Микробиологические методы анализа исследование воды

Микроорганизмы – мельчайшие, главным образом одноклеточные существа, широко распространенные в природе. Они обнаруживаются во всех средах (воздухе, почве, воде), в организме человека и животных, в растениях.

Качественное разнообразие и количество микроорганизмов зависят в первую очередь от питательных соединений. Однако немаловажное значение имеют также влажность, температурный режим, аэрация, действие солнечных лучей и прочие факторы.

Методы санитарно-микробиологического исследования природных сред позволяют выявить наличие патогенных микроорганизмов, определить их количество и, в соответствии с полученными результатами, выработать меры по устранению или предупреждению инфекционных заболеваний. Кроме того, количественный учет необходим для моделирования экосистем и разработке принципов управления естественными процессами. Рассмотрим далее, какими бывают методы микробиологического исследования .

Она рассматривается учеными как один из возможных путей передачи инфекционных патологий. С выделениями больных людей или животных в почву проникают патогенные микроорганизмы. Некоторые из них, в частности, споровые, способны сохраняться в грунте продолжительное время (иногда несколько десятков лет). В почву попадают возбудители таких опасных инфекций, как столбняк, сибирская язва, ботулизм и пр. Методы санитарно-микробиологического исследования почвы позволяют определить «микробное число» (кол-во микроорганизмов в грамме грунта), а также коли-индекс (количество кишечных палочек).

К методам микробиологического исследования почвы следует в первую очередь отнести прямое микроскопирование и посев на плотную питательную среду. Популяции микроорганизмов и их группы, населяющие грунт, различаются по таксономическому положению и экологическим функциям. В науке они объединены под общим термином «почвенная биота». Грунт – среда обитания огромного числа микроорганизмов. В грамме почвы присутствует от 1 до 10 млрд их клеток. В этой среде активно протекает разложение органических веществ при участии разнообразных сапрофитных микроорганизмов.

Анализ среды начинается с отбора образцов. Для этого используют предварительно очищенный и протертый спиртом нож (можно использовать лопату). После этого осуществляется подготовка образца. Следующий этап – подсчет клеток на окрашенных мазках. Рассмотрим каждую стадию в отдельности.

При анализе пахотной почвы, как правило, пробы берут с глубины всего слоя. Сначала удаляется 2-3 см сверху грунта, так как в нем может присутствовать посторонняя микрофлора. После этого с изучаемого участка грунта берут монолиты. Длина каждого из них должна соответствовать толщине слоя, из которого нужно взять образец.

На участке в 100-200 кв. м отбирается 7-10 проб. Вес каждой – порядка 0.5 кг. Пробы необходимо тщательно перемешать в мешке. После этого берут средний образец, весом приблизительно 1 кг. Его следует поместить в пергаментный (стерильный) пакет, вложенный в тканевый мешок. До непосредственного анализа образец хранится в холодильнике.

Перемешанная почва высыпается на сухое стекло. Предварительно его необходимо протереть спиртом и обжечь над горелкой. При помощи шпателя почва тщательно перемешивается и раскладывается ровным слоем. В обязательном порядке необходимо удалить корешки, прочие посторонние элементы. Для этого используется пинцет. Перед работой пинцет и шпатель прокаливают над горелкой и остужают.

Из различных участков почвы, распределенной по стеклу, отбираются небольшие порции. Их взвешивают в фарфоровой чашке на технических весах. Обязательным этапом микроскопического метода микробиологического исследования является специальная обработка образца. Заранее необходимо подготовить 2 стерильные колбы. Их емкость не должна превышать 250 мл. В одну из колб наливают 100 мл водопроводной воды. Из нее берут 0.4-0.8 мл жидкости и увлажняют навеску почвы до пастообразного состояния. Смесь необходимо растереть пальцем или резиновым пестиком в течение 5 мин.

Водой из первой колбы почвенную массу переносят в пустую колбу. Далее ее снова растирают. После этого масса переносится в колбу возле пламени горелки. Емкость с почвенной суспензией встряхивают на качалке на протяжении 5 мин. После этого ее оставляют отстаиваться около 30 с. Это необходимо для того, чтобы крупные частицы осели. Через полминуты массу используют для приготовления препарата.

Прямое микроскопическое изучение грунта осуществляется по методу микробиологического исследования , разработанному Виноградским. В определенном объеме приготовленной суспензии подсчитывается число клеток микроорганизмов. Изучение фиксированных мазков позволяет сохранять препараты в течение длительного срока и выполнять подсчеты в любое удобное время.

Приготовление препарата осуществляется следующим образом. Определенный объем суспензии (как правило, 0.02-0.05 мл) наносится с помощью микропипетки на предметное стекло. К нему добавляют каплю раствора агар-агара (смеси полисахаридов агаропектина и агарозы, извлеченных из бурых и красных водорослей Черного моря), быстро перемешивают и распределяют на площади 4-6 кв. см. Мазок высушивается на воздухе и фиксируется 20-30 мин. спиртом (96 %). Далее препарат увлажняют дистиллированной водой, помещают в р-р карболового эритрозина на 20-30 мин.

После окрашивания его промывают и высушивают на воздухе. Подсчет клеток осуществляется с иммерсионным объективом.

Микроскопические методы микробиологического исследования позволяют выявить большое количество микроорганизмов. Но, несмотря на это, метод посева считается наиболее распространенным в практике. Суть его состоит в высеве объема препарата (почвенной суспензии) в чашке Петри на плотную среду.

Этот метод микробиологического исследования позволяет учитывать не только количество, но и групповой, а в ряде случаев и видовой состав микроскопической флоры. Подсчет числа колоний производится, как правило, со дна чашки Петри в проходящем свете. На подсчитанном участке ставится точка маркером либо чернилами.

Микрофлора водного объекта, как правило, отражает микробный состав почвы около него. В этой связи методы санитарно-микробиологического исследования воды и почвы имеют особое практическое значение при изучении состояния конкретной экосистемы. В пресных водоемах содержатся, как правило, кокки, палочковидные бактерии.

Анаэробы в воде обнаруживаются в малом количестве. Как правило, они размножаются на дне водоемов, в иле, принимая участие в процессах очищения. Микрофлора океанов и морей представлена преимущественно солелюбивыми (галофильными) бактериями.

В воде артезианских скважин микроорганизмов практически нет. Это обуславливается фильтрующей способностью почвенного слоя.

Общепринятыми методами микробиологического исследования воды считаются определение микробного числа и коли-титра либо коли-индекса. Первый показатель характеризует количество бактерий в 1 мл жидкости. Коли-индекс представляет собой количество кишечных палочек, присутствующих в литре воды, а коли-титр – минимальное количество или максимальное разведение жидкости, в котором их еще можно обнаружить.

Этот метод санитарно микробиологического исследования воды состоит в следующем. В 1 мл воды определяют количество факультативных анаэробов и мезофильных (промежуточных) аэробов, способных на мясопептонном агаре (основной питательной среде) при 37 град. на протяжении суток формировать колонии, видимые при увеличении в 2-5 р. или невооруженным глазом.

Ключевой стадией рассматриваемого метода микробиологического исследования воды является посев. Из каждой пробы делается посев не менее 2-х разных объемов. При анализе водопроводной воды в каждую чашку вносят по 1-0.1 мл чистой жидкости и по 0.01-0.001 мл загрязненной. Для посева 0.1 мл или меньшего объема жидкость разводится дистиллированной (стерильной) водой. Последовательно готовят десятикратные разведения. По 1 мл от каждого из них вносят в две чашки Петри.

Разведения заливаются питательным агаром. Его необходимо предварительно растопить и остудить до 45 град. После активного перемешивания среду оставляют на горизонтальной поверхности для застывания. При 37 град. посевы выращивают на протяжении суток. Рассматриваемый метод микробиологического исследования воды позволяет учитывать результаты на тех чашках, где количество колоний находится в пределах от 30 до 300.

Он считается транзитной средой для микроорганизмов. Основными методами микробиологического исследования воздуха являются седиментация (оседание) и аспирация.

Микрофлора воздушной среды условно разделяется на переменную и постоянную. К первой относятся дрожжи, пигментообразующие кокки, спороносные бациллы, палочки и прочие микроорганизмы, устойчивые к высыханию, воздействию света. Представители переменной микрофлоры, проникая в воздух из привычной для них среды обитания, недолго сохраняют свою жизнеспособность.

В воздухе крупных мегаполисов микроорганизмов намного больше, чем в воздушной среде сельской местности. Над морями, лесами бактерий очень мало. Очищению воздуха способствуют осадки: снег и дождь. В закрытых помещениях микробов намного больше, чем на открытых пространствах. Их количество повышается в зимний период при отсутствии регулярного проветривания.

Этот метод микробиологического исследования в микробиологии считается простейшим. Он основывается на оседании капель и частиц на поверхности агара в открытой чашке Петри под действием силы тяжести. Метод седиментации не позволяет точно определить число бактерий в воздухе. Дело в том, что на открытой чашке уловить мелкие фракции пылевых частиц и бактериальных капель довольно сложно. На поверхности задерживаются преимущественно крупные частицы.

Этот метод не используется при анализе атмосферного воздуха. Этой среде свойственны большие колебания скорости движения воздушных потоков. Седиментация, однако, может использоваться при отсутствии более совершенных приборов или источника электроэнергии.

Определение микробного числа осуществляется по методу Омелянского. В соответствии с ним, за 5 минут на поверхности агара площадью 100 кв. см оседает такое число бактерий, которое присутствует в 10 л воздуха.

Бактериологический анализ занимает важнейшее место в комплексе клинико-лабораторных мероприятий, направленных на диагностику, профилактику и лечение разнообразных инфекционных заболеваний. Однако исследованием окружающей среды они не ограничиваются.

Особое значение имеет бактериологический анализ биологического материала в лечебных учреждениях. К исследованиям, проводимым в медучреждениях, предъявляются повышенные требования. Целью Приказа «Об унификации микробиологических методов исследования» является совершенствование бактериологического анализа, повышение качества и эффективности микробиологической диагностики.

Оно является ключевым методом анализа при диагностике инфекций, передающихся половым путем, и оппортунистических заболеваний (вызываемых условно-патогенными бактериями).

Микроскопический анализ позволяет оценить качественный и количественный состав микрофлоры, проверить правильность взятия пробы. К примеру, наличие вагинального эпителия в мазке, взятом из цервикального канала, указывает на нарушение правил отбора биологической пробы.

Стоит сказать, что микробиологическое обследование в данном случае вообще сопровождается определенными проблемами. Они связаны с тем, что в нижних отделах полового тракта в норме присутствует разнообразная микрофлора, изменяющаяся в различные возрастные периоды. Для повышения эффективности исследования и были разработаны унифицированные правила.

Она осуществляется методами выявления РНК и ДНК-возбудителей. Они базируются преимущественно на определении нуклеотидных последовательностей в патологическом материале. Для этого используются молекулярные зонды. Они представляют собой искусственно полученные нуклеиновые кислоты, комплементарные (дополняющие) вирусным кислотам, меченные радиоактивной меткой или биотином.

Особенность метода состоит в многократном копировании конкретного фрагмента ДНК, включающего в себя несколько сотен (или десятков) нуклеотидных пар. Механизм репликации (копирования) заключается в том, что достраивание может начаться исключительно в определенных блоках. Для их создания используются праймеры (затравки). Они представляют собой синтезированные олигонуклеотиды.

ПЦР-диагностика (полимеразная цепная реакция) проста в исполнении. Этот метод позволяет быстро получить результат при использовании небольшого объема патологического материала. С помощью ПЦР-диагностики выявляются острые, хронические и латентные (скрытые) инфекции.

При чувствительности этот метод считается более предпочтительным. Однако в настоящее время тест-системы недостаточно надежны, поэтому ПЦР-диагностика не может полностью заменить традиционные методики.

источник

Цель занятия.Ознакомить студентов с основными методами и показателями, необходимыми для санитарно-микробиологической оценки объектов внешней среды.

Оборудование и материалы. Прибор для подсчета колоний, колбы с пробами воды, бактериологические пробирки с 9 мл воды, пробирки с 10 мл расплавленного агара, мерные стериль­ные пипетки на 2 мл, стерильные чашки Петри, чашки Петри с МПА, чашки Петри с кровяным МПА, навески почвы, стериль­ная водопроводная вода в колбе — 270 мл, пробирки со средой Кесслера, Вильсона—Блера.

Для оценки санитарно-гигиенического состояния объектов окружающей среды проводят санитарно-бактериологические ис­следования, цель которых состоит в определении эпизоотологической и эпидемиологической безопасности. Показателем небла­гополучия служит выявление патогенных микроорганизмов. Од­нако прямое их обнаружение связано с большими трудностями, и прежде всего с низкой концентрацией данных микробов, кото­рые в основном не могут размножаться в воде, воздухе и почве. Поэтому в санитарно-микробиологической практике используют косвенные методы, направленные на определение микробной обсемененности объекта и обнаружение в нем так называемых санитарно-показательных бактерий. О бактериальной обсеме­ненности судят по микробному числу — общему коли­честву микроорганизмов, содержащихся в единице объема или массы (1 мл воды, 1 г почвы, 1 м 3 воздуха).

Содержание санитарно-показательных бактерий определяют по двум показателям: титру и индексу. Титром называют минимальный объем или массу, в которых выявляют данные бактерии, индексом — количество санитарно-показательных бактерий, содержащихся в соответствующем количестве среды.

К санитарно-показательным бактериям относят представи­телей облигатной микрофлоры организма человека и тепло­кровных животных, для которых среда обитания — кишечник или воздушно-дыхательные пути. Они характеризуются следую­щими свойствами: 1) постоянно выделяются с калом или ка­пельками слизи из воздушно-дыхательных путей; 2) не имеют других мест обитания; 3) способны сохраняться в окружающей среде то же время, что и патогенные бактерии, паразитирующие в кишечнике или воздушно-дыхательных путях; 4) не способны интенсивно размножаться вне организма хозяина и изменять свои свойства.

Перечисленные признаки присущи бактериям, признанным санитарно-показательными для различных объектов окружаю­щей среды.

Санитарно-показательные бактерии группы кишечных пало­чек принадлежат к различным родам семейства энтеробактерий.

Обнаружение кишечной палочки в разных объектах окружаю­щей среды считают наиболее достоверным признаком свежего фекального загрязнения. Наличие в этих же объектах бактерий родов Citrobacter и Enterobacter указывает на относительно давнее фекальное загрязнение.

Присутствие С. perfringens, С. sporogenes и других клостридий в почве свидетельствует о ее фекальном загрязнении, причем как свежем, так и давнем, поскольку эти бактерии образуют споры, что позволяет им длительно переживать в окружающей среде (в частности, в почве).

Обнаружение в объектах окружающей среды Streptococcus faecalis также свидетельствует об их фекальном загрязнении. Рез­кое увеличение количества этих бактерий в саморазогревающем­ся навозе и компостах может свидетельствовать о загрязнении почвы разлагающимися отбросами.

Гемолитические стрептококки, будучи облигатными обитате­лями носоглотки и зева, выделяются с капельками слизи ораль­но-капельным путем. Сроки выживания гемолитических стреп­тококков в окружающей среде практически не отличаются от сроков, характерных для большинства других возбудителей воз­душно-капельных инфекций. Обнаружение гемолитических стрептококков в воздухе помещений указывает на возможное его загрязнение микроорганизмами, содержащимися в зеве, носо­глотке, верхних дыхательных путях и вызывающими инфекции, передаваемые воздушно-капельным путем.

Staphylococcus aureus — также факультативный обитатель но­соглотки и зева. Его присутствие в воздухе помещений служит показателем орально-капельного загрязнения.

Одновременное обнаружение золотистого стафилококка и ге­молитических стрептококков свидетельствует о высокой степени загрязнения воздуха.

Санитарно-микробиологическое исследование воды. Вода — ес­тественная среда обитания микробов, которые в большом коли­честве поступают из почвы, воздуха, с отбросами, стоками. Осо­бенно много микроорганизмов в открытых водоемах и реках. Кроме сапрофитов в воде могут находиться возбудители инфек­ций животных и человека.

При контроле санитарного состояния воды исследованию подлежат: вода централизованного водоснабжения, колодцев, открытых водоемов (реки, озера), плавательных бассейнов, сточ­ные жидкости.

Отбор проб воды. Из открытых водоемов пробы воды отбира­ют с глубины 10. 15 см от поверхности и на расстоянии 10. 15 см от дна. Водопроводную воду набирают в стерильные флаконы объемом 0,5 л с притертой пробкой. Предварительно кран обжи­гают и спускают воду в течение 10. 15 мин. Хлорированную воду перед исследованием нейтрализуют тиосульфатом натрия из рас­чета 10 мл на 1л воды. Бактериологическое исследование проб воды следует проводить в течение двух часов после отбора или шести часов при температуре хранения 1. 5°С.

Определение микробного числа воды. Водопроводную воду засе­вают в количестве 1мл, воду открытых водоемов — по 1,0; 0,1; 0,01 мл. Все пробы вносят в стерильные чашки Петри, после чего их заливают 10. 12 мл расплавленного и охлажденного до 40. 45 °С питательного агара, который тщательно перемешивают с водой. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 1. 2сут. Воду из открытых водоемов засевают параллельно на две серии чашек, одну из которых инкубируют при 37 ºС в течение суток, другую — 2 сут при 20 °С. Затем подсчитывают количество выросших на поверхности и в глубине колоний и вычисляют микробное число воды — количество микроорганизмов в 1 мл.

Определение коли-титра и коли-индекса воды. Минимальное количество воды в мл, в котором обнаруживают бактерии группы кишечных палочек (БГКП), называют коли-титром воды, количество БГКП, содержащихся в 1л исследуемой воды, называют кол и-и ндексом воды. Коли-титр и коли-индекс воды определяют титрационным (бродильным) ме­тодом или методом мембранных фильтров.

Титрационный метод. В глюкозо-пептонную среду (1%-я пептонная вода, 0,5%-й раствор хлорида натрия, 0,5%-й раствор глюкозы, индикатор Андреде и поплавок) проводят посевы различных объемов воды.

Воду открытых водоемов исследуют в объемах 100; 10; 1 и 0,1 мл. Для анализа водопроводной воды делают посевы трех объемов по 100 мл, трех объемов по 10 мл и трех объемов по 1 мл. Посевы инкубируют при 37 °С в течение суток. О брожении судят по образованию пузырьков газа в поплавке. Из забродивших или помутневших проб делают посевы на среду Эндо. Из выросших колоний готовят мазки, окрашивают по Граму и ставят оксидазный тест, с помощью которого дифференцируют бактерии родов Escherichia, Citrobacter и Enterobacter от грамотрицательных бак­терий семейства Pseudomonadaceae и других оксидазоположительных бактерий, обитающих в воде. С этой целью 2. 3 изоли­рованные колонии наносят «штрихом» на фильтровальную бума­гу, смоченную диметил-n-фенилендиамином. При отрицатель­ном оксидазном тесте цвет бумаги не изменяется, при положительном она окрашивается в синий цвет в течение 1 мин. Грамотрицательные палочки, не образующие оксидазу, вновь ис­следуют в бродильном тесте — вносят в полужидкий питатель­ный агар с 0,5 % глюкозы и инкубируют при 37 °С в течение су­ток. При положительном результате определяют коли-титр и коли-индекс по статистической таблице.

Метод мембранных фильтров. Определенный объем воды про­пускают под давлением через мембранный фильтр № 3, предва­рительно стерилизованный кипячением в дистиллированной воде. Водопроводную воду и воду артезианских скважин фильт­руют в объеме 333 мл. Чистую воду открытых водоемов фильтру­ют в объеме 100, 10, 1 и 0,1 мл, более загрязненную воду перед фильтрованием разводят стерильной водой. Фильтры накладыва­ют на агар Эндо в чашки Петри и после инкубации при 37 °С в течение суток подсчитывают количество выросших красных колоний. Из двух-трех колоний делают мазки, окрашивают их по Граму и ставят оксидазный тест. Грамотрицательные палочки, не образующие оксидазу, принадлежат к БГКП. По существующим нормативам (ГОСТ 2874—82) питьевую воду считают качествен­ной, если ее коли-индекс не более 3, а микробное число — не бо­лее 100.

Общепринятым дополнительным показателем фекального загрязнения воды служит количество S.faecalis. Для определе­ния его титра цельную воду и ее 10-кратные разведения засева­ют в жидкую элективную среду (щелочная полимиксиновая сре­да). После инкубирования при 37 ºС в течение двух суток, а за­тем еще через сутки и двое суток делают высевы на плотные элективные среды. Фекальные стрептококки идентифицируют по морфологическим, культуральным и тинкториальным свой­ствам.

Есть данные о корреляции между содержанием в воде фекаль­ных кишечных палочек и фагами бактерий группы кишечных па­лочек. Поэтому определение данных фагов служит косвенным показателем возможного присутствия кишечных палочек в ис­следуемой пробе воды.

Санитарно-микробиологическое исследование воздуха. Мик­рофлора воздуха зависит от микрофлоры почвы и воды. Воз­дух — неблагоприятная среда для обитания микроорганизмов из-за отсутствия питательных веществ, действия солнечных лучей, высушивания. Наряду с сапрофитами в воздухе могут находиться патогенные бактерии, споры грибов родов Aspergillus, Mucor и др.

Санитарную оценку воздуха осуществляют по двум показате­лям: 1) определение микробного числа воздуха; 2) определение количества санитарно-показательных бактерий — гемолитичес­ких стрептококков и стафилококков.

Количественные микробиологические методы исследования воздуха основаны на принципах осаждения (седиментации), ас­пирации или фильтрации.

Седиментационный метод осаждения Коха. Чашки Петри с МПА оставляют открытыми на 5. 10 мин. Для определения са­нитарно-показательных бактерий берут чашки Петри с кровя­ным МПА и время экспозиции увеличивают до 40 мин. Чашки выдерживают при 37 °С и комнатной температуре 24 ч и подсчи­тывают выросшие колонии.

Микробное число воздуха (общее количество бактерий в 1 м3) определяют по формуле Омелянского

Х= а * 100 * 1000 * 5 / (b * 10 * T),

где X— количество микробов в 1 м 3 (1000 л) воздуха; а — количество выросших ко­лоний в чашках; b — площадь чашки; Т— время, в течение которого чашка была открыта; 5 — время по правилу Омелянского; 10 — объем воздуха в литрах. (Прави­ло Омелянского предусматривает, что на поверхности агара в чашке Петри площа­дью 100 см 3 за 5 мин из воздуха оседает такое количество микробов, которое нахо­дится в его 10 л.)

Прямое обнаружение патогенных микробов воздуха проводят только при специальных показаниях.

Аспирационный метод. Более точный количественный способ определения микробного числа воздуха, так как посев микроор­ганизмов из воздуха производят с помощью приборов. При использовании аппарата Кротова воздух с заданной скоростью за­сасывается через щель плексигласовой пластины и ударяется о поверхность питательной среды открытой чашки Петри, находя­щейся на вращающейся подставке, благодаря чему происходит равномерный посев бактерий из воздуха на поверхность МПА (при определении микробного числа) или кровяного МПА (при выделении гемолитических стафилококков и стрептококков). После инкубации в термостате в течение двух суток подсчитыва­ют количество выросших колоний и определяют микробное чис­ло воздуха. При исследовании воздуха могут быть использованы и другие приборы (Дьякова, Киктенко, ПАБ-1 — прибор аэро­зольный бактериологический и ПОВ-1 — прибор для отбора воз­духа). В практику входят ускоренные методы индикации микро­флоры воздуха с помощью мембранных фильтров, каскадных им-пакторов, фильтров Петрякова и др.

Санитарно-микробиологическое исследование почвы. Анализ почвы включает в себя определение микробного числа, коли-тит-ра, перфрингенс-титра и титра термофильных бактерий. По эпи­демиологическим признакам проводят определение в почве па­тогенных микроорганизмов: сальмонелл, шигелл, возбудителей столбняка, ботулизма, злокачественного отека, сибирской язвы. Бактериологический анализ почвы нужен при выборе террито­рии под пастбище, ферму, хозяйственные постройки, детские сады, больницы и др.

Предварительно делают отбор проб почвы. На обследуемой территории площадью до 1000 м 3 выделяют два участка по 25 м 3 (один — вблизи источника загрязнения, другой — в отдалении от него), берут пробы из 5 точек (4 — по углам участка, 1 — в цент­ре) на глубине 10. 20 см стерильным совком (из более глубоких мест — с помощью специального бура Некрасова или Френкеля). Пробы почвы по 200. 300 г отбирают в широкогорлые стеклян­ные банки с ватными пробками (можно все взятые с одного уча­стка пробы перемешать и на исследование направить 1 кг). На банки наклеивают этикетки, отправляют с нарочным и сопрово­дительным письмом. Пробы почвы полагается исследовать сразу же или в течение 6. 18 ч, сохраняя их при температуре не выше 1. 5ºС.

В лаборатории почву измельчают, освобождают от камней, ос­колков стекол, корней растений, просеивают через сито, тща­тельно перемешивают и отвешивают 30 г. В колбу на 500 мл наливают 270 мл стерильной водопроводной воды и вносят в нее отвешенную пробу почвы, все интенсивно встряхивают 10 мин, не давая отстояться частицам суспензии, готовят серию десятикратных последовательных разведений. Для относительно чис­тых почв достаточно 4 степени разведения, для загрязненных — 6. 9 разведений. В штатив ставят нумерованные пробирки с 9 мл стерильной воды в каждой. В первую вносят 1 мл суспензии про­бы почвы, смешивают, затем 1 мл из первой пробирки вносят во вторую, смешивают, из нее — 1 мл в третью и т. д. В результате в пробирке № 1 получается разведение 1 : 100, № 2 — 1 : 1000 и т.д. Подготовленные таким образом пробы почвы исследуют.

Определение общего микробного числа. Из последних 3. 4 про­бирок с разведенной суспензией отдельными стерильными пи­петками вносят по 1 мл в стерильные чашки Петри (каждое раз­ведение в отдельности). В каждую чашку добавляют еще по 10. 15 мл расплавленного и охлажденного до 45 ºС МПА. Равно­мерными осторожными круговыми движениями содержимое ча­шек перемешивают, оставляют на столе для уплотнения (затвердения) агара. С застывшей средой чашки перевертывают вверх дном, надписывают и помещают в термостат для культивирова­ния на 24. 48 ч при 37 °С. Выросшие колонии подсчитывают в каждой чашке, умножают на степень разведения, полученные числа суммируют и вычисляют среднеарифметическое число, что составит количество микробов, содержащихся в 1 г почвы.

Определение коли-титра, перфрингенс-титра и титра термо­фильных бактерий почвы. Для определения коли-титра почвы раз­личные разведения почвенной взвеси засевают по 1 мл в пробир­ки со средой Кесслера (на 1л дистиллированной воды — 10г пептона, 50 мл бычьей желчи — 2,5 г лактозы, 4 мл 1%-го водного раствора генцианвиолета) и инкубируют при 43 ºС в течение 48 ч. В дальнейшем исследования проводят по схеме, применяемой при определении коли-титра воды. Наибольшее разведение поч­венной суспензии, в котором отмечена ферментация лактозы (газообразование), соответствует коли-титру почвы. Для опреде­ления перфрингенс-титра почвы различные разведения почвен­ной суспензии по 1 мл засевают в пробирки со стерильным обез­жиренным молоком или железосульфитной средой Вильсона— Блера, приготовленной ex tempore. Посевы инкубируют при 43 °С в течение 24. 48 ч, после чего учитывают результаты по сверты­ванию молока или по образованию черных колоний С. perfringens в агаровом столбике среды Вильсона—Блера. Из колоний делают мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют и вычисляют перфрингенс-титр, который соответствует наибольшему разведе­нию почвы, вызвавшему почернение и разрыв среды Вильсона— Блера в первые 12 ч роста.

Для определения титра термофильных бактерий разведения почвенной суспензии по 1 мл вносят в чашки Петри, заливают расплавленным и охлажденным агаром. Посевы инкубируют в течение суток при 60 ºС, а затем подсчитывают количество вы­росших колоний и пересчитывают на 1 г почвы.

Санитарно-микробиологическую оценку почвы проводят по комплексу показателей, из которых наиболее важный ление степени фекального загрязнения.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Определить микробное загрязнение воздуха.

2. Провести исследование воды с целью установления мик­робного числа и коли-титра.

3. Определить микробное число и перфрингенс-титр почвы.

1. Что такое санитарно-показательные микроорганизмы?

2. Как определяют коли-титр воды?

3. Как определяют микробное число почвы?

4. Как определяют перфрингенс-титр почвы?

5. Какие методы применяют для определения микробного числа воздуха?

6. Что такое санитарно-показательные микробы воздуха и как их определяют?

источник

Загрязненность воды определяется по общей микробной обсемененности и обнаружению санитарно-показательных микроорганизмов индикаторов наличия выделений человека или животных. В воде регистрируют кишечную палочку, БГКП (колиформные палочки), энтерококк, стафилококки;

На основании количественного выявления этих санитарно-показательных бактерий вычисляются индекс БГКП (число БГКП в 1 л воды), перфрингенс-титр, титр энтерококка и т.д. Так, например, титр энтерококка воды — это наименьшее количество воды, в котором определяется энтерококк.

К бактериям группы кишечной палочки относят грамотрицательные палочки, сбраживающие с образованием кислоты и газа лактозу или глюкозу при температуре 37°С в течение 24-48 ч и не обладающие оксидазной активностью. Наиболее часто этот показатель применяют как индикатор фекального загрязнения воды. Другой сходный показатель фекального загрязнения — общие колиформные бактерии: грамотрицательные, оксида-заотрицательные палочки, ферментирующие лактозу или маннит (глюкозу) с образованием альдегида, кислоты и газа при температуре 37°С в течение 24 часов. Вместо последнего термина предлагается использовать термин «бактерии семейства Enterobacteriaceae», так как все бактерии этого семейства имеют индикаторное значение. К бактериям семейства Enterobacteriaceae относятся грамотрицательные, оксидазаотрицательные палочки, растущие на лактозосодержащих средах типа среды Эндо и ферментирующие глюкозу до кислоты и газа при температуре 37°С в течение 24 часов; колиформные бактерии (палочки).

При бактериальном загрязнении воды свыше допустимых норм следует провести дополнительное исследование на наличие бактерий — показателей свежего фекального загрязнения. К таким бактериям относят термотолерантные колиформные бактерии, фекальные кишечные палочки, ферментирующие лактозу до кислоты и газа при температуре 44 °С в течение 24 часов и не растущие на нитратной среде. О свежем фекальном загрязнении свидетельствует также выявление энтерококка. На давнее фекальное загрязнение указывают отсутствие БГКП и наличие определенного количества клостридш перфрингенс, т. е. наиболее устойчивых споро-образующих бактерий.

В соответствии с нормативными документами регламентируются следующие нормативы микробиологических показателей питьевой воды при централизованном водоснабжении:

• 1. Общее микробное число воды не должно превышать 100 микробов в 1 мл исследуемой воды;
• 2. Общие колиформные бактерии должны отсутствовать в 100 мл исследуемой воды;
• 3. Термотолерантные колиформные бактерии должны отсутстовать в 100 мл исследуемой воды;
• 4. Колифаги не должны определяться в 100 мл исследуемой воды (учет по бляшкооб-разующим единицам);
• 5. Споры сульфитредуцирующих клостридий не должны определяться в 20 мл исследуемой воды;
• 6. Цисты лямблий не должны определяться в 50 мл исследуемой воды.

Кроме того, загрязненность воды оценивается по обнаружению патогенных микробов с фекально-оральным механизмом передачи (энтеровирусы, энтеробактерии, холерные вибрионы и др.). № 36 Строение генома бактерий. Понятие о генотипе и фенотипе. Виды изменчивости. Подвижные генетические элементы, их роль в эволюции бактерий.

Бактериальный геном состоит из генетических элементов, способных к самостоятельной репликации, т. е. репликонов. Репликонами являются бактериальная хромосома и плазмиды.

Наследственная информация хранится у бактерий в форме последовательности нуклеотидов ДНК, которые определяют последовательность аминокислот в белке. Каждому белку соответствует свой ген, т. е. дискретный участок на ДНК, отличающийся числом и специфичностью последовательности нуклеотидов.

Бактериальная хромосома представлена одной двухцепочечной молекулой ДНК кольцевой формы. Размеры бактериальной хромосомы у различных представителей царства Procaryotae варьируют. Бактериальная хромосома формирует компактный нуклеоид бактериальной клетки. Бактериальная хромосома имеет гаплоидный набор генов. Она кодирует жизненно важные для бактериальной клетки функции.

Плазмиды бактерий представляют собой двухцепочечные молекулы ДНК. Они кодируют не основные для жизнедеятельности бактериальной клетки функции, но придающие бактерии преимущества при попадании в неблагоприятные условия существования.

Свойства микроорганизмов, как и любых других организмов, определяются их генотипом, т.е. совокупностью генов данной особи. Термин «геном» в отношении микроорганизмов — почти синоним понятия «генотип».

Фенотип представляет собой результат взаимодействия между генотипом и окружающей средой, т. е. проявление генотипа в конкретных условиях обитания. Фенотип микроорганизмов хотя и зависит от окружающей среды, но контролируется генотипом, так как характер и степень возможных для данной клетки стенотипических изменений определяются набором генов, каждый из которых представлен определенным участком молекулы ДНК.

В основе изменчивости лежит либо изменение реакции генотипа на факторы окружающей среды, либо изменение самого генотипа в результате мутации генов или их рекомбинации. В связи с этим фенотипическую изменчивость подразделяют на наследственную и ненаследственную.

Ненаследственная (средовая, модификационная) изменчивость обусловлена влиянием внутри- и внеклеточных факторов на проявление генотипа. При устранении фактора, вызвавшего модификацию, данные изменения исчезают.

Наследственная (генотипическая) изменчивость, связанная с мутациями, — мутационная изменчивость. Основу мутации составляют изменения последовательности нуклеотидов в ДНК, полная или частичная их утрата, т. е. происходит структурная перестройка генов, проявляющаяся фенотипически в виде измененного признака.

Наследственная изменчивость, связанная с рекомбинациями, называется рекомбинационной изменчивостью.

Подвижные генетические элементы.

В состав бактериального генома, как в бактериальную хромосому, так и в плазмиды, входят подвижные генетические элементы. К подвижным генетическим элементам относятся вставочные последовательности и транспозоны.

Вставочные (инсерционные) последовательности IS-элементы — это участки ДНК, способные как целое перемещаться из одного участка репликона в другой, а также между репликонами. Они содержат лишь те гены, которые необходимы для их собственного перемещения — транспозиции: ген, кодирующий фермент транспозазу, обеспечивающую процесс исключения IS-элемента из ДНК и его интеграцию в новый локус, и ген, детерминирующий синтез репрессора, который регулирует весь процесс перемещения.

Отличительной особенностью IS-элементов является наличие на концах вставочной последовательности инвертированных повторов. Эти инвертированные повторы узнает фермент транспозаза. Транспозаза осуществляет одноцепочечные разрывы цепей ДНК, расположенных по обе стороны от подвижного элемента. Оригинальная копия IS-элемента остается на прежнем месте, а ее реплицированный дупликат перемещается на новый участок.

Перемещение подвижных генетических элементов принято называть репликативной или незаконной рекомбинацией. Однако в отличие от бактериальной хромосомы и плазмид подвижные генетические элементы не являются самостоятельными репликонами, так как их репликация — составной элемент репликации ДНК репликона, в составе которого они находятся.

Известно несколько разновидностей IS-элементов, которые различаются по размерам и по типам и количеству инвертированных повторов.

Транспозоны — это сегменты ДНК, обладающие теми же свойствами, что и IS-элементы, но имеющие структурные гены, т. е. гены, обеспечивающие синтез молекул, обладающих специфическим биологическим свойством, например токсичностью, или обеспечивающих устойчивость к антибиотикам.

Перемещаясь по репликону или между репликонами, подвижные генетические элементы вызывают:

• 1. Инактивацию генов тех участков ДНК, куда они, переместившись, встраиваются.
• 2. Образование повреждений генетического материала.
• 3. Слияние репликонов, т. е. встраивание плазмиды в хромосому.
• 4. Распространение генов в популяции бактерий, что может приводить к изменению биологических свойств популяции, смене возбудителей инфекционных заболеваний, а также способствует эволюционным процессам среди микробов.

Изменения бактериального генома, а следовательно, и свойств бактерий могут происходить в результате мутаций и рекомбинаций.

источник

Самой чистой будет считаться вода, добытая из глубоководной артезианской скважины. Она или вовсе лишена загрязнителей бактериологического типа, или содержит небольшое количество загрязнителей, которые не несут в себе никакой опасности здоровью и жизни потребителя.

Артезианскую скважину можно по праву назвать стерильной. Особенно если сравнивать ее с иными источниками питьевой воды. Самыми опасными в плане повышенного уровня загрязненности считаются поверхностные воды.

Именно по этой причине можно говорить о том, что степень загрязнения источника питьевой воды выше, если глубина скважины минимальна. Для обеспечения загородного дома высококачественной питьевой водой следует провести профессиональное, грамотное бурение и оборудование артезианской глубоководной скважины.

Неукоснительное соблюдение абсолютно всех имеющихся и установленных технологических стандартов бурения, монтажа, устройства и последующего использования источника воды опасность бактериологического загрязнения питьевой воды минимальна и практически сводится к нулю.

Но в случае неправильного подхода и неправильно подобранного технического оборудования для артезианской скважины даже ее глубокое залегание не будет являться гарантией того, что в нее не попадут грунтовые и поверхностные воды, которые содержат микробиологические загрязнители.

Основными причинами, по которым происходит заражение питьевой воды, добываемой из артезианской скважины, могут быть:

• ненадлежащего качества трубы для обсадки;
• плохо проведенные работы, связанные со сваркой труб, осуществлением резьбы, соединяющей эти трубы;
• неправильно проведенная герметизация пространства за обсадными трубами;
• попадание поверхностных вод в скважину в момент ее бурения.

Если есть хотя бы малейшие подозрения на наличие причин, по которым вода может быть загрязнена, следует обязательно провести санитарно-микробиологический анализ питьевой воды.

Эффективность фильтров будет достигнута только в том случае, если параметры загрязнителей, находящихся в артезианской воде, имеют постоянные значения.

Именно по этой причине необходимо в обязательном порядке ежегодно сдавать артезианскую воду на микробиологический анализ, который проводится в соответствии с установленными санитарно-эпидемиологическими нормами.

В случае даже незначительных изменений химического состава воды важно провести перенастройку фильтрационной системы во избежание ухудшения водоочистки.

Процесс забора воды для проведения микробиологического анализа достаточно специфический. Взять правильно образец воды на микроанализ сложнее, чем на химический. Правильный забор пробы артезианской воды подразумевает следующие действия:

1. Чтобы доставить воду в лабораторию с целью проведения бактериологического анализа, необходимо брать исключительно стерильную посуду, объем которой не менее 500 грамм. Стерильные емкости можно взять прямо в лаборатории, где в последующем будет осуществляться микробиологический анализ питьевой воды. Можно, в принципе, самостоятельно простерилизовать емкость, прокипятив ее в течение пяти-семи минут, или обработав паром. Можно для этих целей использовать духовой шкаф, где емкость должна находиться в течение 10-15 минут при температуре 180 градусов.
2. Перед тем, как взять воду из водопроводной системы, необходимо в обязательном порядке обработать кран открытым огнем, затем тщательно протереть спиртом. Воду следует спустить, открыв на максимально возможную мощность кран и спускать воду приблизительно 5-7 минут и лишь после этого произвести забор воды в пастеризованную емкость. Категорически запрещено дотрагиваться до крышки, которой будет закрыта тара, и до горловины.
3. Отвезти жидкость в лабораторию, где будет проведено исследование, необходимо в течение нескольких часов. Если сделать это в столь короткий срок по ряду причин невозможно, емкость с водой можно поставить в холодное место на 2-3 часа, плотно закрыв крышкой, после чего отвезти в лабораторию.
4. Отправляемая на изучение питьевая вода должна сопровождаться соответствующими документами, в которых следует указать вид источника воды, откуда была отобрана проба, месторасположение источника, непосредственное место, где взята проба, дата и точное время взятия пробы.

Лаборатория будет проводить микробиологический анализ природных вод по нескольким основным показателям.

Желательно проводить исследование питьевой воды ежегодно, особенно в период после весеннего паводка, а также после произошедших техногенных катастроф или природных катаклизмов, когда вероятность загрязнения подземных источников питьевой воды очень высока.

Лабораторией проводится комплексное исследование пробы воды в соответствии с методиками, которые рекомендованы нормативно-правовыми актами РФ, а также Международным комитетом по стандартизации.

Микробиологический анализ воды подразумевает как выявление микроорганизмов, но и обнаружение вирусов и бактерий, жизнедеятельность которых приводит к развитию инфекционных заболеваний у людей, употребляющих загрязненную воду.

В настоящее время одной из самых удобных, эффективных, надежных методик осуществления микробиологического анализа водопроводной, артезианской питьевой воды является метод мембранной фильтрации. Суть метода заключается в пропускании исследуемой воды через специальную фильтрующую установку, где размер ячеек не превышает 0,65 мкм.

Присутствующие в воде болезнетворные микроорганизмы концентрируются на поверхности мембранного фильтра. После этого фильтр снимается и помещается в специальную среду, где происходит инкубирование микроорганизмов в созданных для них условиях.

Преимуществами методики мембранной фильтрации можно назвать:

• высокоточный конечный результат исследования;
• определение количества микроорганизмов;
• результативность даже при наличии небольшого числа микроорганизмов в воде;
• минимальные затраты рабочего времени;
• быстрое получение результатов.

Для того, чтобы провести микробиологический анализ природных вод методом мембранной фильтрации, необходимо наличие вакуумного фильтра, а также специальных питательных сред – картонных подложек.

источник

Несоответствие воды микробиологическим нормам, так же как и химическим, делает ее непригодной для питья. Если Ваш источник водоснабжения не защищен от прямого воздействия окружающей среды или коммунальные системы устарели или давно не чистились, то сделать микробиологический анализ воды просто необходимо. От этого зависит Ваше здоровье и безопасность! Особенно это важно для тех, кто пользуется колодцем. Колодезная вода – грунтовая, она на прямую контактирует с почвами, а значит, грозит «напоить» Вас и нитратами, и тяжелыми металлами, и аммиаком, и, конечно, вредными органическими веществами, которые попадают в почву в результате деятельности сельскохозяйственных ферм или угодий.

В таблице 1 представлены микробиологические показатели действующего норматива СанПиН 2.1.4.1074-01 для питьевой воды:

Таблица 1. Микробиологические нормативы для питьевой воды

Стандартный микробиологический анализ питьевой воды в МГУ включает определение трех показателей: общего микробного числа, количества общих колиформных и термотолерантных колиформных бактерий.

Расширенный микробиологический анализ воды включает анализ пяти показателей: общего микробного числа, количества общих колиформных бактерий, количества термотолерантных колиформных бактерий, титр колифагов и содержание спор сульфитредуцирующих бактерий.

Часто на наших участках или поблизости имеются водоемы, где мы и наши дети с удовольствием любим провести время. Конечно, вода в данных водоемах не является питьевой, но ее безопасность для человека также, как и питьевая, регламентируется. В таблице 2 представлены микробиологические показатели действующего норматива по гигиеническим требованиям к охране поверхностных вод (СанПиН 2.1.5.980-00)

Таблица 2. Микробиологические нормативы для рекреационного водопользования, а также в черте населенных мест

Микробиологический анализ воды, предназначенной не для питья, включает определение количества двух показателей: общих колиформных и колиформных термотолерантных бактерий.

Помимо двух основных показателей мы предлагаем провести дополнительный анализ на содержание: колифагов, условно-патогенных дрожжей и микромицетов (частых спутников опортунистических заболеваний) и индекса самоочищения водоёма.

При значительном превышении нормативов СанПиН 2.1.5.980-00, а также возможном фекальном загрязнении водоёма, мы предлагаем провести анализ на наличие возбудителей кишечных инфекций (род Salmonella и Enterococcus).

Метод определяет в питьевой воде общее число мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (ОМЧ), способных образовывать колонии на питательном агаре при температуре 37 °С в течение 24 часов, видимые с увеличением в 2 раза. Данный индикатор выявляет потенциальных бактерий, способных причинить вред здоровью человека.

Общие колиформные бактерии (ОКБ) – грамотрицательные, оксидазоотрицательные, не образующие спор палочки, способные расти на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре (37+1) °С в течение (24-48) часов. Многие представители данной группы являются микроорганизмами нормальной микрофлоры желудка, поэтому превышение данной группы микроорганизмов может говорить о возможно антропогенном (в том числе и фекальном) загрязнении воды.

Термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ) входят в число общих колиформных бактерий, обладают всеми их признаками и, кроме того, способны ферментировать лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре (44±0,5) °С в течение 24 часов. Также, как и ОКБ являются индикаторной группой, однако более устойчивые в окружающей среде: вот почему обнаружение данной группы микроорганизмов в воде может говорить об однозначном загрязнении ее продуктами жизнедеятельности человека.

Колифаги, определяемые стандартным методом (МУК 4.2.1018-01), являются вирусами кишечной палочки (Escherichia coli) и рассматриваются эпидемиологами как дополнительный, а порой и более чувствительный, метод в определении загрязнения воды микроорганизмами группы кишечной палочки. Вирусные частицы, и в частности колифаги, более устойчивы к окружающей среде, чем их бактерии-хозяева. В связи с этим, наличие колифагов может служить достоверной меткой о более давнем фекальном загрязнении источника воды. Показана прямая корреляция между содержанием колифагов в воде и опасных для человека энтеровирусов, поэтому наличие колифагов в воде может говорить о вирусном заражении источника. Действующий нормативный документ (СанПиН 2.1.4.1074-01) подразумевает отсутствие колифагов в 100 мл воды.

Сульфитредуцирующие клостридии – спорообразующие анаэробные палочковидные микроорганизмы, являющиеся дополнительным микробиологическим показателем фекального загрязнения водоема. В отличие от относительно неустойчивых колиформных и термотолерантных колиформных бактерий, споры клостридий могут сохраняться в водоемах долгое время. Клостридии встречаются в кишечнике человека и домашних животных, однако, при попадании с водой в большом количестве могут вызвать пищевые отравления. К сульфитредуцирующим клостридиям относятся в том числе и опасные для человека клостридии (Clostridiumbotulinum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani), вызывающие тяжелейшие заболевания. Согласно действующему нормативу (СанПиН 2.1.4.1074-01) споры клостридий должны отсутствовать в 20 мл воды.

К условно-патогенным дрожжам и микромицетам (плесени) относят большую неоднородную группу грибных организмов, способных сапротрофно расти при 37 °С. В нее входят такие представители, как Candida albicans и Cryptococcus neoformans, которые являются частым фактором оппортунистических заболеваний человека, вызывая кандидозы (грибковые заболевания кожи), молочницы и проч. Другие организмы микромицеты (Cladosporium cladosporioides, Aspergillusniger) могут являться активными сенсебилизаторами аллергических реакций, а иногда и самими аллергенами. В РФ не нормируется вода по плесеням и дрожжевым организмам в воде.

Общее число микроорганизмов не нормируется в воде водоемов в зонах рекреаций, поскольку уровень этой группы микроорганизмов в большей мере зависит от природных особенностей каждого объекта, времени года и т.п.

Однако при выборе нового источника водоснабжения или места рекреации в воде водоёмов дополнительно следует определять общую микробную численность, вырастающую:

• при температуре 37 °С в течение 24 часов;
• при температуре 22 °С в течение 72 часов.

1. ОМЧ при 37 °С представлена большей частью алохтонной микрофлорой (внесенную в водоем в результате антропогенного загрязнения, в том числе фекального);
2. ОМЧ при 20-22 °С представлена, помимо алохтонной, аборигенной микрофлорой (естественной, свойственной для данного водоёма).

Соотношение численности этих групп микроорганизмов позволяет судить об интенсивности процесса самоочищения. При завершении процесса самоочищения коэффициент ОМЧ 22 °С/ ОМЧ 37 °С. В местах загрязнения хозяйственно-бытовыми сточными водами численные значения обеих групп близки.

Показатель позволяет получить дополнительную информацию о санитарном состоянии водоемов, источниках загрязнения, процессах самоочищения.

источник

Цель занятия. Ознакомить студентовс микрофлорой воды, источниками ее загрязнения патогенной микрофлорой. Студенты должны овладеть различными методами бактериологического исследования воды: определения количества МАФАнМ, коли-титра и коли-индекса воды.

Материальное оснащение. Пробы речной воды и стерильные пробирки для взятия водопроводной воды; чашки Петри, расплавленный МПА в пробирках столбиком, стерильные пипетки на 1 мл, стерильный физраствор по 9 мл, спирт для факела, пинцет, вата.

Для демонстрации – прибор Зейтца, водоструйный вакуумный насос, кипяченые мембранные фильтры №3 в стакане с дистиллированной водой, среда Эндо в чашках Петри; глюкозо-пептонная среда (ГПС) с индикатором и поплавками, разлитая по колбам и пробиркам.

Для демонстрации – 3 колбы и 6 пробирок с ГПС с готовыми посевами воды для определения коли-титра воды методом бродильных проб. Только в первой колбе с посевом 100 мл исследуемой воды должно быть помутнение, изменение цвета индикатора (красный цвет индикатора меняется на желтый) и наличие пузырьков газа в поплавках. Агар Эндо в чашках Петри с 4 мембранными фильтрами после фильтрации воды и наличием красных колоний на поверхности белого фильтра.

Вода является естественной средой обитания многих микроорганизмов. Особую опасность для здоровья человека и животных представляют патогенные бактерии, которые могут быть в воде.

Источниками загрязнения воды патогенными микроорганизмами являются выделения больных животных и людей, трупы животных, сточные воды, особенно предприятий, перерабатывающих сырье животного происхождения и др. Длительность выживания патогенных микробов в воде зависит от их вида, условий окружающей среды и может составлять от нескольких часов до нескольких лет. Так, возбудитель сибирской язвы может сохраняться в воде до 3 лет, возбудитель туберкулеза до 1 года, а бруцеллы — до 100 дней. Имеется группа болезней, для которых характерен водный путь распространения (паратифы, лептоспирозы).

Таким образом, вода может стать источником распространения инфекционных болезней и возникновения эпидемий и эпизоотий.

Для санитарно-микробиологической оценки воды проводят следующие исследования:

1.Определение количества МАФАнМ в 1 мл воды;

2. Определение коли-титра (КТ) и коли-индекса (КИ);

3. Обнаружение в воде патогенных микроорганизмов по эпидпоказаниям.

При санитарно-микробиологических исследованиях пробы воды забирают в объеме не менее 0,5 л. Из открытых водоемов пробу воды отбирают батометром. Батометр – стерильная емкость с пробкой, в металлическом каркасе и свинцовым грузилом. На нужной глубине пробку открывают, подтягивая ее за веревочку. Воду из рек, озер отбирают с глубины 10-15 см от поверхности, а при небольшой глубине на расстоянии 10-15 см от дна.

Для отбора проб водопроводной воды из крана используют стерильные колбы на 0,5 л с ватной пробкой. Кран предварительно стерилизуют обжиганием, горящим спиртовым тампоном, затем в течение 10 мин спускают воду. Пробы воды исследуют тотчас же или не позднее 2 ч с момента взятия. Если это невозможно, то хранят не более 6 ч при 1-5 0 С.

Определение количества МАФАнМ в водопроводной воде. В чашку Петри с соблюдением правил асептики вносят 1 мл водопроводной воды без разведения, заливают 15 мл расплавленного и охлажденного до 45 0 С МПА. Посевы инкубируют в термостате при 30 0 С 72 ч. Количество бактерий в 1мл воды определяют по количеству выросших колоний.

Для определения количества МАФАнМ в воде открытых водоемов исследуемую воду в зависимости от предполагаемого загрязнения предварительно разводят стерильной водой от 1:10 -1 до 1:10 -4 , из двух последних разведений по 1 мл вносят в стерильные чашки (не менее 2 чашек на каждое разведение) и заливают 15 мл расплавленного и охлажденного до 46 0 С МПА. Посевы помещают в термостат при 30 0 С на 72 ч, подсчитывают количество колоний, умножают на степень разведения и определяют количество бактерий в 1 мл воды открытых водоемов.

Определение коли-титра (КТ) и коли-индекса (КИ) воды.

Коли-титром называют наименьший объем воды, в котором обнаружена одна кишечная палочка.

Коли-индекс показывает число кишечных палочек в 1000 мл воды.

Кишечная палочка является постоянным обитателем кишечника человека и животных, следовательно, ее присутствие в питьевой воде является индикатором фекального загрязнения. Чем выше концентрация бактерий группы кишечной палочки, тем вероятнее присутствие таких бактерий, как сальмонеллы, возбудители дизентерии и холеры. Показатели КТ и КИ указывают на санитарное состояние воды, ее пригодность в качестве питьевой. КТ и КИ определяют двумя методами:

2.Метод мембранных фильтров.

Этот метод основан на ферментативной активности бактерий группы кишечной палочки (БГКП), которая выражается в способности расщеплять при помощи ферментов лактозу или глюкозу до кислоты и газа. Исследуемая вода засевается в различных объемах в среду накопления — глюкозо-пептонную среду (ГПС) с индикатором и поплавками. При наличии кишечной палочки появляется помутнение, меняется цвет индикатора, и появляются пузырьки газа в поплавках. Из забродивших посевов делают пересев на дифференциально-диагностические среды.

Методика: засевают водопроводную воду в объеме 333 мл, разделенной на 9 порций (три объема по 100 мл, три – по 10 мл и три — по 1 мл). При этом вода в объемах по 100 мл засевается в три колбы с 10 мл концентрированной ГПС, 10 мл — в три пробирки с 1 мл концентрированной среды, а 1 мл воды вносят – в пробирки с 10 мл среды с нормальной концентрацией. Посевы инкубируют в термостате 24 часа при 37 0 С. При отсутствии БГКП в исследуемой воде, изменение цвета индикатора и образование газа не происходит

Рост кишечной палочки сопровождается помутнением среды, изменением цвета индикатора (красный цвет переходит в желтый) и появлением газа в поплавках. Из колбы и пробирок с признаками роста проводят пересев на агар Эндо штрихом по секторам. Посевы инкубируют при 37 0 С 24 часа. При отсутствии роста на агаре Эндо или при наличии колоний, не характерных для БГКП, дается отрицательный ответ.

Из колоний, характерных для бактерий БГКП (ярко-красных с металлическим оттенком, розовых), готовят мазки, их окрашивают по Граму, микроскопируют. Дополнительно изучают культуру по оксидазному тесту. Для этого на фильтровальную бумагу пропитанную раствором альфа-нафтола-диэтил-n-фенилендиамина наносят штрихом 2-3 колонии снятые с агара Эндо.

Для кишечной палочки характерно: наличие грамотрицательных палочек в мазке и отсутствие изменений в окраске фильтровальной бумаги на оксидазный тест. Следовательно, наличие грамотрицательных палочек и отрицательный оксидазный тест подтверждает наличие кишечной палочки в исследуемой воде.

Для подтверждения свежего фекального загрязнения исследуемой воды посевы выращивают при 43 0 С для дифференциации от кишечных палочек хладнокровных, не растущих при такой высокой температуре. Требования к санитарному состоянию воды приведены в таблице 3.

Микробиологические нормативы санитарного состояния воды

Из таблицы видно, что для питьевой воды установлены следующие нормативы бактериологических показателей:

— общее микробное число – не более 100 в 1 мл;

— коли-индекс не должен превышать 3 кишечных палочек в 1000 мл.

Вода открытых водоемов считается доброкачественной, если общее микробное число – не более 1000 в 1 мл, коли-титр – не менее 111, коли-индекс – не более 9.

Метод мембранных фильтров

Для исследования воды применяется мембранный фильтр №3 из нитроцеллюлозы, с диаметром пор 0,7 мкм, который задерживает на своей поверхности БГКП. Перед использованием мембранные фильтры кипятят 10-15 мин в дистиллированной воде. Фильтр, с соблюдением правил асептики, матовой поверхностью вверх накладывают на сетку фильтрационного прибора Зейтца. В воронку прибора наливают исследуемую воду и в приемной колбе Бунзена создают вакуум при помощи водоструйного насоса. Исследуемую воду фильтруют через мембранный фильтр, а бактерии, находившиеся в ней, остаются на поверхности. После фильтрации мембранный фильтр матовой стороной вверх переносят на поверхность агара Эндо в чашках Петри. Чашки ставят в термостат при 37 0 С на 18-24 ч.

Через поры мембранного фильтра происходит диффузия питательных компонентов среды Эндо, вследствие этого оставшиеся на поверхности БГКП размножаются на поверхности фильтра и образуют типичные колонии — красные с металлическим оттенком. По числу выросших колоний определяют количество кишечных палочек в 1000 мл воды и тем самым устанавливают коли-индекс.

Водопроводную воду исследуют в объеме 333 мл, которую дробно и последовательно пропускают через четыре фильтра в объемах — 200, 100, 30 и 3 мл воды.

Наличие в воде патогенных бактерий устанавливают путем посева на дифференциально-диагностические и селективные питательные среды с последующей их идентификацией методами, принятыми в микробиологии.

Исследование воды проводят с целью выявления общей микробной загрязненности, обнаружения в ней патогенных микробов и установления нали­чия кишечной палочки (определение коли-титра). Воду для иссле­дования берут из открытых водоемов и из водопровода. Взять воду из крана просто, труднее брать пробы воды на больших глубинах. Для этого существуют специальные приборы (батомет­ры), которые опускают на тросах на определенную глубину. Там, на глубине, прибор открывается и в него набирается вода, после чего его поднимают на поверхность.

Взятие проб из открытых водоемов. При взятии проб воды необходимо соблюдать определенные правила.

1. Если имеется источник загрязнения, то из таких водоемов берут три пробы воды: выше источника загрязнения, против него и ниже по течению.

2. Пробы воды из колодцев берут 2 раза: утром до начала раз­бора воды и вечером после разбора.

3. Из рек, озер и прудов воду берут на глубине 0,5 1 м от поверхности и на расстоянии 1—2 м от берега.

Пробы воды берут в хорошо вымытые (желательно стерильные) стеклянные бутыли с притертыми пробками. Дли анализа необходимо два и более литров воды. К каждой пробе воды прилагают сопроводительную ведомость, в которой отмечают:

1. Наименование источника и место его нахождения.

2. Год, месяц, число и час взятия пробы.

3. Место взятия пробы (расстояние от берега и глубина).

4. Температура воздуха, сведения об осадках в день взятия пробы и за последние десять дней.

5. Температура воды при отборе пробы.

6. Краткое описание водоема.

7. Для какой цели направляется.

8. Должность и место службы лица, взявшего пробу, и его подпись.

Пробы воды в лабораторию доставляют немедленно, зимой их предохраняют от замерзания, летом — от перегревания.

Исследование водопроводной воды. В течение 10 -15 мин воду спускают из водопроводной трубы, после чек» пламе­нем горелки (спиртовки) обжигают кран. Воду набирают в сте­рильную колбу. Заранее готовят две пробирки со стерильной водой, три стерильные чашки Петри и три пипетки.

Из колбы, в которую отобрана вода для исследования, пипет­кой берут 2 мл; 1 мл вносят в первую стерильную чашку и 1 мл — в первую пробирку с 9 мл стерильной воды. Второй пипеткой воду перемешивают в первой пробирке. Получается разведение 1: 10. Затем этой же пипеткой 1 мл разведения переносят, но вторую стерильную чашку и 1 мл — во вторую пробирку с 9 мл стерильной воды, но не перемешивают. Третьей пипеткой перемешивают воду во второй пробирке (разведение 1:100) и 1 мл переносят в третью чашку.

После внесения в каждую чашку по 1 мл воды в разведениях 1:100, 1:10 и не разведенной выливают по 10—12 мл расплавленного и охлажденного до 45 0 С МПА. Чашку быстро закрывают и вра­щательными движениями перемешивают расплавленный МПА с водой. На чашке (крышке) ка­рандашом или специальными чернилами делают надписи с указанием даты посева, разве­дения, фамилии студента, под группы. Чашки переворачивают вверх дном и ставят в термостат при температуре 35—37 0 С. По количеству выросших колоний, с учетом разведения, судят о содержании микробов к засеянном объеме воды.

Загрязненность воды определяется по общей микробной обсемененности и обнаружению санитарно-показательных микроорганизмов — индикаторов наличия выделений человека или животных. В воде регистрируют кишечную палочку, БГКП (колиформные палочки), энтерококк, стафилококки;

На основании количественного выявления этих санитарно-показательных бактерий вычисляются индекс БГКП (число БГКП в 1 л воды), перфрингенс-титр, титр энтерококка и т.д. Так, например, титр энтерококка воды — это наименьшее количество воды, в котором определяется энтерококк.

К бактериям группы кишечной палочки относят грамотрицательные палочки, сбраживающие с образованием кислоты и газа лактозу или глюкозу при температуре 37°С в течение 24-48 ч и не обладающие оксидазной активностью. Наиболее часто этот показатель применяют как индикатор фекального загрязнения воды. Другой сходный показатель фекального загрязнения — общие колиформные бактерии: грамотрицательные, оксидаза-отрицательные палочки, ферментирующие лактозу или маннит (глюкозу) с образованием альдегида, кислоты и газа при температуре 37°С в течение 24 часов. Вместо последнего термина предлагается использовать термин «бактерии семейства Enterobacteriaceae», так как все бактерии этого семейства имеют индикаторное значение. К бактериям семейства Enterobacteriaceae относятся грамотрицательные, оксидазаотрицательные палочки, растущие на лактозосодержащих средах типа среды Эндо и ферментирующие глюкозу до кислоты и газа при температуре 37°С в течение 24 часов; колиформные бактерии (палочки).

Фото: Carnie Lewis

При бактериальном загрязнении воды свыше допустимых норм следует провести дополнительное исследование на наличие бактерий — показателей свежего фекального загрязнения. К таким бактериям относят термотолерантные колиформные бактерии, фекальные кишечные палочки, ферментирующие лактозу до кислоты и газа при температуре 44 °С в течение 24 часов и не растущие на нитратной среде. О свежем фекальном загрязнении свидетельствует также выявление энтерококка. На давнее фекальное загрязнение указывают отсутствие БГКП и наличие определенного количества клостридий перфрингенс, т. е. наиболее устойчивых спорообразующих бактерий.

В соответствии с нормативными документами регламентируются следующие нормативы микробиологических показателей питьевой воды при централизованном водоснабжении:

1. Общее микробное число воды не должно превышать 100 микробов в 1 мл исследуемой воды;

2. Общие колиформные бактерии должны отсутствовать в 100 мл исследуемой воды;

3. Термотолерантные колиформные бактерии должны отсутствовать в 100 мл исследуемой воды;

4. Колифаги не должны определяться в 100 мл исследуемой воды (учет по бляшкообразующим единицам);

5. Споры сульфитредуцирующих клостридий не должны определяться в 20 мл исследуемой воды;

6. Цисты лямблий не должны определяться в 50 мл исследуемой воды.

Кроме того, загрязненность воды оценивается по обнаружению патогенных микробов с фекально-оральным механизмом передачи (энтеровирусы, энтеробактерии, холерные вибрионы и др.).

Исследование воды на присутствие возбудителей брюшного тифа, холеры и лептоспирозов

В воде регистрируют кишечную палочку, БГКП (колиформные палочки).

К бактериям группы кишечной палочки относят грамотрицательные палочки, сбраживающие с образованием кислоты и газа лактозу или глюкозу. Этот показатель применяют как индикатор фекального загрязнения воды. Колиформные бактерии, фекальные кишечные палочки – показатели свежего фекального загрязнения.

Определение колиформных бактерий. Общие колиформные бактерии — это Граспорогенные палочки, не обладающие оксидазной активностью и сбраживающие лактозу с образованием кислоты и газа. Их обнаружение свидетельствует о свежем фекальном загрязнении воды.

Общие колиформные бактерии должны отсутствовать в 100 мл. воды.

Микрофлора воды отражает микробный состав почвы, так как микроорганизмы, в основном, попадают в воду с ее частичками. В воде формируются определенные биоценозы с преобладанием микроорганизмов, адаптировавшихся к условиям местонахождения, освещенности, степени растворимости кислорода и диоксида углерода, содержания органических и минеральных веществ.

В водах пресных водоемов обнаруживаются различные бактерии: палочковидные (псевдомонады, аэромонады), кокковидные (микрококки) и извитые. Загрязнение воды органическими веществами сопровождается увеличением анаэробных и аэробных бактерий, а также грибов. Микрофлора воды выполняет роль активного фактора в процессе самоочищения ее от органических отходов, которые утилизируются микроорганизмами. Вместе с сточными водами попадают представители нормальной микрофлоры человека и животных (кишечная палочка, цитробактер, энтеробактер, энтерококки, клостридии) и возбудители кишечных инфекций (брюшного тифа, паратифов, дизентерии, холеры, лептоспироза, энтеровирусных инфекций). Таким образом, вода является фактором передачи возбудителей многих инфекционных заболеваний. Некоторые возбудители могут даже размножаться в воде (холерный вибрион, легионеллы).

Микрофлора воды океанов и морей также содержит различные микроорганизмы, в том числе светящиеся и галофильные вибрионы, поражающие рыб, при употреблении которых в пищу развивается пищевая токсикоинфекция.

Санитарно-микробиологическое исследование питьевой воды централизованного водоснабжения

При проведении исследований определяют:

Общее число микроорганизмов, образующих колонии на питательном агаре

Содержание общих и термотолерантных колиформных бактерий (ОКБ и ТКБ)

Содержание спор сульфитредуцирующих клостридий

Содержание колифагов

Пробу (в объеме 500 см3 ) отбирают в стерильную емкость, снабженную пробкой и колпачком, после предварительной стерилизации крана обжиганием и последующего спуска воды не менее 10 минут при полностью открытом кране. При отборе пробы напор воды уменьшают.

1.1.1. Определение общего числа микроорганизмов, образующих колонии на питательном агаре.

Метод определяет в питьевой воде общее число мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (ОМЧ), способных образовывать колонии на питательном агаре при температуре 37 оС в течение 24 часов, видимые с увеличением в 2 раза.

Проведение анализа. Из каждой пробы делают высев не менее двух объемов по 1см3. Вносят по 1 см3 воды в две стерильные чашки Петри, затем в каждую чашку вливают 8-12 см3 расплавленного и остуженного до 45-49 оС питательного агара. Быстро смешивают содержимое чашек на горизонтальной поверхности. После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат вверх дном и инкубируют 24 часа при 37 оС.

Учет результатов. Подсчитывают все выросшие на чашках колонии, наблюдаемые при двукратном увеличении. Количество колоний на обеих чашках суммируют и делят на два. Результат выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл исследуемой пробы воды. Если на двух чашках наблюдается рост расплывчатых колоний или выросло более 300 колоний, подсчитывают сектор чашки с последующим пересчетом на всю поверхность. В этих случаях в протоколе отмечают «число КОЕ / см3 — ориентировочно». Если подсчет на чашках невозможен, то в протоколе отмечают «сплошной рост».

Норматив: в 1 см3 питьевой воды должно быть не более 50 КОЕ.

1.1.2. Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий.

1.1.2.1. Метод мембранной фильтрации (основной метод). Общие колиформные бактерии (ОКБ) представлены грамотрицательными, оксидаза-отрицательными, не образующими спор палочкиами, способными расти на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре 37 оС в течение 24-48 часов.

Термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ) входят в число общих колиформных бактерий, обладают их признаками и, кроме того, они способны ферментировать лактозу до кислоты, альдегида и газа при 44 оС в течение 24 часов.

Метод основан на фильтрации установленного объема воды через мембранные фильтры, выращивание посевов на дифференциальной питательной среде с лактозой и последующей идентификацией колоний по культуральным и биохимическим свойствам.

Проведение анализа. При исследовании питьевой воды изучают три пробы объемом по 100 мл. При получении стабильных отрицательных результатов допустима фильтрация 300 см3 воды через один фильтр.

При фильтрации воды неизвестного качества целесообразно увеличить количество фильтруемых объемов для получения изолированных колоний на фильтре (например, 10, 40, 100, 150 см3 воды).

Фильтры помещают на чашки со средой Эндо и затем ставят в термостат дном вверх и инкубируют посевы 24 часа при 37 оС. Если на фильтрах нет роста или выросли колонии пленчатые, губчатые, плесневые, расплывчатые, выдают отрицательный ответ, свидетельсвующий об отсутствии ОКБ и ТКБ в 100 мл исследуемой воды. Анализ заканчивают через 24 часа.

Если на фильтрах обнаружен рост изолированных типичных лактоза-положительных колоний: темно-красных; красных с металлическим блеском или без него или других подобного типа колоний с отпечатком на обратной стороне фильтра, подсчитывают число колоний каждого типа отдельно и приступают к подтверждению их принадлежности к ОКБ и ТКБ.

Каждую отобранную изолированную колонию исследуют на:

а) наличие оксидазной активности; б) отношение к окраске по Граму (микроскопия окрашенного по Граму препарата или постановка теста Грегерсена); 3) ферментацию лактозы до кислоты и газа.

.Постановка оксидазного теста. Полоску фильтровальной бумаги помещают в чистую чашку Петри и смачивают 2-3 каплями реактива для оксидазного теста (например, 1% водным раствором тетраметил-n-фенилендиамина гидрохлорида) или используют СИБ-оксидазу. Готовые бумажные системы смачивают дистиллированной водой. Часть изолированной колонии стеклянной палочкой или платиновой петлей наносят штрихом на подготовленную фильтровальную бумагу. Реакция считается положительной, если в течение 1 мин появляется фиолетово-коричневое или синее (СИБ-оксидаза) окрашивание штриха. При отрицательной реакции цвет в месте нанесения культуры не меняется. При положительном результате эту колонию их дальнейшего исследования исключают.

Определение отношения к окраске по Граму. Из оксидаза-отрицательной колонии делают мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют.

Окраска по Граму может быть заменена тестом Грегерсена: в капле 3% водного раствора КОН на предметном стекле эмульгируют бактерийную массу, взятую с плотной среды. После нескольких секунд перемешивания петлей взвесь ослизняется и за петлей тянутся слизистые нити, что указывает на принадлежность испытуемой культуры к грамотрицательному виду. У грамположительных бактерий слизистые нити не образуются – реакция отрицательная.

Определение ферментации лактозы. Оставшуюся часть оксидаза-отрицательной грамотрицательной колонии засевают параллельно в две пробирки с лактозной средой;

— для подтверждения наличия ОКБ посев инкубируют при 37 оС 48 часов (просматривают через 24 часа);

— для подтверждения наличия ТКБ посев осуществляют в среду, предварительно прогретую до 43-44 оС, и инкубируют при 44 оС 24 часа.

Учет результатов. При отсутствии ОКБ и ТКБ на всех фильтрах результат записывают «не обнаружено КОЕ ОКБ в 100 см3» и «не обнаружено КОЕ ТКБ в 100 см3». В случае идентификации всех выросших подозрительных колоний число КОЕ ОКБ и ТКБ подсчитывают на всех фильтрах и выражают результат анализа КОЕ в 100 см3 воды.

Вычисление проводят по формуле X = , где Х – число колоний в 100 см3 воды; V – профильтрованный объем воды через фильтры, на которых велся учет; a – число подсчитанных на этих фильтрах колоний в сумме.

Окончательный результат выдают: количество КОЕ ОКБ в 100 см3 воды, из них количество КОЕ ТКБ в 100 см3.

1.1.2.2. Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий

Метод основан на накоплении бактерий после посева установленного объема воды на жидкую питательную среду с последующим пересевом на дифференциальную плотную питательную среду с лактозой и идентификацией колоний по культуральным и биохимическим тестам.

Проведение анализа. При исследовании питьевой воды качественным методом засевают 3 объема по 100 см3. При исследовании воды с количественным определением ОКБ и ТКБ при повторном анализе производят посев: 3 объемов по 100 см3, 3 объемов по 10 см3, 3 объемов по 1 см3. Посев 100 см3 и 10 см3производят соответственно в 10 и 1 см3 концентрированной лактозо-пептонной среды, посев 1 см3 пробы проводят в 10 см3 среды обычной концентрации. Посевы инкубируют 48 часов при 37 оС. Из емкостей, где отмечено наличие роста (помутнение) и образование газа или только помутнение, производят высев бактериологической петлей на сектора среды Эндо для получения изолированных колоний. Посевы на среде Эндо инкубируют 18-20 часов при 37 оС.

При образовании помутнения и газа в среде накопления и росте на среде Эндо колоний, типичных для лактоза-положительных бактерий: темно-красных или красных, с металлическим блеском или без него, выпуклых с красным центром и отпечатком на питательной среде, дают положительный ответ на присутствие общих колиформных бактерий в данном объеме пробы.

Факт наличия ОКБ необходимо подтвердить если: в среде накопления отмечено только помутнение; принадлежность к лактоза-положительным колониям вызывает сомнение.

В этих случаях: проверяют наличие окрашенных отпечатков на среде Эндо после снятия петлей подозрительной колонии; выполняют оксидазный тест; подтверждают принадлежность к Граму; подтверждают способность к газообразованию при посеве изолированных 1-2 колоний каждого типа с каждого сектора на среду с лактозой с последующей инкубацией посевов при 37 оС в течение 24-48 часов.

Для определения ТКБ делают посев 2-3 изолированных колоний каждого типа с каждого сектора среды Эндо в пробирки с лактозной средой, нагретой до 44 оС и инкубируют в термостате 24 часа при 44 оС. Допускается просмотр посевов через 4-6 часов.

При образовании газа в среде накопления, росте на среде Эндо лактоза-положительных бактерий и выявлении их способности ферментировать лактозу до кислоты и газа в течение 24 часов при 44 оС дают положительный ответ на наличие в этом объеме пробы воды ТКБ. Во всех остальных случаях дают отрицательный ответ.

Учет результатов. При исследовании 3 объемов по 100 см3 результаты оценивают качественно и при обнаружении ОКБ и ТКБ хотя бы в одном из них, делается запись в протоколе «обнаружены в 100 см3». При исследовании полуколичественным методом определяют наиболее вероятное число (НВЧ) ОКБ и ТКБ по таблице «Расчет НВЧ бактерий в 100 см3 питьевой воды» в методических указаниях 4.2.1018-01. Результат сообщают без доверительного интервала. При отрицательном ответе – «не обнаружены в 100 см3».

Норматив: ОКБ и ТКБ должны отсутствовать в 100 см3 воды.

1.1.3.Определение спор сульфитредуцирующих клостридий

Сульфитредуцирующие клостридии — спорообразующие анаэробные палочковидные микроорганизмы, восстанавливающие сульфит натрия на железосульфитном агаре при 44 оС в течение 16-18 часов.

Метод основан на выращивании посевов в железосульфитном агаре в условиях, приближенных к анаэробным и подсчете черных колоний.

Проведение анализа. Пробу воды 20 см3 прогревают на водяной бане в пробирках 15 минут при 75 оС для уничтожения вегетативных форм. При исследовании хлорированной воды прогревание пробы можно не проводить.

Из каждой пробы питьевой воды делают посев или фильтруют 20 см3. При необходимости подбирают объемы с таким расчетом, чтобы в посевах (в фильтрах) выросло не более 10-15 колоний.

Определение методом фильтрования в пробирках. Перед посевом железосульфитный агар в пробирках расплавляют на водяной бане при 70-80 оС. После фильтрования установленного объема воды мембранный фильтр стерильным пинцетом берут за два противоположных края и согнув в виде «трубочки» помещают в пробирку с горячим агаром. Пробирку с агаром быстро охлаждают в холодной воде. Посевы культивируют 16-18 часов при 44 оС.

Определение методом фильтрования в чашках Петри. Чашки Петри заливают тонким слоем железо-сульфитного агара. После фильтрации фильтр помещают на застывшую питательную среду фильтрующей поверхностью вниз. Затем заливают расплавленным железо-сульфитным агаром до верхнего края чашки, чтобы крышка плотно прилегала к среде для создания анаэробных условий. Посевы культивируют 16-18 часов при 44 оС.

Определение прямым посевом. В стерильные пробирки вносят по 5 или 10 см3 исследуемой пробы воды, заливают горячим железо-сульфитным агаром в количестве, превышающем объем воды в 2 раза. Пробирку быстро охлаждают. Посевы инкубируют при 44 оС в течение 16-18 часов.

Учет результатов. Количественному учету подлежат только посевы, в которых получены изолированные колонии. Подсчитывают черные колонии, выросшие как на фильтрах, так и в толще питательной среды. Результат анализа выражают в колониеобразующих единицах спор сульфитредуцирующих клостридий в 20 см3 воды. При отсутствии роста черных колоний на всех фильтрах дают ответ «не обнаружены в 20 см3 воды». При невозможности учета колоний из-за сливного роста результат оценивается как качественный, в протоколе отмечают «обнаружено в 20 см3».

Норматив: споры сульфитредуцирующих клостридий должны отсутствовать в 20 см3 питьевой воды.

1.1.4. Определение колифагов.

Колифаги — бактериальные вирусы (бактериофаги), заражающие Escherichia coli и, в результате, формирующие зоны лизиса (бляшки) бактериальной культуры, засеянной «газоном» на питательном агаре через 18 часов инкубирования при 37 оС.

Титрационный метод определения колифагов. Определение колифагов в питьевой воде включает предварительное накопление колифагов в среде обогащения на культуре E.coli и последующее выявление зон лизиса (просветления) газона E.coli на питательном агаре. Метод предназначен для проведения текущего контроля качества питьевой воды.

Проведение качественного анализа. В исследуемую пробу воды объемом 100 см3 вносят питательный бульон и подготовленный смыв тест культуры E.coli, помещают в термостат и инкубируют 18 часов при 37 оС. Затем из исследуемой пробы воды отливают в пробирку 10 см3, добавляют хлороформ, пробирку закрывают стерильной резиновой пробкой, встряхивают и оставляют при комнатной температуре до полного осаждения хлороформа. В предварительно расплавленный и остуженный до 45-49 оС питательный агар добавляют приготовленный смыв культуры E.coli. В стерильную чашку Петри пипеткой из пробирки переносят 1 см3 обработанной хлороформом пробы, заливают смесью расплавленного и остуженного до 45-49 оС питательного агара и осторожно покачивают для равномерного перемешивания пробы воды и агара. После застывания чашку переворачивают и инкубируют в термостате 18 часов при 37 оС. Параллельно проводят контроль культуры E.coli.

Учет результатов. Просмотр посевов проводят в проходящем свете. Проба считается положительной при наличии полного лизиса, просветлении нескольких бляшек, одной бляшки на чашке с пробой воды при отсутствии зон лизиса на контрольной чашке. В протоколе анализа отмечается: колифаги обнаружены или не обнаружены в 100 см3 воды. При наличии зон лизиса в контроле культуре результат считается недействительным.

Проведение количественного анализа. Исследуемую пробу воды в количестве 100 см3 разделяют на шесть порций: 1 флакон с 50 см3 и 5 пробирок с 10 см3. К 50 см3 пробы добавляют 5 см3 десятикратного питательного бульона и 0,5 см3 смыва E.coli. В каждые 10 см3 пробы вносят по 1 см3 десятикратного питательного бульона и по 0,1 см3 смыва бактерий.

Для контроля культуры 0,1 см3 смыва E.coli помещают в чашку Петри и заливают питательным агаром. Посевы инкубируют 18 часов при 37 оС.

Затем из объема 50 см3 отливают в пробирку 10 мл. Во все исследуемые 6 объемов добавляют по 1 см3 хлороформа. Пробирки закрывают резиновыми пробками, энергично встряхивают и оставляют при комнатной температуре для осаждения хлороформа.

В предварительно расплавленный и остуженный до 45-49 оС питательный агар добавляют смыв E.coli. Приготовленную смесь разливают в две чашки Петри: одну чашку для контроля культуры E.coli на лизогенность и одну чашку для исследуемой пробы воды. После застывания агара чашки, предназначенные для посева проб, разделяют на 6 секторов и маркируют в соответствии с исследуемыми объемами. На каждый сектор из соответствующей пробирки наносят пастеровской пипеткой (или бактериологической петлей продольным штрихом) по 1 капле надосадочной жидкости. После подсыхания капель чашки с исследуемыми пробами и контрольную чашку помещают в термостат при 37 оС на 18 часов.

Учет результатов. Просмотр результатов осуществляют в проходящем свете. Учитывают наличие зон просветления (лизиса) на секторах газона E.coli. При применении капельного способа посева пипеткой образуется зона лизиса в виде округлого пятна или отдельных бляшек. При посеве продольным штрихом бактериологической петлей отмечается лизис по ходу штриха. Пробу считают положительной при наличии зоны лизиса хотя бы на одном секторе при отсутствии зон лизиса на контрольной чашке. Оценку проводят по таблице наиболее вероятного числа (НВЧ) бляшкообразующих единиц (БОЕ). В протоколе анализов указывают наиболее вероятное количество колифагов в 100 мл воды в диапазоне возможных колебаний: НВЧ БОЕ (нижний предел – верхний предел) колифагов в 100 см3. Результат полуколичественный. При наличии зон лизиса в контрольной чашке результат считают недействительным.

Прямой метод определения колифагов. Определение колифагов в питьевой воде включает исследование нормируемого объема воды (100 см3) путем его прямого посева и последующего подсчета зон лизиса (бляшек) на газоне E.coli в чашках Петри с питательным агаром. Прямой метод выделения колифагов из воды проводят параллельно с титрационным методом при исследовании по эпидемическим показаниям.

Проведение анализа. В питательный агар, расплавленный и остуженный до 45-49 оС добавляют смыв E.coli и перемешивают. Исследуемые 100 см3 воды разливают по 20 см3 в большие пробирки, нагревают до 35-44 оС и немедленно разливают в 5 чашек Петри. Затем в каждую чашку сразу же вносят по 20 см3 смеси агара с культурой E.coli. Для контроля культуры E.coli в одну чашку Петри вносят 20 см3 стерильной водопроводной воды, предварительно прогретой до 35-44 оС, заливают 20 см3 приготовленного агара с E.coli. Содержимое чашек осторожно перемешивают. Чашки с застывшим агаром помещают вверх дном в термостат и инкубируют в течение 18 часов при 37 оС.

Учет результатов. Просмотр посевов проводят в проходящем свете. Учет результатов осуществляют подсчета и суммирования числа бляшек, выросших на 5 чашках Петри. Результаты выражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ) на 100 см3 пробы воды. В контрольной чашке бляшки должны отсутствовать.

Наиболее часто зоны лизиса выглядят прозрачными пятнами на фоне газона тест-культуры питательного агара в виде круглых изолированных бляшек (от 1 до 5-7 мм в диаметре) с четко выраженными либо стертыми границами.

При высоких концентрациях фага можно наблюдать «ажурный» газон Е. coli, рост единичных колоний Е. coli на фоне сплошного лизиса, либо полное отсутствие роста на чашке.

Окончательный количественный учет прямого посева проводят через 18 часов. Результаты выражают количеством бляшкообразующих единиц (БОЕ) на 100 см3 пробы воды. Если отмечен сливной рост бляшек и подсчет затруднителен, то по данным прямого посева может быть выдан качественный результат: «обнаружено в 100 см3воды». При наличии зон лизиса в контрольной чашке результат исследования считается недействительным.

Норматив: В 100 см3 исследуемой воды должны отсутствовать БОЕ колифагов.

Содержание золотистого стафилококка (S.aureus) в 1 м3 воздуха

При исследовании воздуха по эпидемиологическим показаниям определяют также и патогенные микроорганизмы.Для количественного микробиологического исследования воздуха применяют аспирационный и седиментационный (в исключительных случаях) методы.

2.1.1. Определение общего содержания микроорганизмов в 1 м3

Аспирационный метод. Забор воздуха осуществляют аспирационным методом с помощью приборов (ПУ-1Б, «Флора», аппарат Кротова). Приборы устроены таким образом, что воздух с заданной скоростью засасывается через отверстия в крышке, закрывающей чашку Петри с питательным агаром. При этом частицы аэрозоля с содержащимися в них микроорганизмами равномерно фиксируются на своей поверхности среды благодаря постоянному вращению чашки под входным отверстием. Для определения общего количества микроорганизмов засевают по 100 дм3 воздуха на 2 чашки Петри с 2% питательным агаром. После инкубации посевов при 37 оС в течение 48 часов проводят подсчет колоний, выросших на чашках. Производят перерасчет на 1м3 воздуха. Показатель выражают в КОЕ/м3.

Седиментационный метод (обычно применяют для исследования воздуха в боксах во время работы). Для контроля стерильности воздуха в боксах 2 чашки Петри с 2% мясо-пептонным агаром оставляют открытыми в течение 15 минут, после чего посевы инкубируют при 37 ºС 48 часов. Результаты оценивают по суммарному числу колоний, выросших на обеих чашках.

Норматив: допустимо присутствие не более 3 КОЕ неспорообразующих сапрофитов на чашках.

2.1.2. Определение содержания S.aureus в 1 м3. При проведении исследований 250 дм3 воздуха засевают на чашки с желточно-солевым агаром (ЖСА) или молочно-желточно-солевым агаром (МЖСА). Посевы инкубируют при 37 ºС 48 часов. Отбирают подозрительные колонии (круглые, блестящие, выпуклые, пигментированные, с положительной и отрицательной лецитовителлазной реакцией). Подозрительные колонии (не менее 2-х) микроскопируют и пересевают в пробирки со скошенным питательным агаром. Инкубируют посевы при 37 ºС в течение 24 часов. Идентификацию проводят по морфологическим, тинкториальным свойствам и плазмокоагулирующей активности. Стафилококки окрашиваются по Граму положительно (фиолетово-синие кокки, располагающиеся гроздьями). Плазмокоагулирующую активность выявляют в реакции коагуляции плазмы (РКП). При выявлении только плазмокоагулирующей или только лецитовителлазной активности выделенной культуры, определяют ферментацию маннита и мальтозы в анаэробных условиях, гемолитическую активность, хлопьеобразование, образование ацетоина. При необходимости проводят фаготипирование выделенных культур, определяют чувствительность бактерий к антибиотикам, бактериофагам и дезинфектантам. Результаты выражают в КОЕ/м3.

Нормативы: в воздухе помещений класса чистоты А и Б общее количество микроорганизмов должно находится в допустимых пределах, золотистого стафилококка не должно быть. Санитарное состояние воздуха помещений классов чистоты В и Г не нормируется.

Таблица 1. Допустимые уровни бактериальной обсемененности воздушной среды в больничных помещениях

Титрационный метод

Из разведения 1:10 почвенной суспензии 10 см 3 засевают на 90 см 3 среды Кесслера, остальные разведения сеют по 1 см 3 в 9 см 3 среды. Посевы выращивают при температуре 37 о С 48 часов. При отсутствии роста (помутнение, газообразование) дают отрицательный ответ. При наличии помутнения и газообразования или при наличии только помутнения делают высев на среду Эндо. Чашки с посевами инкубируют при 37 о С 18-24 час. Отбирают розовые, красные или малиновые с металлическим блеском колонии, изучают морфологические, тинкториальные свойства, ставят оксидазный тест. По 2-3 колонии каждого типа (грамотрицательные, оксидазаотрицательные) засевают параллельно в 2 в пробирки с полужидкой или жидкой с поплавком средой с лактозой, инкубируют в термостате 37 о С 18-24 час. При ферментации лактозы с образованием кислоты и газа дают положительный ответ на БГКП.

Результаты выражают в величинах коли-индекса.

Норматив. Индекс БГКП 1-10 клеток/г почвы

Метод мембраной фильтрации. Используют в качестве ускоренного метода. Применяют фильтры с диаметром пор 0,45 мкм и размером диска 35 или 47 мм. Фильтруют 5,0-10,0 см 3 почвенной суспензии первого разведения (1:10) через мембранные фильтры, сеют на дифференциальную питательную среду с лактозой, отбирают подозрительные колонии, идентифицируют бактерии по культуральным и биохимическим свойствам.

Метод прямых поверхностных посевов. Применяют при анализе загрязненных и сильно загрязненных почв.

На среду Эндо засевают по 0,1 или 0,2 см 3 разведений почвы: от 10 -1 до 10 -3 для сравнительно чистых почв, из разведений до 10 -5 и 10 -6 для сильно загрязненных почв. Среды обычно используют подсушенные. Растирают посев шпателем. Инкубация посевов 37 о С 24 часа. Дальнейшая идентификация аналогична рассмотренной выше ( в титрационном методе, начиная со среды Эндо). Посчитывают количество колиформных бактерий в 1 г почвы, для чего среднее число колиформных колоний, выросших на чашках, умножается на степень десятикратного разведения. Результаты выражают в количестве КОЕ/г.

Определение энтерококков.

Энтерококки — грамположительные, не образующие каталазу кокки, слегка вытянутые с заостренными концами. В мазках располагаются парами или короткими цепочками, реже одиночно. При росте на жидких средах (лактозо-пептонная среда, ЛПС; щелочная элективная среда с полимиксином, ЩЭС) вызывают диффузное помутнение и образование осадка.

Для выявления энтерококков используют титрационный метод и метод мембранной фильтрации.

Титрационный методприменяют для анализа почв с предполагаемой невысокой степенью загрязнения.

Из разведений почвенной суспензии стерильной пипеткой берут 10 см 3 и засевают во флаконы с 50 см 3 жидкой среды (ЛПС или ЩЭС). Посевы инкубируют 24 час при 37 о С. При наличии признаков роста производят высев на плотные среды МИС (молочно-ингибиторная среда) или ЖСТ (желточная среда Турчинского). Инкубируют 24-48 часов. В случае отсутствия роста дают отрицательный ответ.

При наличии аспидно-черных, выпуклых с металлическим блеском или сероватых, мелких колоний проводят микроскопию окрашенных по Граму мазков и каталазный тест.

После выявления энтерококков устанавливают титр, при котором принимается то предельное разведение почвы, в котором обнаруживают энтерококки. Для перевода титра в индекс, необходимо 1000 разделить на число, выражающее титр.

Содержание мезофильных аэробных и факультативно – анаэробных микроорганизмов (КМАФАМ). Количество МАФАМ выражают в КОЕ в одном см3 или одном г продуктов

Наличие БГКП

Наличие сальмонелл

Наличие стафилококков

Наличие листерий

Ставят пробу на брожение

4.2.1 Определение содержания МАФАМ.

При исследовании пастеризованное молоко разводят стерильным физиологическим раствором в соотношениях 1:10; 1:100, 1:1000 и вносят по 1,0 см3 в чашку Петри и заливают расплавленным и остуженным МПА, перемешивают и инкубируют трое суток при 30 оС, затем подсчитывают число выросших колоний по формуле:

где Х — количество МАФАМ в 1 см3

Норматив. Количество МАФАМ для пастеризованного молока в потребительской таре должно быть не должно превышать 105 КОЕ/см3.

Пастеризованное молоко разводят физиологическим раствором в соотношении 1:10; 1:100 и засевают по 1 см3 в 3 пробирки со средой Кесслера с поплавками: В 1 пробирку вносят 1 см3 цельного молока; во 2 пробирку — 1 см3 из разведения 1:10 и в 3-ю — 1 см3 из разведения1:100. Термостатируют 18-24 часа при 37 оС. При отсутствии газообразования в наименьшем из засеваемых объемов дают заключение об отсутствии в нем БГКП. При наличии газообразовании отмечают, что БГКП в нем обнаружены.

Норматив. БГКП не должны обнаруживаться в 0,01 см3 пастеризованного молока.

По ГОСТу определения сальмонелл не проводят, но согласно СанПиН в 25 граммах продукта сальмонеллы должны отсутствовать. Поэтому выявление бактерий рода сальмонелл, необходимо проводить по ГОСТ Р 52814 – 2007. Пробы засевают на забуференную пептонную воду в соотношении 1:9. Инкубируют 24 часа при 37оС. Затем делают высев по 1 см3 в 2 среды обогащения: RVS (Раппопорта-Вессилиадиса с соей) и тетратионатный бульон либо селенитовый бульон или Мюллера-Кауфмана). Среду RVS (Раппопорта-Вессилиадиса с соей) инкубируют 41 оС-24 часа, а селенитовый бульон или Мюллера-Кауфмана 24 часа 37 оС. Через 24 часа делают пересев на среды: XLD (ксилоза-лизин декстрозный агар) и Эндо, Левина или Плоскирева. Термостатируют 24 часа при 37 оС и учитывают характер роста (сальмонеллы образуют на среде Эндо колонии S-формы бесцветные или розовые) и делают отсев на скошенный МПА. Пробирки инкубируют 24 часа 37 оС.

Через 24 часа ставят реакцию агглютинации (РА) на стекле с поливалентными сальмонеллезными сыворотками А, В, С, D и Е. В случае положительной реакции ставят РА с групповыми сыворотками. Одновременно с РА материал засевают на среду Олькеницкого и изучают другие биохимические свойства путем посева на среды Гисса и МПБ с индикаторными бумажками на индол и сероводород. После инкубации (24 часа 37 оС) отмечают характер роста микроорганизмов. Сальмонеллы подвижными, не расщепляют лактозу и сахарозу, расщепляют глюкозу, образуют H2S и не образуют индол. У выделенной чистой культуры бактерий изучают другие биохимические свойства путем посева на среды Гисса и МПБ с индикаторными бумажками на индол и сероводород.

Для определения серовара сальмонелл используют РА с моновалентными О- и Н- сальмонеллезными сыворотками.Обнаружение микроорганизмов, образующих характерные колонии на средах XLD и Эндо, имеющих характерные морфологические, биохимические и антигенные свойства, указывает на присутствие в исследуемом пищевом продукте сальмонелл.

Норматив. Сальмонеллы должны отсутствовать в 25 см3 молока.

4.2.4. Выявление Staphylococcus aureus.

Проводят в соответствии с ГОСТом 303447 – 97 «Молоко и молочные продукты».

Определение S. аureus в определенном объеме продукта с предварительным обогащением. Из ранее приготовленных разведений, используем ту массу, в которой по нормативному документу S. aureus должен отсутствовать. Например: в молоке пастеризованном в потребительской таре наличие S. aureus не допускается в 1,0 см3.

Для выявления S. aureus 1 см3 цельного продукта вносят в пробирки с солевым бульоном (1:10), инкубируют при 24 часа 37 оС. Через 24 часа отсевают на среду Бэйрд – Паркера (ЖСА, МСА). Инкубируют 24-48 часов при 37ооС, готовят мазки и отсевают характерные колонии на МПА. Посевы инкубируют 24 часа при 37 оС, а затем ставят пробу на плазмокоагулазу.

Наличие характерных морфологических, культурных свойств и положительной реакции плазмокоагуляции свидетельствует о присутствии коагулазоположительных стафилококков в определенном объеме.

Норматив: золотистых стафилококков не должно быть в 1см3 пастеризованного молока в потребительской таре.

Исследование включает несколько этапов:

1-й этап. Для определения листерий подготовленную навеску продукта (25 г/см3) вносят в среду для первичного обогащения в количестве 225 мл (ПБЛ 1 — питательный бульон для листерий) и инкубируют 24 часа при 37 оС.

2-й этап. Затем 0,1 см3суспензии из молока пересевают в 10 см3 среду вторичного обогащения (ПБЛ 2) и инкубируют 48 часов при 37 оС.

3-й этап. Через 48 часов из пробирок независимо от наличия или отсутствия признаков роста отсевают 0,1 см3 на поверхность двух чашек с ПАЛ (РАLСАМ) агаром инкубируют 24-28 часов при 37 С.

Примечание: допустимо не проводить второй этап (этап вторичного обсеменения) при посеве с низким исходным уровнем микробной контаминации и при отсутствии признаков роста в жидкой среде первого этапа, т.е. переходить сразу к посеву на агаризованные среды.

4-й этап. Изучают характер роста: на среде PALCAM — через 24 часа листерии формируют мелкие, серовато-зеленые или оливково-зеленые колонии с черным ореолом, диаметром 0,5-1,0 мм., иногда с черным центром. Через 48 часов их диаметр равен 1,0-2,0 мм.; колонии становятся зелеными с углубленными центрами, окруженными черным ореолом. Кокковая флора образует желтые колонии за счет ферментации маннита. Отобранные колонии (3-5) пересевают на МПА, дополненный 1% глюкозы. Посевы инкубируют посевы 24 часа при температуре 30 о С.

а) микроскопию (грамположительные тонкие короткие палочки, спор не образуют).

б) определение каталазной активности (положительны)

в) определение подвижности посевом уколом на полужидкий агар PALCAM в 2 пробирки. Одну инкубируют при 25 оС, другую при 37 о С 48-72 часов. При 20-25 оС подвижны, характер роста напоминает зонтик; неподвижны при 35-37 оС.

г) определение способности восстанавливать нитраты.

д) определение ферментации углеводов. Проводят посев на пестрый ряд (не утилизируют маннит, ксилозу; утилизируют рамнозу с образование кислоты) при 37 о С в течении 7 дней.

е) Определение гемолитической активности на кровяном агаре (образует зону гемолиза вокруг колоний)

Норматив. Наличие листерии не допускаются в 25 г или см3 продукта.

4.2.6. Определение редуктазной активности.

Проводят при исследовании сырого молока. Метод основан на способности восстанавливать метиленовый голубой ферментами, выделяемыми микроорганизмами, присутствующими в молоке. По продолжительности изменения окраски оценивают бактериальную обсемененность сырого молока. Чем медленнее процесс, тем меньше микроорганизмов в молоке, тем лучше его качество.

Применяют при определении пригодности молока для производства сыра. Метод основан на способности некоторых микроорганизмов, присутствующих в молоке, свертывать его. Чем медленнее происходит образование сгустка без выделения сыворотки и пузырьков газа, тем лучше качество молока.

Исследование мяса по СанПин

При санитарно-микробиологическом исследовании мяса определяют:

— наличие МАФАМ

— наличие БГКП

— наличие сальмонелл

— наличие листерий

4.4.2.1. Для определения МАФАМ делают разведения из расчета 1:10, 1:100 и 1:1000. Для этого 10 г продукта вносят в 90 см3 физиологического раствора (1:10). Из него готовят разведения 1:100 и 1:1000. Затем из каждого разведения по 1 см3 сеют в 2 стерильные чашки Петри и заливают расплавленным и остуженным МПА. Посевы инкубируют 72 часа при 30 оС. Затем делают подсчет выросших колоний, учитывая разведение.

Норматив: количество МАФАМ должно быть не более 10 КОЕ/г.

4.4.2.2. Для определения количества БГКП 10 см3 исходной взвеси (1 г продукта) сеют на среду Кесслера. Дальнейшие исследования проводят по методу, указанному выше (4.1.2).

Норматив: БГКП – не должны обнаруживаться в 1 г продукта.

4.4.2.3. Для определения сальмонелл делают посевы по обычной схеме (4.1.3).

Норматив – сальмонеллы не должны определяться в 25 г мяса.

4.4.2.4. Для определения листерий делают посевы по обычной схеме (4.2.5).

Норматив: листерии не должны определяться в 25 г мяса.

Бактерии рода Salmonella

Бактерии рода Proteus.

4.4.3.1. Для выявления МАФАМ по 1,0 см3 из разведений 1:100, 1:1000 засевают на чашки глубинно, заливают расплавленным и остуженным до 50 оС МПА. Посевы инкубируют 72 часа при 30 оС, затем подсчитывают количество выросших колоний, выражая результат в КОЕ/г.

4.4.3.2. Для выявления БГКП 1,0 см3 исследуемой взвеси из разведения 10-4 высевают на среды Хейфеца или Кесслера, дальнейшее исследование проводят как описано выше (4.1.2).

4.4.3.3. Для выявления бактерий рода Salmonella кусочки весом 25 г первоначально засевают на забуференную пептонную воду, дальнейшее исследование проводят как описано выше (4.1.3.).

4.4.3.4. Для выявления бактерий рода Proteus 0,5 см3 из разв

Самой чистой будет считаться вода, добытая из глубоководной артезианской скважины. Она или вовсе лишена загрязнителей бактериологического типа, или содержит небольшое количество загрязнителей, которые не несут в себе никакой опасности здоровью и жизни потребителя.

Артезианскую скважину можно по праву назвать стерильной. Особенно если сравнивать ее с иными источниками питьевой воды. Самыми опасными в плане повышенного уровня загрязненности считаются поверхностные воды.

Именно по этой причине можно говорить о том, что степень загрязнения источника питьевой воды выше, если глубина скважины минимальна. Для обеспечения загородного дома высококачественной питьевой водой следует провести профессиональное, грамотное бурение и оборудование артезианской глубоководной скважины.

Неукоснительное соблюдение абсолютно всех имеющихся и установленных технологических стандартов бурения, монтажа, устройства и последующего использования источника воды опасность бактериологического загрязнения питьевой воды минимальна и практически сводится к нулю.

Но в случае неправильного подхода и неправильно подобранного технического оборудования для артезианской скважины даже ее глубокое залегание не будет являться гарантией того, что в нее не попадут грунтовые и поверхностные воды, которые содержат микробиологические загрязнители.

Основными причинами, по которым происходит заражение питьевой воды, добываемой из артезианской скважины, могут быть:

• ненадлежащего качества трубы для обсадки;
• плохо проведенные работы, связанные со сваркой труб, осуществлением резьбы, соединяющей эти трубы;
• неправильно проведенная герметизация пространства за обсадными трубами;
• попадание поверхностных вод в скважину в момент ее бурения.

Если есть хотя бы малейшие подозрения на наличие причин, по которым вода может быть загрязнена, следует обязательно провести санитарно-микробиологический анализ питьевой воды.

Эффективность фильтров будет достигнута только в том случае, если параметры загрязнителей, находящихся в артезианской воде, имеют постоянные значения.

Именно по этой причине необходимо в обязательном порядке ежегодно сдавать артезианскую воду на микробиологический анализ, который проводится в соответствии с установленными санитарно-эпидемиологическими нормами.

В случае даже незначительных изменений химического состава воды важно провести перенастройку фильтрационной системы во избежание ухудшения водоочистки.

Процесс забора воды для проведения микробиологического анализа достаточно специфический. Взять правильно образец воды на микроанализ сложнее, чем на химический. Правильный забор пробы артезианской воды подразумевает следующие действия:

1. Чтобы доставить воду в лабораторию с целью проведения бактериологического анализа, необходимо брать исключительно стерильную посуду, объем которой не менее 500 грамм. Стерильные емкости можно взять прямо в лаборатории, где в последующем будет осуществляться микробиологический анализ питьевой воды. Можно, в принципе, самостоятельно простерилизовать емкость, прокипятив ее в течение пяти-семи минут, или обработав паром. Можно для этих целей использовать духовой шкаф, где емкость должна находиться в течение 10-15 минут при температуре 180 градусов.
2. Перед тем, как взять воду из водопроводной системы, необходимо в обязательном порядке обработать кран открытым огнем, затем тщательно протереть спиртом. Воду следует спустить, открыв на максимально возможную мощность кран и спускать воду приблизительно 5-7 минут и лишь после этого произвести забор воды в пастеризованную емкость. Категорически запрещено дотрагиваться до крышки, которой будет закрыта тара, и до горловины.
3. Отвезти жидкость в лабораторию, где будет проведено исследование, необходимо в течение нескольких часов. Если сделать это в столь короткий срок по ряду причин невозможно, емкость с водой можно поставить в холодное место на 2-3 часа, плотно закрыв крышкой, после чего отвезти в лабораторию.
4. Отправляемая на изучение питьевая вода должна сопровождаться соответствующими документами, в которых следует указать вид источника воды, откуда была отобрана проба, месторасположение источника, непосредственное место, где взята проба, дата и точное время взятия пробы.

Лаборатория будет проводить микробиологический анализ природных вод по нескольким основным показателям.

Желательно проводить исследование питьевой воды ежегодно, особенно в период после весеннего паводка, а также после произошедших техногенных катастроф или природных катаклизмов, когда вероятность загрязнения подземных источников питьевой воды очень высока.

Лабораторией проводится комплексное исследование пробы воды в соответствии с методиками, которые рекомендованы нормативно-правовыми актами РФ, а также Международным комитетом по стандартизации.

Микробиологический анализ воды подразумевает как выявление микроорганизмов, но и обнаружение вирусов и бактерий, жизнедеятельность которых приводит к развитию инфекционных заболеваний у людей, употребляющих загрязненную воду.

В настоящее время одной из самых удобных, эффективных, надежных методик осуществления микробиологического анализа водопроводной, артезианской питьевой воды является метод мембранной фильтрации. Суть метода заключается в пропускании исследуемой воды через специальную фильтрующую установку, где размер ячеек не превышает 0,65 мкм.

Присутствующие в воде болезнетворные микроорганизмы концентрируются на поверхности мембранного фильтра. После этого фильтр снимается и помещается в специальную среду, где происходит инкубирование микроорганизмов в созданных для них условиях.

Преимуществами методики мембранной фильтрации можно назвать:

• высокоточный конечный результат исследования;
• определение количества микроорганизмов;
• результативность даже при наличии небольшого числа микроорганизмов в воде;
• минимальные затраты рабочего времени;
• быстрое получение результатов.

Для того, чтобы провести микробиологический анализ природных вод методом мембранной фильтрации, необходимо наличие вакуумного фильтра, а также специальных питательных сред – картонных подложек.

Цель занятия.Ознакомить студентов с основными методами и показателями, необходимыми для санитарно-микробиологической оценки объектов внешней среды.

Оборудование и материалы. Прибор для подсчета колоний, колбы с пробами воды, бактериологические пробирки с 9 мл воды, пробирки с 10 мл расплавленного агара, мерные стериль­ные пипетки на 2 мл, стерильные чашки Петри, чашки Петри с МПА, чашки Петри с кровяным МПА, навески почвы, стериль­ная водопроводная вода в колбе — 270 мл, пробирки со средой Кесслера, Вильсона—Блера.

Для оценки санитарно-гигиенического состояния объектов окружающей среды проводят санитарно-бактериологические ис­следования, цель которых состоит в определении эпизоотологической и эпидемиологической безопасности. Показателем небла­гополучия служит выявление патогенных микроорганизмов. Од­нако прямое их обнаружение связано с большими трудностями, и прежде всего с низкой концентрацией данных микробов, кото­рые в основном не могут размножаться в воде, воздухе и почве. Поэтому в санитарно-микробиологической практике используют косвенные методы, направленные на определение микробной обсемененности объекта и обнаружение в нем так называемых санитарно-показательных бактерий. О бактериальной обсеме­ненности судят по микробному числу — общему коли­честву микроорганизмов, содержащихся в единице объема или массы (1 мл воды, 1 г почвы, 1 м 3 воздуха).

Содержание санитарно-показательных бактерий определяют по двум показателям: титру и индексу. Титром называют минимальный объем или массу, в которых выявляют данные бактерии, индексом — количество санитарно-показательных бактерий, содержащихся в соответствующем количестве среды.

К санитарно-показательным бактериям относят представи­телей облигатной микрофлоры организма человека и тепло­кровных животных, для которых среда обитания — кишечник или воздушно-дыхательные пути. Они характеризуются следую­щими свойствами: 1) постоянно выделяются с калом или ка­пельками слизи из воздушно-дыхательных путей; 2) не имеют других мест обитания; 3) способны сохраняться в окружающей среде то же время, что и патогенные бактерии, паразитирующие в кишечнике или воздушно-дыхательных путях; 4) не способны интенсивно размножаться вне организма хозяина и изменять свои свойства.

Перечисленные признаки присущи бактериям, признанным санитарно-показательными для различных объектов окружаю­щей среды.

Санитарно-показательные бактерии группы кишечных пало­чек принадлежат к различным родам семейства энтеробактерий.

Обнаружение кишечной палочки в разных объектах окружаю­щей среды считают наиболее достоверным признаком свежего фекального загрязнения. Наличие в этих же объектах бактерий родов Citrobacter и Enterobacter указывает на относительно давнее фекальное загрязнение.

Присутствие С. perfringens, С. sporogenes и других клостридий в почве свидетельствует о ее фекальном загрязнении, причем как свежем, так и давнем, поскольку эти бактерии образуют споры, что позволяет им длительно переживать в окружающей среде (в частности, в почве).

Обнаружение в объектах окружающей среды Streptococcus faecalis также свидетельствует об их фекальном загрязнении. Рез­кое увеличение количества этих бактерий в саморазогревающем­ся навозе и компостах может свидетельствовать о загрязнении почвы разлагающимися отбросами.

Гемолитические стрептококки, будучи облигатными обитате­лями носоглотки и зева, выделяются с капельками слизи ораль­но-капельным путем. Сроки выживания гемолитических стреп­тококков в окружающей среде практически не отличаются от сроков, характерных для большинства других возбудителей воз­душно-капельных инфекций. Обнаружение гемолитических стрептококков в воздухе помещений указывает на возможное его загрязнение микроорганизмами, содержащимися в зеве, носо­глотке, верхних дыхательных путях и вызывающими инфекции, передаваемые воздушно-капельным путем.

Staphylococcus aureus — также факультативный обитатель но­соглотки и зева. Его присутствие в воздухе помещений служит показателем орально-капельного загрязнения.

Одновременное обнаружение золотистого стафилококка и ге­молитических стрептококков свидетельствует о высокой степени загрязнения воздуха.

Санитарно-микробиологическое исследование воды. Вода — ес­тественная среда обитания микробов, которые в большом коли­честве поступают из почвы, воздуха, с отбросами, стоками. Осо­бенно много микроорганизмов в открытых водоемах и реках. Кроме сапрофитов в воде могут находиться возбудители инфек­ций животных и человека.

При контроле санитарного состояния воды исследованию подлежат: вода централизованного водоснабжения, колодцев, открытых водоемов (реки, озера), плавательных бассейнов, сточ­ные жидкости.

Отбор проб воды. Из открытых водоемов пробы воды отбира­ют с глубины 10…15 см от поверхности и на расстоянии 10… 15 см от дна. Водопроводную воду набирают в стерильные флаконы объемом 0,5 л с притертой пробкой. Предварительно кран обжи­гают и спускают воду в течение 10… 15 мин. Хлорированную воду перед исследованием нейтрализуют тиосульфатом натрия из рас­чета 10 мл на 1л воды. Бактериологическое исследование проб воды следует проводить в течение двух часов после отбора или шести часов при температуре хранения 1…5°С.

Определение микробного числа воды. Водопроводную воду засе­вают в количестве 1мл, воду открытых водоемов — по 1,0; 0,1; 0,01 мл. Все пробы вносят в стерильные чашки Петри, после чего их заливают 10…12 мл расплавленного и охлажденного до 40…45 °С питательного агара, который тщательно перемешивают с водой. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 1…2сут. Воду из открытых водоемов засевают параллельно на две серии чашек, одну из которых инкубируют при 37 ºС в течение суток, другую — 2 сут при 20 °С. Затем подсчитывают количество выросших на поверхности и в глубине колоний и вычисляют микробное число воды — количество микроорганизмов в 1 мл.

Определение коли-титра и коли-индекса воды. Минимальное количество воды в мл, в котором обнаруживают бактерии группы кишечных палочек (БГКП), называют коли-титром воды, количество БГКП, содержащихся в 1л исследуемой воды, называют кол и-и ндексом воды. Коли-титр и коли-индекс воды определяют титрационным (бродильным) ме­тодом или методом мембранных фильтров.

Титрационный метод. В глюкозо-пептонную среду (1%-я пептонная вода, 0,5%-й раствор хлорида натрия, 0,5%-й раствор глюкозы, индикатор Андреде и поплавок) проводят посевы различных объемов воды.

Воду открытых водоемов исследуют в объемах 100; 10; 1 и 0,1 мл. Для анализа водопроводной воды делают посевы трех объемов по 100 мл, трех объемов по 10 мл и трех объемов по 1 мл. Посевы инкубируют при 37 °С в течение суток. О брожении судят по образованию пузырьков газа в поплавке. Из забродивших или помутневших проб делают посевы на среду Эндо. Из выросших колоний готовят мазки, окрашивают по Граму и ставят оксидазный тест, с помощью которого дифференцируют бактерии родов Escherichia, Citrobacter и Enterobacter от грамотрицательных бак­терий семейства Pseudomonadaceae и других оксидазоположительных бактерий, обитающих в воде. С этой целью 2…3 изоли­рованные колонии наносят «штрихом» на фильтровальную бума­гу, смоченную диметил-n-фенилендиамином. При отрицатель­ном оксидазном тесте цвет бумаги не изменяется, при положительном она окрашивается в синий цвет в течение 1 мин. Грамотрицательные палочки, не образующие оксидазу, вновь ис­следуют в бродильном тесте — вносят в полужидкий питатель­ный агар с 0,5 % глюкозы и инкубируют при 37 °С в течение су­ток. При положительном результате определяют коли-титр и коли-индекс по статистической таблице.

Метод мембранных фильтров. Определенный объем воды про­пускают под давлением через мембранный фильтр № 3, предва­рительно стерилизованный кипячением в дистиллированной воде. Водопроводную воду и воду артезианских скважин фильт­руют в объеме 333 мл. Чистую воду открытых водоемов фильтру­ют в объеме 100, 10, 1 и 0,1 мл, более загрязненную воду перед фильтрованием разводят стерильной водой. Фильтры накладыва­ют на агар Эндо в чашки Петри и после инкубации при 37 °С в течение суток подсчитывают количество выросших красных колоний. Из двух-трех колоний делают мазки, окрашивают их по Граму и ставят оксидазный тест. Грамотрицательные палочки, не образующие оксидазу, принадлежат к БГКП. По существующим нормативам (ГОСТ 2874—82) питьевую воду считают качествен­ной, если ее коли-индекс не более 3, а микробное число — не бо­лее 100.

Общепринятым дополнительным показателем фекального загрязнения воды служит количество S.faecalis. Для определе­ния его титра цельную воду и ее 10-кратные разведения засева­ют в жидкую элективную среду (щелочная полимиксиновая сре­да). После инкубирования при 37 ºС в течение двух суток, а за­тем еще через сутки и двое суток делают высевы на плотные элективные среды. Фекальные стрептококки идентифицируют по морфологическим, культуральным и тинкториальным свой­ствам.

Есть данные о корреляции между содержанием в воде фекаль­ных кишечных палочек и фагами бактерий группы кишечных па­лочек. Поэтому определение данных фагов служит косвенным показателем возможного присутствия кишечных палочек в ис­следуемой пробе воды.

Санитарно-микробиологическое исследование воздуха. Мик­рофлора воздуха зависит от микрофлоры почвы и воды. Воз­дух — неблагоприятная среда для обитания микроорганизмов из-за отсутствия питательных веществ, действия солнечных лучей, высушивания. Наряду с сапрофитами в воздухе могут находиться патогенные бактерии, споры грибов родов Aspergillus, Mucor и др.

Санитарную оценку воздуха осуществляют по двум показате­лям: 1) определение микробного числа воздуха; 2) определение количества санитарно-показательных бактерий — гемолитичес­ких стрептококков и стафилококков.

Количественные микробиологические методы исследования воздуха основаны на принципах осаждения (седиментации), ас­пирации или фильтрации.

Седиментационный метод осаждения Коха. Чашки Петри с МПА оставляют открытыми на 5…10 мин. Для определения са­нитарно-показательных бактерий берут чашки Петри с кровя­ным МПА и время экспозиции увеличивают до 40 мин. Чашки выдерживают при 37 °С и комнатной температуре 24 ч и подсчи­тывают выросшие колонии.

Микробное число воздуха (общее количество бактерий в 1 м3) определяют по формуле Омелянского

Х= а * 100 * 1000 * 5 / (b * 10 * T),

где X— количество микробов в 1 м 3 (1000 л) воздуха; а — количество выросших ко­лоний в чашках; b — площадь чашки; Т— время, в течение которого чашка была открыта; 5 — время по правилу Омелянского; 10 — объем воздуха в литрах. (Прави­ло Омелянского предусматривает, что на поверхности агара в чашке Петри площа­дью 100 см 3 за 5 мин из воздуха оседает такое количество микробов, которое нахо­дится в его 10 л.)

Прямое обнаружение патогенных микробов воздуха проводят только при специальных показаниях.

Аспирационный метод. Более точный количественный способ определения микробного числа воздуха, так как посев микроор­ганизмов из воздуха производят с помощью приборов. При использовании аппарата Кротова воздух с заданной скоростью за­сасывается через щель плексигласовой пластины и ударяется о поверхность питательной среды открытой чашки Петри, находя­щейся на вращающейся подставке, благодаря чему происходит равномерный посев бактерий из воздуха на поверхность МПА (при определении микробного числа) или кровяного МПА (при выделении гемолитических стафилококков и стрептококков). После инкубации в термостате в течение двух суток подсчитыва­ют количество выросших колоний и определяют микробное чис­ло воздуха. При исследовании воздуха могут быть использованы и другие приборы (Дьякова, Киктенко, ПАБ-1 — прибор аэро­зольный бактериологический и ПОВ-1 — прибор для отбора воз­духа). В практику входят ускоренные методы индикации микро­флоры воздуха с помощью мембранных фильтров, каскадных им-пакторов, фильтров Петрякова и др.

Санитарно-микробиологическое исследование почвы. Анализ почвы включает в себя определение микробного числа, коли-тит-ра, перфрингенс-титра и титра термофильных бактерий. По эпи­демиологическим признакам проводят определение в почве па­тогенных микроорганизмов: сальмонелл, шигелл, возбудителей столбняка, ботулизма, злокачественного отека, сибирской язвы. Бактериологический анализ почвы нужен при выборе террито­рии под пастбище, ферму, хозяйственные постройки, детские сады, больницы и др.

Предварительно делают отбор проб почвы. На обследуемой территории площадью до 1000 м 3 выделяют два участка по 25 м 3 (один — вблизи источника загрязнения, другой — в отдалении от него), берут пробы из 5 точек (4 — по углам участка, 1 — в цент­ре) на глубине 10…20 см стерильным совком (из более глубоких мест — с помощью специального бура Некрасова или Френкеля). Пробы почвы по 200…300 г отбирают в широкогорлые стеклян­ные банки с ватными пробками (можно все взятые с одного уча­стка пробы перемешать и на исследование направить 1 кг). На банки наклеивают этикетки, отправляют с нарочным и сопрово­дительным письмом. Пробы почвы полагается исследовать сразу же или в течение 6… 18 ч, сохраняя их при температуре не выше 1…5ºС.

В лаборатории почву измельчают, освобождают от камней, ос­колков стекол, корней растений, просеивают через сито, тща­тельно перемешивают и отвешивают 30 г. В колбу на 500 мл наливают 270 мл стерильной водопроводной воды и вносят в нее отвешенную пробу почвы, все интенсивно встряхивают 10 мин, не давая отстояться частицам суспензии, готовят серию десятикратных последовательных разведений. Для относительно чис­тых почв достаточно 4 степени разведения, для загрязненных — 6…9 разведений. В штатив ставят нумерованные пробирки с 9 мл стерильной воды в каждой. В первую вносят 1 мл суспензии про­бы почвы, смешивают, затем 1 мл из первой пробирки вносят во вторую, смешивают, из нее — 1 мл в третью и т. д. В результате в пробирке № 1 получается разведение 1 : 100, № 2 — 1 : 1000 и т.д. Подготовленные таким образом пробы почвы исследуют.

Определение общего микробного числа. Из последних 3…4 про­бирок с разведенной суспензией отдельными стерильными пи­петками вносят по 1 мл в стерильные чашки Петри (каждое раз­ведение в отдельности). В каждую чашку добавляют еще по 10… 15 мл расплавленного и охлажденного до 45 ºС МПА. Равно­мерными осторожными круговыми движениями содержимое ча­шек перемешивают, оставляют на столе для уплотнения (затвердения) агара. С застывшей средой чашки перевертывают вверх дном, надписывают и помещают в термостат для культивирова­ния на 24…48 ч при 37 °С. Выросшие колонии подсчитывают в каждой чашке, умножают на степень разведения, полученные числа суммируют и вычисляют среднеарифметическое число, что составит количество микробов, содержащихся в 1 г почвы.

Определение коли-титра, перфрингенс-титра и титра термо­фильных бактерий почвы. Для определения коли-титра почвы раз­личные разведения почвенной взвеси засевают по 1 мл в пробир­ки со средой Кесслера (на 1л дистиллированной воды — 10г пептона, 50 мл бычьей желчи — 2,5 г лактозы, 4 мл 1%-го водного раствора генцианвиолета) и инкубируют при 43 ºС в течение 48 ч. В дальнейшем исследования проводят по схеме, применяемой при определении коли-титра воды. Наибольшее разведение поч­венной суспензии, в котором отмечена ферментация лактозы (газообразование), соответствует коли-титру почвы. Для опреде­ления перфрингенс-титра почвы различные разведения почвен­ной суспензии по 1 мл засевают в пробирки со стерильным обез­жиренным молоком или железосульфитной средой Вильсона— Блера, приготовленной ex tempore. Посевы инкубируют при 43 °С в течение 24…48 ч, после чего учитывают результаты по сверты­ванию молока или по образованию черных колоний С. perfringens в агаровом столбике среды Вильсона—Блера. Из колоний делают мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют и вычисляют перфрингенс-титр, который соответствует наибольшему разведе­нию почвы, вызвавшему почернение и разрыв среды Вильсона— Блера в первые 12 ч роста.

Для определения титра термофильных бактерий разведения почвенной суспензии по 1 мл вносят в чашки Петри, заливают расплавленным и охлажденным агаром. Посевы инкубируют в течение суток при 60 ºС, а затем подсчитывают количество вы­росших колоний и пересчитывают на 1 г почвы.

Санитарно-микробиологическую оценку почвы проводят по комплексу показателей, из которых наиболее важный ление степени фекального загрязнения.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Определить микробное загрязнение воздуха.

2. Провести исследование воды с целью установления мик­робного числа и коли-титра.

3. Определить микробное число и перфрингенс-титр почвы.

1. Что такое санитарно-показательные микроорганизмы?

2. Как определяют коли-титр воды?

3. Как определяют микробное число почвы?

4. Как определяют перфрингенс-титр почвы?

5. Какие методы применяют для определения микробного числа воздуха?

6. Что такое санитарно-показательные микробы воздуха и как их определяют?

источник