субъединицы тропонинового комплекса, ослабляющей взаимодействие между актином и миозином.
В литературе появляется все больше информации, что одной из причин ГКМП (гипертрофическая кардиомиопатия) являются миссенс-мутации в гене сердечного тропонина. Тогда как антитела к р31 и р41 в этом случае будут говорить об аутоиммунном поражении миокарда. Оно также может быть спровоцировано ответной реакцией на микроорганизм (вирус, бактерию, грибок) вызвавший кардит (воспаление сердечной мышцы — миокардит, околосердечной сумки — перикардит либо внутренней выстилки и клапанов -эндокардит).
— БТШ60 (белки с молекулярными массами 58, 60 кДа); необычное семейство стрессовых белков, выделяемое в особую группу. К ним относятся бактериальный GroEL, митохондриальный БТШ60, эукариотический цитозольный ССТ (Chaperonin Containing ТСР-1 (ТСР-1 — tailless complex polypeptide-1)), также называемый TRiC, и БТШ60 архебактерий. ССТ не требует белковых кофакторов для функционирования. GroEL и БТШ60 нуждаются в кофакторах – GroES или БТШ10.

gр120
Клетки околощитовидных желез (участвующих в регуляции обмена кальция и фосфора)«ощущают» концентрацию ионизированного кальция своими рецепторами, в относительно большом количестве расположенными на внешней стороне клеточных мембран, — CaR. Этот рецептор с молекулярной массой 120 кДа сопряжен с G-белком и принадлежит к С-группе суперсемейства таких рецепторов. По аминокислотной последовательности CaR гомологичен метаботропным глутаматным рецепторам в ЦНС, рецептору γ-аминомасляной кислоты типа В и большому семейству рецепторов феромонов.
gр160 — белок среднемолекулярных нейрофиламентов (NF-M)
молекулярной массой 160 кДа. Нейрофиламенты находятся в цитоплазме нейронов (ЦНС).
р55 содержится в мембранах и митохондриях печёночных клеток
р66
Эластин является специализированным белком с молекулярной массой от 64 до 66 кДа. В эластине присутствуют десмозин и изодесмозин, из-за чего он может растягиваться в двух направлениях. Эластин содержится в коже и хрящевой ткани.

Как видим, белков с молекулярной массой, «присвоеной» разным фрагментам вириона ВИЧ, в организме предостаточно. Более того, БТШ с аналогичными мол.массами присутствуют в самых разнообразных микроорганизмах — бактериях, вирусах, грибках, дрожжеподобных грибах. Для последних характерны белки с мол.массой 51 кДа (известные нам как белки ферментов вируса ВИЧ р51). Самые обычные пищевые белки нередко имеют в своём составе полипептиды с такими же мол.массами. Антитела к белкам этих молярных масс могут иметь самое следующее происхождение:
1. Вследствии дефицита антиоксидантов, особенно жирорастворимых, таких как витамины А и Е, нарушается правильный метаболизм арахидоновой кислоты, от метаболизма которой зависит очень многое в клетках. Особенно важен правильный метаболизм этой кислоты для корректной работы генетического аппарата и всей иммунной системы. Когда не хватает жирорастворимых антиоксидантов (АОХ) и правильный метаболизм арахидоновой жирной кислоты (из-за недостатка АОХ и/или дефицита самой арахидоновой к-ты), то повреждаются как нуклеиновые кислоты (те или иные гены могут быть повреждены. Например, ген р53, кодирующий одноимённый белок, ответственный за апоптоз и предотвращающий тем самым развитие онкологии) клеток, так и мембраны клеток. Последние повреждаются радикалами, что приводит к повышенному синтезу БТШ, а изменённый метаболизм арахидоновой к-ты приводит к аутоиммунной реакции — синтезу антител к собственным БТШ. Любые аутоиммунные заболевания также служат причиной появления данных антител в крови.
2. Если эти белки принадлежат микроорганизмам, вторгшимся в макроорганизм. В процессе выработки антител к микроорганизмам, вырабатываются и антитела к их белкам.
3. Элементарная пищевая непереносимость, т.е антитела к некоторым пищевым белкам. Так, пшеница содержит много белков с мол.массой 120 кДа.
4. Экспрессия генов, кодирующих БТШ, периодически происходящая в процессе развития любых организмов. Далее, при изменённом метаболизме арахидоновой к-ты, может возникать выработка антител к транзиторно синтезируемым БТШ.
При этом стоит обратить внимание, что во всех случаях, кроме п.4 (если метаболизм арахидоновой к-ты имеет незначительные отклонения) будет иметь место иммунодефицитное состояние (в случаях п.1 и п.3 из-за сильно изменённого метаболизма арахидновой к-ты, а в случае п.2 из-за частичного истощения иммунной системы инфекционными агентами) той или иной степени выраженности. Просто идеальная почва для подтверждения лженаучного псевдодиагноза «ВИЧ», таким методом, как иммуноблот.

Также мол.массу в 24 кДа имеет белок тескальцин, относящийся к семейству кальцийсвязывающих клеточных белков и играющий важную роль в процессах пролиферации и диффиренцировки клеток.

Пролиферация (от лат. proles — отпрыск, потомство и fero — несу) — разрастание ткани организма путём размножения клеток делением.

Дифференцировка клеток — процесс реализации генетически обусловленной программы формирования специализированного фенотипа клеток, отражающего их способность к тем или иным профильным функциям. Дифференцировка меняет функцию клетки, её размер, форму и метаболическую активность.

Читайте также:  Белки их свойства и анализ

Фенотип клеток — это результат координированной экспрессии (то есть согласованной функциональной активности) определённого набора генов. В процессе дифференцировки менее специализированная клетка становится более специализированной, пригодной к выполнению «возложенных» на неё функций.

Становится понятным, что патологические изменения в функциональной активности белков, перечисленных выше, а также наличие к ним антител, скажется на здоровье человека не лучшим образом. В зависимости от того, к каким из них иммунная система становится агрессивна (посредством выработки антител), вследствии дефицита АОХ и сбоя в метаболизме арахидоновой к-ты, будет наблюдаться та или иная картина сероконверсии при анализе на ВИЧ методом иммуноблота.

Сероконверсия
переход отрицательной серологической реакции в положительную и наоборот. Используют для оценки эффективности иммунизации и серологической диагностики заболеваний.

Серология – это раздел иммунологии, изучающий реакции антигенов на антитела сыворотки.

Серологические исследования — это методика изучения определенных антител или антигенов в сыворотке крови пациентов. Основываются они на ответных реакциях иммунитета. Широко применяются данные исследования в процессе диагностики различных инфекционных заболеваний и при определении группы крови человека.
Серологический анализ назначается пациентам с подозрением на какое-либо инфекционное заболевание. Этот анализ в противоречивых ситуациях с постановкой диагноза поможет установить возбудителя заболевания. В случае с ВИЧ это является профанацией, ибо положительную реакцию при исследовании даёт наличие в крови антител, к уже известным нам белкам, описанным выше. Также, к положительной реакции будут приводить антитела, элементарно вырабатываемые против самых различных инфекционных возбудителей, вернее, антитела к отдельным белкам этих возбудителей (а как нам уже известно, БТШ с мол.массами, которые относят к белкам ВИЧ, присутствуют практически в любой бактерии, любом вирусе и любых грибах). И чем тяжелее протекает инфекция (большее кол-во вирионов любого вируса, больше бактерий или грибков проникло в организм) тем больше будет белков уничтоженного возбудителя и тем больше антител к этим белкам будет циркулировать в крови. При этом в ответ на стресс, ещё и многие клетки организма будут экспрессировать БТШ. Другими словами, при ЛЮБОЙ тяжело протекающей инфекции (пневмония; менингит; эндокардит; опоясывающий лишай; генерализованная герпесвирусная, цитомегаловирусная инфекция, туберкулёз,кандидоз и др), человек будет оказываться ВИЧ-позитивным по иммуноблоту. А к тяжёлому течению любой инфекции организм приходит из-за снижения иммунитета вследствии дефицита жирорастворимых (липофильных) АОХ, дефицита глутатиона, дефицита арахидоновой жирной кислоты и изменения ее нормального метаболизма.

Итого: ВИЧ-положительными по иммуноблоту периодически будут:
1. любой организм и это будет носить транзиторный (преходяще-проходящий) характер. Типичный пример — беременные.
2. Некоторые из онкобольных (из-за экспрессии генов, кодирующих стрессовые белки)
3. Люди с аутоиммунными заболеваниями
4. Люди с тяжелопротекающими инфекциями.
Если по медицинскому протоколу болезнь под названием «ВИЧ-инфекция» определяется настолько мошенническим методом, который этот самый протокол считает «Золотым стандартом», то неправильно было бы сказать, что само существование такой болезни вызывает сомнения. Правильнее будет сказать, что её НЕ существование сомнений не вызывает.

Raboy B, Sharon G, Parag HA, Shochat Y, Kulka RG (1991). «Effect of stress on protein degradation: role of the ubiquitin system». Acta biologica Hungarica 42 (1-3): 3–20. PMID 1668897.

1 2 Schlesinger, MJ (1990-07-25). «Heat shock proteins». The Journal of Biological Chemistry 265 (21): 12111–12114. PMID 2197269.

Santoro MG (January 2000). «[h Heat shock factors and the control of the stress response]». Biochemical pharmacology 59 (1): 55–63. DOI:10.1016/S0006-2952(99)00299-3. PMID 10605935.

Гены & Клетки: Том X, №1, 2015 год, стр.: 28-34
Авторы
Колобынина К.Г., Соловьева В.В., Слепак В.З., Ризванов А.А

источник

Биоматериал: Сыворотка крови

Срок выполнения (в лаборатории): 3 р.д. *

Хламидиоз, вызванный микроорганизмом Chlamydia trachomatis — наиболее распространенная инфекция во всем мире, передающаяся половым путем. Инфицирование также возможно при бытовом контакте с зараженным человеком через использование общих предметов гигиены (полотенца, мочалки), постельного белья.

Определение иммуноглобулинов класса G к белкам теплового шока Chlamydia trachomatis (аnti-cHSP60-IgG cHSP60) поможет выявить хроническое течение хламидиоза, что важно для выбора тактики лечения заболевания, выявления и предупреждения осложнений.

У мужчин хламидиоз чаще проявляется уретритом, у женщин уретритом, цервицитом и эндометритом. Острый хламидиозный цервицит может приводить, по крайней мере, к трем типам осложнений: к восходящей инфекции с развитием воспалительных заболеваний органов малого таза; к восходящей инфекции во время беременности, приводящей к преждевременным родам, послеродовым и неонатальным инфекционным осложнениям, а также к развитию карциномы шейки матки.

Помимо этого в 3-4 раза повышается риск передачи ВИЧ-инфекции. По данным Всемирной организации здравоохранения, ежегодно регистрируется до 101 миллиона случаев хламидийных инфекций.

Хламидии — это бактерии сферической или яйцевидной формы, паразитирующие внутри клетки. Этот факт отличает их от других бактерий и объединяет с вирусами. В организме человека хламидии существуют в виде двух форм. Внутри клеток — в виде ретикулярных телец, по мере их созревания они переходят в элементарные тельца, которые выходят из пораженной клетки и внедряются в другие клетки, снова превращаясь в ретикулярные тельца. Непрерывный переход хламидий из одной формы в другую с поражением новых клеток обуславливает наличие воспалительного процесса.

Клинические проявления первичного хламидиоза чаще скудные, или их нет совсем. У женщин она проявляется в виде слизисто-гнойных выделений из влагалища, болями в области гениталий и нижней части живота, иногда с незначительным подъемом температуры. У мужчин могут быть скудные стекловидные выделения из мочеиспускательного канала, боли в паховой области, жжение при мочеиспускании.

Инфекция может принять хроническое течение, что связано с задержкой созревания ретикулярной формы микроорганизма в элементарную форму. При этом снижается реакция иммунитета к инфекции. Ретикулярные формы продуцируют в малом или следовом количестве хламидийные антигены, однако синтез специфических антигенов − белков теплового шока Chlamydia trachomatis (cHSP60) − продолжается. Данные белки cHSP60 Chlamydiatra chomatis смешиваются с активно вырабатывающимися собственными белками теплового шока cHSP60 человека, что может привести к аутоиммунной реакции. Процессы, происходящие во время этих реакций, приводят к повреждению тканей и развитию фиброза пораженных органов.

  • у женщин: бесплодие, невынашивание беременности, внематочная беременность, мертворождение, эндометрит, сальпингит, цервицит, особенно возникший во время беременности, синдром Рейтера;
  • у мужчин: острый баланопостит, орхит, простатит; у молодых мужчин — несимметричный суставной синдром, конъюнктивит;
  • у детей: конъюнктивит, пневмония, отит, бронхиолит;
  • неэффективно пролеченная хламидийная инфекция;
  • неоднократное выявление специфических антител к хламидиям без тенденции к снижению.

Специальной подготовки к исследованию не требуется. Взятие крови проводится натощак или не ранее, чем через 4 часа после необильного приема пищи. Допустимо пить чистую не минеральную и не газированную воду. Чай, кофе, сок запрещаются.

Возможные варианты результатов исследования: положительный, отрицательный, пограничный.

Положительный результат: высокая вероятность трубного фактора бесплодия, индуцируемого Chlamydia trachomatis, перекрестные реакции с антителами других бактерий.

Отрицательный результат: инфекция не обнаружена; факт инфицирования в прошлом (при наличии антител IgA, IgG к Chlamydia trachomatis);

Пограничный результат: низкий уровень антител; неспецифические сывороточные интерференции − рекомендуется повторить исследование.

Примечание. Возможны ложноположительные и ложноотрицательные реакции.

Ложноположительная реакция возможна при соматических и инфекционных заболеваниях, сопровождающихся обширными деструктивными процессами в пораженных органах (цирроз печени, туберкулез легких и других тканей, онкологические заболевания), различных аутоиммунных заболеваниях (наличие ревматоидного фактора IgM и других аутоантител), антифосфолипидном синдроме, беременности.

Ложноотрицательная реакция возможна у иммуносупрессированных лиц, а также у лиц с индивидуальными особенностями иммунной системы и жизнедеятельности возбудителя (низкая иммуногенность).

Адреса медицинских центров, в которых можно заказать исследование, уточняйте по телефону 8-800-100-363-0
Все медицинские центры СИТИЛАБ в г. Москва >>

Код Наименование Цена Заказ
02-91-001 Взятие мазка/соскоба из урогенитального тракта от 1 р.д. 400.00 р.
45-20-001 Ат к Chlamydia trachomatis IgG от 3 р.д. 610.00 р.
45-20-002 Ат к Chlamydia trachomatis IgA от 3 р.д. 610.00 р.
45-20-003 Ат к Chlamydia trachomatis IgМ от 3 р.д. 550.00 р.
61-93-601 Патогены-6 (6 патогенов): Chlamidia trachomatis, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealitycum,Ureaplasma parvum, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis от 1 р.д. 1500.00 р.

* На сайте указан максимально возможный срок выполнения исследования. Он отражает время выполнения исследования в лаборатории и не включает время на доставку биоматериала до лаборатории.
Приведенная информация носит справочный характер и не является публичной офертой. Для получения актуальной информации обратитесь в медицинский центр Исполнителя или call-центр.

источник

Клонированный российскими учеными белок теплового шока позволит эффективно лечить любые виды и стадии рака

«Белками теплового шока» (сокр. БТШ или HSP от англ. Heat shock proteins) называются особые соединения, которые клетки живых организмов продуцируют при резком повышении температуры или в результате других стрессовых нагрузок. Первые HSP впервые были обнаружены учеными еще в середине прошлого века. С тех пор роль белков теплового шока в организме растений, животных и человека активно изучалась.

Вначале считалось, что они выполняют исключительно защитную роль, предупреждая возникновение необратимых нарушений. Однако со временем выяснилось, что эти соединения могут принимать активное участие в регенерации поврежденных структур клетки, а также в работе иммунной системы.

Белки теплового шока активно участвуют в клеточном метаболизме

В том числе, была выдвинута гипотеза, что HSP участвуют в связывании белковых фрагментов, появляющихся при разрушении клеток злокачественных опухолей. При этом образуются конгломераты, распознаваемые противораковым иммунитетом в качестве «агрессора», т.е. происходит так называемая «презентация антигена». Другими словами, иммунная система человека получает возможность «видеть рак», который в обычных условиях может достаточно успешно от нее маскироваться. В результате запускается естественный процесс уничтожения опухоли.

Подтверждение этой теории, а также доскональное изучение структуры белка теплового шока и его действия в опухолевых тканях на молекулярном уровне, стало возможным только после того, как это уникальное вещество попало на международную космическую станцию. Отправили его в космос российские специалисты НИИ Особо Чистых Биопрепаратов ФМБА, синтезировавшие БТШ с помощью эксклюзивных технологий генной инженерии.

Директор НИИ ОЧБ Андрей Симбирцев и его сотрудники рассказывают о своих разработках участникам конференции

Благодаря невесомости, из исходного материала, «упакованного» в тончайшие молекулярные трубочки, выросли идеально ровные кристаллы белка, пригодные для рентгеноструктурного анализа. Космический этап позволил успешно решить главную проблему, стоявшую перед учеными: в условиях земного притяжения белки росли неравномерно, и получить кристаллы с правильной геометрией на Земле было невозможно. Анализ выращенных в космосе кристаллических белков был проведен российскими и японскими учеными на современном сверхмощном оборудовании.

Исследовать структуру синтезированного БТШ позволило выращивание кристаллов белка в лаборатории МКС

Полученные данные легли в основу создания уникального препарата, действие которого опробовали сначала в пробирках на клеточных культурах, а потом – на лабораторных животных. Лекарством на основе синтезированного БТШ были пролечены мыши с саркомой и меланомой, включая животных с четвертой (терминальной) стадией заболеваний.

Результаты оказались более чем впечатляющими:

  • абсолютное большинство мышей полностью выздоровело;
  • не было зарегистрировано ни одного побочного эффекта.

HSP продуцируется клетками бактерий, в которые внедрен выделенный из клеток человека и клонированный ген. Этот ген отвечает за синтез белка теплового шока. В настоящее время его изготовление по данной технологии ведется на производственных участках НИИ ОЧБ.

Разработка и производство особо чистых биопрепаратов проводятся в условиях полной стерильности

Применение биопрепарата направлено на повышение концентрации БТШ в опухолевых тканях онкобольных до значений, вызывающих терапевтический эффект. Такая потребность существует потому, что «показывающий рак иммунитету» белок теплового шока в организме человека:

  • вырабатывается в очень небольших количествах;
  • не может быть «собран» в здоровых клетках и «перенесен» в атипичные клетки раковой опухоли.

Разработчики утверждают, что разработанный ими метод универсален так же, как универсален сам белок, продуцируемый всеми тканями нашего организма. Поэтому если при дальнейших испытаниях лечебное действие лекарства подтвердится, а побочные не будут выявлены, его можно будет применять для терапии абсолютно всех форм рака.

Другие достоинства российской разработки:

  • Лечение эффективно на терминальных стадиях, т.е. именно тогда, когда справится с опухолью каким-либо другим способом чрезвычайно сложно, очень часто – невозможно.
  • Ученые рассматривают возможность целенаправленного действия препарата. До настоящего времени лекарство вводилось лабораторным животным внутривенно и распространялось с кровью по всему организму. На этапе клинических испытаний специалисты планируют параллельно с внутривенным введением опробовать методику адресной доставки белка теплового шока в клетки опухоли, рассчитывая еще более увеличить эффективность лечения и снизить риск побочных эффектов. Эта возможность принципиально отличает российскую технологию от метода «клеточной терапии CAR-T», официальное внедрение которого в клиническую практику ожидается уже летом 2017 года.

Деньги на заключительный этап доклинических исследований нового средства (порядка 100 млн. рублей) уже найдены. Остается найти спонсора, который разделит с государством финансирование клинических испытаний. Пока приоритеты отдаются российскому бизнесу. Если же российских спонсоров найти не удастся, будут рассматриваться варианты партнерства с японскими предпринимателями или бизнес-структурами из других стран. На завершение процесса испытаний может понадобиться еще 3-4 года. При их положительном исходе онкологи смогут получить высокоэффективный инструмент в борьбе с раком.

Вложения в любые клинические испытания несут достаточно большие риски для бизнеса. Ведь даже при современном развитии науки нельзя со стопроцентной вероятностью предположить, как поведет себя новое лекарство, насколько эффективным и безопасным оно окажется не в пробирке и в организме лабораторной мыши, а на практике. Тем не менее, поиски инвестиций – всего лишь вопрос времени.

Насколько действенным будет новый метод, также покажет время. Например, нельзя исключить, что при ослабленном естественном иммунитете его возможностей для борьбы с опухолью может просто не хватить.

И, разумеется, только по истечении нескольких лет можно будет понять:

  • смогут ли раковые клетки мутировать в поисках защиты от «ударных доз» БТШ;
  • не вызовет ли действие препарата нежелательных последствий в отдаленном периоде.

источник

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему: Анализ иммуномодулирующих эффектов белков теплового шока 70 кДа

Автореферат диссертации по медицине на тему Анализ иммуномодулирующих эффектов белков теплового шока 70 кДа

Пономарёв Александр Дмитриевич

АНАЛИЗ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИХ ЭФФЕКТОВ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА 70 КДА

14.00.36 — аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и ЮАОвчинникова РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук,

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

доктор медицинских наук, профессор М.А.Стенина

Ведущая организация: Московский НИИ вакцин и сывороток

Защита состоится 2005 г. в часов на заседании

диссертационного совета при НИИФХМ МЗ РФ по адресу: 119435 г. Москва, Ул. М. Пироговская, д. 1А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИФХМ МЗ РФ

Автореферат разослан 2005 г.

диссертационного совета, к.б.н. Л.Л.Васильева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Семейство белков теплового шока (БТШ) состоит из большой группы высококонсервативных протеинов, интенсивно экспрессирующихся в клетках под действием разнообразных стрессирующих факторов и способствующих выживанию клеток в неблагоприятных условиях. Защитное действие БТШ обусловлено их протективными свойствами, направленными на сохранение нормальной конформации и функциональной активности внутриклеточных протеинов, предотвращение их денатурации и агрегации. Все изученные функции БТШ реализуются во внутриклеточном пространстве, однако в настоящее время существует много свидетельств о локализации этих протеинов на клеточной поверхности. Поверхностная локализация БТШ зарегистрирована у инфицированных, трансформированных и апоптозных лимфоцитов. Причины и механизмы транслокации БТШ на клеточную поверхность пока не изучены, однако известно, что поверхностные БТШ обладают иммуномодулирующими свойствами. В частности, было продемонстрировано, что БТШ, экспонированные на клеточной поверхности, активируют цитотоксические эффекторы иммунной системы. Наряду с явлением необычной локализации БТШ на плазматической мембране, в настоящее время установлено, что БТШ могут находиться вне клеток в виде растворимого пула, попадающего в том числе и в кровоток. Было также обнаружено, что экзогенные, внеклеточные БТШ способны взаимодействовать с клетками и проникать во внутриклеточное пространство. Причем такие интернализованные БТШ сохраняют свои протективные функции и защищают клетки от гибели. В связи с этим очевидно, что наряду с внутриклеточными и поверхностными БТШ, внеклеточная форма этих протеинов также может оказывать влияние на функционирование иммунной системы. В настоящее время интенсивно изучается иммуномодулирующее действие экзогенных БТШ в связи с обнаружением у этих протеинов уникальных адъювантных и иммуностимулирующих свойств. Установлено, что один из механизмов иммуномодулирующих эффектов внеклеточных БТШ связан с активацией этими молекулами антигенпредставляющих клеток. В то же время, анализ описанных эффектов БТШ указывает на то, что зарегистрированные иммуномодулирующие свойства экзогенных БТШ могут быть связаны с действием

этих протеинов не только на антигенпредставляющие клетки, но и на популяции лимфоцитов. Таким образом, накопленные в последнее время данные свидетельствуют о том, что молекулы БТШ участвуют во многих иммунных процессах, связанных с функционированием популяций иммунокомпетентных клеток разных типов. Однако в настоящее время эта тематика остается малоизученной. В настоящей работе были проведены исследования иммуномодулирующих эффектов БТШ, реализующихся на уровне популяций клеток иммунной системы. Основное внимание уделялось главному представителю большого семейства БТШ, протеинам с молекулярной массой 70 кДа (БТШ70).

Цель исследования. Целью работы является исследование иммуномодулирующих функций основного представителя семейства белков теплового шока — БТШ70; анализ зависимости экспрессии БТШ70 клетками иммунной системы от стрессирующих факторов, в частности в модели окислительного стресса; изучение влияния БТШ70 на продукцию перекисных форм кислорода иммунокомпетснтными клетками в процессе «кислородного взрыва».

Читайте также:  Белки в анализе на биохимию

Задачи исследования. (1) Получение высокоочищенных охарактеризованных препаратов БТШ70 для их последующего использования в экспериментах с экзогенными БТШ70. (2) Исследование влияния различных стрессирующих факторов на экспрессию БТШ70 лимфоидными клетками. (3) Анализ взаимосвязи окислительного стресса с экспрессией БТШ70 лимфоидными клетками (4) Анализ взаимосвязи процесса «кислородного взрыва» с экспрессией БТШ70 у клеток лимфоидных тканей мыши и у фагоцитов периферической крови человека. (5) Анализ модуляции «кислородного взрыва» экзогенными БТШ70. (6) Поиск подходов к использованию продуцируемых лимфоидными клетками БТШ70 в противоопухолевой терапии.

Научная новизна. Все основные результаты данного исследования обладают высокой степенью научной новизны. В частности, впервые было охарактеризовано модулирующее действие экзогенных БТШ70 на продукцию активных форм кислорода различными клетками иммунной системы. Высокой степенью новизны обладают также зарегистрированное действие гормонов стресса на экспрессию БТШ70 и продукцию АФК клетками лимфоидных органов. Впервые

описаны эффекты поликатионов, связанные с влиянием на синтез БТШ и продукцию АФК в лимфоидных клетках. К результатам особой новизны можно отнести обнаруженный феномен снижения содержания БТШ70 в клетках иммунной системы на начальном этапе их реакции на различные стрессирующие факторы. Новизной обладают также результаты, свидетельствующие о возможности использования секретируемых опухолевыми клетками БТШ70 для создания противоопухолевых вакцин.

Практическая значимость. Белки теплового шока обладают уникальными иммуностимулирующими и адъювантными свойствами, которые позволяют создавать на основе БТШ эффективные противоопухолевые и противоинфекционные вакцины. Кроме этого, иммунизация экспериментальных животных препаратами БТШ позволяет предотвратить патологические аутоиммунные реакции. Известно также, что появление в сыворотке крови БТШ и антител к ним является характерным диагностическим признаком определенных этапов развития ряда патологий. Все это свидетельствует о значительных потенциальных возможностях применения БТШ в клинической практике. Очевидно, что для реализации таких возможностей необходимо изучение процессов взаимодействия БТШ с иммунной системой. Исходя из этого, данная работа, посвященная исследованию иммуномодулирующих эффектов БТШ, обладает существенной практической значимостью. Можно предположить, что направленный контроль экзоцитоза БТШ лимфоидными клетками может служить основой для разработки нового подхода к проблеме иммунорегуляции. В то же время, обнаруженные корреляции между продукцией перекисных форм кислорода и экспрессией БТШ у иммунокомпетентных клеток открывают новые возможности для терапевтического вмешательства в воспалительные процессы.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на XIV зимней международная научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2002г.), на шестой международной иммунологической летней школе им. Дж. Хэмфри (Пущино, 2002), на VI чтениях, посвященных памяти академика Ю.А.Овчинникова (Москва -Пущино, 2002г.), на шестой научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2002), на 7-ом

региональном конгрессе Азии/Океании по геронтологии (Токио, 2003г.), на Всероссийской конференции «Человек и лекарство» (Москва, 2004г.), на VIII Всероссийском научном форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург 2004г.), на XVII зимней молодежной научной школе «Переспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2005г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы (глава 1, 2, 3, 4 и 5), материалов и методов (глава 6), результатов исследований и обсуждения (глава 7), выводов и списка литературы. Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, содержит 29 рисунков, 2 таблицы. Список литературы включает 235 источников, из которых 224 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные. В экспериментах использовали самок мышей инбредных линий C57BL и BALB/c из питомника экспериментальных животных (ФИБХ РАН, г. Пущино, МО) в возрасте 8-12 недель и исходной массой 16-18 грамм.

Приготовление клеточных суспензий. Суспензии клеток лимфоидных органов мыши получали общепринятым способом. Для удаления эритроцитов использовался раствор Бройля. Жизнеспособность клеток в суспензии, оцененная с помощью раствора трипанового синего составляла в разных экспериментах 9598%.

Выделение клеток из периферической крови доноров. Нейтрофилы изолировали из периферической крови доноров центрифугированием на двойном градиенте плотности фиколл-верографина. Степень обогащения полученных клеточных фракций гранулоцитами и мононуклеарами оценивали с помощью проточной цитометрии. Этот анализ свидетельствовал о том, что во всех экспериментах суспензия изолированных нейтрофилов имела 96-98% чистоты.

Жизнеспособность выделенных клеток, определяемая по окрашиванию трипановым синим, составляла не менее 98%.

Клеточные культуры. Клетки лимфоидных органов мыши и линий лимфоцитов культивировались в 24-луночных планшетах («Nunc», США) и в культуральных флаконах (25 см2, 75 см2 и 162 см2 фирмы «Costar», США) в питательной среде RPMI 1640 («Sigma», США), содержащей 5% фетальной сыворотки (FCS), 20 мМ HEPES, 0,2% NaHCOj, 50 мкг/мл гентамицина (все фирмы «Sigma») в 5% С02 при 37°С.

Моноклональные антитела. В исследованиях использовались моноклональные антитела к БТШ70 фирмы «Sigma» (клон BRM-22, специфичный как к конститутивным, так и индуцибельным БТШ70) и фирмы «StressGen» к конститутивной (клон SPA815) и индуцируемой (клон SPA810) формам БТШ70. В качестве вторых антител к этим антителам использовались Fab фрагменты кроличьих анти-IgG мыши антител, конъюгированные с ФИТЦ или с R-фикоэритрин, оба фирмы «Sigma».

Тепловой шок В части экспериментов, для активации генов белков теплового шока, мы применяли тепловой шок. Для этого клеточные суспензии подвергались термической обработке на водяной бане (42°С в течение 10 мин) с последующим периодом восстановления 1 час 37°С. Такая обработка не приводила к гибели клеток, что было установлено с помощью их окрашивания трипановым синим.

Регистрация внеклеточной продукции АФК. Продукцию нейтрофилами активных форм кислорода оценивали с помощью анализа их люминол-зависимой хемилюминесценции на хемилюминометре 3603 («Диалог» , Москва ). На первом этапе измерений в течение 90-100 мин регистрировали хемилюминесцепцию, вызываемую процессом адгезии клеток к пластику. После этого, для индукции выброса клетками АФК, в образцы добавляли стандартный субстрат для фагоцитоза — опсонизированный зимозан и регистрировали кинетику хемилюминесцентного ответа («дыхательный взрыв»).

Цитофлуориметрический анализ клеток. Анализ морфологических характеристик клеток и уровня экспрессии на их поверхности БТШ проводился на приборе EPICS XL (Coulter Corporation, USA). Окрашивание образцов проводилось

по стандартной методике. Оценку внутриклеточного содержания БТШ проводили после предварительной обработки фиксированных (0,5% раствором параформальдегида в PBS в течение 30 минут) клеток детергентом Тритон Х-100 (в течение 5 мин при 4°С) и последующего их окрашивания первыми и вторыми антителами. Количественную оценку уровня экспрессии БТШ проводили по изменению средней интенсивности флуоресценции клеток в образцах, обработанных анти-БТШ антителами, по сравнению со свечением контрольных (обработанных контрольными антителами, соответствующего изотипа и концентрации) клеток. Относительный уровень экспрессии вычисляли по формуле: Mean(HSP)-Mean(Control).

Цитофлуориметрический анализ апоптоза. Цитофлуориметрическая регистрация процентного содержания аноптозных клеток в образцах лимфоцитов проводилась с использованием ДНК-специфичного флуоресцентного красителя пропидийиодида (PI). Для этого образцы фиксировались в охлажденном 70% растворе этанола (30 — 60 мин.), с последующим двукратным отмыванием, и переводились для измерения в раствор PBS, содержащий 1 мкг/мл PI и 50 Ед/мл РНК-азы А. В одном образце анализировалось не менее 5×103 клеток.

Измерение внутриклеточного уровня АФК. Для определения количества перекисных форм кислорода внутри клетки мы использовали 5-(and-6)-carboxy-2′,7- dichlorodihydrofluorescein diacetate (C-400, «Molecular probes»). Клетки с 10 мкМ С-400 инкубировались при 37°С 20 минут, затем образцы измерялись на приборе EPICS XL (Coulter Corporation, USA).

Статистическая обработка результатов иитометрических измерений. Стагистический анализ проводился, используя t-критерий Стьюдента, с помощью встроенного пакета статистических программ «WinMdi» для обработки гистограмм, полученных во время цитофлуориметрического анализа.

Получение кондиционированного супернатанта клеточных культур и анализ содержания в нем БТШ70. Супернатант, полученный в результате инкубирования клеток в бессывороточной среде, дополнительно очищали от примесей путем фильтрации через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Затем супернатант лиофилизировали, растворяли в деионизованной воде (в количестве 1/20 первоначального объема). Далее проводили диализ в буфере. Полученный

концентрированный супернатант использовали для Вестерн-блот анализа в количестве 20 мкл на лунку. Вестерн-блот анализ проводили по стандартной методике.

Аффинное выделение БТШ70 из биологических образцов. Аффинное выделение БТШ70 из приготовленных образцов осуществляли на колонке с АТФ-агарозой. Это подход основан на способности молекул БТШ70 к прочному связыванию с молекулами АТФ (Welch, Feramisco, 1985).

Экзогенные БТШ70. В ряде экспериментов использовали рекомбинантные БТШ70 человека (StressGen, Канада). Концентрация этих протеинов варьировала в разных опытах от 1 до 10 мкг/мл. В качестве контроля в этих опытах использовали такие же дозы раствора человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) в RPMI.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Получение БТШ70 методом аффинной хроматографии

БТШ70 для проведения ряда последующих экспериментов получали методом аффинной хроматографии на АТФ-агарозе (Welch, Feramisco, 1985). В составе БТШ70 имеется АТФ-связывающий сайт, обладающий очень высокой аффинностью к АТФ. Это свойство БТШ70 используется для получения препаратов белка. На рис. 1 приведен ДСН-ПААГ электрофорез и иммуноблотинг материала, полученного из печени и почек мыши. Полученные образцы были достаточной чистоты. При окрашивании геля красителем кумасси голубым определяется одна полоса в районе 70 кДа. Причем на картине иммуноблотинга можно различить две полосы, соответствующие конститутивной (73 кДа) и индуцибельной (71 кДа) формам БТШ70.

Феномен интернализации экзогенных БТШ70

Белки теплового шока, находящиеся в клеточном микроокружении, активно поглощаются клетками. Чтобы доказать это, мы использовали БТШ70, меченные флюоресцентной меткой фикоеритрином, в концентрации 10 мкг/мл. Инкубация происходила при 4°С и 37°С в течении часа, с последующей отмывкой несвязавшихся молекул. Оказалось, что при 37°С БТШ70 активно

интернализируются. Напротив, при 4°С, когда клетка не активна, БТШ70 не проникают в клетку (Рис 2).

кДа маркеры А(э/форез) Б(блот)

Рис. 1. А — репрезентативная иллюстрация ДСН-ПААГ электрофореза образцов материала, полученного на АТФ-агарозе (мажорная полоса в области 70 кДа) Б — типичный результат иммуноблотинга фракции 70 кДа образцов

Инторналиэация Б1Ш70, меченных фихоеретрииом клетками костного мозга мыши

и Пономарев, Александр Дмитриевич :: 2005 :: Москва

ГЛАВА 1. СЕМЕЙСТВО БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА.

Функции белков теплового шока

Протективные функции белков тетового шока

ГЛАВА 2. БЕЛКИ ТЕПЛОВОГО ШОКА И КЛЕТОЧНЫЙ СТРЕСС

Факторы теплового шока — детекторы стресса

Клеточный стресс и плазматическая мембрана

ГЛАВА 3. РОЛЬ БТШ В ИММУННЫХ ПРОЦЕССАХ

БТШ в инфекционном иммунитете

Лнтигепность поверхностных БТШ

БТШ участвуют в представлении антигена

БТШ и аутоиммунные патологи

БТШ и опухолевые заболевания

ГЛАВА 4. БЕЛКИ ТЕПЛОВОГО ШОКА ВО ВНЕКЛЕТОЧНОМ ПРОСТРАНСТВЕ

ГЛАВА 5. АКТИВНЫЕ ФОРМЫ КИСЛОРОДА И БТШ

Реакции с участием активных форм кислорода

Биологическое значение ЛФК

ГЛАВА 6. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ГЛАВА 7. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Получение БТШ70 методом аффинной хроматографии

Цитометрический анализ экспрессии БТШ70 лимфоидными клетками с помощью конъюгата АТФ-ФИТЦ

Феномен интернализации экзогенных БТШ70 в культурах клеток лимфоидных органов

Активные формы кислорода и белки теплового шока. Влияние БТШ70 па продукцию активных форм кислорода

Влияние А ФК на экспрессию БТШ

Влияние гормонов стресса на продукцию АФК и экспрессию БТШ

Влияние на внутриклеточное содержание АФК и БТШ70 индукторов окислительного стресса

Активные формы кислорода, БТШ70 и старение

Влияние поликатионов на продукцию АФК и БТШ

Возможные подходы к созданию противоопухолевых вакцин на основе секретируемых БТШ

Введение диссертации по теме «Аллергология и иммулология», Пономарев, Александр Дмитриевич, автореферат

Семейство белков теплового шока (БТШ) состоит из большой группы высококонсервативных протеинов, интенсивно эксирессирующихся в клетках под действием разнообразных стрессирующих факторов и способствующих выживанию клеток в неблагоприятных условиях. Защитное действие БТШ обусловлено их протективными свойствами, направленными на сохранение нормальной конформации и функциональной активности внутриклеточных протеинов, предотвращение их денатурации и агрегации. Все изученные функции БТШ реализуются во внутриклеточном пространстве, однако в настоящее время существует много свидетельств о локализации этих протеинов на клеточной поверхности. Поверхностная локализация БТШ зарегистрирована у инфицированных, трансформированных и апоптозных лимфоцитов. Причины и механизмы транслокации БТШ на клеточную поверхность пока не изучены, однако известно, что поверхностные БТШ обладают иммуномодулирующими свойствами. В частности, было продемонстрировано, что БТШ, экспонированные на клеточной поверхности, активируют цитотоксические эффекторы иммунной системы. Наряду с явлением необычной локализации БТШ на плазматической мембране, в настоящее время установлено, что БТШ могут находиться вне клеток в виде растворимого пула, попадающего в том числе и в кровоток. Было также обнаружено, что экзогенные, внеклеточные БТШ способны взаимодействовать с клетками и проникать во внутриклеточное пространство. Причем такие интернализованпые БТШ сохраняют свои протективные функции и защищают клетки от гибели. В связи с этим очевидно, что наряду с внутриклеточными и поверхностными БТШ, внеклеточная форма этих протеинов также может оказывать влияние на функционирование иммунной системы. В настоящее время интенсивно изучается иммуномодулирующее действие экзогенных БТШ в связи с обнаружением у этих протеинов уникальных адъювантных и иммуностимулирующих свойств. Установлено, что один из механизмов иммуномодулирующих эффектов внеклеточных БТШ связан с активацией этими молекулами антигенпредставляющих клеток. В то же время, анализ описанных эффектов БТШ указывает на то, что зарегистрированные иммуномодулирующие свойства экзогенных БТШ могут быть связаны с действием этих протеинов не только па антигенпредставляющие клетки, но и на популяции лимфоцитов. Таким образом, накопленные в последнее время данные свидетельствуют о том, что молекулы БТШ участвуют во многих иммунных процессах, связанных с функционированием популяций иммунокомпетентных клеток разных типов. Однако в настоящее время эта тематика остается малоизученной. В настоящей работе были проведены исследования иммуномодулирующих эффектов БТШ, реализующихся на уровне популяций клеток иммунной системы. Основное внимание уделялось главному представителю большого семейства БТШ, протеинам с молекулярной массой 70 кДа (БТШ70).

Целью работы является исследование иммуномодулирующих функций основного представителя семейства белков теплового шока — БТШ70; анализ зависимости экспрессии БТШ70 клетками иммунной системы от стрессирующих факторов, в частности в модели окислительного стресса; изучение влияния БТШ70 на продукцию перекисных форм кислорода иммунокомпетентными клетками в процессе «кислородного взрыва».

1. Получение высокоочищенных охарактеризованных препаратов БТШ70 для их последующего использования в экспериментах с экзогенными БТШ70.

2. Исследование влияния различных стрессирующих факторов на экспрессию БТШ70 лимфоидными клетками.

3. Анализ взаимосвязи окислительного стресса с экспрессией БТШ70 лимфоидными клетками

4. Анализ взаимосвязи процесса «кислородного взрыва» с экспрессией БТШ70 у клеток лимфоидных тканей мыши и у фагоцитов периферической крови человека.

5. Анализ модуляции «кислородного взрыва» экзогенными БТШ70.

6. Поиск подходов к использованию продуцируемых лимфоидными клетками БТШ70 в противоопухолевой терапии.

Все основные результаты данного исследования обладают высокой степенью научной новизны. В частности, впервые было охарактеризовано модулирующее действие экзогенных БТШ70 па продукцию активных форм кислорода различными клетками иммунной системы. Высокой степенью новизны обладают также зарегистрированное действие гормонов стресса на экспрессию БТШ70 и продукцию АФК клетками лимфоидных органов. Впервые описаны эффекты поликатионов, связанные с влиянием на синтез БТШ и продукцию АФК в лимфоидных клетках. К результатам особой новизны можно отнести обнаруженный феномен снижения содержания БТШ70 в клетках иммунной системы на начальном этапе их реакции на I различные стрессирующие факторы. Новизной обладают также результаты, свидетельствующие о возможности использования секретируемых опухолевыми клетками БТШ70 для создания противоопухолевых вакцин. s

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Белки теплового шока обладают уникальными иммуностимулирующими и адъювантными свойствами, которые позволяют создавать на основе БТШ эффективные противоопухолевые и противоинфекционные вакцины. Кроме этого, иммунизация экспериментальных животных препаратами БТШ позволяет предотвратить патологические аутоиммунные реакции. Известно также, что появление в сыворотке крови БТШ и антител к ним является характерным диагностическим признаком определенных этапов развития ряда патологий. Все это свидетельствует о значительных потенциальных возможностях применения БТШ в клинической практике. Очевидно, что для реализации таких возможностей необходимо изучение процессов взаимодействия БТШ с иммунной системой. Исходя из этого, данная работа, посвященная исследованию иммуномодулирующих эффектов БТШ, обладает существенной практической значимостью. Можно предположить, что направленный контроль экзоцитоза БТШ лимфоидными клетками может служить основой для разработки нового подхода к проблеме иммунорегуляции. В то же время, обнаруженные корреляции между продукцией перекисных форм кислорода и экспрессией БТШ у иммунокомпетентных клеток открывают новые возможности для терапевтического вмешательства в воспалительные процессы.

Материалы диссертации были представлены на XIV зимней международная научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2002), на шестой международной иммунологической летней школе им. Дж. Хэмфри (Пущино, 2002), на VI чтениях, посвященных памяти академика Ю.А.Овчинникова (Москва — Пущино, 2002), на шестой научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2002), на 7-ом региональном конгрессе Азии/Океании по геронтологии (Токио, 2003), на Всероссийской конференции «Человек и лекарство» (Москва, 2004), на VIII Всероссийском научном форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург 2004), на XVII зимней молодежной научной школе «Переспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2005).

ПУБЛИКАЦИИ По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы (глава 1, 2, 3, 4 и 5), материалов и методов (глава 6), результатов исследований и обсуждения (глава 7), выводов и списка литературы. Работа изложена на 133 страницах машинописного текста, содержит 29 рисунков, 2 таблицы. Список литературы включает 208 источник, из которых 204 иностранных.

источник